Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Nykyinen tutkimus tehtiin luonnehtimaan vaikutus anti-metaboliittien asiakkuutta CXCL8 signalointi ja määritetään, konstitutiivista ja /tai lääkkeen aiheuttama CXCL8 signaloinnin metastasoivaa eturauhassyöpää syöpä (CAP) solut moduloi niiden herkkyyttä tämän luokan edustaja.

Methods

vaste metastaattisen CaP solujen 5-fluorourasiili (5-FU), Pemetreksediä tai Tomudex määritettiin käyttäen solua laskea määritykset, virtaussytometria ja PARP pilkkominen analyysi. Kvantitatiivinen PCR, ELISA ja immunoblot käytettiin määrittämään vaikutuksia huumeiden tai CXCL8 hallinnon kohdegeenin /proteiinin ilmentymisen.

Tulokset

anto 5-FU mutta ei pemetreksediin voimistua CXCL8 eritys ja lisääntynyt CXCR1 ja CXCR2 geeniekspression metastaattisessa PC3-soluissa. Sopusoinnussa tämän inhibition CXCL8 signalointia käyttäen CXCR2-antagonisti, AZ10397767, lisääntynyt sytotoksisuus 5-FU 4-kertaisesti (P ​​ 0,001), ja kasvoi 5-FU: n indusoiman apoptoosin PC3-soluissa (P 0,01). Sitä vastoin, kun taas anto AZ10397767 ei ollut vaikutusta herkkyyteen pemetreksedin, The CXCR2 antagonisti kohdistuu suurin vaikutus lisäämään herkkyyttä PC3-solujen Tomudex, suunnattu tymidylaattisyntaasia (TS) estäjä. Tämän jälkeen tehdyt tutkimukset vahvistivat, että anto rekombinantin ihmisen CXCL8 lisääntynyt TS ilme, vastaus välittämä osittain CXCR2 reseptori. Lisäksi siRNA-välitteisen knockdovvn on CXCL8-kohdegeenin Bcl-2 lisääntynyt herkkyys PC3-solujen 5-FU.

Päätelmät

CXCL8 signalointi tarjoaa valikoivan vastus metastaattisen eturauhassyövän soluissa tiettyihin antimetaboliitit edistämällä kohde-liittyvä vastus, lisäksi taustalla kiertäminen hoidon aiheuttaman apoptoosin.

Citation: Wilson C, Maxwell PJ, Longley DB, Wilson RH, Johnston PG, Waugh DJJ (2012) perustamisasiakirjan ja hoito aiheuttama CXCL8-merkinanto valikoiden moduloi teho antimetaboliitti Therapeutics in Metastaattinen eturauhassyöpä. PLoS ONE 7 (5): e36545. doi: 10,1371 /journal.pone.0036545

Editor: Kin Mang Lau, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 20 joulukuu 2011; Hyväksytty: 10 huhtikuu 2012; Julkaistu: 09 toukokuu 2012

Copyright: © 2012 Wilson et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoittajat: Tutkimus oli tukee rajoittamattoman tutkimus avustusta Ulster Cancer Foundation (DJJW ja PGJ) ja PhD Stipend palkinto (CW) osastolta työ- ja oppimisen, Pohjois-Irlanti. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saatiin tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Edenneen kastraatiotason vastustuskykyisten metastaattinen eturauhassyöpä (CRPC) on edelleen merkittävä kliininen tyydyttämätön tarve. Lisäksi hiljattain hyväksytyt abirateronin-asetaattia toisen linjan hoito CRPC on merkittävä edistysaskel, mutta tämä aine, joka kohdistuu androgeenireseptorin synteesireitti sisältää vain parannus kokonaiselossaoloaikaa ja vain potilaita, joilla on hyvä suorituskyky tila hyötyä sen säännöksen [1], [2]. Monet potilaat eivät täytä etuoikeutettu tehokkuustilana joka on optimaalinen vaste abirateronin. Lisäksi monet kasvaimet ovat vastustuskykyisiä abirateronin toisen linjan hoidossa. Näin ollen tämä valtuutetaan että pyrkimyksiä laajentaa keinovalikoimaa tekijöille on lääkärien saatavilla hoitoon CRPC ei ole rento. Tällaiset pyrkimykset ei pitäisi rajoittaa ainoastaan ​​löytämään uusia aineita, vaan pitäisi hyödyntää jatkuvasta tietoa sairauden biologian määritellä resistenssin ja tunnistaa uusia aineita, joita voidaan hyödyntää tehokkuuden parantamiseksi nykyisten solunsalpaajiin.

