Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tuotanto metalloproteinaasien (MMP: t) varten hajoamisen soluväliaineen on tärkeä askel syövän etäpesäkkeiden. Tutkimme vaikutukset HPV16 onkoproteiineja (16E6, 16E6 * I ja 16E7), joko yksin tai yhdessä, sen transkriptio 7

MMP

s osallisina kohdunkaulan syövän invasiivisuus. Tasot 7

MMP

raportoitu lisääntynyt kohdunkaulan syövän määritettiin C33A vakaasti ilmaista erilaisia ​​HPV16 onkoproteiineja käyttäen kvantitatiivista RT-PCR ja verrattiin hyökkäys kyky solulinjoja käyttämällä

in vitro

invaasio ja haavan paranemista määrityksissä. Yliekspressio

MMP-2

ja

MT1-MMP

havaittiin HPV16E6E7 ilmentävät solut, jotka korreloivat lisääntynyt soluinvaasiota. Yhdistelmä HPV onkoproteiineja aina osoitti suurempi vaikutus kuin yksittäisten muodossa. Esto soluinvaasion käyttämällä erityistä MMP-2-estäjän, OA-Hy, ja anti-MT1-MMP-vasta-ainetta vahvistettiin, että hyökkäys näissä soluissa oli riippuvainen sekä MMP-2 ja MT1-MMP ilmentymistä. Ehtyminen HPV16E6E7 by shRNA välittämä knock-down kokeiden tuloksena vähentynyt MMP-2 ja MT1-MMP ekspressiotasot sekä vähennetään invaasio kyky, joka voimakkaasti ehdotti konkreettisia vaikutuksia HPV onkoproteiineja molemmilla MMP ja solujen invaasiota. Immunohistokemia tutkimuksessa invasiivisen kohdunkaulan syöpiä vahvisti tehostetun

in vivo

ilmentymistä näiden kahden MMP: iden HPV16-infektoiduissa soluissa. Lisäksi mahdolliset sivustot vaatimat HPV16E6E7 on

MMP-2

ja

MT1-MMP

promoottorit tutkittiin ja PEA3 (at -552 /-540 varten

MMP-2

, -303 ja

MT1-MMP

) ja SP1 (at -91 varten

MMP-2,

-102 varten

MT1-MMP

) sitoutumiskohtia osoitettiin on olennaista välittävät heidän transaktivaation toimintaa. Lopuksi todettakoon, että tutkimus osoitti, että HPV16E6 ja E7 onkoproteiineja yhteistyötä edistääkseen kohdunkaulan syövän invasiivisuus vastaavat erityisesti säätelemällä

MMP-2

ja

MT1-MMP

transkriptio samalla tavalla.

Citation: Kaewprag J, Umnajvijit W, Ngamkham J, Ponglikitmongkol M (2013) HPV16 onkoproteiineja edistää kohdunkaulan syövän invasiivisuus säätelemällä Erityiset Matrix Metalloproteinases. PLoS ONE 8 (8): e71611. doi: 10,1371 /journal.pone.0071611

Toimittaja: Nikos K. Karamanoun, University of Patras, Kreikka

vastaanotettu: 28 helmikuu 2013; Hyväksytty: 01 heinäkuu 2013; Julkaistu: 13 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Kaewprag et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin tiedekunnan ja Medical Scholars Program, Mahidol yliopisto, Thaimaa ja National Research Council of Thailand. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Jatkuva infektio korkean riskin ihmisen papilloomavirusten (HPV) on tärkein syy kohdunkaulan syövän, joka on toiseksi yleisin syöpä Thai women [1]. HPV16 havaitaan useimmiten ja muodostaa yli 50% kaikista kohdunkaulan syövistä maailmanlaajuisesti [2]. Karsinogeneesi johtuen HPV16 johtuu viruksen onkoproteiineja, E6 ja E7, niiden vuorovaikutusta isännän solun proteiinien mukana solusyklin säätelyssä johtaa solutransformaatio ja kuolemattomaksi [3]. HPV 16E7 (16E7) sitoutuu solusykliä proteiinin pRb, joka altistetaan seuraavaksi hajoamisen kautta proteasomin-välitteisen prosessin [4], kun taas HPV16E6 (16E6), vuorovaikutuksessa ja indusoi proteasomin-välitteinen hajoaminen p53 [5]. Sekä E6- ja E7-onkoproteiineja voivat myös moduloida transkription useiden isännän geenejä. Esimerkkejä ovat 16E6 riippuva säätelyä katalyyttisen alayksikön ihmisen telomeraasin käänteistranskriptaasin (

hTERT

) ja transformoiva kasvutekijä β (

TGFli

geenejä erityisillä SP1 sitoutumiskohtia [6], [7 ] ja lisääntyneen ekspression DEK proto-onkogeeni, joka koodaa vanhenemista estäjä, jonka E7 kautta pRb perheen proteiinin riippuvaisen reitin [8]. sen lisäksi, tuottaa täyspitkän E6 (16E6F), HPV16 muodostaa myös typistetty muoto E6 (16E6 * I), joka edistää Dlg proteiinien hajoaminen [9] ja transaktivaation aldo-keto-reduktaasin geenin [10].

