Krooninen sairaus

tiivistelmä

Wnt reitti on kiinteästi mukana säätelyssä itse- uusiminen, leviämisen, ja ylläpito syövän kantasoluja (CSCS). Olemme tutkineet vaikutusta Wnt-antagonisti, erittyy frizzled-related protein 4 (sFRP4), moduloimaan epiteelisolujen ja mesenkymaalitransitioon (EMT) in CSCS ihmisen glioblastooma-solujen linjat, U87 ja U373. sFRP4 kemiallis-herkistyneet CSC rikastettua solujen yleisimmin käytetty anti-glioblastoma huumeiden temotsolomidi (TMZ), jonka käänteinen EMT. Cell liike, pesäkkeiden muodostumista, ja invaasio

in vitro

hiljennettiin sFRP4 + TMZ hoito, joka korreloi kytkimen ilmentymisen merkkiaineet mesenkymaalisista (Twist, Snail, N-kadheriinin) epiteeli- (E-kadheriinin ). sFRP4 hoito sai aikaan aktivoitumisen Wnt-Ca

2

+ koulutusjakson, joka antagonisoi Wnt /SS-kateniinin reitin. Merkittävää on, että kemoterapia-herkistymistä vaikutus sFRP4 korreloi kanssa ilmentyminen vähenee lääkeresistenssin markkereita ABCG2, ABCC2, ja ABCC4. Teho sFRP4 + TMZ hoidon osoitettiin

in vivo

käyttäen karvattomia hiiriä, jotka osoittivat vähintään kasvaimen siirteen avulla CSCS esikäsitelty sFRP4 + TMZ. Nämä tutkimukset osoittavat, että sFRP4 jälkeen auttaisi parantamaan vastauksena yleisesti käytetty kemoterapeuttisia glioomis- moduloimalla EMT kautta Wnt /SS-kateniinin reitin. Näitä havaintoja voidaan hyödyntää suunniteltaessa paremmin kohdennettuja strategioita, joilla parannetaan Chemo-vasteen ja lopulta poistaa glioblastooma CSCS.

Citation: GB, Arfuso F, Millward M, Dharmarajan A, Warrier S (2015) Eritettyä Frizzled kaltainen proteiini 4 Estää Gliooma Stem-Like Cells kääntämällä epiteelikasvaimet ja mesenkymaalitransitioon, aiheuttamaan apoptoosin ja pienentäminen Cancer Stem Cell Properties. PLoS ONE 10 (6): e0127517. doi: 10,1371 /journal.pone.0127517

Academic Editor: Rajeev Samant, University of Alabama at Birmingham, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 13 joulukuu 2014; Hyväksytty: 15 huhtikuu 2015; Julkaistu: 01 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 G et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

rahoitus: Tätä työtä tukivat Curtin University kaupallistaminen Advisory Board ja School of Biomedical Sciences Strategic Research Funds, Intia Research Initiative varat (prof Arun Dharmarajan), rahoitusta Department of Biotechnology, Intia (BT /PR8493 /MED /31/226/2013) ja varoja prof Michael Millward, University of Western Australia, Perth, Länsi-Australiassa.

Kilpailevat edut: Tätä työtä tukivat Curtin University kaupallistaminen Advisory Board ja School of Biomedical Sciences Strategic Research Funds, Intia Research Initiative varat (prof Arun Dharmarajan), rahoitusta Department of Biotechnology, Intia (BT /PR8493 /MED /31/226/2013) ja varoja prof Michael Millward, University of Western Australia, Perth, Länsi-Australiassa. Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, ettei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

glioblastoma multiforme (GBM) on Maailman terveysjärjestön IV asteen kasvain ja on yleisin ja aggressiivinen aivokasvain aikuisilla [1] . GBM edustaa 15-20% kaikista ensisijaisen kallonsisäinen kasvaimet ja huolimatta multimodaalisille hoitovaihtoehtoja, yleinen ennuste on synkkä kanssa mediaanielossaolosta noin 14,6 kuukautta ja kahden vuoden eloonjääminen on 30% [2]. Pääsyy heikkoon tulokset GBM ovat korkeat toistuminen ja kestävyys kemoterapiaa. Pääsyy toistuvan uusiutumisen ja monipuolinen kemoterapeuttisen vaste on havaittu olevan syövän kantasolut (CSCS) sisällä gliooma kasvain [3]. Gliooma CSCS (GSCs) ensin tunnistetaan, että läsnä on ainutlaatuinen solun pinnan proteiini, prominin 1 tai CD133. Myöhemmin monet muut määritellään markkereita kartoitettiin gliooman CSCS. Kuten CSCS muista kasvaimista kuten veren, rinta-, eturauhas- ja paksusuolen, gliooman CSCS myös yliekspressoivat moniresistenssin (MDR) markkereita, kuten ABC-kuljettajat, jotka ovat yksi tärkeimmistä syistä tehostetun kemoterapian resistenssin [4] .