Perinteiset kemoterapia on ollut pitkälti tehoton hoidossa CRPC; doketakseli on ainoa kemoterapia agentti ovat saaneet luvan CRPC pohjalta rajoitetun parannusta kokonaiselossaoloaikaa [3]. Anti-metaboliitin 5-FU on ollut tukipilari kiinteä kasvain kemoterapiaa yli viiden vuosikymmenen ajan; tultaessa solu, 5-FU muunnetaan kolmeksi aktiiviset metaboliitit fluoriuridii- trifosfaatiksi (FUTP), flurodeoxyuridine trifosfaatiksi (FdUTP) ja flurodeoxyuridine monofosfaatin (FdUMP), jotka ovat väärin sisällytetty RNA, edistää DNA-vaurioita, tai edistää esto ja tymidylaattisyntaasientsyymin, vastaavasti [4]. Viimeaikaiset vaiheen II tutkimuksia 5-FU ja sen suun analogiset kapesitabiinin ovat osoittaneet niiden olevan turvallisia toisen linjan hoitona metastasoituneen CRPC, vaatimaton vasteita havaittiin, kun sitä annettiin yhdessä doketakselin tai oksaliplatiinin [5], [6]. Vaikka nämä selvästi jäävät optimaalisia ratkaisuja, kyky kohdistaa nopeasti lisääntyviä CaP solut indusoimalla S-vaiheen lohkon ja tämän jälkeen apoptoosin yhä houkutteleva terapeuttinen skenaario, erityisesti kasvaimia, jotka ovat refraktaarisia antiandrogeeninen hoito.

syöpäsolujen kohdistuu lausutaan autokriiniseen CXCL8 signalointi ärsyke, joka kasvaa taudin vaiheesta ja on maksimaalinen kastraatiotason-resistenttejä [7], [8]. Suuruus CXCL8 signaloinnin voimistaa ympäristötekijät, kuten hypoksia [9] ja kemiallisesti indusoitua stressiä, mukaan lukien altistuminen kemoterapia-aineisiin [10], [11], joka samanaikaisesti säätelevät ilmentymistä ligandin ja reseptorien kautta se välittää sen biologiset vaikutukset eli CXCR1 ja CXCR2. CXCL8 edistää etenemistä castrate-resistenssin kautta ligandista riippumattoman aktivaation androgeenireseptorin (AR) [12], [13] ja indusoi leviämisen metastaattisen eturauhassyövän soluissa [7], [14] (). Lisäksi olemme osoittaneet, että stressin aiheuttama CXCL8 signaloinnin vaimentaa herkkyyttä eturauhasen syöpäsolujen apoptoosia vasteena DNA: ta vaurioittavien aineiden [9], [10], Hsp90-suunnattu estäjät [15], ja syöttämällä reseptorin agonistit (TRAIL) [11] ja AR-kohdennettuja terapeuttisten kuten bicalutimide (Casodex) [13].

tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää, miten sisäinen ja /tai hoidon aiheuttama CXCL8 signalointi säätelee vaste CRPC solujen anti -metabolites.

Materiaalit ja menetelmät

Kemialliset ja reagenssit

Kaikki kemikaalit olivat lähde Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), ellei toisin mainita. 5-FU saatiin Bridgewater Kemoterapia Suite, Belfast kaupungin sairaala. Pemetreksedi oli ystävällinen lahjoitus tri Dean Fennell (CCRCB, QUB, Belfast, UK). AZ10397767 luovutti ystävällisesti Dr. Simon T. Barry ja tohtori David Blakey (AstraZeneca, Alderley Park, Cheshire, UK).

Cell Culture

PC3 eturauhassyövän solut viljeltiin kuten aiemmin on kuvattu [10]. Seuraavissa kokeissa tutkittaessa CXCL8 signalointia, PC3-soluja inkuboitiin seerumittomassa RPMI 1640-alustassa 16 tuntia ennen altistamista 3 nM rekombinanttia ihmisen (rh) -CXCL8 (Peprotech, Lontoo, UK).

Sytotoksiset aineet

5-FU: n ja pemetreksediliuos säilytettiin 4 ° C: ssa 10 mM kantaliuokset. Sarjalaimennoksia tehtiin steriiliin injektioveteen ja lääkkeet lisättiin suoraan soluihin, jolloin saadaan haluttu pitoisuus sytotoksinen aine. Kun kyseessä on 5-FU: n hoitoon, soluja ylläpidettiin ja käsiteltiin elatusaineessa, joka sisälsi dialysoitua FCS: ää.

siRNA Transfektiot

siRNA transfektiot suoritettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [11]. Solut (5 x 10

5) pestiin kahdesti steriilissä PBS: ssä ja sitten inkuboitiin transfek- seos, joka käsittää OPTIMEM, Oligofectamine (Invitrogen, Paisley, UK), ja erityiset oligonukleotidi (Bcl-2 200 nM; Dharmacon Inc) 48 tuntia 37 ° C: ssa. Ei-kohdennussekvenssin sisällytettiin näissä kokeissa samassa pitoisuudessa kuin siRNA järjestyksessä käytetty.