rooli viruksen proteiinien kasvainten invasiivisuus todettiin ensimmäistä kertaa tutkimuksessa osoitetaan in hepatoomasolulinjassa kyky hepatiitti B -viruksen (HBV) X-proteiinin ekspression indusoimiseksi matriksin metalloproteinaasien MMP-2 ja MT1-MMP (MMP-14), kautta, Cox-2-riippuvaisen mekanismin [11]. MMP kuuluvat perheeseen, sinkkiä proteaasien vastuussa hajoaminen soluväliaineen joka tarvitaan maahanmuuttoa ja etäpesäke syöpäsolujen [12]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet yhdistyksen välillä läsnäolo MMP ja HPV kohdunkaulan syövän [13], [14]. Kohonnut ekspressiotasot useita MMP (MMP-1, MMP-2, MMP-3, MMP-7, MMP-9, MMP-10, MMP-11, MMP-12, MMP-13, MT1-MMP: n ja MMP -15) on raportoitu invasiivisen kohdunkaulan karsinoomat verrattuna normaaleissa kudoksissa [15] – [17]. Kuitenkin korrelaatio HPV onkoproteiineja ja MMP tyyppejä on edelleen kiistanalainen. Smola-Hess

et al

. osoitti, että keratinosyytit, jotka transformoitiin HPV16 ja HPV8 indusoima MT1-MMP [14]. Eräässä tuoreessa tutkimuksessa, kohonnut HPV16E7 ilmentymistä osoitettu liittyvän kasvun kanssa pro-MMP-9: n aktiivisuutta organotyyppisessä viljelmässä keratinosyyttien kuitenkin HPV16E6 /E7 ei ollut vaikutusta MMP-2, -9 ja MT1-MMP tasot ihmisen esinahan keratinosyyteissä [18]. Vaikka yli-ilmentyminen useita erilaisia ​​MMP on havaittu kohdunkaulan syövän kudoksissa, vain kohonnut MMP-2 ja MMP-9 oli osoitettu korreloivan huonon ennusteen potilailla [16]. Lisäksi suhde

MMP-2

mRNA-tasojen ja kohdunkaulan syövän invasiivisuus on osoitettu [19]. Aktivointi sekä MMP-2 ja MT1-MMP havaittiin levyepiteelikarsinooma kohdunkaulan karsinoomat [16] ja sukupolven aktiivisen muodon MMP-2: n osoitettiin edellyttävät aktivointia, jonka MT1-MMP [20]. Tämä vaatimus on tuettu sen osoittaminen, että MT1-MMP pystyy pilkkomaan MMP-2, jolloin muodostuu pro-MMP-2 /MT1-MMP /TIMP-2 kompleksi, joka parantaa konsentraatio aktiivisen MMP-2: n kärjessä tunkeutuvat syöpäsolut [21]. Vaikka useita MMP on päällekkäisiä aktiivisuus samanlainen ryhmä substraattien, sääntely niiden ekspressiotasoja näyttää itsenäisesti säänneltävä.

MMP-2

ilmentyy jatkuvasti monissa solutyypeissä, kun taas sytokiinien säännellä

MMP-9

transkriptio [22] ja sääntelyn

MT1-MMP

(konstitutiivista tai indusoitu ) jää epäselväksi [14].

tässä tutkimuksessa olemme analysoineet kykyä onkoproteiineja riskialttiisiin HPV16 ja HPV18 transkriptionaalisesti säännellä 7 tyyppisiä

MMP

s

(MMP- 1, -2, -7, -9, -10, -11

ja

MT1-MMP) B ja korreloivan MMP ilmaisutapoja soluinvaasiota kohdunkaulan syövän solulinjoissa. Lisäksi nämä tulokset verrattiin saatuja koepaloja invasiivisen vaiheessa kohdunkaulan syöpä. Me arveltu, että korkean riskin HPV onkoproteiineja voimistunut tietyntyyppisiä MMP kohdunkaulan syövän solut transkription tasolla.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Human kudosnäytteiden käytetty tässä tutkimuksessa saatiin kirjallinen suostumus potilailta tai heidän omaisilleen. Tutkimus hyväksyi eettinen komitea National Cancer Institute, Thaimaa (EY 236/2011).

plasmidikonstrukteja ja vakaasti transfektoituja solulinjoja

HeLa-, SiHa-, CaSki- (ystävällisesti toimittanut P . Chambon, IGBMC, Ranska) ja C33A (ATCC: HTB-31) kohdunkaulan syövän solulinjat ja ihmisen alkion munuais- 293T-solulinja (saatiin ystävällisesti P. Angeletti, University of Nebraska Lincoln, USA) pidettiin 37 ° C: ssa ilmakehässä 5% CO

