Krooninen sairaus

tiivistelmä

Wnt signalointi on kriittinen sääntelyn väylän kehittämiseen ja sairaus. Hyvin vähän tiedetään mekanismeista Wnt signalointia eturauhassyövässä, johtava kuolinsyy miehillä. Kvantitatiivinen analyysi ilmentymisen Wnt5A proteiinin ihmisen kudosmatriisien, joka sisältää 600 eturauhasessa ydintä, osoitti 50%: n lisäys pahanlaatuinen verrattuna hyvänlaatuinen ytimet (

p

0,0001). Vuonna sovitetun parin eturauhassyövän ja normaali solulinja, ilmentymistä Wnt5A proteiinin lisättiin. Kalsium aallot indusoitiin eturauhasen soluissa vasteena Wnt5A kanssa 3 kertainen lisäys Flou-4 intensiteettiä. Aktiivisuus Ca

2 + /kalmoduliiniriippuva proteiinikinaasi (CaMKII), anturia ei-kanoninen Wnt /Ca

2 + signalointi, kasvoi 8 kertaiseksi syöpäsoluja; mitään muutosta ei havaittu β-kateniinin ilme, tiedetään aktivoivan kanoninen Wnt /β-kateniinin reitin. Mining yleisesti saatavilla olevien ihmisen eturauhassyövän oligoarray aineistoja paljasti, että ilmaus lukuisten geenien (esim CCND1, CD44) valvonnassa β-kateniinin transkriptio on alassäädetty. Konfokaaliset ja määrällinen elektronimikroskoopilla osoitti, että spesifinen esto CaMKII syöpäsoluissa aiheuttaa remontin aktiinisytoskeletonin, epäsäännöllinen haavan reunat ja löysä solujen väliset arkkitehtuuria ja 6 ja 8 kertaiseksi määrää ja pituutta filopodia, vastaavasti. Sitä vastoin käsittelemättömät normaalissa eturauhasessa solut osoittivat epäsäännöllistä haavan reunan ja löysät solujen väliset arkkitehtuuri; inkubointi normaalien eturauhasen solut yhdistelmä Wnt5A proteiini indusoi aktiini remodeling tavallisella haavan reunan ja lisääntynyt haavan paranemista kapasiteettia. Elävien solujen kuvantaminen osoitti, että funktionaalinen seurauksena CaMKII eston oli 80%: n lasku haavan paranemista kapasiteettia ja pienentää soluliikkuvuus syöpäsoluissa. Ehdotamme, että ei-kanoninen Wnt /Ca

2 + signalointi kautta CaMKII toimii uutena säätelijänä rakenteellisten plastisuus ja soluliikkuvuus eturauhassyövän.

Citation: Wang Q, Symes AJ, Kane CA, Freeman A, Nariculam J Munson P, et ai. (2010) romaani Rooli for Wnt /Ca

2+ signalointia Aktiinisytoskeletonin Remodeling ja soluliikkuvuus eturauhassyövässä. PLoS ONE 5 (5): e10456. doi: 10,1371 /journal.pone.0010456

Editor: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Iso-Britannia

vastaanotettu: 19 marraskuu 2009; Hyväksytty: 08 huhtikuu 2010; Julkaistu: 4. toukokuuta 2010

Copyright: © 2010 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat National Cancer Research Institute ja eturauhassyöpä Research Center, Iso-Britannia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Wingless /Wnt geenit koodi perheen erittyvän glykoproteiineja, jotka säätelevät monissa solun prosesseissa [1], [2]. Poikkeava signaloinnin Wnt signalointireittejä liittyy useita sairauksia, kuten syöpää [3] – [6]. Wnt signalointia kautta tapahtuvaa kanoninen (Wnt /β-kateniinin, CTNNB1) ja ei-kanoninen (Wnt /Ca

2 +) väyliä [3], [7]. Vähemmän hyvin kuvattu Wnt polku on Wnt-JNK-reitin [8]. Signaloinnin kautta Wnt /β-kateniinin reitin aktivoi useiden geenien transkription, kuten sykliini Ds ja kalvon (MMP), kautta TCF /LEF tekijät. Wnt /Ca

2+ polku johtaa solunsisäisen kalsiumin [9] ja aktivointi kalmoduliinista riippuvaisen proteiinikinaasin II (CaMKII) [10], ja se on tunnettu moduloida solujen liike ja käyttäytyminen [11], [12] ja aiheuttaa rakenteellisia muutoksia [11], [13], [14]. Välinen yhteys nousi β-kateniinin signalointi kasvainten synnyssä ja lisääntynyt transkriptio geenien solutransformaatio ja lisääntymistä dokumentoidaan kuitenkin rooli kaanoniin Wnt /Ca

2 + signalointi syöpä vasta hitaasti selvitetty [15] , [16].