Cell Count Analysis

Solut (1 x 10

5 solua /kuoppa) sallittiin kiinnittyä yön yli. Elatusaine korvattiin tuoreella RPMI 1640 väliaineessa ja käsiteltiin eri pitoisuuksilla 5-FU tai pemetreksedin puuttuessa tai läsnä AZ10397767 (20 nM). Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-ilmakehässä 72 tuntia, sitten trypsinisoitiin ja laskettiin käyttäen Coulter® Z

TM Series hiukkasten määrä ja koko analysaattori (Beckman Coulter, Miami, FL), kuten aikaisemmin kuvatulla tavalla [10]. Solujen lukumäärät normalisoitiin kontrolliarvoihin ja tilastollisia analyysejä tietojen suoritetaan käyttämällä GraphPad PRISM 3.0 -ohjelmisto.

virtaussytometria

solu- syklin analyysi arvioitiin propidiumjodidivärjäys soluja kuten aiemmin on kuvattu [ ,,,0],10].

immunoblottauksella

kokosolulysaateille valmistettiin, ratkaistaan ​​ja blotattiin kuten aiemmin on kuvattu [7]. Membraanit pestiin Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa /0,1% Tween-20 (TBS-T), salvattiin sitten 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa 5% naudan seerumin albumiinia /TBS-T (BSA /TBS-T). Kalvoja testattiin primaarisilla vasta-aineilla on Bcl2 (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), TS (Rockland Immunochemicals Inc., Gilbertsville, PA) tai PARP (eBiosciences Inc., San Diego, CA, USA). Membraanit pestiin kolme kertaa TBS-T: n ja sitten inkuboitiin piparjuuriperoksidaasiin (HRP) -leimattu sekundaarista vasta-ainetta (GE Healthcare UK Ltd, Buckinghamshire, UK). Sen jälkeen kolme pesua TBS-T bändejä havaittiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin (ECL plus reagenssit, Amersham Biosciences). Kalvot uudelleen koetettiin GAPDH vasta-tasapuolisen lastaus (Biogenesis, Dorset, UK).

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR (qPCR) B

RNA kerättiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [9]. Real-time PCR, 1 ug kokonais-RNA oli oligo (dT) käänteistranskriptio käyttäen MMLV-RT (Invitrogen, Paisley, UK) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. 50 ng cDNA sekoitettiin alukkeilla (2 nM), steriili vesi ja SYBR Green PCR Mastermix (Roche Diagnostics, Sussex, UK). Alukesekvenssit olivat, kuten aiemmin on raportoitu [9]. Reaaliaikainen PCR suoritettiin 96-kuoppaisen levyn käyttämällä LC480 valoa cycler väline (Roche Diagnostics). Kynnyssyklinä (C

P) laskettiin kullekin reaktiossa LC480 järjestelmän. Tuntematon ilmentymisen tasot määritettiin käyttämällä suhteellisen standardikäyrän menetelmää ja normalisoidaan 18S.

ELISA

määrä erittyy CXCL8 havaittu keskipitkällä eturauhassyöpäsolujen määritettiin käyttäen ELISA-määritystä mukaan valmistajan ohjeita (Pelikine Compact CXCL8 ELISA kit, Beckman Coulter, High Wycombe, UK), kuten aiemmin on kuvattu [9]. CXCL8 pitoisuus kussakin näytteessä laskettiin vertaamalla standardikäyrän avulla varastoliuoksesta injektiopullo CXCL8.

Tulokset

5-FU voimistaa kemokiini signalointi metastaattisessa CaP soluissa

PC3-solulinja eristettiin alunperin luun etäpesäke CaP, ja näin ollen pidetään kliinisesti-asianmukainen malli järjestelmä tutkia pitkälle CaP [16]. Koska ennen tutkimukset ovat osoittaneet solunsalpaajiin aiheuttaa CXCL8 synteesin, alunperin kokeiluja keskittyi luonteenomaiset vaikutuksista annetaan antimetaboliittien kun eritystä tämän kemokiinin. Sen lisäksi, että käyttämällä 5-FU, alkuperäistä kokeita suoritettiin myös käyttäen pemetreksedin, multi-kohdennettu anti-folaattia, joka estää tymidylaattisyntaasia (TS), dihydrofolaattireduktaasia (DHFR), ja glysinamidiribonukleotidiformyylitransferaasia (GARFT), kaikki entsyymit osallistuvat

de novo

biosynteesissä tymidiinin ja puriininukleotidien [17]. Erityinen ELISA käytettiin määrällisesti CXCL8 eritystä PC3 soluista yli 8 tunnin timecourse, vertaamalla aika-verrokit 5-FU-käsitelty tai pemetreksedi- käsiteltyjä soluja. Anto 5-FU edistää merkittävää kasvua CXCL8 eritystä PC3-solujen (P 0,05) (kuvio 1A). Kuitenkin Pemetreksedin anto oli vähäinen vaikutus CXCL8 eritykseen (kuvio 1 B). Voit tarkistaa havaintojemme kokeet toistettiin LNCaP eturauhassyöpäsolulinja; lisäämällä 1 uM 5-FU myös nostivat CXCL8 erittää tässä solulinjassa (kuvio 1C).