2 DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% penisilliini-streptomysiiniä cocktail (GIBCO, Invitrogen). HPV16 onkogeeni cDNA, nimittäin, 16E6 (jotka sisältävät sekä 16E6 * I ja 16E6F), 16E6 * I, 16E7, 16E6E7 (sekä 16E6 ja 16E7) ja 16E6 * IE7 (molemmat 16E6 * I ja 16E7) valmistettiin SiHa-soluja ja cDNA: HPV18E6E7 (sekä 18E6 ja 18E7) ​​valmistettiin HeLa-soluista. Kaikki cDNA: t insertoitiin pcDNA3 vektori, ja C33A-solut, jotka ekspressoivat stabiilisti HPV-proteiineja tuotetaan ja ylläpidetään kuten aiemmin on kuvattu [10]. Kaksi lyhyttä hiusneula (sh) RNA konstruktioita (shE6A ja shE6B), jotka sisältävät oligonukleotidejä suunniteltu hiljentäminen HPV16E6 mRNA [23] ja ei-kohdistaminen negatiivinen kontrolli shRNA (shCtrl) kloonattiin pSUPER.retro.puro (OligoEngine). Promoottorikonstrukteja kertyi monistamalla DNA-sekvenssejä -1721 /+ 40, -1001 /+ 40 ja -211 /+ 40

MMP-2

promoottori ja -1,277 /+ 187, -425 /+ 187 ja -151 /+ 187

MT1-MMP

promoottori C33A soluista ja insertoitiin pGL3-Basic (Promega). Seuraavia alukkeita; -1721 /+ 40

MMP-2

alukkeesta 5′- GAGTGCTCGAGGATCAGGCTGAAGGGCCTGG 3 ’, -1001 /+ 40

MMP-2

alukkeesta 5′- GAGTGCTCGAGGAATTCGTGGAACTGAGGG 3′, -211 /+ 40 MMP -2 eteenpäin aluke 5 ’GAGTGCTCGAGCGAGAGAGGCAAGTGGGG 3’,

MMP-2

käänteisaluke- 5 ’CCTGAAAGCTTCTGGATGCAGCGGAAACAA 3’, -1277 /+ 187

MT1-MMP

alukkeesta 5′- CACCTCGAGGGAGGCTCCACAGGACCTGAAA 3 ’, – 425 /+ 187

MT1-MMP

alukkeesta 5′- CCACTCGAGTCCCACACTCTGAGCTCCTCGTT 3 ’, -151 /+ 187

MT1-MMP

alukkeesta 5′- TTGCTCGAGGGCTAAAACAACCACGTCCCCA 3′ ja

MT1-MMP

reverse-aluke 5 ’CCGGGAAGCTTGGGCACTGTGGGCTCCGC 3’ käytettiin.

Reverse Transcription (RT) -PCR ja Kvantitatiivinen PCR (qPCR) B

Kokonais-RNA uutettiin soluista kanssa Illustra ™ RNAspin Mini kit (GE Healthcare) ja sitä käytettiin templaattina cDNA-synteesi käyttämällä SuperScript®III RNaseH

-RT Kit (Invitrogen). qPCR suoritettiin käyttäen Stratagene Mx3000P qPCR järjestelmä (Agilent Technologies) yhdessä RBC ThermOne® Real-Time Esiseos (SYBR Green). Lämpösykli- olosuhteet sekä qPCR ja RT-PCR: llä olivat seuraavat: 10 minuuttia 95 ° C: ssa; (40 sykliä RT-PCR), 30 s 95 ° C: ssa, 30 s 60 ° C: ssa ja 30 s 72 ° C: ssa. Määrittäminen Hypoksantiini-Guaniinifosforibosyylitransferaasi (

HPRT

) taloudenhoito geeniekspressio Jokaisessa kokeessa korjaamaan vaihteluiden malliin pitoisuuksina. Määrät PCR amplikonien analysoitiin käyttäen Gel Doc 2000 Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad). Alukesarjat käytetään monistamiseksi HPV16E6 /E7,

MMP

,

TIMP-2

ja sisäisen valvonnan

HPRT

cDNA on aiemmin kuvattu [10], [24] , [25]. Suhteellinen ekspressio on esitetty keskiarvona ± SEM kolmesta riippumattomasta kokeesta suoritettiin kahtena kappaleena.

gelatiinitsymografialla

Gelatinaasin aktiivisuutta MMP-2 arvioitiin käyttäen gelatiinitsymografialla kuten aikaisemmin on kuvattu [26]. C33A, jotka ekspressoivat stabiilisti eri onkoproteiineja inkuboitiin seerumittomassa väliaineessa 48 tuntia ennen analyysiä. Sen jälkeen, kun se väkevöitiin käyttäen Amicon Ultra-0,5 keskipako- suodatinlaitteen (Millipore), yhtä suuret määrät kokonaisproteiinia on käytetty alusta kunkin solulinjan sekoitettiin ei-pelkistävän näytepuskuria (2% SDS, 10% glyserolia, 62,5 mM Tris HCl: lla pH 6,8 ja 0,01% bromophenolblue) ja ajettiin 7,5% polyakryyliamidigeelillä, joka sisälsi 1 mg /ml gelatiinia (Sigma). Elektroforeesin jälkeen geelit renaturoitiin pesemällä 2,5% Triton X-100 kahdesti 30 min. Selkeä vyöhykkeet hydrolysoidun substraatin kehitettiin inkuboimalla kehittää puskurissa (50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 10 mM CaCl

2, 1 uM ZnCl

2, 0,02% NaN

3 ja 1% Triton X -100) 37 ° C: ssa 18 tuntia ja värjättiin 0,025% (w /v) Coomassie blue R250: ssa 1 tunti. Gelatinolyyttinen MMP nauhojen kvantitoitiin densitometrinen analyysi (Määrä Yksi ohjelma, Gel Doc 2000-järjestelmä, Bio-Rad, USA) ja esitetään kertainen lisäys koko MMP-2 (pro-MMP-2 (72 kD) ja aktiivisen MMP-2 (68 kD)) kontrolliin verrattuna pcDNA3-soluja 48 h.