Aktivoidut itseuudistumisen, lisääntynyt chemo-vastus, ja säädelty epiteelin ja mesenkymaalitransitioon (EMT), jotka ovat ominaisia ​​tunnusmerkkejä CSCS, ovat liittyy poikkeavaan Wnt /β-kateniinin signalointi [4 -6]. Useita esikasvaintekijät edistää GBM kasvua ja lisätä CSC väestön aktivoimalla Wnt-reitin komponentti, TCF-4 [7]. Erittyy frizzled-related proteins, DKK1 4, ja WIF1 estää aloittamista Wnt signalointia solun pinnalla häiritsemällä vuorovaikutusta Wnt-ligandien ja FZD reseptoriin ja co-reseptori LRP5-6 [8].

Eritettyä frizzled kaltainen proteiini 4 (sFRP4) on yksi viidestä jäsenestä SFRP perhe, ja on ollut mukana olevan pro-apoptoottisen funktion monissa kudoksissa [9-15]. Yli-ilmentyminen sFRP4 on liittynyt Hidastuneen leviämisen laski ankkurista riippumaton kasvu, ja laski invasiivisuuden että eturauhassyövän solulinjaa, PC-3 [16]. Hiljentäminen SFRP geenien kautta hypermetylaation promoottorialueen on havaittu syövät kuten maksasyöpä [17,18] ja GBM [19]. Edellisessä raportteja gliooman ja pään ja kaulan alueen syöpä kantasolujen kaltaisia ​​soluja, sFRP4 väheni huomattavasti CSC väestö ja laski stemness geenit [20,21]. sFRP4, joka on fysiologisesti erittyy estäjä, jota itseään ei näytteillä voimakas apoptoottisen kyky on CSCS tutkittu. Kuitenkin rooli sFRP4 näytti olevan kemoterapian herkistämällä CSCS yleisesti käytössä onkopsykologista terapeuttisten johon CSCS ovat tulenkestävät. On pyrkimys käsitellä joitakin uskottavaa aiheuttavat tekijät, joiden sFRP4 voisi toimia CSCS, tutkimme gliooma CSCS niiden vaste sFRP4. Osoitamme, että on olemassa keskinäisten suhteiden EMT allekirjoitus ominaisuuksia, kemiallis-vastus indusoivat tekijät, ja sFRP4 välittämä Chemo-herkistymistä gliooma CSCS; mikä tarjoaa toimintatapa tämän Wnt antagonisti. Tämä yhdistelmä lähestymistapa sFRP4 ja huumeiden sisältyy lupaava CSC-suunnatun hoidon parantamiseen eloonjäämisaste ja vähentää glioblastooma toistuminen.

Tulokset

Syöpä kantasolujen rikastaminen ja luonnehdinta gliooman pallojen

ensin rikastettu CD133 positiivinen väestön U87 ja U373 glioomasolulinjoja kasvattamalla niitä sferoidiviljelmiä puuttuessa seerumin täydennettynä kasvutekijät LIF, EGF, ja B27 in tarttumattomat elylevyillä. Sferoidiviljelmiä pesäkkeet ovat tyypillinen kuvaava piirre CSCS, jotka pystyvät lisääntymään edelleen erilaistumaton, ja säilyttävät stemness profiili seerumittomassa kulttuureissa. Alkuvaiheen solukuolema, muutama jäljellä solut kasvoivat ja lisääntyivät nopeasti, muodostaen neuropallo pesäkkeitä. Sen jälkeen immunohistokemiaa CD133 ilmaisun, selvä värjäytyminen pallomainen pesäkkeiden havaittiin. Soluviljely Seerumin rikastettua yksikerrosviljelmään osoitti alhainen värjäytymisen CD133 (kuvio 1A). Expression of CD133 mRNA näkyi vain sferoidiviljelmiä, kuten on esitetty semikvantitatiivinen RT-PCR (S1 kuvio) ja kvantitatiivinen PCR, joka osoitti kasvua ilmaus CD133 vuonna pallosia yli yksikerrosviljelmään sekä solulinjoissa (kuvio 1 B) . Proteiinin ilmentyminen CD133 havaittiin olevan suurempi sferoidiviljelmiä kuin yksikerrosviljelmässä molempien solulinjojen tutkittu (S2 Kuva). Lopuksi tunnettu läsnäolo CD133 positiivisten solujen virtaussytometrialla ja totesi, että 94,12% of U87 pallosia ja 83,91% of U373 pallosia oli positiivinen CD133, kun taas yksikerrosviljelmä oli vain 63.56% for U87 ja 67,6% ja U373-solulinjoja vastaavasti (kuvio 1 C).