(A) bar käyrä tason CXCL8 erityksen käsittelyn jälkeen PC3-solujen kanssa 1 uM 5- FU. Arvot on piirretty suhteessa aika-haun ohjaus ja edustavat keskiarvoa ± SEM Kolmen riippumattoman kokeen. (B) Kuten A, paitsi että solut käsiteltiin 1 uM pemetreksedin. Erot CXCL8 ilmaisun välillä ajan sovitettu ohjaus ja lääkkeellä käsiteltyihin näytteet analysoitiin kaksisuuntaista Studentin t-testiä; *, P 0,05. (C) bar käyrä tasot CXCL8 erityksen käsittelyn jälkeen LNCaP 1 uM 5-FU. Arvot on piirretty suhteessa aika-haun ohjaus ja edustavat keskiarvoa ± SEM kolmen itsenäisen kokeen.

vaikutuksia 5-FU: n ja pemetreksedin annon yhteydessä ilmaus CXCL8 reseptorien tutkittiin myös käyttämällä kvantitatiivista PCR-analyysiä. Anto 5-FU oli voimakas ja jatkuva vaikutukset, kun geenin ilmentymisen molempien CXCR1 (kuvio 2A, vasen paneeli) ja CXCR2 (kuvio 2B, vasen paneeli), lisäämällä transkriptipitoisuuksissa tekijöillä 8- ja 15-kertaiseksi. Sen sijaan, anto pemetreksedin oli ohimenevä ja vähäinen vaikutus geeni-ilmentymisen joko reseptorin. Edelleen vahvistivat, että 5-FU: n antamisen kasvoi myös CXCR1 ja CXCR2 transkriptipitoisuuksissa LNCaP-soluissa (kuvio 2A /B, oikea paneeli), vaikka vastaus oli selvästi selektiivisempi CXCR2 tässä solulinjassa.

(A ) Pylväsdiagrammi, joka esittää ajasta riippuvia muutoksia CXCR1 transkriptipitoisuuksissa PC3-soluissa (vasen paneeli) ja LNCaP-soluja (oikea paneeli) havaittuna qPCR analyysin hoidon jälkeen 1 uM 5-FU (mustat palkit) tai 1 uM Pemetreksedi (open palkit – PC3-solut vain). Expression on esitetty omana kertamuutosta suhteessa geeniekspressiotasot havaittiin käsittelemättömissä soluissa. (B) Kuten A, paitsi että tiedot osoittavat geenin ilmentymistaso havaittiin CXCR2. Näytetyt tiedot keskiarvoa ± SEM neljästä itsenäisestä kokeesta. Tilastollisesti merkitseviä eroja ei määritettiin käyttämällä Studentin kaksisuuntaista t-testiä (*, p 0,05).

inhibitio CXCL8 signaloinnin voimistaa 5-FU: n tehoa metastaattisen CaP soluissa

solumäärä määrityksiä käytettiin kuvaamaan suhteellinen sytotoksisuuden 5-FU tai pemetreksedin PC3-soluissa ja sen määrittämiseksi, onko lääkkeen aiheuttama tai luontainen CXCL8 signalointi vaikuttaa herkkyys näille aineille. Esto CXCL8 signalointi on suoritettu käyttämällä selektiivistä CXCR2-reseptorin antagonisti, AZ10397767. PC3-solut olivat vain herkkiä 5-FU pitoisuuksina, jotka ylittävät 1 uM (kuvio 3A). Lisäämällä AZ10397767, käytetään lopulliseen pitoisuuteen 20 nM voidakseen suorittaa selektiivisyys CXCR2 reseptorin lisäsi tehoa 5-FU aiheuttama sytotoksisuuden PC3-soluissa. Ei-lineaarista regressioanalyysiä, että tiedot vahvistivat, että inhibitio CXCR2 signaloinnin parantaa tehoa 5-FU 3,8-kertaiseksi, lisäämällä laskettu IC

30-arvo 4,2 uM 1,1 uM (n = 4). Lisäksi tietojen analysointi määritetty, että lisäämällä AZ10397767 5-FU oli synergistinen, jonka laskettu RI arvon 1,2, kun taas ANOVA-analyysi vahvisti vahvan välisen synergistisen vuorovaikutuksen 5-FU: n ja AZ10397767 (P 0,0001). Samoin hallintoa AZ10397767 lisääntynyt herkkyys LNCaP 5-FU. Tukahduttaminen CXCR2 signalointi ei ollut vaikutusta lisäämään maksimaalisen vasteen 5-FU-hoidon joko solulinjassa. Sen sijaan hallinnon CXCR2 antagonisti ei lisännyt tehoa tai maksimaalisen vasteen pemetreksedin PC3-soluissa (Täydennyskuvio S1). Teho pemetreksedin näissä määrityksissä laskettiin 0,27 uM.