In vitro

Invasion Pitoisuus

In vitro

invaasio määrityksiä suoritettiin Transwell kammiossa päällystetty ylemmässä kammiossa 30 ug Matrigelillä® (BD Bioscience). -Soluja (2 x 10

5) seerumivapaassa väliaineessa ympättiin ylempään kammioon ja DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon. Inhibition määritykset solut (10

4 SiHa ja 5 x 10

4 16E6E7) käsiteltiin vaihtelevilla pitoisuuksilla (0, 2, 5, 10 tai 20 uM) on MMP-2-estäjän,

cis

-9–oktadekenoyyli-N-hydroksyyliamidi; OA-Hy (Calbiochem), tai 20 ug /ml anti-MT1-MMP-aineella (ab78738, Abcam) ylemmässä kammiossa 1% FBS SiHa ja 2% FBS 16E6E7 alemmassa kammiossa. Kun oli inkuboitu 24 h (tai 12 h inhibitiomäärityksissä) ja 16E6E7 ja 12 h (tai 7 h eston määritykset) ja SiHa-solut alemmassa kammiossa kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla. Invasion aktiivisuus määritettiin laskemalla numerot hyökkäsi solujen viidellä satunnaisesti aloilla ja tulokset esitetään keskiarvona ± SEM värjäytyneiden solujen kontrolleihin verrattuna, ajoneuvo tai ei-kohdistuksen shRNA plasmidilla tai käsittelemättömiä soluja.

Haavan Healing Pitoisuus

Solut kasvatettiin konfluenssiin asti ja keinotekoinen haava luotiin käyttäen P-200 pipetin kärki. DMEM, joka sisälsi 100 ug Matrigel® (BD Bioscience), lisättiin soluihin ja annetaan polymeroitua 15 minuuttia. Numerot solujen kulkeutuminen naarmuuntunut alueelle laskettiin 0 ja 48 h inkuboinnin jälkeen, ja on raportoitu prosentteina solujen naarmuuntunut alueella kontrollisoluihin verrattuna.

Luciferase Activity Assay

C33A-solut ilmentävät HPV16E6E7 transfektoitiin ohimenevästi pGL3-Basic sivektorissa konstrukteja, jotka sisältävät

MMP-2

ja

MT1-MMP

promoottorit, kuten edellä on kuvattu. Transfektoidut solut lyysattiin ja niistä määritettiin lusiferaasiaktiivisuus, kuten on raportoitu aiemmin [10].

Western blot -analyysi

C33A soluja, jotka ilmentävät HPV16 onkoproteiineja lyysattiin Lysis-M Reagent, EDTA-vapaata, ja täydellinen proteaasiestäjäseostabletit (Roche). Proteiinit erotettiin 10% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Sen jälkeen kun esto 10% rasvatonta maitoa PBST, kalvoja inkuboitiin hiiren anti-p53 (sc-126, Santa Cruz Biotechnology at 1:5,000), hiiren anti-MT1-MMP (ab78738, Abcam at 1:1,500 ), hiiren anti-TIMP-2 (ab1828, Abcam at 1:1,000), tai hiiren anti-GAPDH (sc-166574, Santa Cruz Biotechnology at 1:2,000) vasta-aineita, 4 ° C: ssa yön, jota seuraa inkubaatio sekundaarisen HRP- konjugoitua lampaan anti-hiiri-IgG (GE healthcare) (1:3,000) 2 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Tulokset visualisoitiin käyttäen Pierce ECL-järjestelmää (Thermo Scientific), jossa GAPDH latauskontrollina. Proteiinitasot kvantitatiivisesti käyttäen densitometrillä (Määrä Yksi ohjelma, Gel Doc 2000-järjestelmässä, Bio-Rad) ja tulokset on esitetty kannen lisäys proteiinin (sekä pro- ja kypsät muodot) verrattuna ajoneuvon hallinnan normalisoinnin jälkeen vastaan ​​GAPDH.

fluoresoiva immunohistokemia

Kaikki kliiniset tutkinnan suorittamisen ilmoituksen mukaan Helsingin ja hyvän kliinisen. Parafinoidut kudosleikkeiden 26 invasiivisen kohdunkaulan karsinoomat, kolme kohdunkaulan intraepiteliaalinen neoplasia (yksi kutakin CIN 1, CIN 2 ja CIN 3), ja yksi adenomyoosi saatiin National Cancer Institute (NCI), Thaimaa. Kaikki kudokset analysoitiin NCI patologit ja tehtävä nimettömiksi ennen niiden toimittamista tutkimuksen. Antigeenejä haettiin mikrossa näytteet Tris-EDTA-puskuriin (10 mM Tris-emästä, pH 9,0, 1 mM EDTA, 0,05% Triton X-100) 5 minuutin ajan ja endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus inhiboitui käsittelemällä 3% H