a) mikrovalokuvia yksikerroksisen ja sferoidiviljelmiä pesäkkeet (vasen ruutu, asteikko bar = 50 um, n = 3) ja CD133 merkki värjäyksen (oikea paneeli, asteikko bar = 100 um), kuten immunosolukemiallisella vuonna yksikerroksisen ja pallonen siirtomaita U87 ja U373 solulinjoissa. b) Kvantitatiivinen RT-PCR CD133 mRNA ilmentymisen U87 ja U373-solulinjoja kasvatettiin CSC väliaineessa. Tulokset ovat keskiarvoja ± SD kolmesta riippumattomasta kokeesta suoritettiin kolmena rinnakkaisena (* p-arvo 0,05, ** p-arvo 0,01, n = 3). ML = yksikerroksista, CSC = syövän kantasoluja. c) Virtaussytometrianalyysi of CD133 vuonna U87 ja U373-solut kasvatetaan CSC väliaineessa.

sFRP4 tukahduttaa kasvua GSCs peräisin U87 ja U373-solulinjoja ja kärjistää vastaus neuropallojen temotsolomidille

arvioimiseksi vaikutusten sFRP4 ja TMZ joko yksin tai yhdessä, kasvuun pallomaisten pesäkkeitä U87 ja U373 solulinjat, 3D-viljelmiä inkuboitiin sFRP4 (S), temotsolomidi (T), tai S + T varten 24h. Kasvun estäminen arvioitiin MTT, BrdU, ja pallo inhibitiomenetelmissä. Käyttäen MTT-määritystä, havaittiin, että S tai T yksin inhiboi proliferaatiota U87 ja U373 pallosia 25%. Kuitenkin, S + T oli suurempi estävä vaikutus on noin 50% pallosia sekä solulinjoissa (kuvio 2A). Samanlainen malli havaittiin käyttämällä BrdU-solujen lisääntymisen määrityksessä, jossa S + T todettiin hoidon proliferaation inhiboimiseksi 40% (kuvio 2B). Käsittelemättömissä kontrolliviljelmissä, tulokset osoittivat, että palloset säilyi ennallaan. Käsittely S yksinään tai T yksin näkyy lievää laskua alalla kooltaan toisin S + T, jossa hajoamiseen pallojen oli dramaattinen. Tämä vahvistettiin leimaamalla pallojen varten CD133 merkki immunosolukemiallisella, joka näkyy selvää vähenemistä CD133 värjäyksen S + T käsiteltyjen näytteiden (kuvio 2C). Arvioida inhibitioprosentti ja kuolleiden solujen GSCs päässä U87 ja U373-solulinjoja altistettiin propidiumjodidilla (PI)-värjäys eri lääkehoitoon. Prosenttiosuus terveiden solujen oli 83% käsittelemätön kontrolli, laski hieman ja 79% S käsitelty, jossa selvemmin laski 68% T käsitelty, joka laski rajusti 27% S + T käsitelty GSCs alkaen U87 soluista. Vuonna GSCs alkaen U373 soluista, käsittelemätön kontrolli oli 86% terveitä soluja, mikä laski 55%, kun S hoitoa. Toisin kuin U87-soluja, T hoidon ja S + T hoidossa U373 GSCs havaittiin olevan samanlainen prosenttiosuus (26%) terveiden solujen (kuvio 3). Sen määrittämiseksi, solukuoleman johtuu apoptosis, tutkimme häiriöitä mitokondrion kalvon, joka on indikaattori apoptoosin, käyttämällä JC-1 väriaine [22]. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen lisääntynyt S, T ja S + T käsitelty U87 ja U373, mikä osoittaa apoptoosin alkaminen muutokset mitokondrion kalvon potentiaali (kuvio 4). Molemmissa solulinjoissa, korkein apoptoosin (57% ja U87 GSCs ja 38% ja U373 GSCs) havaittiin yhdistelmänä käsiteltiin GSCs. Jotta voitaisiin arvioida lasku CD133 positiivisia väestöstä jälkeen lääkehoitoa, virtaussytometria-analyysi suoritettiin. Kuten odotettua, oli väheneminen CD133 positiivisissa soluissa sekä U87 ja U373 GSCs, Vähennystä oli 69% käsittelemättömän 62% S käsitelty, 54% T, käsitellään 47% S + T käsitelty U87 GSCs , ja 68% vuonna käsittelemättömän, 64% S käsitelty, 62% T käsitelty, 56% S + T käsitelty U373 GSCs (kuvio 5).

a) ja b) Käyrät edustavat esto of U87 ja U373 CSCS vastaavasti hoidon jälkeen 24 tuntia samalla sFRP4- 250pg /ml (S), temozolomide- 25 uM (T), ja sFRP4 + temotsolomidia (S + T). Tulokset ovat keskiarvoja ± SD kolmesta riippumattomasta kokeesta suoritettiin kolmena rinnakkaisena (* p-arvo 0,05, ** p-arvo 0,01, n = 3). c) mikrovalokuvia pallo muodostavien määrityksen ja immunosolukemiallisten värjäys CD133 hoidon jälkeen ohjaus, S, T ja S + T. Tumat vastavärjättiin DAPI (sininen), (asteikko bar = 100 um).

virtaussytometrianalyysin solusyklin profiilit U87 ja U373 CSCS hoidon jälkeen ohjaus, S, T tai S + T värjäyksen jälkeen propidiumjodidilla.