(A) Kuvaajat havainnollistaa solumäärämäärityksessä tietoja, määritetään hoito PC3-solujen (vasen paneeli) tai LNCaP (oikea paneeli) kasvavien pitoisuuksien joko 5-FU, puuttuessa tai läsnä ollessa CXCR2-reseptorin antagonisti, AZ10397767. AZ10397767 annettiin lopulliseen konsentraatioon 20 nM. Solujen määrä otettiin 72 tunnin kuluttua altistuksesta, jossa anti-metaboliitti. Solumäärä analysoitiin käyttäen ei-lineaarista regressiota funktio GraphPad Prism, käyttäen sigmoidaalista yhdellä päällä käyrän yhtälöllä. Data pistettä osoittaneet ovat keskiarvo ± SEM arvo neljä itsenäistä kokeita. (B) pylväsdiagrammi, joka havainnollistaa vaikutus käyttämällä siRNA ja pudotus CXCR1 ja CXCR2 ilmaisun, kun sytotoksisuus 1 uM 5-FU: PC3 (vasen paneeli) ja LNCaP-soluja (oikea paneeli). Data pistettä osoittaneet ovat keskiarvo ± SEM arvo neljä itsenäistä kokeita. (C) Pylväsdiagrammi, joka esittää tasoa apoptoottisten solujen lääkettä saaneissa PC3 (vasen paneeli) ja LNCaP (oikea paneeli) solupopulaatioiden. Tiedot osoittavat, osa G0 /G1-solupopulaatio määritettiin virtaussytometrialla analyysi hoidon jälkeen kasvavien pitoisuuksien kanssa 5-FU, puuttuessa ja läsnä ollessa CXCR2-reseptorin antagonisti, AZ10397767.

Ylimääräisenä validointi meidän saatujen tulosten kanssa CXCR2 antagonisti, käytimme siRNA-strategia tukahduttaa reseptoriekspressiota. Huolimatta käyttämällä kaupallisia sekvenssit väitetään olevan selektiivinen CXCR1 tai CXCR2 Knockdown, myöhemmät RT-PCR-analyysillä määritettiin merkittäviä alassäätöä vastavuoroisia reseptorin PC3 ja LNCaP. Riippumatta, down-regulation of CXCR1 ja CXCR2 ilmentyminen johti suurempaan menetykseen PC3 ja LNCaP solujen elinkyky, kun läsnä oli 1 uM 5-FU: n (kuvio 3B).

Virtaussytometria-analyysi vahvisti, että inhibitio CXCR2 signalointi voimistua 5-FU: n indusoiman apoptoosin sekä PC3 ja LNCaP. Suhteessa käsittelemättömiin kontrollisoluihin, kasvua pitoisuuksilla kuin 5-FU: n 1 uM 10 uM johti lisääntyneeseen kertyminen solujen S-vaiheen solusyklin (Täydennyskuvio S2) ja havaitseminen lisääntynyt solujen prosenttiosuus sub G0 /G1 vaiheessa (kuvio 3C). Lisäämällä AZ10397767 yksin PC3 soluihin ei havaittu vaikuttavan millään vaiheessa solusyklin klo 72 h ajan-. Kuitenkin, kun se yhdistetään 1 uM 5-FU, AZ10397767 vähentynyt kertyminen solujen pidätettiin S-vaiheen solusyklin, kun samanaikaisesti tason nostaminen apoptoottisten solujen havaittu (p 0,0045) (Täydennyskuvio S2).

CXCL8 signalointi edistää tavoitteellisesti liittyvän resistenssin 5-FU

Tymidylaattisyntaasi (TS) lauseke on keskeinen tekijä 5-FU herkkyys [18], [19]. Lisääntynyt herkkyys solujen 5-FU jälkeen tukahduttamisen CXCL8 signaloinnin sai meidät tutkimaan, CXCL8 signalointi säänneltyjä ilmaisu tämän entsyymin korkki soluissa. PC3-soluja ja LNCaP-soluja kussakin stimuloitiin 3 nM rekombinantti-ihmisen CXCL8 (rh-CXCL8) enintään 8 h. TS-geenin ilmentyminen oli aluksi analysoitiin kvantitatiivisella PCR; joka vahvisti kasvua yli 4-kertaisesti molemmissa solulinjoissa seuraavien stimulaation rh-CXCL8 (kuvio 4A). Expression of TS entsyymin analysoitiin myös immunoblottauksella. Stimulaatio rhCXCL8 lyhyen ajan kurssin vahvisti välitöntä lisäämistä ilmaus TS PC3-soluissa (kuvio 4B). Lisäksi sopusoinnussa lisäys mRNA-transkriptin tasot, havaitsimme myöhemmin vastaus CXCL8 antoa, jossa TS ekspressiotasoja osoitettiin lisäävän hetkellä huomauttaa 8 h PC3-soluissa (kuvio 4C, vasen paneeli) ja LNCaP-soluja (kuvio 4C, oikea paneeli).

(A) Pylväsdiagrammi, joka esittää ajasta riippuvia muutoksia TS transkriptipitoisuuksissa PC3-soluissa (vasen paneeli) ja LNCaP-soluja (oikea paneeli) havaittuna qPCR analyysin hoidon jälkeen 3 nM rhCXCL8. Expression on esitetty omana kertamuutosta suhteessa geeniekspressiotasot havaittiin käsittelemättömissä soluissa. (B) Immunoblot osoittavat vaikutuksen annettaessa 3 nM rhCXCL8 kun taso TS ilmentymistä PC3-soluissa, havaittiin jopa 1 h stimulaation jälkeistä solujen. (C) Immunoblot, joka esittää taso TS ilmentymisen havaittiin PC3-soluissa (vasen paneeli) ja LNCaP-soluja (oikea paneeli) jopa 8 h stimulaation jälkeen solujen kanssa rhCXCL8. Yhtä suuri kuin proteiinin lastaus kunkin edustajan blotteja on esitetty (B) ja (C) vahvistettiin uudelleen koettimella kalvojen havaita ilmentymisen GAPDH. Tilastollisesti merkitseviä eroja ei määritettiin käyttämällä Studentin kaksisuuntaista t-testiä (***, p 0,001).

seuraavan tutkittiin, kuinka esto CXCR2 signalointi vaikuttaa TS ilmaisua. Lisäämällä AZ10397767 ja PC3-solujen vaimensi CXCL8 aiheuttama lisäys TS-geenin transkriptin tasot (kuvio 5A) ja vähentää CXCL8-edistää korotukset TS-proteiinia (kuvio 5B). Koska yhdistys CXCL8 ja CXCR2 sääntelyyn TS ilmaisun, tutkimme vaikutus CXCL8 signalointi kun tehoa Tomudex (TDX) estäjä ja TS-suunnattu terapeuttinen. PC3-solut olivat merkittävästi herkkä TDX jopa korkeita pitoisuuksia lääkkeen. Kuitenkin, kuten 5-FU, teho TDX lisääntyi merkittävästi yhteistyössä hallinto CXCR2 antagonisti AZ10397767 (kuvio 5C, vasen paneeli). Ei-lineaarista regressioanalyysiä, että solumäärä tiedot vahvistivat, että teho (IC30) on TDX kasvoi 37-kertaiseksi, 1,1 uM 30 nM läsnä ollessa AZ10397767. Vuorovaikutus AZ10397767 ja TDX oli vahvasti synergistinen, määritettiin kahdella tavalla tilastollisen analyysin (RI = 1,4, ANOVA P 0,0001). Tuloksemme osoittavat myös, että maksimaalinen vaste TDX on hieman lisääntynyt läsnä ollessa CXCR2 antagonisti. Sen sijaan, LNCaP-solut olivat paljon herkempiä TDX yksin, ja näin ollen herkkyyttä ei voida tehostaa edelleen lisäämällä CXCR2-antagonisti (kuvio 5C, oikea paneeli).

(A) pylväsdiagrammi, joka havainnollistaa vaikutus CXCR2 estäjän on CXCL8-edistänyt kasvua TS transkriptipitoisuuksissa PC3-soluissa havaittuna qPCR analyysi. Inhibiittori lisättiin yön yli ja stimuloitiin 3 nM rhCXCL8 8 tuntia. (B) Edustava immunoblot, joka havainnollistaa vaikutusta CXCR2 inhibiittorin AZ10397767 ilmentämällä TS stimuloimattomissa ja CXCL8-stimuloiduissa olosuhteissa. AZ10397767 lisättiin yön yli ja stimuloitiin 3 nM rhCXCL8 8 tuntia. (C) Kaavio, joka havainnollistaa solumäärämäärityksessä tietoja, määritetään hoitoon PC3-solujen (vasen paneeli) ja LNCaP-soluja (oikea paneeli) kasvavien pitoisuuksien kanssa Tomudex puuttuessa tai läsnä ollessa CXCR2-reseptorin antagonisti, AZ10397767. Solujen määrä otettiin 72 tunnin kuluttua altistuksesta, jossa anti-metaboliitti. Solumäärä analysoitiin käyttäen ei-lineaarista regressiota funktio GraphPad Prism, käyttäen sigmoidaalista yhdellä päällä käyrän yhtälöllä. AZ10397767 annettiin lopullinen konsentraatio 20 nM kaikissa kokeissa. Data pistettä osoittaneet ovat keskiarvo ± SEM arvo kolmen erillisen kokeen; * P 0,05; ** P 0,01.

inhibitio Bcl-2, alavirran CXCL8 transkription kohde- herkistää CaP soluja 5-FU

CXCL8 signalointi lisäävät ilmentymistä useiden anti-apoptoottisen geenejä, mukaan lukien Bcl-2 [10]. Pieni-häiritsevä RNA (siRNA) strategiaa käytettiin inhiboimaan Bcl-2. Immunoblottaus vahvisti, korkea endogeenisen Bcl-2: n ilmentymisen in PC3-soluissa. Solujen transfektio, jossa lopullinen konsentraatio on 50 nM Bcl-2-kohdennettuja oligonukleotidi (Bcl-2-T) vähensi, mutta ei poistanut Bcl-2: n ilmentymisen in käsittelemättömän tai 5-FU-käsitelty solupopulaatioiden. Mielenkiintoista on, että altistuminen itse 5-FU on osoitettu lisäävän Bcl-2: n ilmentymisen PC3-soluissa (kuvio 6A). Down säätelevä Bcl-2 yksinään oli huomattava vaikutus edistämisessä apoptoosin PC3-soluissa (nostamisesta 8,5% ja P 0,001 verrattuna salattu ohjaus (SC). Vaikka 1 uM 5-FU oli vähäinen vaikutus apoptoosin, kombinaatio 1 uM 5-FU: n ja Bcl-2 siRNA-oligonukleotidien kasvattanut apoptoottisten solujen keskiarvo 10,7%, (P 0,01 verrattuna 5-FU hoito yksinään) (kuvio 6B). lisääntynyt taso apoptoosin aiheuttama alas-säätely Bcl-2 puuttuessa ja läsnä oli 5-FU vahvistettiin havaitseminen kasvoi PARP pilkkominen immuunitäpläkokeilla (kuvio 6C).

(A) Immunoblot esitellään ilmentymistason anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-2: PC3-soluissa, jotka oli transfektoitu ei-kohdistuksen oligonukleotidi (Sc), tai geenin, kohdistetun oligonukleotidin (Bcl2-T). Kaikki oligonukleotideja käytettiin lopullisena pitoisuutena 50 nM. Expression of Bcl-2 on esitetty puuttuessa tai läsnä on 1 uM 5-FU. (B) Pylväsdiagrammi, joka esittää apoptoottisten solupopulaation määritetään virtaussytometrialla analysointia PC3-soluissa, jotka oli transfektoitu ei-kohdistuksen oligonukleotidi (Sc), tai geenin, kohdistetun oligonukleotidin (Bcl2 -T) lopulliseen pitoisuuteen 50 nM, puuttuessa tai läsnä on 1 uM 5-FU. Tilastollisesti-merkittäviä eroja apoptoosin tasot määritettiin tekemällä kaksisuuntaisella Studentin t-testi analyysi; *, P 0,05; **, P 0,01. (C) Immunoblot esittää ilmaisun ja hajoamistuotteessa PARP PC3-soluissa, jotka oli transfektoitu ei-kohdistuksen oligonukleotidi (Sc), tai geenin, kohdistetun oligonukleotidin (Bcl2-T), käytetään lopulliseen konsentraatioon 50 nM, puuttuessa tai läsnä on 1 uM 5-FU. Equal Proteiinilisäyksen immunobloteissa esitetty (A) ja (C) vahvistettiin uudelleen luotaa kalvoja ilmentämiseksi GAPDH.

Keskustelu

CRPC on tällä hetkellä parantumaton sairaus. Vaikka syntynyt uusi sukupolvi androgeenireseptorin signalointireitin estäjät (esim abirateronin-asetaatti ja MDV3100) käytettäväksi CRPC potilailla parantavat osaltaan tuloksia monille potilaille, on selvää, että enemmän tietoa tavanomaisten kemoterapeuttisten aineiden on tarpeen parantaa hoitotuloksia potilaille, joille nämä uudet lääkkeet eivät toimi. 5-FU ja sen suun analogiset kapesitabiinin on raportoitu olevan turvallinen kuin toisen linjan hoitona metastasoituneen kastraatiotason korkilla, jossa on vaatimaton vasteita havaittiin, kun sitä annettiin yhdessä doketakselin tai oksaliplatiinin pienissä vaiheen II tutkimuksissa [5], [6 ]. Lisääminen vastauksena toisen linjan kemoterapia on ensiarvoisen tärkeää laajentamiseen eloonjäämiseen ja laatu-of-life potilailla, joilla on edennyt sairaus.

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että on tärkeää CXCL8 signaloinnin perustana romaani tila kohde liittyvä vastus, joka vähentää herkkyyttä metastaattisen CaP solujen 5-FU. CXCL8 ilmentyminen natiivisti koholla metastasoituneen tai CRPC yli normaalin tai hyvänlaatuista eturauhasen kudosta [7], [8], [20]. Lisäksi olemme vahvistaneet, että altistus 5-FU voimistaa tätä tasoa CXCL8 opastinjärjestelmillä samanaikaisesti indusoimalla CXCL8 eritystä ja ajan säätelevä CXCR1 ja CXCR2 geeniekspression metastaattisessa eturauhassyövän solut. Tärkeää on, inhibitio luontaisia ​​ja lääkkeiden aiheuttaman CXCL8 signalointia käyttäen pieni molekyyli CXCR2-reseptorin antagonisti tilastollisesti merkittävän kasvun herkkyyttä CRPC solujen 5-FU. Vaikka olemme yksinomaan tutkineet rooli CXCL8 moduloinnissa tämän vastauksen, havaintojemme käyttäen CXCR2 estäjä osoittaa, että stressistä johtuvaa nousua ylimääräinen CXC-kemokiinien että myös aktivoida CXCR2 reseptorin lukien CXCL1 ja CXCL5 todennäköisesti myös osaltaan terapeuttisia vastus.

Kohonnut ilmaus TS on vakiintunut biomarkkeri laski 5-FU tehoa kasvaimissa [18], [19]. Anto joko 5-FU tai CXCL8 yksinään havaittiin lisäävän TS geenin ja proteiinin tasot. Stimulaatio CXCL8 osoitettiin edistämään kaksi vaihetta sääntelyn. Havaitsimme nopea kasvu TS ilmaisun vastauksena CXCL8 antoa, vastaa meidän aikaisempien tutkimusten luonteenomaiset roolia tämän kemokiinin säätelyssä proteiini käännös [14]. Tätä seurasi myöhemmin alkanut kasvu proteiinin ekspression, sopusoinnussa CXCL8-edistänyt kasvua transkription TS-geenin. Anto CXCR2 antagonistin on osoitettu heikentävän CXCL8 aiheuttama lisäys TS-geenin ja proteiinin ekspressiotasot. Näin ollen tietomme osoittavat, että CXCL8 signalointi ilmenee kohde-liittyvä vastus 5-FU: CRPC soluissa lisäämällä ilmentymistä TS. Tätä päätelmää tukee lisäksi havainto, että anto CXCR2 antagonisti oli syvällinen vaikutus herkistävät PC3 solujen suora TS kohdistetun estäjä, Tomudex.

Lisäksi ehdotamme, että CXCL8 signalointi voi lisäksi myötävaikuttaa solun resistenssin 5-FU lisäämällä anti-apoptoottisen proteiinin ekspressiota. Virtaussytometria ja PARP pilkkominen analyysit osoittivat, että suojaava vaikutus CXCL8 signalointi välittyy mahdollistaa solujen välttää kemoterapian indusoiman apoptoosin. Olemme aiemmin osoittaneet, että CXCL8 voi säätää ylös antiapoptooppinen ilmentymistä korkki soluissa, kuten ilmaus Bcl-2, ja että samanaikainen anto AZ10397767 voi alas-säädellä kemoterapiaindusoitu tämän proteiinin ilmentymisen [10], [11] . Tarjoamme lisäksi näyttöä siitä, että tukahduttaminen Bcl-2 voi nostaa apoptoosin 5-FU-käsitellyt solut. Näin ollen, CXCL8 signalointi voi myös edistää vastus CRPC solujen 5-FU helpottamalla kasvu ekspression kriittisen estäjiä apoptoosin.

Nykyinen tutkimus paljastaa hyvin selkeä ja lääkkeen erityinen vaikutus anti -metabolites on CXCL8 signalointia. Vaikka 5-FU ehkäisee TS aktiivisuutta, pemetreksedi on monen kohdistetun estäjän kanssa johtuvat vaikutukset kolme folaatti riippuvaisten entsyymien tymidiinin ja puriinin nukleotidisynteesiä reittejä; TS, dihydrofolaattireduktaasi (DHFR), ja glysinamidiribonukleotidiformyylitransferaasia (GARFT) [17]. Vaikka 5-FU voimistua CXCL8 eritystä ja lisääntynyt CXCL8 reseptorin ilmentymisen PC3-soluissa, pemetreksedin oli vähäinen vaikutus ilmaus CXCL8 tai sen reseptorit. Siksi havaintomme että CXCR2 antagonisti olisi ollut mitään vaikutusta herkkyyttä solujen pemetreksedi voi koskea puuttuessa pemetreksedin aiheuttama lisäys CXCL8 signalointi ja /tai heijastaa jotka CXCL8 signalointi ei ehkä säännellä laajempi tavoitteista, joiden toiminta on moduloitu pemetreksedi. Vaikka PC3-solut olivat herkkiä ja vastasi myönteisesti pemetreksedin hoidon, vaiheen II tutkimukset potilailla ovat epäonnistuneet edesautetaan käyttää tätä ainetta toinen rivi kemoterapiaa metastasoineeseen CRPC, mikä viittaa siihen, että muut resistenssimekanismit merkitystä tämän lääkkeen ovat leikkiä tämä tauti asetus [21], [22].

CXCL8 signalointi on suuri proinflammatoristen signaalin useiden kiinteiden kasvainten kuten rinta- ja paksusuolen ja peräsuolen syöpiä [23], [24], sairauksiin, joissa 5-FU on tällä hetkellä käytetään tai suositellaan vakiona-of-hoidon etäpesäkkeitä.