2O

2 10 minuuttia. Fluoresoiva immunohistokemia suoritettiin inkuboimalla 4 ° C: ssa yön yli, joilla on primaarinen hiiren anti-MMP-2 ja anti-MT1-MMP monoklonaalisia vasta-aineita (42-5D11 ja 114-6G6 vastaavasti; Chemicon) kanssa 1:100 laimennuksen jälkeen inkuboitiin johdetun Alexa Fluro 647-leimattua vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (1:400 laimentamista; Invitrogen). Hoechst 33258 (1:1,000 laimennus; Invitrogen) käytettiin tumavärjäystä. Leikkeitä asennettu VECTASHIELD® anti-fade väliaineessa (Vector Laboratories) ja fluoresoivat signaalit mitattiin käyttäen Olympus FV1000 -konfokaalimikroskoopilla varustettu ImageJ ohjelmisto. MMP-2 ja MT1-MMP ilmaisu pisteytettiin positiivisia tai negatiivisia vähentämisen jälkeen kanssa lähtötilanteen kontrolleihin ilman ensisijainen vasta-hoitoa annetaan määrä värjättyä solujen ≥1% tai 0% vastaavasti.

Tulokset

vaikutukset HPV ja HPV onkoproteiineja on

MMP

Expression ja Invasion kyky

Invasion kyky kohdunkaulasyövän solulinjoissa kätkeminen HPV-genomin (SiHa- HPV16, CaSki HPV16 ja HeLa kanssa HPV18) verrattiin HPV-negatiivisten C33A ja 293T-solut. Kaikki HPV-positiivisia solulinjoja selvästi näkyvissä kykyä hyökätä, kun taas invasiivisuus HPV-negatiivisten solulinjoissa oli minimaalinen (Fig. 1A). Korkeampi miehityksen kyky havaittiin SiHa (5000 solua) ja HeLa (11000 solua) verrattuna CaSki- soluihin (2500 solua) (Fig. 1A). Ilmaisu mitatut käyttäen qPCR on 7

MMP

s (

MMP-1, -2, -7, -9, -10, -11

ja

MT1-MMP)

näissä viidessä solulinjoissa osoitti korrelaation läsnäolo HPV ja kasvu

MMP

selostukset vain

MMP-2

,

-7

ja

MT1-MMP

(Fig. 1 B). Säätelyä

MMP-2

ilmentymistä erittäin havaittiin sekä HPV16- ja HPV18-positiivisia soluja verrattuna HPV-negatiiviset solut, jolla on korkein aktiivisuus HPV18-positiivisia HeLa-soluissa.

MMP-7

ja

MT1-MMP

transkriptin tasot olivat lisääntyneet huomattavasti HPV16-positiivisia SiHa ja CaSki soluja, mutta vain hieman koholla HeLa-soluissa (kuvio. 1 B). Kuitenkin, ei ollut korkeus

MMP-10

ja

-11

transkriptien tahansa HPV-positiivisia soluja (Kuva. 1 B). Nämä tulokset osoittavat, että ilmentyminen

MMP-2

,

-7

ja

MT1-MMP

ovat todennäköisempiä soluissa kätkeminen HPV, erityisesti HPV16.

(A) kvantitointi hyökkäystä käyttäen maahanmuuton suodattimien päällystetty matrigeelin HPV positiivinen (SiHa-, CaSki- ja HeLa) ja negatiiviset (C33A ja 293T) esitteleville soluille numeroiksi hyökkäävän soluja. (B) Suhteellinen ilmentyminen

MMP-1

,

-2

,

-7

,

-9

,

-10

,

-11

ja

MT1-MMP

mitataan solulinjoissa käyttäen qPCR. Data normalisoitiin C33A. *:

p

-arvo 0,05 suhteessa C33A. (C) Suhteellinen ilmentyminen

MMP-2, -7

ja

MT1-MMP

in C33A soluissa stabiilisti ilmentävät erilaisia ​​HPV16 (

16E6, 16E6F, 16E6 * I, 16E7, 16E6E7

,

16E6 * IE7

), HPV18:

(18E6E7) B ja matalan riskin HPV6

(6E6) B onkoproteiineja mitattuna qPCR ja normalisoitiin pcDNA3. *

p

-arvo 0,05 verrattuna pcDNA3 ilmentävien solujen. (D) tason HPV-transkriptien kontrolliin verrattuna, HPRT, kussakin solulinjassa, kuten on esitetty RT-PCR: llä. (E) P53 hajoaminen aktiivisuus 16E6, 16E7 ja 16E6E7 verrattiin Western blot -analyysillä. GAPDH käytettiin latauskontrollina.

