Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA säädellä useita näkökohtia tumorigeneesin ja syövän etenemistä. Useimmat syöpäkudokset arkistoidaan formaliinilla kiinnitetyt ja parafinoidut (FFPE). Vaikka MikroRNA ovat vakaampaan muotoon RNA ajatellaan kestämään FFPE-käsittely ja hajoaminen on vain vähän näyttöä jälkimmäisen oletuksen. Tutkimme, onko microRNA profilointia voidaan menestyksekkäästi suoritetaan FFPE syöpä kudoksiin käyttämällä kiinteän ligaatio perustuva sekvensointi. Tissue säilytysaika (2-9 vuotta) ilmestyi ei vaikuta havaittujen MikroRNA vuonna FFPE näytteissä verrattuna Hyväksytty jäädytettyjä näytteitä (pariksi t-testi p 0,7). Korrelaatiot mikroRNA ilmaisun arvot olivat erittäin korkeita kaikkialla MikroRNA tietyssä näytteessä (Pearsonin r = 0,71-0,95). Korkeampi varianssi ilmaisun arvojen joukossa näytteitä liittyi korkeampi korrelaatiokertoimet välillä FFPE ja jäädytetyn kudoksia. Yksi FFPE näytteet tässä tutkimuksessa hajonnut tuntemattomista syistä, joiden huippu lukea pituus 17 nukleotidia verrattuna 21 kaikissa muissa näytteissä. Havaittujen MikroRNA tässä näytteessä oli alueella MikroRNA havaittiin kaikissa muissa näytteissä. Ligaatio-pohjainen microRNA syvään sekvensoinnilla FFPE syöpä kudoksiin on mahdollista ja RNA: n hajoamisen asteeseen havaittu tutkimuksessamme näyttää ei vaikuta määrää MikroRNA jotka voidaan esittää määrällisesti.

Citation: Meng W, McElroy JP, Volinia S, Palatini J, Warner S, Ayers LW, et al. (2013) vertailu MicroRNA Deep sekvensointi osuvan Formaliinifiksoidusta parafinoidut ja tuore Cancer kudokset. PLoS ONE 8 (5): e64393. doi: 10,1371 /journal.pone.0064393

Toimittaja: Soheil S. Dadras, University of Connecticut Health Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 tammikuu 2013; Hyväksytty: 13 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 16, 2013

Copyright: © 2013 Meng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat rahoitus osastolta Radiation Oncology ja Kattava Cancer Center, ja, jonka Biostatistics Core ja Microarray jaetun resurssin The Ohio State University. Työtä tukivat Award Number Grant 8UL1TR000090-05 National Center For edistäminen Translational Sciences. Sisältö on ainoastaan ​​vastuulla kirjoittajien ja ei välttämättä edusta näkemyksiä National Center For edistäminen Translational Sciences tai National Institutes of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA ovat ei-koodaavaa pieni RNA: t, joiden pituus on 22-26 nukleotidin (nt). MikroRNA johtaa hajoamiseen täydentävien lähetti-RNA monille lajeille. MikroRNA on tärkeä rooli solujen kehitystä, solukuoleman, solujen lisääntymistä [1], apoptoosin [2] ja angiogeneesin [3]. Edelläkävijä helmi-pohjainen virtaussytometristen microRNA ilmaisun profilointi menetelmä paljasti, että microRNA profiilit heijastavat kehitys- linjaa ja erilaistumista kasvaimissa [4]. Normaalit kudokset ja syövän kudokset osoitettu olevan erottuva ekspressioprofiileja ja microRNA profiilit voidaan kuvata microRNA perustuvaa reittejä kiinteissä kasvaimissa [5].