Eturauhassyöpä osuus arviolta 25% kaikista uusista syöpätapauksista ja on toiseksi suurin syy syöpäkuolemista miehillä [17]. Kumpikaan ilmentymisen Wnt-proteiinien eikä mekanismeja Wnt signaloinnin eturauhassyövän ymmärretään [18]. Aikaisemmat tutkimukset keskittyivät luonnehdinta Wnt reseptorien reseptori liittyvät proteiinit ja ilmentyminen Wnt-geenien [5], [19] – [21], eturauhassyövän solulinjoissa. Suora vuorovaikutus androgeenireseptorin (AR) ja TCF varten β-kateniinin ja muut transkriptio keratekijöitä Lisäksi ehdotettiin [22]. Kuitenkin vain pieni osa eturauhassyöpänäytteissä ovat väärin säädellystä tuhoaminen monimutkaisia ​​tai mutatoituja β-kateniinin [18]. Siten on todennäköistä, että muut mekanismit, mahdollisesti liittyvät suoraan Wnt signalointia, voi olla mukana.

osoittivat äskettäin [23], että WNT5A (yksi 19 jäsentä Wnt perhe) geenin ilmentyminen lisääntyy ( 50-kertainen) eturauhassyövässä kudosten ja syöpäsolujen linjojen takia hypometylaatio. Kuitenkin tärkeitä kysymyksiä Wnt5A ilmaisun ja mekanismit Wnt5A välitteisen signaloinnin eturauhassyövässä säilyvät. Esimerkiksi, emme tiedä (i) Onko kasvu WNT5A geenin transkriptio johtaa lisääntyneeseen Wnt5A proteiinin ilmentymistä pahanlaatuisia kasvaimia? (Ii) Onko kanoninen tai ei-kanoninen signalointireitin aktivoituu eturauhasen syöpä? (Iii) Mikä on toiminnallista roolia Wnt signalointia eturauhasen syöpä? Näiden kysymysten testasimme seuraavia hypoteeseja: (i) Tämä Wnt5A proteiinin ilmentyminen lisääntyy ihmisen eturauhassyövän (ii) Tämä Wnt /β-kateniinin signalointi pitäisi johtaa lisääntyneen ilmentymisen TCF /LEF kohdegeenien, kuten MMP ja TIMP-3 in eturauhassyöpä (iii) aktivointi Wnt /Ca

2 + signalointi eturauhassyöpäsoluissa pitäisi johtaa kasvuun CaMKII entsyymiaktiivisuuden aiheuttavat muutoksia solun tukirangan ja solun liikkuvuus. Me osoitamme ensimmäistä kertaa, että Wnt5A proteiinin ilmentyminen lisääntyy pahanlaatuisten ihmisen eturauhasen verrattuna hyvänlaatuinen kudosten ja Wnt /Ca

2+ signalointi mekanismi aktivoituu eturauhasen syöpäsoluja. Tarjoamme myös uusia mekanistinen näyttöä kriittinen rooli CaMKII moduloijaksi aktiinisytoskeletonin ja soluliikkuvuus eturauhassyövän.

Tulokset

RNA-kopion laatiminen reaaliaikaista PCR

mittasimme mRNA-tasot WNT5A (taulukko S1), aiemmin tunnistettu meidän oligoarray analyysin väärin säädellystä eturauhassyöpäsoluissa [23]. WNT5A mRNA näkyy samanlainen Muutoksen suuruus (-50-kertainen) 1542-CP

3TX syöpäsolujen verrattuna normaaliin 1542-NPTX soluissa, onko mitataan oligoarray [23] tai reaaliaikainen PCR (taulukko S1). WNT5A transkripti ilmentyy myös muissa eturauhassyövän solulinjoissa esim PC3 ja DU145 [19], [23].

Wnt5A proteiinin ilmentymistä pahanlaatuisia ja hyvänlaatuisia ihmisen eturauhasen

3,3-diaminobentsidiiniä (DAB) etiketti, joka edustaa Wnt5A ilme, havaittiin molemmissa pahanlaatuinen ja hyvänlaatuisia kudoksen ytimet (Fig. 1A ja B). Kvantitoimme etiketissä, puolueettomasti, käyttämällä toistettavissa, puoliautomaattista partikkelianalyysimallia (Analysoi hiukkaset) protokollaa käyttäen ImageJ ohjelmistojen [24] sen jälkeen, kun RGB-kuvat 16-bittinen harmaasävy (kuvio 1 C ja D) 600 yksilön eturauhasessa ytimet (katso materiaalit ja menetelmät). Laskettu parametrit laskea, kokonaispinta-ala, keskimääräinen koko ja alueen osa on esitetty taulukossa S2. Integrointi AUC paljasti 55%, 25% ja 45% lisäys kokonaispinta-ala, keskimääräinen koko ja alueen osa (kokonaispinta-ala /yhteensä pikseliä), joka edustaa laajuus ja värjäyksen voimakkuuden, vuonna pahanlaatuinen ytimet (n = 301 ) verrattuna hyvänlaatuinen ytimet (n = 299), vastaavasti (kuvio 1 E, F ja G), jotka olivat erittäin merkitseviä (p 0,0001, Studentin t-testi). Nämä tulokset osoittavat, että Wnt5A ilmentyminen lisääntyy pahanlaatuisten verrattuna hyvänlaatuinen ihmisen eturauhasen.