Jotta voidaan tutkia suhdetta korkea ilmentymä

MMP-2, -7

ja

MT1-MMP

ja HPV onkoproteiineja, qPCR käytettiin seuraamaan

MMP

transkriptin tasot C33A soluissa stabiilisti ilmentävät 16E6, 16E6F, 16E6 * I, 16E7, 16E6E7, 16E6 * IE7, 18E6E7 ja (alhaisen riskin) HPV6E6. 16E6F, 16E6 * I ja 16E7 kykenivät indusoimaan lisääntymistä

MMP-2

,

MT1-MMP

, mutta ei

MMP-7

transkriptien verrattuna pcDNA3- transfektoidut kontrollisoluja (Fig. 1 C). C33A solut, jotka ilmentävät 16E6 * näytin alin

MMP-2

ja

MT1-MMP

transkriptien joukossa HPV16 onkoproteiineja testattu. Soluissa, jotka ilmentävät 16E6F ja 16E6 * I (eli 16E6-ilmentäviä soluja) tai 16E6 * I ja 16E7 (eli 16E6 * IE7-ilmentäviä soluja) tai 16E6F, 16E6 * I ja 16E7 (eli 16E6E7-ilmentäviä soluja) oli merkittäviä lisäyksiä

MMP

s selostukset, erityisesti

MMP-2

ja

MT1-MMP

(Fig. 1 C). Kuitenkin C33A soluissa, jotka ilmentävät 18E6E7, transkriptio tasot

MMP-2

,

MMP-7

ja

MT1-MMP

eivät eroavat pcDNA3 ilmentävien solujen ja odotetusti ei tapahtunut muutoksia

MMP

transkriptien matalan riskin HPV6E6 ilmentävien solujen verrattuna pcDNA3 ilmentävien solujen. Nämä tulokset osoittavat selvästi, että HPV16 mutta ei HPV18 onkoproteiineja nimenomaan parantaa ilmentymistä

MMP-2

ja

MT1-MMP

, mutta ei

MMP-7

. Tasot HPV16 onkogeenin transkriptien C33A-soluissa, kuten on esitetty RT-PCR: llä kuviossa. 1D osoitti, että

MMP

indusoitumisaktiivisuuden korreloi enemmän tyyppejä, mutta ei annoksen HPV onkoproteiineja. Funktionaalisia toiminnallisuuksia HPV onkoproteiineja halventava p53-proteiinien osoitettiin myös 16E6, 16E7 ja 16E6E7 ilmentävien solujen (Kuva. 1 E).

invasiivisuus, Gelatinaasiaktiivisuuden ja MMP ilmentäminen C33A soluissa, jotka ilmentävät HPV16 onkoproteiineja

täsmentyvät onko korotukset

MMP-2

ja

MT1-MMP

transkriptien kääntää tehostetun invasiivisuus HPV16-onkogeenin ilmentävien solujen käyttäen sekä

in vitro

invaasiota ( Fig. 2A) ja haavan määritykset (kuva 2B). HPV16-onkoproteiinin ilmentävät C33A olivat invasiivisia kummassakin määrityksessä kuin ohjaus HPV6E6 ilmentävät ja pcDNA3-transfektoitiin C33A, jossa solut, jotka ilmentävät yhdistelmä E6F, E6 * I ja E7 (16E6E7), jolla on korkein hyökkäyksen ominaisuus (Fig. 2A ja B). Koska nämä solut ovat kasvaneet

MMP-2

ja

MT1-MMP

transkriptien, ne tehtiin gelatiinitsymografialla käyttäen yhtä suurta määrää proteiineja (30 ug), voiko kohonnut MMP-aktiivisuutta esiintyi. Medium kaikki C33A soluista osoitti, että läsnä on gelatinaasin, joka vastaa pro-MMP-2 (~72 kD) ja MMP-2 (~62 kD) [14], jossa on voimakkaampi MMP-2 bändejä läsnä soluissa, jotka ilmentävät 16E6, 16E6 * IE7 ja 16E6E7 (Fig. 2C). Solut, jotka sisältävät alhaisen riskin HPV6E6 osoitti samanlaista gelatinaasiaktiivisuutta ohjaus- pcDNA3, joka sisältää soluja (tietoja ei esitetty). Liivate lyysi bändi liivate zymographies on varmistettu lisäämällä 5 mM dinatrium EDTA, joka on gelatinaasin estäjä, reaktioon ja käynnissä päälle erillinen geeli. Katoaminen odotettavissa tsymografisen nauhojen vahvisti gelatinaasiaktiivisuutta näiden lyysin nauhojen (tuloksia ei ole esitetty). On syytä huomata, että yhdistetty läsnäolo 16E6 * I ja 16E6F in 16E6 helpottaa aktiivista MMP-2 tasossa verrattuna soluihin, jotka ilmentävät 16E6F tai 16E6 * I yksin (Fig. 2A, 2B, 2C), mikä viittaa lisävaikutus näiden kahden muodot E6 stimuloimaan

MMP-2

ilmaisun ja näin edistää solujen invaasiota. Proteiinin tasot MT1-MMP näissä soluissa määritettiin myös Western blot -analyysillä käyttäen anti-ihmisen MT1-MMP-vasta-aineen kanssa, GAPDH kontrollina. Kannen lisäys MT1-MMP ekspressio laskettiin yhteensä MT1-MMP (pro-MT1-MMP ja MT1-MMP), jossa vektorin ohjaus asettaa 1. Kuten kuviossa. 2D, kaikki solut, jotka sisältävät HPV16 proteiineja ilmaistaan ​​sekä pro- (~66 kD) ja kypsä MT1-MMP (~57 kD) kanssa suurin bändi intensiteetti pro-MT1-MMP in 16E6E7 (2,5 ×, yhteensä MT1-MMP) ja kypsä MT1-MMP in 16E6 (2,3 ×, yhteensä MT1-MMP), kun taas vektorisäätö osoitti vain pro-MT1-MMP. Nämä havainnot paljastivat, että invasiivisuus HPV16 onkoproteiinia ilmentävien solujen korreloi MMP-2 aktiivisuutta ja MT1-MMP ilme.