JC-1 mitokondrioiden depolarisaatio määrityksen jälkeen ohjaus, S, T tai S + T hoitoon U87 ja U373 CSCS.

Flow sytometrinen analyysi CD133 ilmentymisen analyysi käsittelemättömän, S, T ja S + T käsitelty U87 ja U373 CSCS yhdessä ohjaus värjäys iso PE.

sFRP4 down-regulation EMT edistävät geenit ja chemo-vastus geenit

Analyysi semikvantitatiivinen ja kvantitatiivinen RT-PCR: ää käytettiin määrittämään ilmaisua muutokset CD133, EMT markkereita, ja lääkeresistenssin geenit. Hoito U87 ja U373 GSCs kanssa sFRP4 ja TMZ johti merkittävään kasvuun ilmaus epiteelin merkki E-kadheriinin. Ilmaus mesenkymaalisten merkki N-kadheriinin havaittiin olevan heikentynyt merkittävästi S + T käsiteltiin GSCs, jossa lausutaan lasku U87 GSCs. Pieneneminen stemness liittyvä markkeri CD133 havaittiin olevan dramaattinen S + T käsitelty GSCs päässä U87 ja U373 solulinjoissa. Arvioida, rakenteellisia muutoksia EMT heijastuivat muutoksia transkription sääntelyviranomaiset EMT, ilmaus

Snail

,

Twist

, ja

Slug

tutkittiin. Odotetusti, hoito S + T johtanut merkittävään laskuun ekspression näiden kolmen transkriptiotekijöitä molemmissa solulinjoissa kuten nähdään RT-PCR: llä (S3 kuvassa) ja qPCR (kuvio 6A ja 6B). Nämä tulokset osoittavat selvästi liittyvät muutokset EMT molekyylitasolla. Analysoida, lääke herkkyys oli mukana lasku ilmaisun lääkkeiden kantaja, ilmaisu tutkimuksia tehtiin

ABCG2

,

ABCC2

, ja

ABCC4

. Havaittiin, että ekspressio näiden markkereiden vähenee merkittävästi käsiteltäessä S + T, ja taso

ABCC2

oli havaittavissa S + T käsiteltiin U87 GSCs (kuvio 6A ja 6B).

a) ja b) edustaja kaavioita suhteellinen mRNA ilmaus CSC merkki, EMT liittyvien geenien (

N-kadheriinin

,

Twist

,

etana

, ja

Slug) b, ja huumeiden kuljettamiseen geenit (

ABCG2

,

ABCC4

, ja

ABCC2

) in U87 (a) ja U373 (b) CSCS jälkeen lääkehoitoa suoritettiin kvantitatiivinen RT-PCR: llä. Tulokset ovat keskiarvoja ± SD kolmen erillisen kokeen suoritettiin kolmena rinnakkaisena (* p-arvo 0,05, ** p-arvo 0,01, n = 3).

sFRP4 down-regulation fibroblastivasteeseen merkkiaineet EMT ja aktivoi Wnt /kalsium-reitin

tyypillinen muutokset havaittu EMT sisältää vähemmän solujen välistä noudattaminen, vähemmän tiukka liittymissä, ja menetys solun polariteetti. β-kateniinin aktivointi ja koekspressio fibroblasti- merkkiaineiden vimentiinista ja α-sileän lihaksen aktiini (α-SMA) ovat solutapahtumiin mukana nämä muutokset [23].

tutkittiin ilmentymisen kolmen EMT liittyviä markkereita, β-kateniinin, α-SMA, ja vimentiinistä proteiinitasolla. Vuonna U87 sferoidiviljelmiä käsitelty eri huumeiden yhdistelmä, ilmentävien solujen α-SMA, vimentiinistä, ja β-kateniinin analysoitiin immunohistokemiallinen lokalisointi. Sferoidiviljelmiä menettäneet pallomainen morfologia, ja ilmaus α-SMA ja vimentiinista S + T käsitellyissä soluissa oli heikko. Solut olivat läpikäyneet massiivinen solukuolema, pallo häiriöitä, ja olivat kiinnittyneet S + T käsitelty U87 aloilla; ja osuus β-kateniinin värjäytyvät solut oli erittäin alhainen verrattuna käsittelemättömään kontrolliin sferoidi soluissa (kuvio 7A). Kuvio havaittu immunohistokemiallisella värjäyksellä edelleen vahvistettiin Western-blottauksella. Hoito U87 sferoidit S + T aiheutti huomattavaa vähentämistä α-SMA, vimentiinistä, ja β-kateniinin proteiinin ilmentymisen verrattuna käsittelemättömään kontrolliin U87 sferoidiviljelmiä soluja (kuvio 7B).