Nykyinen menetelmät microRNA kvantifiointiin ovat: reaaliaikainen käänteistranskriptio-PCR [ ,,,0],6], [7], mikrosiru [8], Nanostring, ja seuraavan sukupolven sekvensointi [9] – [11]. Erityisesti äskettäin kehitetty seuraavan sukupolven sekvensoinnin avulla on mahdollista löytää uusia MikroRNA ja muita pieniä RNA: iden. Useimmat kudokset käsitellään terveydenhuollossa menossa formaliini-kiinnitys ja parafiini-embedding (FFPE). Useimmat kliiniset analyysit suoritettiin patologian laboratorioissa on optimoitu FFPE kudoksia. FFPE kudokset ovat tyypillisesti säilytetään huoneenlämpötilassa. Formaliini säilyttää kudosnäytteiden luomalla ristisilloitukseen välillä, DNA ja RNA. DNA uutetaan FFPE kudos on osoitettu olevan käyttökelpoisia kopioluvun analyysi ja mutaation analyysi ainakin yhdellä alustalla tietyissä ympäristöissä [12]. Kuitenkin kemiallinen modifiointi välillä makromolekyylien ja RNA: t aiheuttama formaliinilla kiinnitys voi nopeuttaa RNA: n hajoamisen [13] [14]. Vakaus MikroRNA on yleensä paljon vakaampi kuin lähetti-RNA: [15]. Seuraavan sukupolven sekvensointi perustuu microRNA ilmentymisanalyysiä on kehitetty useilla alustoilla, kuten Roche /454 alusta, Illumina n Genome Analyzer ja ABI: n vankan pohjan [16] [17], ja erilaisia ​​kaupallisia protokollat ​​miRNA kirjaston valmistelu on kehitetty kolme yritystä [ ,,,0],18]. Tällä hetkellä vain vähän näyttöä siitä, että microRNA sekvensointi tulokset ovat luotettavia ja päteviä. Ma et ai. osoitti toteutettavuus miRNA profilointi perustuu Sanger sekvensointia 10-vuotiaan arkistoidut kudoksen [19]. Tietääksemme on vain kaksi vertaisarviointiin perustuvat tutkimukset julkaistaan, joissa verrattiin microRNA sekvensointi tuloksiin sovitetun jäädytettyjen ja FFPE yksilöitä käyttämällä Illumina platform [9], [20]. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää, FFPE näytteitä voidaan menestyksellisesti ominaista syvä miRNA sekvensoinnilla. Tätä varten analysoimme Hyväksytty jäädytetty ja FFPE kudosten erilaisten histologialtaan joille yksityiskohtainen käsittely ja varastointi oli saatavilla.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Ihmisen pahanlaatuiset kudosnäytteiden hankitaan jaksolla 2003-2009 saatiin Cooperative Human Tissue Network (CHTN /NCI), keskilännen Division, jonka rahoittaa National Cancer Institute, perustuu sisäiseen Review board (IRB) hyväksytyn tutkimussuunnitelman (Ohio State University ihmiseen kohdistuvan Protocol – 2011E0377). Muita Tutkijat ehkä saanut näytteitä samoista aiheista.

Tissue yksilöitä

Kahdeksan pariksi ihmisen pahanlaatuinen kudosnäytteitä saatiin. Remnant kirurginen kudokset otettiin jälkeen diagnostisia näytteitä turvattu potilailta (viisi urosta ja neljä narttua; mediaani-ikä 58 vuotta, vaihteluväli 39-78 vuotta) ja rinta- invasiivisia duktaalikarsinooma (2), munuaisten kirkas cell carcinoma (2), keuhkon adenokarsinooma ( 1), eturauhasen adenokarsinooma (1), metastaattinen melanooma (1), ja sarkooma reiden (1). Kirurginen näytteet kuljetettiin leikkaussalien kudosten hankintaan, tutkitaan patologi valvonnassa ja säilynyt sisällä 5-57 kirjattu minuuttia. Parilliset kudosnäytteitä valittiin tutkimukseen oli joko välittömästi jäädytettiin nestemäisessä typessä ja sijoitettiin -80 ° C pakastimeen valvottuun varastointiin tai kiinnitettiin 10% puskuroituun formaliiniin jopa 24 tuntia ja sitten jalostetaan parafiiniin lohko ja säilyttää huoneen lämpötila. Kun tutkimus näytteitä saatiin CHTN, koodatut näytteet mukana on koodattu lopullisen patologian raportti ja laadun arviointiraportti tarkistaa kokoelma kasvainkudoksen. Yksilöt ovat tarkastelleet patologi ja 4 tapauksia oli 100% kasvain, 3 tapausta 90-95% ja 1 tapauksessa 50-60% kasvain, ja Hyväksytty FFPE ja jäädytetyt näytteet olivat yleensä vertailukelpoisia kasvaimen sisällön ja koon. Viittaavia tekijöitä tapauksista käytetään microRNA sekvensointi ja ilmentyminen analysointi on lueteltu taulukossa 1.