(A)

In vitro

invaasiota ja (B) haavan paranemista määritykset C33A solut, jotka ilmentävät erilaisia ​​HPV16 onkoproteiineja. (C) Edustava liivate tsymografisen geeli osoittaa MMP-2 aktiivisuus normalisoidaan saman verran lastaus proteiinia (30 ug). Vastaavat juovat Gelatinolyyttinen MMP-2 kvantitoitiin densitometrinen analyysi ja verrattiin niihin, jotka saatiin valvonnan pcDNA3 ilmentäviä soluja. (D) Western blot-analyysi MT1-MMP käyttäen anti-MT1-MMP-aineella (ab78738) at 1:1,500 laimentaminen GAPDH kuin latauskontrollina. *

p

-arvo 0,05, **

p

-arvo 0,01.

Vaikutus invaasiokyvyssä HPV16E6 Knock-down Cells

Sen varmistamiseksi, että HPV16 onkoproteiineja aiheuttavat säätelyä

MMP-2

ja

MT1-MMP

ilme, E6 onkogeenien HPV16-positiivisia SiHa soluja tippuu alas kahdella shRNAs (shE6A ja shE6B) kohdistaminen eri sivustoja 16E6 mRNA [23]. Käyttämällä RT-PCR: llä, tasot HPV16E6F, 16E6 * I ja 16E7-transkriptien SiHa-soluissa osoitettiin alennetaan -50% transfektion jälkeen shE6A, että vain 10-30%: n vähennys havaittiin transfektoiduissa soluissa shE6B (Fig. 3A). Vain

MMP-2

ja

MT1-MMP

mutta ei

MMP-7

transkriptit vähennetään E6 knock-down SiHa soluja (Fig. 3B). Kun yhtä suuret määrät proteiinia (20 ug) peräisin elatusaine analysoitiin gelatiinitsymografialla, havaittiin, että MMP-2: n aktiivisuuden in shE6A-transfektoiduissa soluissa oli vähentynyt verrattuna pSUPER ja shCtrl transfektoitiin kontrolli-soluissa (kuvio. 3C). Solulysaateista (30 ug proteiinia kussakin) analysoitiin western blotteja arvioida MT1-MMP tasolle GAPDH kontrollina, paljasti lievää laskua (-30% ja -40% vähennys shE6A ja shE6B vastaavasti) MT1-MMP tasot molemmissa knock- alas soluja verrattuna shCtrl valvontaa (Fig. 3d). Mielenkiintoista, MT1-MMP-proteiinien havaittiin SiHa solut olivat pääasiassa kypsän MT1-MMP (57 kD). Yhdenmukaisesti näiden havaintojen sekä shRNA-transfektoituja soluja, erityisesti shE6A, oli merkittävästi vähentynyt invasiivisuus (~48%) ja haavan paranemista kyky (-50%), verrattuna shCtrl soluissa (kuvio. 3E). Näin ollen, ablaatio HPV16E6 /E7 onkoproteiineja vähentää MMP-2: n aktiivisuuden, MT1-MMP ilmentymisen ja lopuksi invasiivisuus HPV16-positiivisia SiHa-soluissa.

(A) RT-PCR

16E6F, 16E6 * I

ja

16E7

selostukset normalisoida ohjaus,

HPRT

. SiHa-solut, jotka oli transfektoitu ei-kohdistuksen shCtrl ja ajoneuvon hallinnan pSUPER käytettiin negatiivisina kontrolleina. shE6A ja shE6B ovat kaksi eri shRNAs käytetään knock-down kokeita. (B) qPCR on

MMP-2

,

-7

ja

MT1-MMP

selostukset ja (C) MMP-2 aktiivisuus analysoituna gelatiinitsymografialla, yhtä määrät proteiinia (20 ug), ja shRNA transfektoiduissa soluissa. (D) MT1-MMP-proteiinin pudotti soluissa määrittää Western blot analyysillä GAPDH kuin latauskontrollina. (E) Invasion kyky SiHa transfektoitujen solujen eri shRNAs määritetty

in vitro

invaasiota ja haavan paranemista määrityksissä. Suhteellinen kertainen soluinvaasiota kanssa käsittelemättömiä soluja asetettiin 1 raportoidaan. *

p

-arvo 0,05 verrattuna shCtrl soluihin.