edustajan pahanlaatuinen (A) ja hyvänlaatuisia (B) kudoksen ydin ihmisen eturauhasen matriiseja käytetään laskettaessa Wnt5A ilmentymisen (DAB etiketti, ruskea, pitkälti in rakkulasoluissa). RGB-kuvat (A ja B) muutettiin 16 bitin kuvia (C ja D) kvantifiointiin DAB-signaalin avulla Analysoi Particle protokollan ImageJ ohjelmisto saada Kokonaispinta-ala värjätty (E) ja keskimääräinen koko hiukkasen mitattuna (F) , pikselin, ja alue Fraction (G, kokonaispinta-ala jaettuna kuvan pikselien). Wnt 5A ekspressio lisääntyi pahanlaatuisten v hyvänlaatuista ytimet (p 0,0001). Jokainen bin on tietoja yksittäisen, pahanlaatuinen (punainen, n = 301) tai hyvänlaatuinen (vihreä, n = 299) ydin.

mekanismit Wnt-signaloinnin eturauhassyövässä

Expression of Wnt5A proteiinin kasvoi myös 1542-CP

3TX syöpäsolujen verrattuna vastaaviin normaaleihin 1542-NPTX soluja (Fig. 2A). Myös samanaikainen lasku (2,5-kertainen) mRNA transkriptio CTNNB1 ja muiden osien Wnt /β-kateniinin signalointia (esim. Ak- siini, DVL1, GSK3p) syöpäsoluissa verrattuna normaaleihin soluihin (taulukko S1). Antagonismi β-kateniinin, koska yli-ilmentymisen Wnt5A, mikä downregulation Wnt /β-kateniinin tavoite on ehdotettu aiemmin melanooma [25] ja Xenopus alkioiden [11]. β-kateniinin proteiinin ekspressiota, käyttäen Western-blottaus osoitti yhden ainoan vyöhykkeen (~94kDa) proteiinipitoisuutena riippuvalla tavalla, solulysaateista sekä 1542-CP

3TX ja 1542-NPTX solut (Fig. 2B). Densitometri-analyysi osoitti, ettei muutosta β-kateniinin proteiinin syöpä verrattuna normaaliin solulinja (Fig. 2C). Lisäksi mukaan meidän oligoarray data [23] useita Wnt /β-kateniinin välitteisen TCF transkriptio kohdegeenien osoitti väheni mRNA ilmentymistä syöpäsoluissa (taulukko S3). Yksityiskohtainen tarkastelu on proteiini ja toiminnallinen taso valittujen tavoitteiden TCF /LEF transkriptio (esim MMP2, MMP14 ja TIMP-3) [26] vahvisti nämä havainnot. mRNA lauseke näiden geenien oli 3-10 kertaa pienempi syöpäsoluissa verrattuna normaaleihin soluihin (taulukko S1) tukevat epäsuoralla immunofluoresenssilla (Fig. S1). MMP-14 aktiivisuus olisi vastattava tasapainon MMP-14 katalyyttinen ja TIMP-3 sääntelytoimintaa. MMP-aktiivisuus oli 3 ± 0,06 kertaa pienempi syöpäsoluja käyttäen gelatiinitsymografialla (Fig. S2). Nämä tulokset vahvistivat, että lukuisia tavoitteita Wnt /β-kateniinin signalointireitin ovat alas-säädellä geenin proteiinia tai sen toiminnallista tasoa.

Western blot (A) Wnt5A proteiinin ekspression, jotka osoittavat korkeampaa 1542-CP

3TX (CP) soluja verrattuna 1542-NPTX (NP) soluja. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. (B) β-kateniinin (94kDa) ilmentyminen solulysaatissa 1542-CP

3TX ja 1542-NPTX solulinjoissa (GAPDH, 35kDa, käytettiin proteiinin latauskontrollina samalla blot). (C) densitometrinen analyysi suoritettiin käyttäen kaupallista ohjelmistoa (GeneTools, Synoptics, UK). NP (täytetty palkki) = 1542-NPTX ja CP (ontto bar) = 1542-CP

3TX.

Analyysi geenin ilmentymisen CTNNB1 ja TCF /LEF transkriptio tavoitteet käyttäen Oncomine [27 ] ja GeneSpring ohjelmistot ja julkisesti saatavilla mikrosirujen aineistoja normaalin (ei-neoplastisia tai hyvänlaatuinen)

vs

syöpä eturauhasen kudosta, osoitti, että ilmentyminen lähes kaikkien Wnt /β-kateniinin /TCF tavoitteet analysoidaan, paitsi c-myc oli vähentynyt eturauhassyövässä (kuvio. S3). Nämä tulokset ovat samanlaisia ​​kuin eturauhasen solulinjojen ja osoittavat, että β-kateniinin välittämää kasvu TCF transkriptio ei todennäköisesti mekanismi Wnt signalointia eturauhassyövässä. Siksi testattiin hypoteesi, että eturauhassyövän, Wnt signalointia transdusoida Wnt /Ca