RNA: n eristäminen, kvantitointi ja laadun arviointi

RNA FFPE näytteet uutettiin käyttäen Palauta kaikki yhteensä Nucleic Acid Isolation Kit (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA). Lyhyesti, 5-10 mg: n näytteet leikattiin parafiini lohkot ja deparaffinizated jonka ksyleeniin 50 ° C: ssa, jota seurasi 100% etanolilla pesten. Ilmakuivaa kudosnäytteet digestoitiin proteinaasi K: lla 24 tuntia mikroputkessa ravistamalla inkubaattorissa 50 ° C: ssa. Sulanut Näytteet sekoitettiin sopivaan määrään eristäminen lisäaineen ja 100% etanolia. Sen jälkeen antamalla seoksen kulkea läpi suodattimen patruunan, DNA ja RNA pysyy suodattimen pinnalla. DNA poistettiin paikan suodattimen DNaasi ruoansulatusta. RNA puhdistettiin pesemällä puskurilla ja eluoitiin nukleaasitonta vettä.

microRNA näytteitä tuore näytteet uuttamalla PureLink ™ miRNA Isolation Kit (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA). Lyhyesti, 5 mg tuore kudosnäytteitä sekoitettiin 300 ul Binding Buffer (L3) ja homogenoidaan käyttäen kudoshomogenisaattorissa. Homogenoitu Näytteet sentrifugoitiin, ja supernatantti sekoitettiin 300 ui 70% etanolia. Sisältävä liuos RNA puhdistettiin kaksi pyöreää spin sarakkeita uudelleenjärjestäminen. RNA eluoitiin 50-100 ul: aan steriiliä RNaasi-vapaaseen veteen.

MicroRNA sekvensointi

Pieni RNA: iden FFPE ja tuore näytteet valmistettiin kiinteän sekvensointi seuraavasti: kokonais-RNA-näytteet olivat käsittelemät flashPAGE jakotislauslaitteen (Ambion) ja flashPAGE Clean-Up Kit (Ambion). Rikastetun pieniä RNA käsiteltiin sitten mukaisesti kiinteillä pienillä RNA Expression Kit-protokollaa (Applied Biosystems). Puhdistettu pieniä RNA: t ligoitiin 5 ’ja 3’ adapteri sekoitus käyttäen RNA-ligaasia. Ligoidut tuotteet (40-60 emästä pitkiä) on käänteistranskriptio ja puhdistettiin Novex 10% TBE-Urea geeli. Sen jälkeen, 15-18 sykliä PCR suoritettiin monistamalla puhdistettu cDNA viivakoodilla PCR sarjojen pakkauksessa, joka poikkesi ainutlaatuinen 6-nukleotidisekvenssi. Monistetut tuotteet ladattiin Novex 6% TBE-geelin (Invitrogen) ja geeli bändejä, jotka sisältävät 110-130 emäsparin fragmentteja. Vahvistetut tuotteet purfied peräisin leikatusta geelivyöhykkeestä, monistettiin emulsio PCR, lastattiin Applied Biosystems Solid 4 seuraavan sukupolven suurikapasiteettisten sekvensointijärjestelmällä tietojen hankinnan. Laatu näytteitä ja kirjastot tarkastettiin Agilent Bioanalyzer [21], [22]. Raaka kiinteä aine sekvensointi tietoja ladataan NCBI Gene Expression Omnibus ja pääsee läpi GEO Sarjan hakunumerolla GSE45740 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE45740).