Alennettu invasiivisuus erityisillä estäjät ja MMP-2 ja MT1-MMP

Voit selvittää selektiivinen esto endogeenisen MMP-2 tai MT1-MMP heikentää invaasio kyky, sekä SiHa ja 16E6E7 ilmentävien C33A solulinjoja käsiteltiin OA-Hy, spesifinen inhibiittori MMP-2, (Fig. 4A, 4B) ja anti-MT1-MMP, spesifistä vasta-ainetta katalyyttiseen domeeniin MT1-MMP (Fig. 4C). Tuloksemme osoittivat selvästi, että hoito OA-Hy johti merkittävään vähenemiseen soluinvaasiota sekä 16E6E7 (-70% 10 uM) (Fig. 4A) ja SiHa soluja (~65% 20 uM) (Fig. 4B) annoksesta riippuvalla tavalla. Samoin, MT1-MMP inhibition käyttäen spesifistä vasta-ainetta vähensi selvästi invasiivisuus (-50%), molemmat solulinjat käsittelemättömiin soluihin verrattuna (kuvio. 4C). Meidän vahvistivat, että hyökkäys HPV16-tartunnan saaneiden solujen oli riippuvainen MMP-2 ja MT1-MMP ilme. Koska on tunnettua, että muodostumista MT1-MMP /TIMP-2 /pro-MMP-2-kompleksi on välttämätön aktivointi pro-MMP-2: MT1-MMP solun pinnalla, tasot TIMP-2 ilmentyminen kaikissa HPV16 onkoproteiinia ilmentäviä soluja tutkittiin myös. Mielenkiintoista on, että TIMP-2: n ilmentymisen havaittiin olevan hieman lisääntynyt sekä mRNA (~ 3 x) ja proteiini (~ 2 x) tasot kaikissa soluissa verrattuna kontrolliin pcDNA3 lukuun ottamatta alhaisen riskin HPV6E6, että esillä TIMP -2 ilmaus verrattavissa tyhjän vektorin (Fig. 4D). Olipa HPV onkoproteiineja suoraan tehostettu ilmentyminen TIMP-2 on vielä määrittämättä.

(A) Cell Invasion määritetään

in vitro

invaasiota ja haavan paranemista HPV16E6E7 ilmentävien solujen ja (B) SiHa-solut käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla MMP-2-estäjän, OA-Hy. (C) Sama solulinjoja käsiteltiin myös anti-MT1-MMP-vasta-ainetta (20 ug /ml). Suhteellinen kertainen soluinvaasiota pcDNA3 ajoneuvon hallintaan tai käsittelemättömät solut asettaa 1 at φ

p

0,05 verrattuna pcDNA3 ja *

p

-arvo 0,05 verrattuna käsittelemättömiin soluihin näytetään. (D) TIMP-2-proteiinin (normalisoitu yhtä lastaus proteiinin 5 ug) havaittiin Western blot -analyysiä käyttämällä anti-TIMP-2-vasta-aine (Abcam, 1:1,000 laimennos) ja TIMP-2-transkriptien mitattiin qPCR (normalisoitu ja HPRT) ja HPV16 onkoproteiinia ilmentäviä soluja.

transkriptiota säätelemällä aktiivisuus HPV16 Onkogeenit on

MMP-2

ja

MT1-MMP

Promoottori

promoottori, jotka sisälsivät 5′-ylävirran sekvenssit, nimittäin -1721 /+ 40, -1001 /+ 40 ja -211 /+ 40 maasta

MMP-2

promoottori ja -1,277 /+ 187, -425 /+187 ja -151 /+ 187 iältään

MT1-MMP

promoottori fuusioitiin lusiferaasireportterigeenin in pGL3-Basic luotiin. Kutakin konstruktia myöhemmin transfektoitiin C33A, jotka ilmentävät stabiilisti HPV16E6E7. Läsnä ollessa HPV16E6E7, lusiferaasin aktiivisuus -1721 /+ 40

MMP-2

konstrukti osoitettiin olevan verrattavissa -1001 /+ 40 näytetään 4,6 ja 3,9 kertaa suurempi ekspressio kuin ohjaus transfektoitu tyhjällä pGL3-Basic-vektori tai ~ 2-kertainen nousu sekä promoottorin toimintaa verrattuna perustason taso pcDNA3 ilmentävät solut (Fig. 5A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin

MT1-MMP

promoottorikonstrukteja (Fig. 5B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että sekvenssit vastaavat välittävä HPV16 onkoproteiinia aktiivisuuden tulisi oleskella -1001 /+ 40 ja -425 /+ 187 alueet

MMP-2

ja

MT1-MMP

promoottorit, tässä järjestyksessä. Molemmat sisälsivät PEA-3 (at -552 ja -540 varten

MMP-2

ja -303 varten

MT1-MMP

) ja SP1 (at -91 MMP-2 ja -102 varten

MT1-MMP

) sitoutumiskohtiin viittaa siihen, että HPV16 onkoproteiineja aikaansaavat transaktivaation aktiivisuuden avulla näitä sivustoja samalla tavalla. Puute p53 ja kauko PEA-3 sitoutumiskohtiin in

MMP-2

promoottori ja TIE-kaltaiset sekvenssit

MT1-MMP

promoottorikonstrukteja osoitti, että nämä sivustot eivät ole vastuussa välittävä vaikutus HPV onkoproteiineja. Kuitenkin pienin konstruktit

MMP-2

promoottori (-211 /+ 40), joka sisältää yhden SP1, AP2 ja PEA-3 sitoutumiskohtiin ja

MT1-MMP

promoottori (