2+ kautta. Suoritimme kokeita sen selvittämiseksi, Wnt5A suoraan aiheuttamaa kalsiumin vapautumista eturauhasen soluissa. Lisääminen Wnt5A peptidin aiheuttamaa kalsiumin aaltoja, kestävä Jopa 100s, eturauhasen syöpäsolun mukaisesti 3,1 ± 0,1 (n = 12) kertainen intensiteetti Flou-4 perusviivasta (kuvio 3 ja Elokuva S1).

edustaja kuvaaja kalsiumin vapautumisen eturauhassyöpäsolulinja (PC3) funktiona Fluo-4 intensiteetin muutos ajan konfokaali elävien solujen kuvantamiseen. Vihreä viiva kuvaa muutosta Fluo-4 intensiteetin (vihreä viiva) (A) kontrolli (lisäyksen jälkeen ajoneuvon PBS) tai (B) yhdistelmä-Wnt5A peptidin (100 ng /ml). Oli 3,1 ± 0,1 kertainen lisäys Fluo-4-intensiteetin lisäyksen jälkeen Wnt5A (n = 12). Joissakin kokeissa Fura Red (punainen viiva) ladattiin Fluo-4. Suhde muutosta Fluo-4 ja Fura-punainen on piirretty (C).

CaMKII toimintaa ja sen rooli rakenteellinen plastisuus eturauhasen solujen

CaMKII on suuri muuntimen Wnt /Ca

2 + signalointi. Kaikissa eturauhasen solulinjoissa CaMKII entsyymin aktiivisuus oli Ca

2+ riippuvaisia, ainakin 1542-NPTX, enemmän 1542-CP

3TX ja DU145 ja lausutaan PC3-solulinjassa (kuvio. 4). Oli 4 ja 8 kertainen lisäys Ca

2 + -riippuvaisen CaMKII aktiivisuus in1542-NPTX ja 1542-CP

3TX solut (Fig. 4), vastaavasti. Vielä tärkeämpää on, Ca

2 + riippuvainen aktiivisuus CaMKII korotettiin ~ 4-kertaiseksi 1542-CP

3TX verrattuna 1542-NPTX (

upotettavat

Fig. 4). Nämä tulokset osoittavat kasvua aktiivisuudessa CaMKII syöpäsoluissa verrattuna normaaleihin soluihin.

raasin aktiivisuutta CaMKII solulysaateista mitattiin käyttämällä [γ-

32P] ATP perustuu CaMKII määritys ( Upstate, UK) kanssa Ca

2+ (viivoitetut pylväät) tai ilman Ca

2+ (ontot palkit).

Inset

: Ca

2 +: sta riippuvainen CaMKII aktiivisuus laskettiin, kuten on kuvattu materiaalit ja menetelmät. Arvot ovat keskiarvo ± SE 3 kokeita. NP is1542-NPTX, CP is1542-CP

3TX, DU on DU145 ja PC on PC3 eturauhasen solulinja.

roolin tutkimiseksi Wnt signaloinnin aktiinisytoskeletonin normaalin ja syövän eturauhasen solujen käytimme haava /naarmu määrityksessä yhdessä konfokaalisella ja pyyhkäisyelektronimikroskoopilla ja elävien solujen kuvantamiseen. Ensinnäkin, etureuna haavan havaittiin aktiini-remodeling, käyttäen konfokaalimikroskopialla värjäyksen jälkeen fluoresoivasti leimatulla phalloidin. 1542-CP

3TX solujen etureunan haavan, 4 h haavan tekemisen, osoitti tasainen, säännöllinen aktiinivärjäyksen, jossa soluilla esiintyvää lamellipodioihin kuten muodostumista (Kuva. 5A). 1542-NPTX solujen etureuna haava oli epäsäännöllistä morfologiaa yksittäisten solujen, jotkut hieno filopodia rakenteita näkyvissä 4 h (Fig. 5B).

Solut haavoittui ja värjättiin phalloidin- fluoreskeiini -5-isotiosyanaatti (FITC, vihreä) visualisoida aktiinisäikeiden käyttämällä Leica SP2 -konfokaalimikroskoopilla. A, B ja G ovat käsittelemättömiä 1542-CP

3TX, 1542-NPTX ja PC3-soluissa, vastaavasti. C, D ja H ovat AIP (10 uM) käsitellään 1542-CP

3TX, 1542-NPTX ja PC3-soluissa, vastaavasti. E ja F ovat 1542-CP

3TX ja 1542-NPTX käsitelty yhdistelmä-Wnt5A (100 ng /ml). Epäsäännöllinen haava etureunan ja löysät solujen välisen yhteyksiä ja hienoja filamentteja aktiini (filopodia ulkonemia), valkoiset nuolet ovat näkyvissä 1542-NPTX normaalit solut ja sen jälkeen AIP hoidon 1542-CP

3TX ja PC3 syöpäsoluja. Propidiumjodidia käytettiin värjäämään nukleiinihapon (punainen). Asteikko bar = 10 pm

Seuraavaksi testasimme seuraavia hypoteeseja: (i) estämällä CaMKII pitäisi häiritä haavan etureunan eturauhassyöpäsolulinjoissa (ii) aktivointi Wnt5A signaloinnin 1542-NPTX soluissa tulisi edistää aktiini remontin haavan havaittuna 1542-CP

3TX soluja. Käytimme Myristoylated autokamtidi-2-liittyvä estävää peptidiä (AIP), estäjä CaMKII, ja yhdistelmä Wnt5A proteiinia (aktivoimiseksi Wnt signalointia) normaaleissa ja syöpäsolujen testata näitä hypoteeseja (Fig. 5). Konfokaalimikroskopia haavoittuneita /naarmuuntunut yksikerroksista 1542-CP

3TX soluja inkuboitiin AIP (10 uM) näytetä häirinnyt, epäsäännöllinen haava etureuna hienoa filopodia (Fig. 5C, nuolet) verrattuna säännölliseen haavan reuna käsittelemättömissä soluissa (kuvio . 5A). Etureuna haavoittuneen 1542-NPTX solujen kanssa tai ilman AIP oli epätasaista reuna, irtonaisella solusta soluun kontakti ja hieno aktiinifilamentin ulokkeita (kuvio. 5B ja D). Nämä mikroskooppikuvat osoittavat, että esto CaMKII 1542-CP

3TX syöpäsoluja aiheuttaa filopodia ulkonemia. Toisaalta, haavoittuneen 1542-NPTX normaalit solut, inkuboitiin rekombinantin Wnt5A-proteiinin (100 ng /ml), näytetään säännöllisesti etureuna (Fig. 5E) haavan verrattuna käsittelemättömään kontrolliin (kuvio. 5B). Mitään ilmeistä eroa ei havaittu johtavan haavan reuna käsittelemättömän vs Wnt5A proteiinia inkuboitiin 1542-CP

3TX soluja (Kuva. 5A ja F).

vahvistaa, että aktiini remodeling välitti CaMKII eikä kautta muut kinaasit (esim CaMKIV, PKA, PKC, Raf: n tai MAPK1, JNK1α1 tai Raf), käytimme tatCN21a, spesifinen inhibiittori CaMKII [28]. 1542-CP

3TX soluja käsiteltiin 5 uM tatCN21a oli epäyhtenäinen haavan reunat ja löysä solusta soluun kontakti ja filopodia muodostumista (Kuva. S4) kuin havaittiin AIP (Fig. 5). Esto CaMKII indusoi myös, epäsäännöllinen haavan reuna, irtoaminen ja solusta soluun kontakti ja filopodia muihin eturauhassyövän solulinjoissa, mukaan lukien PC3 (Fig. 5G ja H ja kuvio. S5), DU145 (kuvio. S6) ja androgeenin herkkiä LNCaP-solulinja (Fig. S7).

mekanismi, jolla CaMKII aiheuttama esto filopodia muodostumista eturauhassyövän soluissa oli seuraava harkita. Käytimme pyyhkäisyelektronimikroskoopilla määrällisesti filopodia rakenteita (Fig. 6). Pieni suurennus pyyhkäisyelektronimikroskooppi- 1542-CP

3TX soluilla säännöllisiä ja epäsäännöllisiä haavan etureunat käsittelemättömissä (

upotettavat

Fig. 6A) ja AIP käsiteltyjä soluja (

upotettavat

Fig. 6B ). Korkea suurennos kuvia osoittavat selvästi lukuisia ja laajennettiin hieno filopodia kuin ennusteiden solukalvon (Fig. 6B) AIP käsiteltiin 1542-CP

3TX soluja käsittelemättömiin soluihin verrattuna (kuvio. 6A). Esto CaMKII kanssa AIP aiheutti samanlainen vaikutus PC3-solulinjassa (kuvio. 5H ja Fig. S5B). Taajuus ja pituus filopodia mitattiin manuaalisesti ImageJ ohjelmistoa. Gaussinen sovitus pituuden jakautuminen histogrammin käsitellyn ja käsittelemättömän 1542-CP

3TX solut paljasti 8 kertaiseen kasvuun pituus ja 6 kertainen nousuvauhdin taajuus filopodia ulkonemia AIP käsitellyissä verrattuna hoitamattomiin 1542-CP

3TX solut (Fig. 6C ja taulukko 1). Histogrammi voidaan asentaa vähintään kaksi pituudet filopodia ulkonemia 1542-CP

3TX solut: pitkä (jopa 2 um) ja hyvin pitkä ( 2 pm). Lisäksi analyysi osoitti, että oli 5 kertainen kasvu pituus, mutta on paljon suurempi (15 kertaisesti) lisäys taajuus hyvin pitkä ulkonemat AIP käsitellyissä soluissa verrattuna käsittelemättömiin soluihin (taulukko 1). Nämä tulokset vahvistavat merkittävä rooli CaMKII välittämän Wnt signalointia aktiini remodeling eturauhassyövässä vähentämällä pituuden ja taajuus filopodia.

Main kuvat ovat edustavia kuvia (asteikko bar 1 mikrometriä) käsittelemättömän (A) ja AIP (10 uM) käsiteltiin (B-solut). Inset on pieni suurennus kuva (asteikko bar 10 mikrometriä) pääkuvan. Epäsäännölliset haavan reunan ja hieno filopodia ulokkeen näkyvät hoidon jälkeen AIP (B, pääkuva). Pituus filopodia ulkonemia mitattiin Image J ohjelmisto ja muuntaa jakelu histogrammi (C) AIP käsitelty (ontot palkit) ja käsittelemättömän (viivoitetut pylväät) soluja. 8-kertaiseksi AUC havaittiin käsitellyissä verrattuna käsittelemättömiin soluihin käyttäen Gaussin istuvuuden.

toiminnallinen vaikutuksista Wnt /Ca

2 + signalointi eturauhasen syöpäsolut

Cytoskeleton tärkeä osuus in solun liikkuvuus. Tutkimaan mahdollisia ilmenemismuotoja solun tukirangan muutoksia testasimme hypoteesia, että CaMKII esto vähenee solun liikkuvuus eturauhassyövän solulinjoissa. Käytimme haavan naarmu määritys ja elävien solujen kuvantamisen Incucyte (Essen Instruments) laskea nopeus haavan mittana solun liikkuvuus. Haavan sulkeminen pieneni 80% PC3 syöpäsolulinjoissa käsitelty AIP (Fig. 7 ja Movie S2, ohjaus ja elokuva S3, AIP).

Confluent PC3 eturauhassyöpäsolulinjoissa haavoittui ja kuvattiin yön yli 1h välein. Kuvat otettiin koostuviin (ks elokuvat S2, ohjaus ja S3, AIP) ja data tuodaan laskentataulukkoon. Lisäämällä AIP (10 uM, viivoitettu pylväs) vähensi haavan 80% kontrolliin verrattuna (ontto bar, * p 0,001) tai Wnt5A (100 ng /ml, pylväs). Tiedot esitetään keskiarvoina ± SE, merkitys ero valvonnan ja AIP saatiin ANOVA. Haavan sulkeminen määritettiin suorittamalla lineaarinen regressio laskea kaltevuus linjan (

Inset

edustava n = 6-7) ja käsittelemätön kontrolli (umpinaiset kolmiot,

R

= 0,99) , Wnt5A (täytetyt neliöt,

R

= 0,99) tai AIP (ympyrä,

R

= 0,97) käsiteltiin PC3-soluissa.

keskustelu

Wnt ilmaisun ja mekanismit Wnt signalointia edelleen heikosti tutkittu alue eturauhasen. Osoitamme, että (i) Wnt5A proteiinin ekspressio lisääntyy pahanlaatuisten verrattuna hyvänlaatuista ihmisen eturauhasessa ja syöpäsolulinjoissa verrattuna normaaliin. (Ii) Wnt5A on merkittävä muutin Wnt signalointia aktivoimalla Wnt /Ca

2+ koulutusjakson eikä Wnt /β-kateniinin väylän eturauhasen soluissa. (Iii) aktivointi CaMKII on uusi ja kriittinen säätelijä solun tukirangan eturauhassyövässä. (Iv) CaMKII esto vähentää merkittävästi solun liikkuvuus ja kapasiteettia haavojen paranemisen eturauhassyövän solulinjoissa.

ymmärtäminen molekyyli perusteella eturauhassyövän, ja rooli signalointi verkkojen kuten Wnt-reitin, edellyttää paitsi kattava kuvaus geenin ja proteiinin ilmentymistä ihmisen eturauhasen kudoksessa, mutta myös solun, joka mahdollistaisi liittyvien mekanismien signaloinnin ja sen toiminnallinen seurauksia tauti. Meidän eturauhasen kudoksen array tutkimukset osoittavat, että oli erittäin merkitsevä (p 0,0001) kasvavan sekä kokonaispinta-ala (laajuus) ja keskikoko leimatun hiukkasten (voimakkuus) ja alueen osa (kuvio 1 E, F ja G ja taulukko S2) . Nämä tulokset tukevat aikaisempien havaintojen kasvusta ilmentymisen Wnt5A geenin eturauhassyövässä johtuen hypometylaatio [23] ja myös erittäin tuoreessa raportissa Yamamoto

et ai

l [29], että käytetään tavanomaisia, ei-kvantitatiivisella histologinen tutkimus arvioimaan Wnt5A ilme eturauhasessa. Nämä tiedot on myös samaa mieltä, että saatu normaali (1542-NPTX) ja syöpä (1542-CP

3TX) solulinjoja (kuvio 2). Yhdessä ihmisen kudosten ja solujen linja tiedot viittaavat siihen, että Wnt5A proteiini ilmentyy normaalissa (tai hyvänlaatuinen) kudokseen, mutta sen ilmentyminen dramaattisesti lisääntynyt pahanlaatuinen (syöpä) eturauhasessa ja tämä muutos heijastuu solulinjoissa tässä tutkimuksessa käytetyt.

Lähes kaikki tunnetut transkriptio tavoitteet aktivoida Wnt /β-kateniinin reitin, esimerkiksi CTNNB1, CCCNDs, MMP, PITX2, CD44, APCDD1, kesäkuu [30] – [32], pysyy ennallaan tai ovat alassäädetty eturauhassyövässä kudoksessa tai solulinjoja verrattuna normaaliin kudokseen tai solulinjaan (Fig. S3 ja taulukko S1) . Nämä tulokset osoittavat, että solulinja aineisto heijastaa pitkälti geeniekspressiomalli for TCF /LEF geenien sekä solulinjassa ja syöpäkudoksessa. Lisäksi ei kasvanut proteiiniekspressiossa tai toiminnallinen aktiivisuus alavirtaan tavoitteista kanoninen Wnt-signalointi (esim. MMP-14). Tämä viittaa siihen, että 1542-NPTX ja 1542-CP

3TX ja PC3 solulinjat voivat olla hyödyllinen malli liittyvien mekanismien Wnt signaloinnin eturauhassyövän eheyttä Wnt signalointia elementtien eturauhassyövän säilyvät näissä solulinjoissa geeni, proteiini ja toimiva.

CaMKII on keskeinen välittäjä Wnt /Ca

2+ signalointi, vaikka edelleen osajoukon ei-kanoninen Wnt-signalointi Wnt5A ehdotetaan olevan β-kateniinin hajoamisreitit joka ei vaadi aktivointia CaMKII [33]. A3 kertainen kasvu vapaan solunsisäisen kalsiumin pitoisuus havaittiin lisäämisen jälkeen Wnt5A eturauhasen soluissa (kuvio 3 ja Elokuva S1). Lisäksi emme nähneet lasku β-kateniinin proteiinin ilmentymisen ja aktiivisuuden CaMKII todettiin lisäävän eturauhassyövän solulinjoissa, mikä osoittaa, että Wnt /Ca

2+ polku oli todennäköisesti operatiivinen kautta CaMKII eturauhasen syöpä.

moninaiset roolit CaMKII vuonna aktiini remodeling, soluliikkuvuus ja kulkeutumista normaali keratinosyyttien, lihas- ja hermosolujen tiedetään [34] – [36]. Kuitenkin osallistuminen CaMKII välittämän Wnt /Ca

2 + signalointi tauti on huonommin tunnettu. Pukrop

et ai

[37] esitetään, että ei-kanoninen reitti voi olla mukana lisääntynyt liikkuvuus /invasiivisuus MCF7 rintasyövän solulinjoissa, kun yhdistelmä-DNA-Wnt5A lisätään soluviljelmässä. Kuitenkin mekanismit vai Wnt5A välittämä sen vaikutus kautta CaMKII aktivaation, ei tutkittu. Solun liikkuvuus edellyttää kahta päätyyppiä aktiini perustuu rakenteiden solukalvon, lamellipodioihin ja filopodia. On ehdotettu, fibroblasteissa, että filopodia muodostumista lamellipodioihin on tiukasti säännelty prosessi, joka on osittain ohjataan aktiini sitovia proteiineja, kuten käytössä (Ena) /verisuonia laajentavan stimuloiman fosfoproteiini (VASP) rajaaminen aktiinifilamentin [38]. Fibroblastit liikkua laajentamalla lamellipodioihin kärjessä ja hienojen aktiini rakenteiden kärjessä aiheuttaa taaksepäin liikkeen [39]; sitomisen Ena /VASP mitokondriot kasvaa taas sen kohdistamista solukalvon vähentää liikkuvuuden [38]. Rooli Wnt5A välitteisen signaloinnin solun liikkuvuus [37] ja muut välittäjän proteiineja (esim Ena /VASP, Arp2 /3) on filopodia muodostuminen on tutkittu ihmisen [14], [40] ja hiiren [41] melanoomasoluja. Weeraratna ja kollegat [40] esitetään, että Wnt5A lisääntynyt solun liikkuvuus ihmisen melanoomasolulinjat mukaan proteiinikinaasi C (PKC). Witze

et ai

[14] osoittivat, että akuutti vaste melanooma solulinjojen Wnt5A liittyy rekrytointi suurten solun tukirangan proteiineihin (aktiini ja myoxin IIB) ja Frizzled 3 ja melanooma adheesiomolekyyli solunsisäiseen rakenteen kautta Wnt5A asetuksen Rab4 ja RhoB guanosiini triphosphatases. Toisessa tutkimuksessa tutkittiin rooli Ror2 kinaasia Wnt5A aiheuttamaa solujen vaeltamiseen [42]. Toisin kuin tiedot esitetään tässä, nämä tutkimukset [40], [42] tutkimusten ja suoraan manipuloida CaMKII toimintaa kokeensa tai tutkittu sen rooli filopodia muodostumiseen. Käytimme tatCN21a, spesifinen inhibiittori CaMKII (mutta ei CaMKIV, PKA, PKC, MAPK1, JNK1α1 tai Raf). Eturauhassyövän hoitoon solujen tatCN21a aiheutti myös irtoamisen solusta soluun kontakti ja indusoi filopodia muodostumista (Kuva. S4) on samanlainen kuin tulokset, jotka saatiin AIP (Fig. 5). Nämä tulokset osoittavat, että suora inhibitio CaMKII (ei CaMKIV, PKC, PKA ja muiden kinaasien) johtaa menetykseen solusta soluun kontakti ja filopodia muodostumista eturauhasen syöpäsoluja.

eturauhassyövän solulinjoissa (1542 -CP

3TX ja PC3) sileä, säännöllinen haavan reuna on havaittu lähellä solusta soluun kontakti edeltävän lamellipodioihin kuten etureuna (kuviot. 4 ja 5). Sitä vastoin hoito AIP indusoi kasvua filopodia ulkonemia, joissa on irtoamisen solusta soluun kontakti edeltävän haavan reunalla (Fig. 5 ja 6, ja taulukko 1). Itse haavan sulkeminen pieneni 80%, kun esto CaMKII syövän solulinja (PC3). Toisaalta, lisäämällä Wnt5A normaalin solulinjan (1542-NPTX) korotettiin haavan (im /h) käsittelemättömiin soluihin verrattuna 25 ± 4%. Ehdotamme, että aktivointi CaMKII kautta Wnt5A signalointi on edullista syöpäsolu liikkuvuutta, koska se estää muodostumista hienoja filopodia jotka aiheuttavat taaksepäin liikkuvuus mikä vähentää solujen liikkuvuutta.

Proteiinin ilmentymistä Wnt5A ihmisen eturauhassyövän ja mekanismit Wnt signalointia normaalissa ja syöpä eturauhasen solulinjoissa, tässä kuvatut, ovat ensimmäinen kehys, jonka tarkka osallistuminen Wnt reseptorit ja sekretoristen frizzled liittyviä proteiineja [20], [21] ja erilaisten aktiini sitovien proteiinien ja välittäjänä molekyylejä kuten Ena /VASP ja ERK1 [34], [38], voitaisiin tutkia syövän. Lisätutkimukset tunnistaa reseptori (t) Wnt5A sitovien ja muiden osallistuvien proteiinien loppupään signalointi kautta CaMKII in soluliikkuvuus eturauhassyövässä auttaa selvittämään uuden roolin CaMKII tukahduttamiseen filopodia muodostumisen lisäämiseksi soluliikkuvuus eturauhassyövässä . Yhteenvetona tuloksista esitetään tässä ja meidän tuoreessa tutkimuksessa [23] osoittaa hypometylaatio säätelijänä Wnt5A geenin transkription eturauhasessa, seuraavassa järjestyksessä voitaisiin harkita: (i) Geenien ilmentyminen on Wnt5A lisääntyy syöpään verrattuna normaaleihin soluihin takia jotta hypometylaatio geenin promoottorialueen (ii) lisäys geenien ilmentyminen johtaa lisääntyneeseen proteiinin ilmentymistä Wnt5A ihmisen eturauhassyövän (iii) Wnt /Ca

2+ koulutusjakson (eikä β-kateniinin reitti) aktivoituu eturauhassyövässä solut (iv) signalointi kautta Wnt /Ca

2+ polku aktivoi CaMKII (v) CaMKII aktiivisuutta, todennäköisimmin kautta välittäjä signaloinnin mukana aktiini sitovien proteiinien, aiheuttaa merkittäviä uudelleenjärjestelyjä solun tukirangan syöpäsoluissa vähentämällä pituuden ja taajuus hienoja , filopodia kuten aktiini rakenteita. (Vi) solun tukirangan remontin takia CaMKII aiheuttaa lisää solun liikkuvuus. Kohdentaminen Wnt /Ca

2 + signalointi, varsinkin CaMKII voi tarjota hyödyllinen väline eturauhassyövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen eturauhasen epiteelisolujen line1542-NPTX ja eturauhassyövän solulinja 1542-CP

3TX [43] (johdettu normaalista ja eturauhasen syöpä kudosta samalta potilaalta [43]) saatiin SL Topalian, National Cancer Institute, NIH, USA, alkuperäisiltä näistä solulinjoista. Eturauhaskarsinoomasolulinjaa linja PC3 saatiin M E Kaighn alkuperäisiltä tämän solulinjan [44]. DU145 saatiin solusta pankin ylläpitämän Jørgen Fogh Sloan Kettering Cancer Center, NY, USA, mistä talletus tehdään antajan tämän solulinjan [45]. PC3 ja DU145 viljeltiin RPMI 1640 (Invitrogen) alustaa, joka sisälsi 5 mM L-glutamiinia ja sikiön seerumia (FBS) ja 1542-NPTX ja 1542-CP

3TX pidettiin keratinosyyttispesifisestä SFM (KSFM) keskipitkän ja täydennykset ( Invitrogen), jossa 5% FBS ja KSFM täydennykset (Invitrogen).

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR

fluoresoiva reaaliaikainen PCR (TaqMan, Applied Biosystems, UK) käytettiin tarkistaa geeniekspression 1542 -NPTX ja 1542-CP

3TX alunperin tunnistettu microarray kokeiluja [23]. RNA: n eristys on kuvattu muualla [23]. TaqMan-koettimet ja alukkeet real-time PCR ostettiin valmiiksi kehitetty määritysjärjestelmää; Applied Biosystems määritys tunnukset käytettyjen koettimien ja lyhyt protokolla on esitetty taulukossa S4.