Krooninen sairaus

tiivistelmä

Lukuisia muutoksia epigeneettisellä mekanismit on kuvattu erilaisia ​​kasvaimia. Etsimään uusia biomarkkereita, tutkimme ilmaus Polycomb-(PCG) proteiinien EZH2, BMI1 ja SUZ12 ja niihin histonimodifikaation H3K27me3 kolorektaalisyövässä. Nuclear ilmaus PcG proteiinien ja histonimodifikaation H3K27me3 olivat immunohistokemiallisesti (IHC) värjättiin kudoksen mikrosirulla (TMA), mukaan lukien 247 kasvain kudosten ja 47 normaaleista kudoksista, ja pisteytetty puoliautomaattiko- Ariol järjestelmä. Kasvaimen kudokset osoittivat korkeampi ilmentyminen EZH2 (p = 0,05) ja H3K27me3 (p 0,001) verrattuna niiden normaaleihin kanssa. Yhdistetty merkki trendi-analyysit osoittivat, että kasvu määrän merkkiaineiden osoittaa korkea ilmentyminen liittyi parempaan ennusteeseen. Korkea ilmaus kaikki neljä merkkiä yhdistettyyn merkkianalyysit korreloi parhaiten potilaan selviytymisen ja pisin uusiutumista elinaika, jossa kokonaiselinaikaa (p = 0,01, HR 0,42 (0,21-0,84)), tautivapaan elinajan (p = 0,007, HR 0,23 (0,08-0,67) ja paikallisen uusiutumisen elinaika (p = 0,02, HR 0,30 (0,11-0,84)). Lopuksi, olemme huomanneet, että ilmaus PcG proteiinien ja H3K27me3 osoitti ennusteen arvioinnissa tutkimuksessamme kohortissa. Parempi kerrostuminen potilaista saatiin yhdistämällä ekspressiotietojen tutkittujen biomarkkerit verrattuna yksittäisiä merkintöjä, korostetaan tutkivat useiden merkkiaineiden samanaikaisesti.

Citation: Benard A, Goossens-Beumer IJ, van Hoesel AQ, Horati H, Putter H, Zeestraten ECM, et al. (2014) Prognostic arvo Polycomb- proteiinit EZH2, BMI1 ja SUZ12 ja histonimodifikaation H3K27me3 kolorektaalisyövässä. PLoS ONE 9 (9): e108265. doi: 10,1371 /journal.pone. 0108265

Editor: Richard L. Eckert, University of Maryland School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 25 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 20 elokuu 2014; Julkaistu: 22 syyskuu 2014

Copyright: © 2014 Benard et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoittajat: Nämä kirjoittajat eivät tuki ja rahoitus raportoida.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Uusi prognostisia biomarkkereiden taataan kolorektaalisyövässä jotka voisivat parantaa päätökset hoitoon yksittäisten potilaiden lisäksi nykyisen TNM (American sekakomitean Cancer, AJCC [1]) pysähdyspaikan järjestelmä kuten vaikka potilaat, joilla on sama TNM luokittelu läsnä suuria eroja potilaiden eloonjäämisen ja kasvaimen uusiutumisen [2], [3]. Epigeneettiset mekanismeja on tunnistettu tekijöitä usein vapautettu kasvaimissa ja ovat houkuttelevia kohteita biomarker tutkimukseen, koska niiden roolien säätelyssä geenien ilmentymistä ja niiden mahdollisesti palautuvia luonteeltaan. Lukuisat muutokset DNA: n metylaatio, histonimodifikaation ja modifioivia entsyymejä on kuvattu erilaisissa kasvaintyypeissä, kuten peräsuolen syöpä [4] – [6]. Tässä tutkimuksessa olemme keskittyneet ilmentymistä histoni-modifioivia entsyymejä on Polycomb-(PCG) ja niihin liittyviä histonimodifikaation, trimethylation lysiinin 27 histoni H3 (H3K27me3), peräsuolen syövän kudoksissa.

PcG proteiinit toimivat suuri multi-proteiini kompleksit, ns Polycomb- tukahduttavaa komplekseja (PRC) 1 ja 2 [7]. PcG proteiinit on tärkeä rooli sikiön kehityksen soluproliferaatiota [8], [9], ja ovat mukana myös asiakkuutta epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) [10]. Poikkeava ilmentyminen useiden PcG proteiinien ja korrelaatiot potilaiden hoitotuloksiin on raportoitu erilaisia ​​syöpiä. Esimerkiksi ekspressiota BMI1 Polycomb etusormi onkogeenin (BMI1), osa PRC1 ja tärkeä tekijä kantasoluja [11], [12], havaittiin korreloivan potilaan lopputulokseen useiden syöpätyyppien [13] – [16]. Enhancer of zeste homologin 2 (EZH2), keskeinen proteiini PRC2 monimutkainen, todettiin myös olevan ennusteen arvioinnissa vuonna useiden syöpätyyppien [17] – [20]. SUZ12 Polycomb tukahduttavaa kompleksin 2 alayksikkö (SUZ12), toinen keskeinen komponentti PRC2 monimutkainen, havaittiin kasvaimen edistäviä toimintoja useissa syövissä, mukaan lukien paksusuolen syöpä [21] – [23]. Tähän liittyvä histonimodifikaation H3K27me3 havaittiin korkeampia ilmaistaan ​​kasvaimen kudoksissa, ja liittyä paremmin ennustetta ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [24] ja rintasyövän [19].

Käyttämällä immunohistokemiallisella värjäyksellä (IHC ) ja puoliautomaattinen pisteytys, tutkimme ilmaus PcG proteiinien EZH2, BMI1 ja SUZ12 ja niihin liittyviä histonimodifikaation H3K27me3 kohortin 247 TNM I-III peräsuolen syövän potilaiden, korrelaatio kliinisten tutkimusten tulosten kanssa. Koska PcG proteiinit toimivat yhdessä samalla histonimodifikaation, me arveltu yhdistelmä kaikkien neljän merkkiaineiden olisi informatiivinen suhteen kliiniseen tulokseen verrattuna kunkin yksittäisen markkereita.

Materiaalit ja menetelmät

Patient valinta

kasvaimen kudokset kerättiin peräkkäinen 408 kolorektaalisyövän potilasta joille tehtiin kirurginen resektio niiden ensisijainen kasvain on Leidenin yliopiston Medical Center (LUMC) vuosina 1991 ja 2001. potilaat, jotka tehtiin ennen leikkausta hoito, joka oli kahden- kasvaimia, tai aiemmin syövän muiden kuin tyvisolusyöpä tai

in situ

kasvaimia, suljettiin pois tutkimuksesta analyysit. Lisäksi olemme mukana vain potilaille, joiden histologisesti todistettu TNM I-III peräsuolen karsinooma, määritettynä kokenut patologi. Tämä johti tutkimuskohortissa 259 potilasta, joiden keskimääräinen seuranta 8,6 vuotta. Kliinis oli saatavilla kaikille potilaille tutkimuskohortissa. Data oli oikea sensuroitu, kun potilaat olivat elossa tai vapaa toistumisen niiden Viimeisimmässä seurannassa tasalla. Potilaiden ominaisuudet näkyvät taulukossa 1. Potilaskertomus tiedot nimettömiksi ja de-tunnistettu ennen analysointia mukaan kansallisten eettisten ohjeiden ( ”Code for Oikea Toissijainen käyttö Human Tissue”, hollantilainen Federation of Medical Scientific Societies), ja hyväksytty Medical eettinen komitea Leidenin yliopiston Medical Center (LUMC). Tämä tutkimus suoritettiin HUOMAUTUS suuntaviivojen (NCI-EORTC) [25].

Tissue mikrosirujen rakentamiseen ja immunohistokemia

Formaliinifiksoidusta parafinoidut (FFPE) kasvain kudoksia kukin potilaista peräkkäinen paksusuolen syövän potilaiden (n = 408) kerättiin LUMC patologian arkistoon ja käyttää rakentamaan kudoksen mikrosiru (TMA), kuten aiemmin on kuvattu [26]. Jaksot 4 um leikattiin kustakin TMA lohkon ja käyttää IHC värjäystä. Histologisesti normaalia peräsuolen kudoksiin, määritettynä kokenut patologi, 47 potilasta vastaaviin tuumorikudoksista mukana tässä tutkimuksessa kerättiin myös ja valmis IHC. Seuraavia vasta-aineita käytettiin IHC: anti-EZH2 (612667, BD Biosciences, San Jose, CA, USA), anti-BMI1 (ab14389, Abcam, Cambridge, UK), anti-SUZ12 (ab12073, Abcam) ja anti-H3K27me3 (ab6002, Abcam). Kaikki vasta-aineita on validoitu käytettäviksi immuunihistokemiallisessa Western blot [27] – [30]. Kaikki ensisijainen vasta-aineita käytettiin ennalta optimaalinen laimennuksia ja IHC suoritettiin käyttäen standardia IHC-protokollaa [31]. Lyhyesti, endogeeninen peroksidaasi estettiin inkuboimalla osiot 0,3% liuos vetyperoksidia (PBS: ssä) 20 minuutin ajan. Antigeeni haku suoritettiin kuumentamalla osat 10 minuutin ajan 95 ° C: ssa sitraattipuskuria (pH 6, pH matala Target Retrieval Solution, Dako, Glostrup, Tanska) EZH2, BMI-1 ja H3K27me3 ja kuumentamalla osat 10 min 95 ° C: ssa Tris-EDTA-puskuriin (pH 9; pH korkea Target Retrieval Solution, Dako) ja SUZ12. TMA leikkeitä inkuboitiin vastaavien primaaristen vasta-aineiden yön yli (16 tuntia). Värjäys tehtiin näkyväksi käyttämällä Dako REAL EnVision Detection System, Peroxidase /DAB +, Kani /hiiri (Dako). Värjätyt TMA osat skannattiin käyttäen 20x suurennos on puoliautomaattinen Ariol järjestelmä (Leica Microsystems, Wetzlar, Saksa). Kasvainsolu alueilla (kasvain kudokset) ja paksusuolen epiteelin (normaaleissa kudoksissa) on merkitty tietokoneen näytöllä kun silmämääräinen tarkastus, seuraa huolellinen koulutus Ariol järjestelmän tunnistaa oikein positiivisesti värjättyä ja negatiiviset ytimet sisällä merkitty kudosta alueet, kunkin markkereita erikseen. Nuclear ilme, määritellään prosenttiosuutena positiivisesti värjättyä ytimien merkitylle alueelle kunkin kudoksen ydin, sitten arvioi Ariol ohjelmisto. Useat satunnainen sydämiä arvioitiin kunkin TMA osassa silmämääräisesti jälkeen automaattisen analyysin varmistaakseen oikea tunnistaminen positiivisesti värjättyä ytimeksi.

Tilastolliset analyysit

Tiedot analysoitiin kuullen tilastotieteilijä (HP ) SPSS 20.0 for Windows (SPSS Inc., Chicago, USA). 12 potilasta jätettiin tilastolliset analyysit, koska kaikki tiedot kaikista neljästä markkereita oli käytettävissä näillä potilailla, jolloin lopulliseksi potilaan kohortin koostui 247 potilasta. Koska yksittäiset merkki data ei jakautunut normaalisti (Shapiro Wilkin-testi), ei-parametrinen Wilcoxonin rank suoritettiin arvioimaan eroja ydin- ilmaisun välillä kasvain ja pariksi normaaleissa kudoksissa (n = 47) kullekin markkereita. Spearmanin allekirjoitettu listalla korrelaatio analyysit suoritettiin tutkimaan korrelaatio ydinvoiman ilmaus yksilön PcG proteiinit ja histonimodifikaation H3K27me3. Coxin suhteellisen vaaran trendi analyysit tehtiin yhden ja usean eloonjääminen analyysit yksittäisiä merkintöjä. Kovariaatit sisältyy kaikkiin monimuuttuja analyysit olivat ikä toimintaa, sukupuoli, TNM kasvain vaiheessa (kasvain vaiheiden I-III), kasvaimen sijainti, kasvaimen koon, mikrosatelliitti vakaus (MSS) tila. Kovariaatit ”kasvain seurantaan” ja ”apuaine terapia” kirjattiin aikariippuvainen kovariantteja. Kokonaiselinaika (OS) määriteltiin aika leikkauksesta kuolemaan saakka (minkä tahansa syyn). Tautivapaa elinaika (DFS) määriteltiin aika leikkauksesta esiintymiseen asti toisen ensisijaisen peräsuolen kasvain, Paikallista uusiutuminen tai etäpesäkkeenä, tai kuoleman peräsuolen syöpä. Paikallista toistuminen-elinaika (LRRFS) määriteltiin aika leikkauksesta asti esiintyminen Paikallista uusiutumisen tai kuoleman syövän. Metastasoinnista-elinaika (DRFS) määriteltiin aika leikkauksesta esiintymiseen asti kaukainen toistumisen tai kuolemaan syöpään.

pohjalta vinot jakelun ekspressiotietojen kunkin yksittäisen markkereita, mediaani ilmaisua käytettiin jakaa potilaille osaksi korkea ilmentyminen (edellä mediaani) ja heikkoa ilmentymistä (jäljempänä-mediaani) ryhmiä. Neljä markkereita yhdistettiin sitten uuteen muuttuja, joka perustuu määrä markkereita osoittaa ydinvoiman ilmaisua, johon seuraava ryhmittelyn: kaikki alhainen (ryhmä 1), 1 korkea (ryhmä 2), 2 korkea (ryhmä 3), 3 korkea (ryhmä 4) ja kaikki korkea (ryhmä 5). Yhden ja usean Coxin suhteellisen vaaran analyysit tehtiin käyttäen ryhmänumeroista kategorisena muuttuja käyttäen ryhmä 1 (kaikki matala) kuin vertailuryhmään. Näiden tulosten perusteella päätimme yhdistää potilasryhmille 2, 3, ja 4 yhdeksi potilasryhmälle; kaikki muut tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen kolmea potilasryhmille. Sen lisäksi, että Coxin suhteellinen vaara analyysejä, trendi-analyysit suoritettiin käyttäen ryhmää numeroita jatkuvien muuttujien vaikutuksen arviointiin yhdistetyn markkereita elossaololuku ja kasvaimen uusiutumisen. En vaaraa suhde (HR) edustaa HR kunkin yksikön lisäys (lisäys ryhmän numero). Kumulatiivinen ilmaantuvuus käyrät tehtiin DFS, LRRFS ja DRFS, osuus kilpailevien riskien [32]. Kaplan-Meier -käyrät visualisoida Kolmea potilasryhmien OS. Kaikkien tilastolliset analyysit, kaksipuolinen p-arvot ≤0.05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä, ja p-arvot 0,05 p≤0.1 katsottiin trendi.

Tulokset

Expression kasvain versus pariksi normaali peräsuolen kudosten

Nuclear ilmaus kaikkien yksittäisiä merkintöjä (EZH2, BMI1, SUZ12 ja H3K27me3) kasvainkudoksissa verrattiin ydin- ilmentymistä pariksi normaaleissa peräsuolen kudoksiin. Kun analysoidaan ilmentymisen eroja tutkimuskohortissa kokonaisuudessaan vain mediaani H3K27me3 ja EZH2 ilmentyminen oli merkitsevää eroa kasvain- ja normaaleissa kudoksissa (p 0,001 ja p = 0,05, vastaavasti, kuvio 1A). Yksittäisissä kasvaimia, kuitenkin, kaikki merkit osoitti selviä eroja ilmentymisen verrattuna niiden normaaleihin vastineet (kuvio 1 B). Survival analyysit perustuvat alempana tai edellä mediaani ilmentymisen normaaleissa kudoksissa ei havaittu eroja potilaiden eloonjäämisen tai kasvaimen uusiutumisen (tuloksia ei ole esitetty).

(A) Näkyy eroja ydin- ilmentyminen, mitattuna prosenttiosuus positiivisesti värjättyä ytimien välillä normaalin ja kasvaimen kudokset (n = 47). Boxplots osoittavat mediaani ja alue ilmentymisen kunkin yksittäisen markkereita normaalin (N) ja kasvaimen (T) näytteitä. Mediaani prosenttiosuudet positiivisten tumien annetaan kullekin markkereita. P-arvot edustavat tilastollisia eroja normaalin ja kasvaimen näytteet, lasketaan käyttäen Wilcoxonin testi. (B) histogrammit osoittavat eron ilmaisun välillä kasvaimen ja pariksi normaaleissa kudoksissa (y-akseli) kunkin yksittäisten potilaiden (x-akseli). Erot ilmaisun laskettiin seuraavasti: ilmaus ero = lauseke kasvainkudoksessa – ilmentymistä normaalissa kudoksessa. Negatiiviset arvot osoittavat suurempi ekspressio normaaleissa kudoksissa, positiivinen, että suurempi ekspressio kasvaimen kudoksissa.

Yksittäiset merkkianalyysit kasvainkudoksissa

Esimerkkejä tunnistaminen positiivisten ja negatiivisten tuumorisolujen ytimiä kunkin yksittäisen merkkiaineiden Ariol järjestelmä on esitetty kuviossa 2. ensin analysoidaan, jos ilmaus histonimodifikaation H3K27me3 korrelaatiota ilmentymisen yksittäisten PcG proteiineja. Ydin- lauseke (prosentteina positiivisten tumien) on H3K27me3 todellakin korreloi positiivisesti ilmaus EZH2 (p 0,001), BMI1 (p 0,001) ja SUZ12 (p = 0,05). Mitään korrelaatiota ei havaittu ilmentyminen yksittäisten markkerien ja TNM kasvaimen vaiheessa. Hengissä analyysit, potilaat jaettiin matala ja korkea ilmaisun perusteella ryhmiin mediaani ilmaisua kunkin yksittäisen markkereita, kuten esitetty kuviossa 1A. Eloonjäämisessä analyysit yksittäisiä merkintöjä, BMI1 osoitti vahvaa korrelaatiota potilaan (OS ja DFS) ja kasvaimen uusiutumisen (LRRFS ja DRFS) sekä yhden ja usean analyysit (taulukko 2). EZH2 ja H3K27me3 osoittivat merkittäviä korrelaatioita DFS vain. Kaikki kolme merkkiä (BMI1, EZH2 ja H3K27me3), korkea ekspressio liittyi parempi potilaan eloonjääminen verrattuna potilaat, joilla on alhainen ilmentyminen, p-arvoja DFS p = 0,07 (BMI1), p = 0,04 (EZH2) ja p = 0,06 (H3K27me3). SUZ12 ei ilmennyt mitään eroja elossaololuku tai kasvaimen uusiutumisen perustuu matala tai korkea ilmentymisen merkkiaineen kasvainkudoksissa.

Ariol järjestelmä kouluttaja overlay näkyy oikea tunnistaminen positiivisten (merkitty keltaiset pisteet) ja negatiivinen ( siniset pisteet) ydinten kasvaimen ydintä. TMA dioja skannattiin käyttäen 20x suurennus. Näkyy kaikille markkereita ovat positiivisesti värjäytyneet kasvain ytimet (

ylärivissä

) ja negatiivinen kasvain ytimet (

alarivissä

). Ariol järjestelmä koulutettu tunnistamaan positiivisia ja negatiivisia soluja kunkin merkin erikseen.

Yhdistetty markkereita

Oletimme, että yhdistämällä useita markkereita johtaisi parempaan kerrostumista potilaista. Siksi teimme tilastoanalyysien yhdistelmiä histoni-modifioivia entsyymejä. Nämä analyysit osoittivat, että todellakin yhdistämällä useita markkereita aiheutti tilastollisesti merkittäviä eroja potilasryhmien ja voimakkaampia riskisuhteita, mikä osoittaa selvemmin vaikutus potilaan selviytymistä. Yhdistelmä histoni-modifioivia entsyymejä EZH2 ja BMI1 osoittivat merkittäviä eroja sekä potilaiden eloonjäämisen ja uusiutumista elinaika, p = 0,02 (HR = 0,72; 95% CI 0,54-0,94) ja DFS ja p = 0.012 (HR = 0,71; 95% CI 0,54-0,92) ja LRRFS monimuuttujatestauksessa analyyseissä. Yhdistäminen EZH2 ja SUZ12 osoitti suuntaus DFS monimuuttuja analyysit, joissa p = 0,08 (HR = 0,77; 95% CI 0,57-1,04). Yhdistelmä BMI1 ja SUZ12 osoittivat merkittäviä eroja potilaiden eloonjäämisen, p = 0,02 (HR = 0,76; 95% CI ,61-0,96) yleisen selviytymisen ja p = 0,05 (HR = 0,73; 95% CI 0,54-1,00).

Koska kolme PcG proteiinit toimivat yhdessä usean proteiinin kompleksit säätelemään H3K27me3 ilmaisua, me arveltu, että yhdistämällä kaikki markkereita (BMI1, EZH2, SUZ12 ja H3K27me3) yhdeksi muuttujan johtaisi vielä paremmin kerrostumista potilaista. Potilaat jaettiin viiteen ryhmään sen perusteella, kuinka monta markkereita osoittaa ydinvoiman ilme. Tämä johti seuraavissa potilasryhmissä: kaikki alhainen (ryhmä 1), yksi korkea (ryhmä 2), kaksi korkea (ryhmä 3), kolme korkea (ryhmä 4) ja kaikki korkea (ryhmä 5). Potilaan ominaisuuksista 5 potilaan ryhmät olivat verrattavissa tutkimuskohortissa (taulukko S1). Monimuuttuja kehitysanalyysejä yhdistetyn markkereita käyttäen potilasryhmässä numerot jatkuvia muuttujia, osoitti yleistä vaaraa suhteilla 0,79-0,88 jokaista merkki osoittaa ydinvoiman ilmentymistä sekä yhden ja usean analyysit, osoittaa parempaa elossaololuku ja alempi mahdollisuudet kasvaimen uusiutumisen jokaista merkki osoittaa korkea ilmentyminen (kuvio 3A). Kun potilas ryhmänumeroista kirjattiin kategorinen muuttujia, samanlainen suuntaus havaittiin (kuviot 3B ja 3C). Yleensä riskisuhteita OS, laskivat ryhmän numero, joka osoittaa parempaa elossaololuku kun lisää markkereita ilmentyy suuresti verrattuna ”kaikki low” ilmaisun ryhmä (ryhmä 1). Potilaat, joilla on korkea ilmentymä kaikkien markkereita, ”All korkea” ryhmä (ryhmä 5), osoitti parhaat kokonaiselinaika (p = 0,01, HR = 0,42, 95% CI +0,21-,84) verrattuna vertailuryhmään 1, joka osoitti lyhin selviytymistä. Ryhmät 2, 3 ja 4 osoitti vastaavia riskisuhteita (kuviot 3B ja 3C), joka heijastui myös Kaplan-Meier selviytymisen käyrät, jotka kulkevat lähellä toisiaan verrattuna eloonjäämiskäyrien ryhmien 1 ja 5. Siksi päätimme yhdistää kolmen potilasryhmien 2,3 ja 4 yhdeksi ryhmäksi, jolloin kolme potilasryhmissä (ryhmä 1, ryhmät 2-4 ja ryhmä 5). Kaplan-Meier käyrät ja kumulatiivinen ilmaantuvuus tonttien osoitti merkittäviä eroja kolmen tuloksena potilasryhmien OS, DFS, LRRFS ja suuntaus DRFS, mikä näkyi myös 5 vuoden eloonjäämisluvut (kuva 4). Paras elossaololuku ja pisin uusiutumista jaksoja havaittiin potilailla osoittavat suuren ilmaus kaikki neljä merkkiä ( ”kaikki high”, ryhmä 5) kasvain näytteissä, joissa 5-vuoden eloonjäämisluvut 77% OS, 83% osalta DFS ja DRFS, ja 86% varten LRFS. Potilaat yhdistettyjen ryhmissä 2-4 osoittivat lyhyempi OS, DFS ja LRFS, 5-vuoden eloonjäämisluvut 67% OS ja DFS, 69% osalta LRFS ja 72% varten DRFS. Potilaat ”kaikkien vähän” ryhmä (ryhmä 1) osoitti huomattavasti lyhyempi OS, DFS ja LRFS verrattuna joko muiden potilasryhmien, kanssa 5-vuoden eloonjäämisluvut 43% OS ja LRFS, 49% DFS ja 55% for DRFS. Yhdessä 5-vuoden eloonjäämisluvut olivat alhaisempia lisää markkereita osoitti heikkoa ilmentymistä. Vaaroja suhdelukuja sekä yhden ja usean heijastuu myös nämä havainnot (taulukko 3): ryhmä 5 esittää alin riskisuhde verrattuna vertailuryhmään 1 (esim monimuuttujamenetelmien HR = 0,23 (0,08-0,67) DFS). Tämä osoittaa pienempi riski tapahtuman (potilas kuolee tai Paikallista kasvaimen uusiutumisen) potilaiden käyttöön ”kaikki korkea” ryhmä OS, DFS ja LRFS. Sillä DRFS, tilastollisesti merkittäviä tuloksia vasta havaittiin Yksiulotteisissa analyyseissä.

Potilasjärjestöt tehtiin perustuen määrästä merkkiaineiden osoittaa korkea ilmaus: kaikki alhainen (ryhmä 1), yksi korkea (ryhmä 2), kaksi korkea ( ryhmä 3), kolme korkea (ryhmä 4) ja kaikki korkea (ryhmä 5). (A) yhden ja usean Coxin regressio trendi-analyysit suoritettiin käyttäen yhdistettyä markkeri ryhmien jatkuvia muuttujia. Riskisuhteita kohden kasvoi kunkin potilasryhmät olivat piirretty (B) ja lueteltu (C) sekä yhden ja usean Coxin regressio trendianalyysit käyttäen yhdistettyä markkeri ryhmät kategoriseksi muuttujia. Potilaiden määrä yksittäisissä potilasryhmissä olivat: ryhmä 1 (n = 28), ryhmä 2 (n = 59), ryhmä 3 (n = 55), ryhmä 4 (n = 74) ja ryhmä 5 (n = 31) .

Yhdistetty merkki (EZH2, BMI1, SUZ12 ja H3K27me3) ilmaisun ryhmät jaettiin kolmeen potilasryhmät: ryhmä 1, ryhmät 2-4 ja ryhmä 5. potilaiden määrä yksittäisissä potilasryhmien olivat: ryhmä 1 (n = 28), ryhmä 2 (n = 59), ryhmä 3 (n = 55), ryhmä 4 (n = 74) ja ryhmä 5 (n = 31). Kaplan-Meier -käyrät tehtiin kokonaiselinaikaa (A) ja kumulatiivinen ilmaantuvuus käyrät on esitetty tautivapaan elinajan (B), Paikallista toistuminen-elinaika (C) ja etäpesäkkeenä-elinaika (D). 5-vuoden eloonjäämisluvut annetaan kullekin potilasryhmälle. Taulukoissa käyrät osoittavat numerot vaarassa (#) ryhmää kohti eri ajankohtina.

Keskustelu

Lisäksi geenimutaatioita, poikkeava ekspressiomalleja epigeneettiset sääntelyviranomaisten on kirjattu ratkaiseva tapahtumia kasvaimia prosessissa, jolloin merkittäviä muutoksia geenien ilmentyminen. Muutokset ilmaus näiden epigeneettiset sääntelyviranomaisten ovat DNA metyylitransferaasien ja seurauksena muutoksia DNA: n metylaation profiileja, ja histoni-modifioivia entsyymejä ja johtuvat muutokset niitä vastaaviin histonimodifikaation. Tässä tutkimuksessa tutkimme ilmentymisen kolmen PcG-proteiinien (EZH2, BMI1 ja SUZ12) ja niihin liittyvät histonimodifikaation H3K27me3 kolorektaalisyövässä kudoksissa. Poikkeava ekspressio kunkin näistä histoni-modifioivia entsyymejä, ja histonimodifikaation H3K27me3, on ilmoitettu edistää tuumorigeneesiä useiden syöpätyyppien ja on verrannollinen potilaan lopputulosta [11] – [24]. Tutkimukset kirjallisuudessa näyttää ristiriitaisia ​​tuloksia koskien ennustetekijöiden arvoa Polycomb- ryhmän proteiineja peräsuolen syöpä. Esimerkiksi korkea EZH2 ilme on yhteydessä huonoon ennusteeseen sarjassa peräsuolen syövän potilaiden Wang

et al

. [33], kun taas korkea EZH2 ilmentyminen havaittiin liittyvän paremmin uusiutumisen elinaika paksusuolensyöpä potilailla (mutta ei peräsuolen syöpäpotilaat) mukaan Fluge

et al

. [34]. Lisäksi korkea ilmentyminen BMI1 havaittiin korreloivan hyvän ennusteen rintasyövän tekemässä tutkimuksessa Pietersen

et al

. [35], kun taas korkea BMI1 oli yhteydessä huonoon ennusteeseen paksusuolensyöpä tutkimuksessa Du

et al

. [36]. Tutkimuksessamme kohortin Eloonjääntitulokset yksittäisten markkereita osoitti, että korkea ilmentyminen kaikki merkit korreloi paremmin potilaan selviytymisen ja pidemmän uusiutumista jaksoja verrattuna potilaisiin osoittaa heikkoa ilmentymistä. Tulokset löytyi tässä tutkimuksessa vastaavat meidän aikaisempia havaintoja, korkea ilmentyminen H3K27me3 liittyi paremmin potilaan selviytymistä peräsuolen kasvaimissa [4]. Tässä tutkimuksessa osoitimme, että korkea ilmentyminen H3K27me3 todellakin liittyy parempaan elossaololuku ja pidemmän uusiutumista jaksoja. Kuten olemme osoittaneet, että ilmaus PCG proteiinien liittyy suoraan ilmaus H3K27me3, odotimme samanlainen korrelaatio ilmentymisen PCG proteiinien kliinisten tutkimusten tulosten kanssa, joka todellakin vahvistettiin esitetyt tulokset tämän käsikirjoituksen. Korkea H3K27me3, koska poikkeava ilmentymä PcG proteiinien, saattaa estää poikkeava ilmentymä onkogeenien, aktivointi retroposoni-sekvenssin (kuten LINE-1; [4]), ja johtaa muiden (epi) genomista tapahtumia, jotka edistävät kasvaimen aggressiivisuus.

lisäksi yksittäisiä markkereita, yhdistelmiä PcG proteiinien korrelaatio potilaiden hoitotuloksiin on tutkittu useita tutkimusryhmiä. Esimerkiksi, koekspressio EZH2 ja BMI1 raportoitiin liittyvän huonoon ennusteeseen erilaisissa syövissä [37] – [39]. Sen sijaan, yliekspressio EZH2 ja BMI1 on raportoitu olevan erilaisia ​​vaikutuksia potilaiden ennusteeseen rintasyövän [35], ja sen havaittiin olevan ei prognostista arvoa urothelial virtsarakko- [40]. Meidän kolorektaalisyövän tutkimuskohortissa, kaikki yhdistelmät histoni-modifioivia entsyymejä osoitti ennusteen arvioinnissa. Saadakseen lisätietoja epigeneettisellä väyliä mahdollisten ennusteen arvioinnissa kolorektaalisyövässä, suoritimme monimuuttuja selviytymisen analyyseistä yhdistetty ekspressiotietojen useiden PcG proteiineja (EZH2, BMI1 ja SUZ12) ja niihin liittyvät histonimodifikaation H3K27me3. Yhdistämällä kolme PcG-proteiinien ja niihin liittyvien histonimodifikaation johti selvästi parempaan kerrostuminen potilasryhmien verrattuna yksittäisiä merkintöjä. Yhdistetyissä merkkianalyysit, paras elossaololuku ja pisin uusiutumista jaksoja havaittiin potilailla osoittavat suuren ilmaus kaikki neljä merkkiä ( ”kaikki high”) kasvain näytteissä. Potilaat ”kaikkien vähän” ryhmä osoitti huomattavasti lyhyempi OS, DFS ja LRFS verrattuna joko muiden potilasryhmien. Tulokset Yhdistetyn merkkianalyysit korostavat yhteistyötä näiden kolmen entsyymien PcG komplekseja, ja parantaa siten riski kerrostuminen potilaista.

Lisäksi roolit EZH2, BMI1 ja SUZ12 in epigeneettiset sääntelyn kromatiinirakenteen ja geenien ilmentymisen, suora sääntely proteiinin toiminta on kuvattu EZH2 ja BMI1, mukaan lukien proteiini fosforylaatio ja ubikitinaatio. Sytosolin EZH2 ja SUZ12 sisältävien metyylitransferaasi kompleksi on yhdistetty aktiini polymerointi, tärkeä prosessi soluproliferaatioon [41]. Shuttling on EZH2 ja SUZ12 sisältävät monimutkaisia ​​eri soluosastoihin voi selittää heikko sytosolin värjäytyminen havaittiin EZH2 ja SUZ12 lisäksi voimakas tuman värjäytymisen näitä markkereita, verrattuna tiukat tumavärjäystä havaittu BMI1. Toinen ei-histoni proteiinin metyloida EZH2 on sydämen transkriptiotekijä GATA4. Metylointi vähentää sen transkriptioaktiviteettia, ja estää siten asianmukaisen sydämen kehityksen [42]. Nämä esimerkit osoittavat, että poikkeava ilmaisu näiden PcG proteiinien vaikutteet keskeisiä prosesseja, kuten geenin transkription ja soluproliferaatiota edistävät muutosta normaalien solujen kasvainsoluihin.

Yhteenvetona olemme osoittaneet, että yhdistetty ilmentyminen PcG proteiinien EZH2, BMI1 ja SUZ12 ja niihin liittyviä histonimodifikaation H3K27me3 on ennusteen arvioinnissa meidän peräsuolen syövän tutkimuskohortissa. Yhdistetty merkki ilmaisun johtanut parempaan kerrostuminen potilaiden verrattuna yksittäisiä merkintöjä ja siten tarjoaa enemmän käsityksen roolit näiden epigeneettiset proteiinien ja -modifications kolorektaalisyövässä. Muut yhdistelmät epigeneettiset mekanismit olisi tutkittava peräsuolen syövän edelleen purkaa taustalla biologia yksittäisissä kasvaimia. Tämä etenee etsimään uusia biomarkkereita käytettäväksi hoitopaikassa, jotta voidaan paremmin luokitella potilaita hoitoon.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Potilaiden ominaisuudet kaikkia potilasryhmiä käytetään yhdistetyissä-merkkianalyysit. Potilaan ominaisuudet esitetään kaikkien potilaiden ryhmille, jota käytetään yhdistetyssä-markkeri analyysit. Potilasryhmien vertailukelpoiset potilaan ominaisuudet täydellisen tutkimuskohortissa 247 potilasta (taulukko 1). P-arvot edustavat Jonckheeren-Terpstra testiä testata, jos näytteet olivat peräisin samasta jakelusta. Muuttujan ”kasvaimen koon”, yksisuuntainen ANOVA suoritettiin testaamaan tilastollisia eroja potilasryhmissä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0108265.s001

(DOC) B

Kiitokset

Haluamme kiittää CM Janssen josta saimme kudoksen mikrosirulla osissa käytetään immunohistokemiallisesti.