a) Immunosytokemia on mesenkymaaliset markkereita a sileän lihaksen aktiini (α SMA), vimentiinistä, ja ß-kateniinin U87 CSCS hoidettu ohjaus, S, T tai S + T (asteikko bar = 100 um). Tumat vastavärjättiin DAPI (sininen). b) immunoblot-analyysi α SMA, vimentiinin, ja ß-kateniinin U87 CSCS käsiteltiin ohjaus, S, T tai S + T.

tutkimme seuraavaksi vaikutus sFRP4 on ei- kanoninen käsivarsi Wnt signalointia kautta liikkeelle solunsisäisen Ca

2

+. Vaikutus sFRP4 on Wnt /kalsium-signalointireitin in CSCS tutkittiin käyttämällä fluoresoivaa indikaattoria fura-2. Hoidon jälkeen sFRP4, oli merkittävä nousu solunsisäisen Ca

2

+ julkaisu (kuvio 8), jolloin mikä viittaa osallistuminen kaanoniin Wnt signalointi sFRP4 estoa CSCS.

solunsisäisen kalsiumin määritys määräytyy loisteputki radiometrisillä Ca

2

+ ilmaisin Fura-2, in U87 CSCS hoidettu ohjaus, S, T tai S + T (* p-arvo 0,05, ** p-arvo 0,01, n = 3).

Sferoidiviljelmiä soluissa näyttää alempi pesäkkeenmuodostuskyvyn, soluväliaineen (ECM) levinneisyys, ja muuttavien /invasiivisia mahdollisten hoidon jälkeen sFRP4 ja temotsolomidi

Rapid self -renewal on tunnusomaista omaisuutta CSCS, ja menetys stemness johtaa erilaistumiseen ja poistua solusyklin. Kuten analogisesti, tutkimme itseuudistumisen piirre indikaattorina estoa tai apoptoosin CSCS. By palloja muodostavan määrityksissä pehmeässä agarissa, vertasimme kyky muodostaa aloilla, käsittelemätön kontrolli, S, T ja S + T käsiteltiin U87 pallosia. Värjäämällä pesäkkeet kristallivioletilla, havaittiin, että käsittelemätön GSCs muodostivat suuria pesäkkeitä, mutta S yksin ja T yksin käsiteltyjä soluja, pesäkkeet olivat pienempiä ja lisääntymistä oli heikko. Lisäksi U87 GSCs käsiteltiin S + T, pesäkkeet oli jyrkkä lasku koko ja solujen numerot pesäkkeet olivat vähäiset (kuvio 9A).

a) Micrograph kuvia pehmeässä agarissa pesäkkeiden määritystä U87 CSCS hoidon jälkeen ohjaus, S, T tai S + T. Värjäys kristalliviolettiliuokseen osoitti pesäkkeen koko (asteikko bar = 50 um). b) angiogeenisen määritystä U87 CSCS (käsitelty 24 tuntia samalla valvontaa tai S, T tai S + T) ympättiin angiogeneesiä ECMatrix geelillä esipäällystää levy. Värjäys kristalliviolettiliuokseen havaitaan putken muodostumiseen ja alkuvaiheen prosessit (asteikko bar = 100 um). c) käsittelyn jälkeen U87 CSC ohjaus, S, T tai S + T 24 tuntia, joka on

in vitro

siirtokuoppaan migraatiokokeessa suoritettiin. Kristallivioletti värjäys osoitti solun siirtymät Transvvell- kammio (asteikko bar = 100 um).

Ensisijainen kyky CSCS on kyky aloittaa kasvun primaarikasvaimen ja ajaa ja metastaasit. On perustettu suhde prosentteina CSCS rintasyövän ja osoitus etäpesäkkeiden [24]. Invasiivisen kyvyn voidaan korreloida solujen kyky tunkeutua ja lisääntyä läpi ECM. Tutkimme kyky U87 GSCs kasvaa ECM ja myöhemmin esto hotellin tarjoamat lääkehoitoa. Havaittiin, että S + T käsitelty GSCs, leviämisen haittasi jälkeen 24 yhtäläisen solun kylvö (kuvio 9B, paneeli 2). Värjäys kristallivioletilla osoittivat, että solujen kasvun esto läpi ECM S + T käsiteltyjen solujen (kuvio 9B, paneeli 3). Invasion johtaa metastaattisen leviämisen ja tutkimme tätä vertaamalla metastaattista potentiaalia eri lääkkeellä käsiteltyjen U87-GSCs käyttäen Matrigel hyökkäystä kammioon. Havaitsimme dramaattinen ero käsittelemättömän ja S + T käsiteltyjä soluja, kuten käsittelemättömät solut vaelsivat täysin kalvon läpi, ja kerätään, kuten pesäkkeitä. Vaeltavien potentiaali S + T käsitellyissä soluissa oli erittäin huonot, ja havaittiin, että vain harvat solut eriytetty morfologia olivat vaeltaneet (kuvio 9C).