RT-qPCR varten microRNA validointi

RNA tuore ja FFPE kudoksia todensi reaaliaikaisen (RT) kvantitatiivinen PCR. microRNA ilmentyminen normalisoitiin pieni ydin- RNA U6 käyttäen TaqMan MicroRNA Assay sarjat (Applied Biosystems, Darmstadt, Saksa). 30 ng RNA: ta oli käsitelty TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Darmstadt, Saksa). Lyhyesti, 5 ui RNA sekoitettiin 1 mmol /l kutakin deoksiribonukleotiditrifosfaattia, 50 yksikköä Multiscribe käänteiskopioijaentsyymi-, 5 x reaktio puskurit, 4 yksikköä RNaasi-inhibiittoria, ja 5 x geenispesifisestä RT alukkeiden yhdistelmä lopullisessa reaktiotilavuudessa 15 ui. Reaktioita inkuboitiin sitten 16 ° C: ssa 30 minuutin ajan, 42 ° C: ssa 30 minuutin ajan, 85 ° C: ssa 15 minuutin ajan ja sen lopullinen pitää 4 ° C: ssa. Sen jälkeen 15 ui cDNA liuos laimennettiin nukleaasitonta vettä lopulliseen tilavuuteen 100 ui. Kvantitatiivinen PCR ajettiin 7900 HT PCR koneen denaturaatiovaiheen 95 ° C: ssa 10 minuuttia, minkä jälkeen 40 sykliä denaturaatiovaiheen 95 ° C: ssa 15 sekunnin ajan, ja hehkutus /pidennysvaiheen 60 ° C: ssa 60 sekuntia . Kertainen muutos microRNA kudosnäytteistä laskettiin sitten käyttäen yhtälöä 2-ACt testi /2-ACt-ohjaus.

Data-analyysi

kytkijäsekvenssit pieniä RNA-kirjastojen poistettiin käyttäen cutadapt ohjelmistoa ( https://code.google.com/p/cutadapt/) alle oletusparametrit. Pituus jakauma mikroRNA muodostettiin kuvaaja lukee lasketaan mukaan 0-30 nukleotidin pituisia. Pieni RNA Analysis Pipeline Tool Applied Biosystems käytettiin seuraavia parametreja sisältävän vain riittävän laadukkaita lukee tutkimuksessamme: 1) Vähäinen keskimääräinen luku- alarajan oli 20 (QV arvo lasketaan käyttämällä Phred kuten pisteet q = -10 × log10 (p), missä q on laatu arvo ja (p) on ennustettu todennäköisyydellä väri puhelu on väärä.), 2) on tiukat annoimme vain 1 epäsuhta lukee ja miRBase versio 16 osumia jokaisen lasketaan seuraavasti 3 ) minimaalinen pituus linjassa lukee täytyi olla 17 emästä. Tiedot normalisoitiin niin lukee miljoonasosaa (RPM). Sekvenssit ilme arvo on alle 5 RPM katsottiin ei havaittu korrelaatiota jäädytetyn ja FFPE analyysin osa.

Tulokset

Effects of FFPE näytteen hajoaminen: microRNA lukea pituus jakelu

formaliini kiinnitys ja pitkät säilytysajat ovat tiedetään aiheuttavan RNA: n hajoamisen [23]. Tämä hajoaminen johtaa keskimäärin lyhyempiä RNA pituus [24]. Kartoittamaan mahdollisia hajoamisen vaikutukset MikroRNA, analysoimme luetun pituuden jakautuminen Hyväksytty tuore ja FFPE syöpä kudosnäytteistä. Kun 3 ’adapteri sekvenssit kustakin lukea karsittiin, sekvenssi lukee pituus jakelu tutkittiin (kuvio 1). Lue pituudet havaittiin keskitetään 21 nt jäädytetyn näytteet ja kaikki paitsi yksi FFPE näytteitä. Oli yksi FFPE näyte, jonka huippu microRNA pituus löydettiin 17 nt, joka osoittaa merkittävää hajoamista. Sitten tutki huolellisesti pieniä RNA luokitus profiilit ja korrelaatio mikroRNA ilmaisun arvojen tuore ja FFPE näytteitä. Olemme havainneet, että on olemassa tai olemattomaan vaikutuksia niihin analyyseihin. Säilytysajat tai valmistusmenetelmät eivät eroa tämän huonontuneen FFPE näyte ja toinen analysoidut näytteet tässä tutkimuksessa. Myös osa pienistä RNA: iden 20-22 nt alue oli pienempi useita tapauksia FFPE verrattuna Hyväksytty jäädytetty yksilöt (yksi munuaissyövän tapauksessa keuhkoadenokarsinooma tapauksessa ja eturauhassyövän tapaus). Tämä on myös todennäköisesti johtuu hajoaminen FFPE näytteissä, vaikkakin pienet vaihtelut aikana kirjaston valmistelu voisi osittain myötävaikuttaa havaittu eroja.

Effects of FFPE näytteen hajoaminen: varastointiaika

varastointiaika näytteistä vaihteli 2-9 vuotta. 624 micoRNAs ja niiden lähtöaineiden tunnistettiin 8 paria kudosnäytteistä. Jotkut MikroRNA ei voitu havaita joko tuore tai FFPE näytteitä. Kuvio 2 esittää prosenttiosuudet MikroRNA jotka havaittiin sekä tuore ja FFPE näytteitä, vain Tuorenäytteissä ja ainoastaan ​​FFPE näytteistä vuoden aikana näytteen keräämistä. Ei ollut varastointi ajan riippuvia muutoksia nämä prosenttiluvut, mikä osoittaa, ettei merkittävää yhdistyksen välillä säilytysaika ja määrä MikroRNA läsnä tässä 9 vuotta aikaikkunassa.

vieressä tutki prosenttiosuus ja mikroRNA lukee osuus koko lukee (kuva 3) ymmärtää, jos puhtauden MikroRNA pelkistettiin FFPE näytteissä. Noin 70% ja 85% lukee FFPE ja pakastetut näytteet, vastaavasti, havaittiin microRNA sekvenssit. Mahdollinen syy tähän eroon voi olla läsnä sirpaleet lncRNAs ja mRNA osa RNA pienempi kuin 40 nukleotidin (nt) in FFPE kudoksissa (kuva 4).

Effects of FFPE näyte hajoaminen: luokittelu pieniä RNA: iden

paremmin ymmärtää, jos ero osuus pienten RNA-sekvenssien kaikkien lukee välillä jäädytetyn ja FFPE kudos tietojen tarkastelimme jakelu RNA luokkien yhdessä rintasyövän näyte . Oli yhteensä 11563414 ja 10273837 sekvensointi lukee, että kaksi tutkituista Hyväksytty näytettä ja lukee kartoitettiin ihmisen genomiin (hg19, National Center bioteknologian tietojen rakennus) käyttämällä mukautettuja Python skriptejä. Lukuoperaatioista luokiteltiin eri RNA ryhmiin Ensembl tietokantaan. Suurin osa pienten RNA: iden sekä tuore ja FFPE kirjastot olivat MikroRNA (kuva 4). Vertaamalla tietoja täsmäsi Tuorenäytteissä tietoihin FFPE näytteistä oli lincRNA ja sekvenssit tuntemattomien luokkia saadut tiedot FFPE näytteistä. Koska vain RNA: t pienempi kuin 40 nt uutettiin ja prosessoitiin sekvensointi tämä viittaa siihen, että on olemassa pirstoutuminen lincRNA ja muiden pitkän RNA FFPE kudoksissa, jotka ovat pidempiä kuin 40 nt.

Yhteensä 469-548 ( tarkoittaa 519) eri MikroRNA ja niiden lähtöaineiden tunnistettiin sekä tuore ja FFPE näytteitä. Selvitimme prosenttiosuudet MikroRNA joka on enemmän kuin 2-kertainen ero ilmaisun välillä Hyväksytty tuore ja FFPE näytettä (kuva 5). Joukossa eri tapauksissa 69-145 microRNA selostukset oli yli 2-kertaisesti yli-ilmennetään Tuorenäytteissä. 73-186 microRNA transkriptit yli 2-kertainen yliekspressoituu FFPE kudoksissa (kuvio 5).

korrelaatio mikroRNA ilmentymisen arvojen täsmäsi FFPE ja pakastettujen näytteiden

vieressä määritetään korrelaatio of mikroRNA ilmaisun arvojen Hyväksytty FFPE näytteiden ja Tuorenäytteissä. Oli 250 MikroRNA havaittiin kaikissa näytteissä tässä tutkimuksessa. Siellä oli vahva korrelaatio mikroRNA ilmaisun arvojen Hyväksytty FFPE ja snap tuore kudoksista kaikilla MikroRNA ja kaikissa tapauksissa (r = 0,85; kuva 6). -korrelaatiot Havaittu MikroRNA samasta kasvain /potilas olivat korkeat, r vaihtelee 0,71-,95 (kuvio 7) [25].

Vain 250 MIRS ilman puuttuvat tiedot käytetty.

Jokainen piste edustaa ilmaus arvoja yhden mikroRNA on tuore-FFPE paria.

keskiarvo Pearsonin korrelaatiokertoimet yksittäisten mikroRNA ilmaisun arvoja FFPE ja jäädytettyjen kudoksissa oli 0,46 (kuvio 8), jossa on vain 41 kypsä MikroRNA ja lähtöaineiden ottaa korrelaatiokertoimet yli 0,8 (taulukko 2). Olemme pyrkineet tunnistamaan ominaisuuksia, jotka liittyvät korkeaan korrelaatiokertoimet osoittaa invarianssia kudokseen säilyttämiseen menetelmällä. Testata, jos ekspressiotaso tietyn mikroRNA liittyy korrelaatio tuore ja FFPE kudos, Fisher muunneta (arctanh) korrelaatioita taantunut päälle keskiarvo FFPE ilmaisu (kuvio 9). Ei ollut yhdistyksen välillä ilmaisun arvojen ja korrelaatioita tietoja jäädytetyn ja FFPE havaittu kudos. Sitten pyrkineet ymmärtää, jos mahdollisia puutteita vaihtelua yksittäisten MikroRNA keskuudessa biologinen toistojen on seurauksena huono korrelaatioita. Fisher transformoituja korrelaatioita taantunut päälle tukin muuttaneet FFPE vaihtelut. Varianssi-analyysi osoitti, että MikroRNA on suurempi varianssi on huomattavasti korkeampi korrelaatiot tietojen FFPE ja pakastetut kudokset (kuva 10; arctanh (r) = 0,47 + 0,59 x log10 (FFPE varianssi)), joka voi johtua siitä, että läsnä on todellinen biologinen vaihtelu läsnä näissä MikroRNA.

PCR validointi mikroRNA ilmaisun

Valitsimme kaksi MikroRNA (miR-21 ja miR-19a), jotka olivat ilmaistuna suurempi jäädytetyistä näytteistä kuin FFPE näytteitä meidän microRNA sekvensointi tulokset validointi käyttämällä PCR (Taqman). Sekä miR-21 ja miR-19a havaittiin myös suurempi ilmaistu jäädytetty kudoksessa kuin Hyväksytty FFPE näytettä seulotaan PCR (kuvio 11), mikä on yhdenmukaista sekvensointialustamme tuloksia.

RNA näytteitä tuore ( n = 8) ja FFPE (n = 8) kudosta analysoitiin. Pieni ydinaseiden RNA U6 käytettiin viitteenä. MiR-21 ja miR-19a oli suurempi ilmaisun Tuorenäytteissä kuin FFPE näytteissä, sopusoinnussa sekvensointi tuloksia.

Keskustelu

MikroRNA kuten geenien ilmentyminen sääntelyviranomaisten näytä olevan tärkeä rooli syöpäsolujen erilaistumista [4], leviämisen [26], etäpesäke [27] ja apoptoosin [28]. On ollut monia microRNA profilointi pyrkimyksiä käyttää jäädytetyt syöpäsoluissa [29] [30] [31]. Syöpä kudosnäytteitä tyypillisesti arkistoidaan formaliinin jälkeen kiinnitys ja parafiiniupotusta (FFPE) ja jäädytetty kudos on käytettävissä vain harvoissa tapauksissa patologian arkistoista ja kudospankkeihin. Parempi ymmärrys laadusta mikroRNA sekvensoinnin tulosten FFPE kudosten mahdollistaisi entistä tietoisen päätöksen siitä, milloin käyttö FFPE kudoksen pienten RNA sekvensointia kokeet olisi tarkoituksenmukaista.

Tässä tutkimuksessa kartoitettiin pieniä RNA sekvensointi profiilit kahdeksan paria Hyväksytty tuore ja FFPE syöpä kudosnäytteitä käyttämällä ABI Solid 4 alustalla. Varastointiaika jopa yhdeksän vuoden ilmestyi ei vaikuta määrä havaittavissa MikroRNA joko jäädytetty of FFPE kudoksen tässä tutkimuksessa. Läsnä suurempi prosenttiosuus kuin MikroRNA on osa nukleotidien pienempi kuin 40 nt ehdotti, että FFPE kudokset ovat huonontunut, vaikka. Kuitenkin tämä ilmeinen hajoamista ei johtanut vähemmän MikroRNA on havaittu FFPE kudoksissa, mikä viittaa siihen, että sekvensointi lähestymistapa voi voittaa näytteen hajoaminen jossain määrin. Vaikka pieniä RNA: t yhdellä kahdeksasta FFPE näytteiden ilmestyi hajoavat ehdottivat alennettu luku- pituudet keskitetty 17 nt verrattuna muihin kahdeksan FFPE ja kaikki kahdeksan jäädytetyistä näytteistä keskitetty 21 nt, lukumäärä linjassa lukee ja havaittujen MikroRNA vuonna tämän huonontuneen näyte olivat samanlaisia ​​tietoja muista näytteistä, mikä viittaa siihen, että tiedot on saatu näytteistä edellä kuvatun heikkenemisen aste ei välttämättä tarvitse poistaa kaikentyyppisiä analyysin.

kaiken oli erinomainen korrelaatio miRNA ilmaisu arvojen välillä Hyväksytty jäädytetyn ja FFPE kun yhdistetään kaikki näytteet ja kaikki MikroRNA (kuva 6), tai kun analysoidaan kaikki MikroRNA sisällä yksittäisen potilaan näytteestä paria (kuva 7). Havainnot koostuivat aikaisempien raporttien kanssa eri sekvensointia alustojen viittaa siihen, että sekvensointi lähestymistavat voivat aiheuttaa hyvässä korrelaatioita FFPE ja jäädytetyn näytteitä lukien useita satoja MikroRNA [32] [33] [9] [34].

korrelaatioita ilmaisun arvojen yksittäisten MikroRNA (katso kuvat. 8, 9, 10) olivat pienemmät kuin korrelaatiot, mukaan lukien kaikki MikroRNA (kuviot 6, 7). Perimmäisenä syynä tähän havaintoon todennäköisesti peräisin yksilöidyllä yhdistys korrelaatiokertoimet yksittäisten MikroRNA ja varianssi mikroRNA ilmaisun arvojen (kuva 10). Hyvin samanlainen ilmaisu arvoja yksittäisen mikroRNA niistä kahdeksasta tapauksista (vastaa alhainen vaihtelu kuva 10) johtavat tyypillisesti alhainen korrelaatio kertoimet, koska vaihtelu jäädytetyn ja FFPE data on suurempi kuin vaihtelu ilmaisun välillä kahdeksassa tapauksessa sisällytetty tähän tutkimus. Siksi ei ole välttämättä yllättävää on laaja jakauma korrelaatiot yksittäisten MikroRNA analysoituna yksityiskohtaisesti kuvioissa 8, 9, ja 10.

rajoitukset Tämän analyysin ovat rajoitu pienen otoksen koko ja mahdollinen PCR kielteiset ilmiöt ja PCR valinta harhat monistamisen aikana on multiplex PCR-tekniikkaan perustuvat kirjaston rakentaminen [35] [36]. Tämä haitta olisi poistettava 3

kolmannen sukupolven of sekvensointitekniikan, jonka arvellaan vaadi vahvistusta kohdesekvenssin enää, mutta havaita yhden nukleiinihappomolekyylejä [37]. Lisäksi se, että viereisten kudosten luoda Hyväksytty yksilöille Analyysin tehty joitakin kudos heterogeenisyys vaikutuksia ja todennäköisesti vaikuttaa havaitun erot Hyväksytty jäädytetyn ja FFPE näytteitä. Yhteenvetona microRNA sekvensointi FFPE kudoksiin on mahdollista käyttää ligaatio-pohjainen sekvensointi ja microRNA ilmaisun arvoja yksittäisten potilaiden korreloi voimakkaasti ilme datan sovitetun jäädytetty kudoksista. MikroRNA korkeamman varianssi näyttää olevan suurempi korrelaatio niiden ilmaisun arvot Hyväksytty jäädytetty ja FFPE kudoksen tiedot.

Kiitokset

Kiitämme Carlo M. Croce varten hyödyllisiä keskusteluja.