Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Luontainen ja hankittu sisplatiini vastus vähentää tehokkuutta tämän agentin hallinnassa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Ymmärtäminen molekyyli- mekanismeista tämä prosessi voi johtaa uusien aineiden kehitykselle parantaa herkkyyttä sisplatiinin.

Methods

isogeeninen malli sisplatiinin resistenssi syntyi paneelia NSCLC solulinjojen (A549, SKMES-1, MOR, H460). Yli kahdentoista kuukauden ajan, sisplatiini resistenttejä (CisR) solulinjat, jotka ovat peräisin alkuperäisestä, samanikäisiin kantasoluja (PT) ja sen jälkeen, tunnettu siitä. Proliferation (MTT) ja klonogeeniset selviytymisen määritykset (kristalliviolettia) välisenä aikana tehtiin PT ja CisR soluja. Soluvaste sisplatiinin indusoiman apoptoosin ja solusyklin jakautuminen tutkittiin FACS-analyysillä. Paneeli syövän kantasolujen ja pluripotenttien merkkiaineita tutkittiin lisäksi EMT proteiineja, c-Met, ja β-kateniinin. Sisplatiini-DNA adduktin muodostumista, DNA-vaurioita (γH2AX) ja solun platina oton (ICP-MS) arvioitiin myös.

Tulokset

karakterisointi tutkimukset osoittivat vähentynyt proliferatiivista kapasiteettia keuhkojen kasvainsolujen vastauksena sisplatiinia, lisääntynyt vastustuskyky sisplatiinin indusoimaa solukuolemaa, kertyminen resistenttien solujen G0 /G1 vaiheen solusyklin ja parannettu klonogeenisten selviytymisen kyky. Lisäksi resistentit solut näkyvät otaksuttu varsi kaltainen allekirjoitus lisääntynyt ilmentyminen CD133 + /CD44 + solut ja lisääntynyt ALDH aktiivisuus suhteessa niiden vastaavien vanhempien soluja. Kantasolu markkereita, Nanog, Oct-4 ja SOX-2, oli merkittävästi voimistunut kuin oli EMT markkereita, c-Met ja β-kateniinin. Vaikka kestävä alalinjoja osoitti vähentynyt otto sisplatiinin hoitovasteen vähensi sisplatiini-GpG DNA adduktin muodostumista ja laski merkittävästi γH2AX pesäkkeitä havaittiin verrattuna vanhempien solulinjoihin.

Johtopäätös

tulokset tunnistettu sisplatiinia kestävä alapopulaatioista NSCLC solujen oletetun varsi kaltainen allekirjoitusta, joka tarjoaa lisää ymmärrystä matkapuhelinverkon liittyviä tapahtumia sisplatiinin resistenssifenotyyppi keuhkosyövässä.

Citation: Barr MP, Gray SG, Hoffmann AC, Hilger RA , Thomale J, O’Flaherty JD, et ai. (2013) Generation ja karakterisointi sisplatiinia hylkivät ei-pienisoluinen keuhkosyöpä Solulinjat näyttäminen Stem-Like allekirjoitus. PLoS ONE 8 (1): e54193. doi: 10,1371 /journal.pone.0054193

Editor: Pan-Chyr Yang, National Taiwan University Hospital, Taiwan

vastaanotettu: 07 helmikuu 2012; Hyväksytty: 10 joulukuu 2012; Julkaistu: 17 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Barr et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

yli miljoona keuhkosyöpää diagnosoidaan joka vuosi. Tauti on johtava syy syövän liittyvän kuoleman miesten ja naisten [1]. Huolimatta intensiivistä pyrkimyksiä valvoa sairastuvuutta ja kuolleisuutta keuhkosyöpään, yleinen viiden vuoden pysyvyys on edelleen huono.

sisplatiini,

cis

-Diamminedichloro-platina (II), on yksi kaikkein yleisesti käytetty kemoterapeuttisten aineiden syövän hoidossa, erityisesti ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [2]. Sytotoksiset vaikutukset sisplatiinin välittävät sen vuorovaikutusta DNA: n, jolloin muodostuu DNA-adduktien, jotka aktivoivat useita signaalintransduktioreitteihin ja huipentuu aktivointi apoptoosin [3]. Vaikka 20-40% metastasoituneen NSCLC kokemus osittainen vastaus äskettäin kehitetty yhdistelmähoitoja [4], useimmat vaste uusiutumisen kuuden kuukauden kuluessa [5]. Populaatiossa potilaiden että relapsi, valinta ennestään resistenttien solujen ja /tai hankkiminen resistenttien solujen hoidon aikana kemoterapiaa on ehdotettu. Siksi ymmärtää paremmin molekyylitason perustan Sisplatiinin vastus on perusteltua, jotta valaista ja merkkiaineiden taustalla lääkeresistenttiä fenotyyppi, joka tällä hetkellä radikaalisti rajoittaa kliininen hyöty tämän lääkkeen keuhkosyöpäpotilaiden.