Tuumorigeenisuustutkimuksissa

in vivo

väheni hoidon jälkeen of U87 GSCs kanssa sFRP4 ja temotsolomidi

tasoa määritettäessä kasvaimien ja U87 GSCs hoidon jälkeen S, T ja S + T, havaitsimme kasvainten kehittymistä nude-hiirissä, jotka oli injektoitu subkutaanisti syöpäsoluja. On 4

päivänä injektion, eläimiä ei saanut hoitoa kehittynyt kasvaimia, kun taas eläimillä, jotka saavat S + T käsitelty GSCs ei ollut kasvaimen muodostumisen. GSCs käsitelty T oli pienempi kasvain verrattuna S käsitelty GSCs, mutta molemmat olivat pienempiä kuin käsittelemätön kontrolli on 4

päivänä injektion (kuvio 10A). On 10

päivänä, kun sato oli huomattavasti pienempiä määriä ihonalainen kasvainten hiiristä injektoitu S + T kohdellaan GSCs kuin käsittelemättömän, S käsitelty, ja T testiryhmään (kuvio 10B).

Keskimääräiset kasvaimen kokoa (a, b) ihon alle annetun U87 CSCS käsitelty kontrolli (U), S, T tai S + T (* p-arvo 0,05, ** p-arvo 0,01, n = 4).

keskustelu

Gliooma kantasoluja voidaan saada erilaisia ​​strategioita, kuten solujen lajittelun perustuu pintamerkkiaineita kuten CD133, rikastuminen väriaine effluxing puolella väestöstä, ja huumeiden ja säteilyä kestävien solupopulaatioiden ilmentävien ATP-sitova kasetti kuljettajat ja ATM proteiineja vastaavasti [25,26]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme rikastettu CSC populaatioita kahdesta ihmisen glioblastoomasolut linjat, U87 ja U373, kasvattamalla rakeita seerumivapaassa kulttuureissa ja vahvisti CSC omaisuutta nojalla niiden selkeästä korkeus CD133 ilmaisua. Käyttämällä rikastettu gliooma kantasoluja näistä kahdesta glioomasolulinjoja, tutkittiin niiden inhibitioon kemoterapeuttiset, lisättynä herkistymisen sFRP4. Voisimme osoittavat selvästi, että yhdistetty hoito sFRP4 standardin lääkettä käytetään GBM temotsolomidi, esti leviämisen GSCs molemmista solulinjoista, häirinneet pallo muodostumista kyky, vähentäneet pesäkkeiden muodostumisen pehmeässä agarissa määrityksen, ja haittasi solusyklin etenemisen osoituksena PI-värjäyksellä. Depolarisaation mitokondrion kalvon on selvä merkki apoptoosin jossa eheyden mitokondrion kalvon vaarantuu [22]. Voisimme osoittavat selvästi korostunut mitokondrion kalvon häiriöitä lääkekäsittelykokeen GSCs.

määrittämiseksi Tuumorigeenisuustutkimuksissa lääkekäsittelykokeen GSCs

in vivo

, kasvaimen kehitys suoritettiin nude-hiirissä. Tulokset ja kuviot

in vitro

Kokeet vahvistivat lisäksi

in vivo

, jossa S + T yhdistelmää saaneilla GSCs oli pienin määriä ihonalaista kasvaimia. Chemo-herkistyminen on yksi strategia voittaa Chemo-kestävyys ja liittyy käytön yhden lääkeaineen aktiivisuuden lisäämiseksi toisen moduloimalla mekanismeja Chemo-resistenssin. Tutkimuksemme osoittavat, että sFRP4 voimisti TMZ on gliooma kantasoluja. Wnt signalointi on keskeinen polku mukana normaalissa kudoksessa homeostaasin. SFRP: t ovat suurin perheen erittää Wnt antagonisteja ja ovat homologisia ligandia sitovan kysteiinirikkaan domeenin Frizzled perheen Wnt-reseptoreihin. sFRP4 on mukana apoptoosin säätelyyn, leviämisen, kudoksen muodostumista, ja kasvaimen kasvu [10,12,27,28]. Chemo-allergiaa sFRP4 palvelee kaksi tarkoitusta: vähentämällä tarvittava kemoterapeuttisten kuorma syöpien ja edistää kestävää Wnt esto, jotta terapeuttinen ikkuna kemoterapiaan, säästäen normaalin Wnt-riippuvaista kudosten. Tämä kaksinkertainen hyöty voisi estää pitkäaikaisen käytön sekä Wnt antagonisti ja temotsolomidi ja sidetrack haitallisista myrkyllisiä vaikutuksia hoidon normaaleihin soluihin.

aktivaatio epiteelin ja mesenkymaalitransitioon joka on tehokkaiden metastaattisen kolonisaation, ja se on prosessi aktiivisesti säädellään ylöspäin CSCS. Syntyvä, määräävä piirre CSCS on hankinnan mesenkymaalisten piirteet ja siirtyminen epiteelin ja mesenkymaaliset fenotyyppiin [29]. Tässä tutkimuksessa esittelemme käsityksen mekanismi eston CSCS mukaan sFRP4 analysoimalla epiteelin ja mesenkymaaliset ominaisuuksia gliooma kantasolujen jälkeen kemiallis-herkistymisen sFRP4. Tarttumattomat pallo muodostavat määritykset ovat luotettavia määrityksiä käytetään arvioimaan kantasolujen toimintaa normaalia kudosta ja oletettua CSCS, ja neuropallon on hyvin tutkittu alalla määritys [30]. Havaitsimme, että GSCs käsitelty S + T oli kasvanut huomattavasti ankkurointi ja laski pallo muodostavat kyky, jolloin solut voivat kasvaa ulos pallojen ja noudattaa muodostaa yksikerroksinen. Vastaavalla tutkimuksessa CSCS pään ja kaulan syöpä, sferoidiviljelmiä jossa osoitettu yli-express EMT markkereita ja oli vähentynyt pallomainen muodostumista kyky ja lisääntynyt sitoutuminen oli verrannollinen mesenkymaaliset epiteeli- kytkin [31]. Toinen tyypillinen fenotyyppinen ilmentymä EMT on muuttoliike ja hyökkäys [32,33]. Havaitsimme, että hoito S + T laski GSC invasiivisuus läpi ECM ja maahanmuuton siirtokuoppaan kammioiden, joka voitaisiin kytkeä toisiinsa hankintaan epiteelin ominaisuuksia tämän lääkkeen yhdistelmällä.

Lisäys noudattamista ja ankkurointi on liitetty ilmentymä epiteelin merkki E-kadheriinin, desmosomeja ja kiristyminen vyöliitos, joka on ankkuroitu solun tukirangan SS-kateniinin; ja menetys mesenkymaalisten määritellään markkereita, kuten tukirankaproteiinin proteiinit vimentiinista ja sileän lihaksen aktiini [34]. Tämä on liitetty transkription muutos tekijöitä, jotka aktivoivat mesenkymaaliset geenit ja tukahduttaa epiteelin markkereita, kuten Snail, ZEB ja bHLH perheen transkriptiotekijöiden, ja lisätä kerrostumista ECM proteiinia, fibronektiiniä. Tuntuva vähentäminen että havaitsimme tukirankaproteiinin proteiinien vimentiinistä, ja ai sileän lihaksen aktiini ja vyöliitos proteiini, ß-kateniinin, S + T käsitelty CSCS on selvä osoitus kytkimen tilan mesenkymaalisten epiteeli-.

jäsenet Snail perhe- Snail, Slug, ja Smuc, on yhteinen SNAG domain ja sinkkisormipolypeptidiin alue on C-terminaalissa, jonka kautta ne sitoutuvat E-laatikot promoottorialueissa kohdegeenien. Snail perheen transkriptiotekijöiden aloittaa tukahduttaminen E-kadheriinin välittämällä histonimodifikaation, jotka muuttavat niiden proteiinia vakautta ja solunsisäinen sijainti. Sääntely Snail proteiinien on valvonnassa eri signaalien kuten Wnt Shh, EGF, FGF, ja TGFp [35]. Transkriptiotekijän Twist vuorovaikutuksessa komponenttien Nurd monimutkainen, Polycomb-repressorin komplekseja PRC1 ja PRC2 E-kadheriinin promoottorin ja tukahduttaa E-kadheriinin, kun taas sitoutuminen Twist 1 metyylitransferaasin SET8 aktivoi N-kadheriinin. Osallistuminen EMT-välittävien transkriptiotekijöiden nähtiin selvästi tutkimuksessamme, jossa ilmaus

Snail

,

Slug

, ja

Twist

pieneni puoleen S + T käsitelty GSCs. Yhdenmukaiset, ilmaus toiminnallisen epiteelin merkki E-kadheriinin oli kahden kertaisen kasvun S + T käsitellylle GSCs, ja sen mesenkymaalisten vastine N-kadheriinin vähentynyt upon lääkehoitoa.

sFRP4 on monitasoinen toiminta on Wnt /SS-kateniinin polku ja voi antagonisoida Wnt /SS-kateniinin ja myös muiden kuin ensisijaisen Wnt /Planar solun polariteetti koulutusjakson aktivoimalla Wnt /Ca

2

+ koulutusjakson [36]. Kertyminen Ca

2

+ by sFRP4 että havaitsimme meidän tutkimuksissa voisivat viitata aktivointi kalsineuriini, joka on osoitettu stimuloida sFRP2 kautta Wnt /Ca

2

+ polku [ ,,,0],37]. Kalsium on liitetty olevan tärkeä välittäjäaine antagonismi Wnt signaloinnin vaikuttamalla useita pisteitä. Kasvu solunsisäisen kalsiumin johtaa aktivaatioon kalsium /kalmoduliinista riippuvainen proteiinikinaasi II (CaMKII) ja proteiinikinaasi C: n (PKC), joka puolestaan ​​antagonisoi kanoninen Wnt-reitin [38,39]. Tuloksena apoptoosin että havaitsimme jälkeen sFRP4 hoito voisi siis olla vaikutusta lisääntynyt solunsisäisen kalsiumin tasoa ja puolestaan ​​kasvu kalsium voi lisätä reaktiivisia happiradikaaleja (ROS), ja ROS voi aiheuttaa apoptoosin [36].