Äskettäin syövän kantasolujen (CSC) teoria ehdotettiin selittää kasvaimen heterogeenisuus ja syövän syntymistä [6]. Tämän mallin mukaan, kasvaimet voidaan pitää seurauksena epänormaali organogeneesin ohjaavat CSC: n. Nämä ovat itseuudistuvien kasvainsoluja, jotka kykenevät aloittamaan ja ylläpitämään kasvaimen kasvua alapopulaatioista kasvainsolujen varren tai kantasolujen ominaisuuksia. Käyttämällä

in vitro

järjestelmissä ja

in vivo

malleja ihmisen ensisijainen keuhkosyövän hiirissä, viimeaikainen tutkimus on osoittanut, että keuhkojen kasvainsolut ilmentävät tiettyjä CSC merkkiaineet olivat erittäin kasvaimia, jolla on varsi kaltaiset ominaisuudet ja säästyneet sisplatiinihoidolle [7].

tässä tutkimuksessa olemme luoneet ja ominaista paneeli sisplatiinin resistenttien NSCLC solulinjoja, jotka tarjoavat arvokas väline, jolla voidaan tutkia molekyyli polkuja ja otaksuttu kantasolujen markkereita, jotka voivat liittyä tähän resistenssifenotyyppi keuhkosyövässä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

ihmisen suuret keuhkosyövän solulinjaa, NCI-H460 (jäljempänä kutsutaan H460) ja sen kestävä variantti ystävällisesti lahjoitti tri Dean Fennell, Centre for Cancer Research and Cell Biology, Belfastin yliopisto [8]. Ihmisen adenokarsinoomasolulinja, MOR [9], ja sen vastaava sisplatiini variantin saatiin American Type Culture Collection (ATCC) (LGC Promochem, Teddington, UK). A549 (adenokarsinooma) ja SKMES-1 (squamous karsinooma) solulinjat hankittiin myös ATCC: [10], [11]. MOR ja H460-soluja kasvatettiin Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640) väliaine. A549-soluja viljeltiin Hamin F12-alusta täydennettynä 4 mM L-glutamiinia, kun SKMES-1-soluja viljeltiin EMEM-alusta täydennettynä 2 mM L-glutamiinia ja 1% ei-välttämättömiä aminohappoja (NEAA). Kaikki solulinjat, media oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), penisilliiniä (100 U /ml) ja streptomysiiniä (100 ug /ml) (Lonza, Yhdistynyt kuningaskunta). Kaikki solut kasvatettiin yksikerrosviljelyissä ja pidettiin kosteutetussa ilmakehässä 5% CO

2 ilmassa 37 ° C: ssa.

Drugs

Sisplatiini [

cis

-diammineplatinum (II) dikloridi], saatiin Sigma-Aldrich ja liuotettiin 0,15 M NaCl. Alikvootteja säilytettiin -20 ° C: ssa enintään kolme kuukautta ja sulatettiin välittömästi ennen käyttöä.

induktio Cisplatin-Resistance in NSCLC Solut

Sisplatiini vastustuskykyisten (CisR) variantit kustakin solulinjasta olivat peräisin kunkin alkuperäisen vanhempien (PT) solulinjassa jatkuva altistuminen sisplatiinia (Sigma-Aldrich, UK) seuraavasti alkuperäisen annos-vaste-tutkimuksissa sisplatiinia (0,1 uM-100 uM) yli 72 h, jonka IC

50-arvot saatiin. Aluksi jokainen CisR alalinja käsiteltiin sisplatiinilla (IC

50) 72 tuntia. Väliaine poistettiin ja solujen annettiin toipua vielä 72 tuntia. Tämä kehityksen aikana tehtiin noin 6 kuukautta, minkä ajan jälkeen IC

50 pitoisuudet arvioitava uudelleen kussakin resistenttejä solulinjassa. Sitten soluja pidettiin jatkuvasti läsnä sisplatiinia näiden uusien IC

50 pitoisuuksia vielä 6 kuukautta. Vaikka A549-soluja saivat ensin IC

50 sisplatiinin, solut olivat herkkiä hoidolle tässä pitoisuudessa johtaa solujen vanhenemista ja hidastunut kasvu. Tästä syystä sisplatiinin konsentraatio pienennettiin (IC

25), kunnes solut osoittivat herkkyyttä sisplatiini asianmukaisella IC

50 pitoisuus.

Drug Herkkyys määritys (MTT) B

Solut (2,5 x 10

3) ympättiin 96-kuoppalevyille ja annettiin kiinnittyä yön yli 37 ° C: ssa. Lyhyesti, seuraavat solujen käsittely sisplatiinin 72 tuntia, MTT-reagenssia [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi] lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 4 tuntia 37 ° C: ssa . Dimetyylisulfoksidi (DMSO), lisättiin kuhunkin kuoppaan ja sekoitetaan 5 min orbitaaliravistelijassa. Absorbanssi rekisteröitiin 595 nm ja herkkyys sisplatiinin laskettiin soluproliferaatioon mittaukset 72 h.

Cell Cycle Apoptoosin analysointi

Solut kerättiin trypsinoinnilla, pelletoitiin sentrifugoimalla 1300 rpm: ssa 3 minuutin ajan ja suspendoitiin 1 ml: aan fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS). Solut fiksattiin 90% kylmää etanolia, ja niitä inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 min. Solut pelletoitiin ja suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan PBS: ää, joka sisälsi propidiumjodidilla (25 ug /ml) ja DNaasi-vapaata RNaasi A: ta (100 ug /ml). Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan, solusyklin jakautuminen PT ja CisR-solut analysoitiin FACS: ää käyttäen (Becton Dickinson, UK). Apoptoottisia soluja (SubG0) mitattiin vasteena yhä sisplatiinin välillä PT ja CisR solujen käsittelyn jälkeen 24 tuntia.

klonogeeninen eloonläämismääritys

herkkyys NSCLC-solujen sisplatiini mitattiin käyttäen klonogeenisten määritys, menetelmä valinta, jota käytetään tehokkuuden määrittämiseksi sytotoksisten aineiden kuten kemoterapia [12]. Solujen annettiin kiinnittyä yön yli 37 ° C: ssa ja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla sisplatiinia 9-14 päivää. Pesäkkeet kiinnitettiin ja värjättiin metanolia (25% v /v), joka sisälsi kristalliviolettia (0,05% w /v) 30 minuutin ajan, minkä jälkeen jäljellä oleva värjäys-liuos poistettiin ja levyt pestiin vedellä. Pesäkkeitä, jotka sisälsivät 100 solua tai enemmän laskettiin käyttäen ColCount ™ pesäkelaskuri (Oxford Optronix Ltd, Oxford, Iso-Britannia). Plating tehokkuus (PE) laskettiin kaavalla: PE = määrä pesäkettä /kylvettyjen solujen lukumäärä. Elossa jae (SF) laskettiin käyttämällä kaavaa: SF = määrä pesäkettä /lukumäärä soluja kylvetään x PE). Survival konstruoitiin määrittämiseen selviytymisen kyky sisplatiinin resistenttien solujen suhteessa emosoluihin vastauksena erilaisiin sisplatiinin.

virtaussytometria analyysi Otaksuttavat Cancer Stem Cell tussit

Parent ja sisplatiinia kestävä solut kerättiin trypsination ja pestiin FACS-puskurissa (2% FBS: ää 0,1% natriumatsidia PBS: ssä) ja pelletoitiin sentrifugoimalla 1300 rpm: ssa 3 minuutin ajan. Dual värjäys CD133 ja CD44 (epiteelisolujen markkeri) suoritettiin. -Soluja (1 x 10

6) inkuboitiin joko CD133 /1 (AC133) fykoerytriini (PE) leimattua vasta-ainetta tai isotyyppikontrollivasta-ainetta (lgG1) (Miltenyi Biotec GmbH), tai anti-ihmis-CD44 FITC-konjugoitua vasta-ainetta ja vastaava isotyyppikontrolli (IgG2b) (ImmunoTools GmbH, Saksa) 30 min ajan pimeässä 4 ° C: ssa. Solut pestiin lyhyesti ja suspensoitiin uudelleen FACS-puskuriin myöhempää analysointia varten. Näytteet hankittiin ja analysoitiin FACS: lla. Sivusironnan ja sirontamittari profiileja käytettiin poistamaan roskia ja solujen dupleteiksi. Prosenttiosuus CD133 + ja CD44 + soluja määritettiin PT ja CisR solulinjat virtaussytometrillä.

Aldefluor Pitoisuus

Aldefluor Kit (Stem Cell Technologies, Vancouver, Kanada) käytettiin tunnistamaan solupopulaatioiden kanssa aldehydidehydrogenaasille (ALDH1) aktiivisuus. Määritys suoritettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, solut (1 x 10

6 solua /ml) kerättiin PT ja CisR solulinjoja ja suspendoitiin uudelleen Aldefluor Assay Buffer ja inkuboitiin 60 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Määrän fluoresoivan ALDH-reaktion tuote, joka kertyy soluihin suoraan korreloi ALDH aktiivisuutta näissä soluissa. Aktiivinen ulosvirtaus soluista estyy erityisen muotoiluun Aldefluor Assay Buffer. Kunkin solulinjan (PT ja CisR), kontrolli solut värjättiin käyttäen identtisiä olosuhteita, mutta mukana tietyn ALDH-inhibiittoria, diethylaminobenzaldehyde (DEAB), joka toimii negatiivisena kontrollina kussakin kokeessa. Tällaiset solut tunnistetaan vertaamalla fluoresenssi testinäytteessä kuin kontrollinäytteessä, joka sisältää DEAB. Koska ainoastaan ​​solut, joilla on ehjä solukalvon voi säilyttää Aldefluor reaktiotuote, ainoa käyttökelpoinen ALDH1-positiiviset solut tunnistettiin. Kirkkaasti fluourescent ALDH1-ilmentäviä soluja (ALDH1-positiivinen) havaittiin vihreä fluoresoiva kanava (520-540 nm) syaani

ADP -virtaussytometriä (Dako, Glostrup, Tanska) ja lasketaan prosentteina ALDH1-positiivisten solujen kussakin solulinjassa.

Western blot -analyysi

Yhteensä proteiini uutettiin emo- ja sisplatiinin resistentit solut käyttäen jääkylmää RIPA-puskuria (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% (v /v) Triton-X 100, 0,1% (w /v) SDS) täydennettynä fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (PMSF) ja proteaasiestäjäseostabletit (2 mM AEBSF, 1 mM EDTA, 130 pM bestatiinia, 14 uM E-64, 1 uM Leupepin, 0,3 uM aprotiniini). Proteiini pitoisuudet määritettiin käyttäen bikinkoniini- happoa määrityksessä valmistajan ohjeiden mukaisesti (BCA). Proteiinia (40 ug) kokonaisista solulysaateista fraktioitiin 12% SDS-PAGE-geeleissä ja siirrettiin PVDF-kalvolle (PALL Corporation, FL, USA). Hyötysuhdetta ja lastaus vahvisti reversiibeli värjäys kalvon Ponseau S-liuosta (Sigma-Aldrich, UK) seuraavasti proteiinin siirtoa. Membraanit blokattiin huoneenlämmössä 5% rasvatonta maitoa Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (TBS), joka sisälsi 0,1% Tween-20 (TBS-T), ja seulotaan käyttäen ihmisalkion kantasolujen markkeripaneelin (Abcam plc, Iso-Britannia) . Näihin sisältyvät ensisijainen kaniinin polyklonaalista hiiren vasta-aineita Nanog, Oct-4 ja SOX-2 (1:1000). Proteiinin ilmentyminen c-Met (Millipore) ja β-kateniinin (BD Transduction Laboratories) tutkittiin myös käyttäen hiiren monoklonaalisia vasta-aineita on 1:100 ja 1:2000, vastaavasti. Membraanit pestiin TBST: ssä ja inkuboitiin sekundaarisella piparjuuriperoksidaasi (HRP) -leimattu vasta-ainetta 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa (1:2000). Kalvot pestiin TBST inkuboinnin jälkeen johdetun vasta-aineita. Sitoutunut vasta-aine-kompleksit havaita ja visualisoitiin käyttäen SuperSignal

® West Pico tehostettu kemiluminesenssi substraattia (Pierce, IL, USA). Blotit riisuttu ja uudelleen koetettiin α /β Tubulin vasta-ainetta (Cell Signalling) valvoa lastaus. Densitometri-analyysi suoritettiin käyttäen TINA ™ ohjelmistoa ja prosentuaalinen ilmaisu edustaa suhteessa kontrolleihin (100%).

immunofluoresenssimikroskoopilla ja mittaus Cisplatin-DNA Adducts

Solut (PT ja CisR) käsiteltiin sisplatiinin (IC

50) 0, 4, 12 ja 24 tuntia, minkä jälkeen ne on kerätty trypsinaation ja pestiin kahdesti PBS: ssä. Solut (1 x 10

6 solua /ml) suspendoitiin uudelleen PBS: ään ja täplikäs (10 ui), kolmena kappaleena, päälle Superfrost Gold Kalvot (ThermoFisher). Dioja annettiin kuivua nopeasti huoneenlämpötilassa. Immunofluoresenssivärjäyksen ja mittauksen spesifisten DNA-platination tuotteiden suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [13], vähäisin muutoksin. Lyhyesti, solut kiinnitettiin yön yli jääkylmällä metanolilla ja proteolyyttisesti pilkkomalla 60 ug /ml pepsiiniä ja 40 ug /ml proteinaasi K (100 ui per paikka 10 min 37 ° C: ssa kostutetussa kammiossa). Kun salpaus ei-spesifisiä sitoutumiskohtia 5% (w /v) rasvatonta maitojauhetta PBS: ssä, kalvot inkuboitiin rotan ensisijainen vasta-aine, joka tunnistaa spesifisesti CDDP-GpG DNA adduktit (RC-18) 37 ° C: ssa 2 h tai 4 ° C: ssa yön. Ensisijainen vasta-aineen sitoutuminen havaittiin käyttämällä anti-rotta-Cy3®-leimattua vasta-ainetta (Dianova, Hampuri). Sitten aluslaseja inkuboitiin 1 ug /ml (paino /tilavuus), DAPI PBS: ssä 30 minuutin ajan RT: ssä ydin- counterstaining. Kuvat hankittiin Axioplan fluoresenssimikroskooppia (Carl Zeiss GmbH, Göttingen, Saksa), joka on kytketty C4880 CCD-kamera (Hamamatsu Photonics, Herrsching, Saksa). Kvantifiointiin CDDP-GpG DNA adduktit immunofluoresenssimikroskopialla, fluoresenssisignaalien mitattiin kvantitatiivisen digitaalinen kuva-analyysi käyttäen ACAS- 6,0 CytometryAnalysis System (ACAS II, Ahrens Electronics, Bargterheide, Saksa). Tasot adduktien kussakin näytteessä laskettiin mielivaltaisesti fluoresenssin yksiköissä (AFU: n), yhteydessä normalisointi integroitu vasta-aineesta peräisin fluoresenssin 200 yksittäistä ytimet /näyte vastaaviin DNA-pitoisuutta. Tiedot esitetään keskiarvona AFU ± 95%: n luottamusväli (CI) kolmesta itsenäisestä kokeesta.

γH2AX Foci muodostumisen määritys

Solut (5 x 10

3) ympättiin, vuonna kolmena kappaleena 96-kuoppaisille levyille ja annettiin kiinnittyä yön yli. Parent ja resistenttejä soluja käsiteltiin sisplatiinin kanssa 0, 4, 8, 12 ja 24 h. Kussakin aikapisteessä, soluviljelyalustoissa poistettiin kustakin kuopasta ja kiinnitettiin 10 minuutin ajan 100 ul: ssa formaldehydiä (4% tilavuus /tilavuus PBS: ssä). Sitten solut pestiin kahdesti PBS: ssä. Estopuskuria (5% vuohen seerumia, 3% Triton X-100 PBS: ssä) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Tämän jälkeen soluja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa primaarisen kanin anti-ihmis-anti-fosfo-histoni 2AX (Ser139) vasta-aine (1:100) (Cell Signalling Technology) vasta-laimennuspuskuriin (1% BSA.0.3% Triton X- 100 PBS: ssä). Poistamisen jälkeen primaarisen vasta-aineen, solut pestiin kolme kertaa PBS: ssä ja inkuboitiin Alexafluor 488-leimattua vuohen anti-kani sekundääristä vasta-ainetta (Invitrogen) (1:2000) 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa pimeässä. Toissijainen vasta-aine poistettiin ja solut pestiin kolme kertaa PBS: ssä. Sitten soluja inkuboitiin Hoechst 33342 tumaväriä (3 ug /ml) 30 min ajan 37 ° C: ssa, jota seurasi kolme pestiin PBS: ssä. Solut värjäystä fosforyloidun histoni 2AX (havaitaan vihreä fluoresoivia) on kuvantaa immunofluroescence käyttämällä korkean sisällön analyysi (GE Healthcare). Kymmenen näkökentät kuoppaa kohti hankittiin käyttäen 20X tavoite. Tumavärjäystä havaittiin käyttäen viritys suodattimen 360 nm ja emissiosuodatin 460 nm, kun taas Alexafluor 488 havaittiin 480 nm: ssä ja 535 nm, vastaavasti. Tarkoittaa ydin- fluoresenssi-intensiteetti käytettiin mittana γH2AX käyttäen InCell analysaattorin 1000 kuva-analyysi-ohjelmisto.

kvantifiointi Cellular Cisplatin oton ICP-MS

Sisplatiinin oton tutkimuksia varten solut (1 x 10

7 solua /ml) siirrostettiin viljelypulloihin ja annettiin kiinnittyä yön yli. Sitten soluja käsiteltiin sisplatiinin kanssa 24 h. Käsittelyn jälkeen solut pestiin PBS: ssä, otettiin talteen ja laskettiin. Huumeiden oton analyysiä varten solut (1 x 10

6) suspendoitiin 1% HNO

3: ssa 24 tunnin ajan 70 ° C: ssa. Hajotetut solut analysoitiin induktiivisesti kytketty plasma massaspektrometria (ICP-MS). ICP-MS antaa kvantitatiivisen analyysin pitoisuuden elementin vesiliuoksessa ja on herkkyys 5 PPT tai parempi Platinum tuotteita. Analyytin konsentraatio on verrannollinen ionien erityinen osa, joka saavuttaa massaspektrometrin välillä höyrystynyt liuos 6000 ° C: ssa. Yksi ICP-MS mittaus edustaa keskimäärin 20 skannausta per rinnakkaisnäytettä viiden rinnakkaista samasta nestenäyte, jossa on hyvin pieni virhe ( 5%). Sisplatiini pitoisuudet raportoitu otettiin keskiarvo neljässä sarjassa kulttuurien, varmistaa, että arvot oikein skaalataan osuus solupopulaatio eroja ja laimennoksia.

Standard dikäyrät käyttämällä vesipitoista sarjalaimennoksia kantaliuoksia jäljitettävissä takaisin normaaliasentoon vertailuaineisto (SRM) NIST (National Institute of Standards and Technology). Variaatiokertoimet olivat 1-4% (määrityksen sisäinen) ja 5-10% (inter-määritys).

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen vertailu ryhmien välillä suoritettiin käyttäen analyysiä varianssianalyysillä (ANOVA). Jos kahdella aineistoja verrattiin, merkittävyys määritettiin kaksisuuntaista Opiskelijat

t-

testi. Erot katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä, jos p≤0.05. Tiedot on esitetty graafisesti keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM). Kaikki tiedot analysoitiin käyttämällä GraphPad InStat ™ (versio 3) tilastollisia ohjelmistoja.

Tulokset

Generation IC

50 pitoisuudet ja kehittäminen NSCLC solujen kanssa Cisplatin kestävä Fenotyyppikuvaus

sen määrittämiseksi, IC

50-arvot, joiden hoitoon vanhempien solulinjojen sukupolven sisplatiinin resistenttien solulinjojen soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla sisplatiinin alueella 0,1 100 um. H460 CisR solulinja aiemmin luotu ja ylläpidetään 5 uM sisplatiinia. Herkkyys kaikkien alkuperäisten (PT) solulinja lisäämään annoksia sisplatiinia osoitettiin, jossa sisplatiinia merkitsevästi (p 0,001) estivät leviämisen A549, SKMES-1 ja MOR soluja 10pM-100gM yli 72 h (Fig. 1A ). Annos-vaste-käyrät muodostettiin ja IC

50 pitoisuudet laskettiin kaikissa solulinjoissa (Fig. 1 B). Sisplatiini pitoisuudet (IC

50) vaihtelivat kaikkien neljän solulinjojen (

A549

5,95 uM,

SKMES-1

2,65 uM,

MOR

3,3 uM,

H460

5,0 uM) ja myöhemmin käyttää hoitamaan kutakin emosolulinjan luodakseen vastaavan iän ja passage-Hyväksytty sisplatiini resistenttejä solulinjoja. Kun kyseessä on H460-solujen, ylläpito resistenttien alalinjan jatkettiin 5 uM. Hoito A549-soluja sisplatiinin (IC

50) johti merkittävään kasvun viivästyminen, hidas elpyminen aikoja. Soluja näin ollen käsiteltiin IC

25 pitoisuuksien useita viikkoja ennen valintaa sisplatiinin resistentti alalinja on IC

50 pitoisuus.

(A) NSCLC-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla sisplatiinin ( 0,1 uM-100 uM) 72 tuntia. Solujen eloonjääminen mitattiin käyttäen MTT-määritystä. Sisplatiini vähensi leviämisen A549, SKMES-1 ja MOR NSCLC soluja. (B) Annos-vaste-käyrät muodostettiin, joista IC

50-arvot päätellä. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta (n = 3) (* p 0,001 vs käsittelemätön).

Sisplatiini resistenttejä alalinjoja käsiteltiin sisplatiinin kanssa 72 tuntia, minkä jälkeen elatusaine poistettiin ja solujen annettiin toipua ja uudelleen kansoittavat. Tänä aikana solujen selviytymistä /lisääntymiseen arvioitiin välillä PT ja CisR solujen 4 viikon välein muutosten määrittämiseksi herkkyys sisplatiinia. 6 kuukauden, IC

50-arvot arvioitiin uudelleen ja päätellä annos-vaste käyrät välillä PT ja CisR soluja. Merkittävä kertainen nousu havaittiin pitoisuuden sisplatiinin, joka tarvitaan inhiboimaan solujen 50%: lla sisplatiinin resistenttien solujen suhteessa niiden vastaaviin kantasoluja (Fig. 2). Tämän jälkeen soluja pidettiin sisplatiini näissä pitoisuuksissa vielä 6 kuukautta. A549-soluja, IC

50 konsentraatio sisplatiinin resistenttien solujen määritettiin 23,60 uM verrattuna 1,58 uM alkuperäinen emosolulinjan, 15-kertainen pitoisuus sisplatiinin joka tarvitaan 50% inhibition solujen kasvu. Merkittävä lisäys IC

50 pitoisuuksia havaittiin myös SKMES-1-soluissa (16,0 uM vs. 4,09 uM), MOR soluja (31.98 uM vs 6,39 uM) ja H460-solut (30,40 uM vs 5,72 uM), mikä osoittaa 4- kertainen (SKMES-1) ja 5-kertainen (MOR, H460) lisäys välillä CisR ja PT solulinjoissa. Yhdessä nämä lähtötiedot osoittivat sisplatiinin kestävä fenotyyppi neljässä NSCLC solulinjoissa seuraavien jatkuva

in vitro

saaneet sisplatiinia.

Huollon sisplatiinin käsitellään alilinjat viljelmässä 6 kuukautta sisplatiinin , IC

50 pitoisuudet arvioitava uudelleen jokaisen solulinjan avulla annos-vaste käyrät syntyvät GraphPad Prism-ohjelmiston. Merkittävä lisäys IC

50 konsentraatio määritettiin kullekin sisplatiinin kestävä solulinjaa suhteessa, että vastaavan samanikäisiin emosolulinjassa.

Kun luonnehdinta solujen viikon 52 altistuksen jälkeen soluja sisplatiinin, joka on merkittävä ero leviämisen kapasiteetin välillä PT solulinjoja ja niiden vastaavat sisplatiini resistenttejä alalinjoja havaittiin (Fig. 3), joka osoittaa syntyminen resistenttien fenotyyppi resistenttejä alalinjoja suhteessa emosolulinjoista. Vaikka A549 ja H460-solut osoittivat merkittäviä eroja niiden proliferatiivinen kyky emo ja vastaavien CisR solujen pitoisuuksina niinkin alhainen kuin 0,1 uM (

A549

, 65,56 ± 0,73 vs. 102,50 ± 0,87;

H460

, 87.66 ± 0,67 vs. 114,06 ± 1,57, p 0,001) 100 uM (

A549

, 16,56 ± 0,29 vs. 41,44 ± 0,94, p 0,001;

H460

, 20.89 ± 1,22 vs. 34,32 ± 1,17, p 0,01), merkittävä ero havaittiin myös vanhemman ja CisR SKMES-1 ja MOR-solujen sisplatiinin välillä 10 uM (

SKMES-1

, 54,38 ± 1,56 vs. 79,00 ± 2,25;

MOR

64,33 ± 2,33 vs. 76,87 ± 2,77, p 0,01) ja 100 uM SKMES-1 ja MOR soluja, tässä järjestyksessä (

SKMES-1

, 32,79 ± 1,55 vs. 59,33 ± 5,20, p 0,01;

MOR

, 34,33 ± 2,50 vs. 45,33 ± 2,33, p 0,05).

Parent (PT) ja sisplatiinin resistenttejä (CisR) solulinjoja käsiteltiin kasvavilla sisplatiinin 72 tuntia. Proliferaatio mitattiin käyttäen MTT-määritystä. Vaikka sisplatiini inhiboi kasvua sekä PT ja CisR solulinjat, inhiboiva vaikutus sisplatiinin väheni suuresti CisR soluissa suhteessa kanta-soluihin. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta (n = 3) (* p 0,001 vs PT hoitamatta,

$$ p 0,001 vs CisR hoitamatta,

# p 0,001 PT vs CisR,

$ p 0,01 vs CisR käsittelemätöntä [A549],

$ p 0,01 PT vs CisR,

# $ p 0,05 PT vs CisR [MOR]).

sisplatiiniannoksen indusoiman apoptoosin on merkittävästi kumottiin resistenttien solujen Suhteessa niiden Parent Counterparts

tasot sisplatiinin indusoiman apoptoosin, määritettynä käyttäen SubG0 (apoptoottisten) solujen fraktio, arvioitiin PT ja vastaavat CisR solulinjat käsittelyn jälkeen solut kasvavia annoksia sisplatiinia. Vaikka oli merkittävä kasvu keuhkotuumorisolulinjoissa apoptoosia PT solujen vasteena sisplatiinin pitoisuuksina 10 uM ja 100 uM, sisplatiinin indusoiman apoptoosin CisR solujen väheni huomattavasti kaikissa solulinjoissa (Fig. 4), ja erityisesti A549 , SKMES-1 ja H460-soluissa. A549 ja SKMES-1-solut, merkittävä solukuolemaa havaittiin vain korkeammilla pitoisuuksilla välillä 40 pM (

A549

, p 0,01;

SKMES-1

, p 0,01) ja 100 uM (p 0,001). Lisää merkittävästi kuitenkin, H460 CisR soluilla suurempi resistenssi sisplatiinin aiheuttama kuolema suuremmilla sisplatiinin verrattuna muihin solulinjoja, joissa merkittävä apoptoosin induktio havaittiin vasteena sisplatiinin pitoisuuksina niinkin suuri kuin 80 uM (p 0,01) ja 100 uM (p 0,001). Kaikissa keuhkosyövän solulinjat, merkittävä ero soluvasteen sisplatiinin indusoimaa apoptoottista solukuolemaa ei havaittu CisR ja PT-soluja. Merkittäviä eroja tasojen apoptoosin välillä H460- PT ja CisR soluja nähtiin vastauksena sisplatiinin lainkaan pitoisuuksina 10 100 um, mikä korostaa suuremman sisplatiinin kestävä fenotyyppi tässä CisR solulinjassa.

Parent ja resistenttejä solulinjoja sisplatiinia 72 tuntia. Apoptoottisia soluja, mitattuna prosentteina solujen SubG0 vaiheen solusyklin, mitattiin. Tasot indusoiman apoptoosin sisplatiinin lisättiin merkittävästi kantasoluja, kun taas sisplatiini indusoiman apoptoosin väheni merkittävästi vastaavaan resistenttejä solulinjassa. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta (n = 3) (* p 0,01 vs PT hoitamatta, ** p 0,001 vs PT hoitamatta,

$$ p 0,001 vs CisR hoitamatta,

$ p 0,01 vs CisR käsittelemätöntä [A549, H460],

$ p 0,05 vs CisR käsittelemätöntä [MOR],

$ p 0,05 PT vs CisR,

# p 0,001 PT vs CisR, *

$ p 0,05 vs PT hoitamatta).

sisplatiini Kestää NSCLC solut kerääntyvät G0 /G1 of Cell Cycle

pohjapinta tasoilla, ja vastauksena yhä sisplatiinin , lisääntynyt kertyminen solujen G0 /G1 vaihe havaittiin kaikissa CisR solulinjoissa suhteessa niiden vanhempien solulinjoja (Fig. 5A). Edustaja histogrammit on esitetty SKMES-1 PT ja CisR solujen kasvaessa, sisplatiinin (kuvio. 5B). Sisplatiinin resistenttejä solulinjoja, sisplatiini indusoi merkittävää kerääntymistä solujen G0 /G1 vaiheessa, suhteessa PT-soluja käsiteltiin samoina pitoisuuksina. Tällaiset havainnot olivat samanaikainen lasku S-vaiheen solusyklin. Pohjapinta jakeet solujen välillä G0 /G1, S ja G2 /M-vaiheisiin solusyklin tutkittiin myös välillä PT ja CisR solulinjat. Merkittävä kasvu G0 /G1 jae löytyi SKMES-1 CisR (61,60 ± 2,734, p 0,05) ja MOR CisR (60,20 ± 0,872, p 0,05) soluja suhteessa vanhempiensa kollegansa (47,01 ± 1,549, 42,44 ± 1,351, p 0,05). A549 ja H460 sisplatiini-resistentit solut, suuremman merkityksen nähtiin G0 /G1 murto suhteessa vanhempiensa kollegansa (

A549

, 85,19 ± 1,763 vs. 52,83 ± 2,234,

H460

, 69.12 ± 1,987 vs 39,61 ± 2,00, p 0,001). At-tasojen, osa solujen S ja G2 /M-vaihetta ei muuttunut merkittävästi välillä PT ja CisR solulinjat. Nämä muutokset solusyklin jakelu voi olla tärkeä rooli sisplatiinin kestävä fenotyyppiä NSCLC solulinjojen syntyy.

Parent ja sisplatiinia resistenttejä NSCLC-soluja käsiteltiin sisplatiinin 24 tuntia. Solusyklin jakautuminen PT ja CisR solut tutkittiin propidiumjodidivärjäys ja mitattiin FACS (A). Merkittävä kertymistä CisR solujen havaittiin G0 /G1 vaiheen solusyklin koko paneelin solulinjoissa. Edustaja histogrammien solusyklin jakautuminen SKMES-1 CisR solujen ja PT vastaavien kasvaessa, sisplatiinin on esitetty (B). Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta (n = 3) (

# p 0,001,

* p 0,05).

solunsalpaajaresistentti NSCLC Solut osoittaa Enhanced klonogeeninen Survival kyky

selviytyminen kyky PT ja CisR NSCLC-solujen sisplatiinikäsittelyn jälkeen arvioitiin käyttäen klonogeeniset -eloonjäämiskoe. Kaikki solulinjat osoittivat säätövastusele- välillä PT ja CisR soluja. Useimmissa solulinjoissa tutkittiin, oli merkittävästi suurempi osa elossa pesäkkeitä A549, SKMES-1 ja H460 CisR solujen suhteessa kanta-solujen 1 uM ja 10 uM sisplatiinin (Fig. 6).