CSCS olla keskeinen rooli kasvaimen uusiutumisen nojalla tehostetusta kemiallis-kestävät ominaisuudet. Chemo-vastus ilmenee molekyylitasolla mukaan ilmaus lääkkeiden kantaja eli ATP: n sitoutuminen kasetti (ABC) proteiineja, jotka liittyvät monilääkeresistenssin [40,41]. Lisäksi yhdistyksen välinen transkriptiotekijät säätelevät EMT ja yli-ilmentyminen lääkkeiden kantaja on todettu [42]. Siten vähentynyt ilmentyminen lääkevuoto- proteiinien ABCG2 ja ABCC4 S + T hoito voi heijastaa voitto epiteelin ominaisuuksia, ja että kaksi prosessia EMT ja Chemo-resistenssi voi olla toisiinsa.

Yhteenvetona vuonna Tutkimuksella osoittaa, että endogeenisesti ilmaisi Wnt antagonisti, sFRP4, tuet kemiallis-herkistävä gliooma kantasoluja yleisesti käytettyyn gliooma kemoterapeuttinen aine, temotsolomidi. Tuloksemme antaa oivalluksia molekyylitason mekanismeja taustalla vaikutuksen sFRP4, mikä viittaa siihen, että sFRP4 toimii läpi muuttamalla kiinteästi toisiinsa ja monimutkainen CSC ominaisuudet itseuudistumisen, epiteelin ja mesenkymaalitransitioon, ja huumeiden effluxing koneita, jotka olemme yhteenveto kaavioesitys (S4 kuvio). Yhdistelmä hoito sFRP4 tavanomaisten kemoterapeuttisten auttaa vähentämään kemoterapeuttisen kuormitusta, joka on merkittävä kliinisestä näkökulmasta. Tuloksemme viittaavat siihen, että kohdistettu Wnt-reitin voi estää pro-selviytymisen signaalit CSCS sisällä gliooma toisaalta, ja hidastamaan invaasion ja muuttoliike toisaalta estäen kasvainmetastaasit ja uusiutumisen.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen glioblastoomasolulinjoissa U87 ja U373 saatiin National Center for Cell Sciences, Pune, Intia, ja ylläpidetään DMEM /F-12 ja DMEM-HG (Gibco) (1: 1), joka sisälsi 1X GlutaMAX (Life Technologies), 10% naudan sikiön seerumia (HiMedia), ja 100 U /ml PenStrep (Life Technologies). Seerumittomalla väliaineella (SFM) ja pallo kulttuurin suoritettiin perusalustassa (DMEM /F-12 + DMEM-HG) ja 100 U /ml PenStrep, 2 mM GlutaMAX, ja joka sisälsi 20 ng /ml: n epidermaalisen kasvutekijän (EGF), perus fibroblastikasvutekijä (bFGF; R & D Systems), ja leukemiaa estävä tekijä (LIF, Chemicon). Kaikki solut viljeltiin 37 ° C: ssa kosteassa inkubaattorissa 5% CO

2.

immunofluoresenssivärjäyksellä

varhainen luonnehdinta CSC merkki, CD133, immunofluoresenssimenetelmällä (IF) värjäys pallojen johdettu U87 ja U373 solulinjoja viljeltiin CSC väliaine tehtiin. Analysoitaessa U87 ja U373 CSCS jälkeen lääkehoitoa, jos värjäytyminen tarkoituksena oli selvittää α-SMA, vimentiinistä, ja ß-kateniinin ilmaisu kuten aikaisemmin on kuvattu [43], jossa on joitakin muutoksia. Lyhyesti, solut kiinnitettiin käyttämällä 4% paraformaldehydillä 20 min ajan 4 ° C: ssa, ja estettiin 3% naudan seerumin albumiinia (BSA) PBS: ssä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten soluja inkuboitiin 1 tunti pimeässä 4 ° C: ssa primääristen ei-leimatun hiiren anti-humaani-vasta-aineita CD133, α-SMA, vimentiinin, ja ß-kateniini (1: 200 laimennoksina, BD Biosciences), jota seurasi anti- -hiiri kanin fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) tai fykoerytriini (PE) leimatut sekundääriset vasta-aineet (1: 500 laimennokset, Invitrogen) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa.