Krooninen sairaus

tiivistelmä

Genetic uudelleenjärjestely

ROS1

Reseptorityrosiinikinaasin äskettäin määritelty erilliseksi molekyylimerkkiaineet ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Kuitenkin suoria todisteita keuhko- syövän synnyn aiheuttamien

ROS1

-fuusiogeenit vielä tarkastettava. Tämä tutkimus osoittaa, että

EZR-ROS1

on keskeinen rooli kasvaimen synnyssä NSCLC kätkeminen fuusio geeni.

EZR-ROS1

tunnistettiin neljä naispotilaiden keuhkojen adenokarsinooma. Kolme heistä oli tupakoimattomia. Interstitial poistaminen 6q22-q25 johti geenin fuusio. Fuusio-kinaasi NIH3T3-soluissa indusoi ankkurista riippumaton kasvu

in vitro

ja ihonalainen kasvaimia nude-hiirissä. Tämä muuttamassa kyky johtui sen kinaasiaktiivisuuden. ALK /MET /ROS1 estäjä, crizotinib, tukahdutti fuusio aiheuttama kiinnittymisestä riippumatonta kasvua NIH3T3-solut. Tärkeintä on, perustettiin siirtogeenisen hiiren linjat nimenomaan ilmentävät EZR-ROS1 keuhkojen keuhkorakkuloiden epiteelisoluissa kehitetty useita adenokarsinooma kyhmyt molemmissa keuhkoissa varhaisessa iässä. Nämä tiedot viittaavat siihen, että

EZR-ROS1

on keskeinen onkogeeni ihmisen NSCLC, ja että tämä eläin malli voisi olla arvokas tutustumiseen terapeuttisia aineita vastaan ​​

ROS1

-rearranged keuhkosyöpään.

Citation: Arai Y, Totoki Y, Takahashi H, Nakamura H, Hama N, Kohno T, et ai. (2013) Mouse Model for ROS1-järjestetty uudelleen Lung Cancer. PLoS ONE 8 (2): e56010. doi: 10,1371 /journal.pone.0056010

Editor: John D. Minna, Univesity Texas Southwestern Medical Center at Dallas, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 lokakuu 2012; Hyväksytty: 04 tammikuu 2013; Julkaistu: 13 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Arai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Program edistämisen Fundamental Studies in Health Sciences National Institute of Biomedical innovaatio, National Cancer Center tutkimus- ja kehitysrahasto (23-A-7 ja 23-B-28), Research Grant prinsessa Takamatsu Cancer Research Fund ja Apurahat-in-Aid alkaen terveysministeriön, Labour and Welfare 3.lle aikavälin Kattava 10 vuoden strategia Cancer valvonta. National Cancer Center Biopankkiverkosto tukee National Cancer Centerin tutkimus- ja kehitysrahasto, Japani. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on johtava syy syövän kuoleman maailmassa [1]. Keuhkoadenokarsinooma (LADC), yleisin muoto ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) koostuu useista eri genomista alaryhmiä määritelty ainutlaatuinen onkogeeninen muutoksia, ja huomattava osa LADC tapauksista satama kuljettaja muutoksia

EGFR, KRAS

ja

ALK

geenien toisiaan poissulkevia tavalla muutamaa poikkeusta lukuunottamatta [2] – [5]. Ymmärtäminen molekyylitason syövän avulla voimme kehittää terapeuttisia aineita, jotka kohdistuvat geneettiset druggable poikkeamia havaittu syövän genomeja. Tyrosiinikinaasin estäjät (TKI), joka kohdistaa EGFR ja ALK-proteiinit ovat erityisen tehokkaita hoidettaessa LADC kuljettaa

EGFR

mutaatioiden ja

ALK

fuusioita varten [2] – [6]. Kuitenkin kehittää tehokas TKI vaatii kokeellinen validointi geneettisen poikkeavuuksien hyödyllisinä ja druggable. Siirtogeenisen hiiren mallia kätkeminen

EGFR

mutaatioita tai

EML4-ALK

geenifuusioissa ovat onnistuneesti osoittaneet kasvaimia synnyttävän potentiaalin muutokset ja tehoa TKI-terapialle [7], [8]. Geneettiset uudelleenjärjestely

ROS1

äskettäin määritelty erilliseksi molekyylimerkkiaineet ihmisille LADC [9] – [16]. Tässä tutkimuksessa, loimme hiirimallissa

ROS1

fuusio, ja osoitti, että

EZR-ROS1

olennaisena kuljettaja onkogeeni keuhkojen karsinogeneesissä.

Tulokset

tunnistaminen EZR-ROS1 Fusion Gene in LADC Never tupakoimattomien

Koko transcriptome suurikapasiteettisten sekvensointi kasvain yksilöitä on yksi tehokkaimmista menetelmät niiden fuusio onkogeenien [17]. Analyysi viisi LADC tapausta koskaan tupakoineet ilman

EGFR /KRAS /ALK

muutoksia käyttämällä transcriptome sekvensointia tunnistettu 56 lukee ohittaen in-frame

EZR-ROS1

geeni sulamispiste yhdistävät

EZR

eksoni 10

ROS1

eksoni 34 yhdessä kasvain. RT-PCR-analyysi sovitettu ei-syöpä kudoksista varmisti kasvain-spesifisen fuusio-transkriptin (kuvio 1A). Lisäksi, transcriptome sekvensointi osoitti selvästi, tietyn ekspression lisääntymisen fuusioidun 3′-osa

ROS1

(eksonit 34-43) sen jälkeen, kun murtuessa, mikä viittaa siihen, että

EZR-ROS1

fuusio transkripti aiheuttaa poikkeava yliekspressio

ROS1

tyrosiinikinaasidomeeniin yhdessä 5 ’osan

EZR

(kuvio 1 B). SNP array vertaileva genominen hybridisaatio (array CGH) tiedot osoittivat, että tämä fuusio geeni muodostuvat suurelta interstitiaalinen poisto kattavat ~41.5 Mb kromosomissa 6q22-q25 (kuvio 1 C). Genominen PCR ja sekvenssianalyysi paljasti myös poistamista 41,5 Mb aiheuttaa somaattista fuusiot

EZR

introni 10 klo 6q25 kanssa

ROS1

introni 33 6q22 (kuva S1).

(A) Junction lukee edustavat

EZR-ROS1

fuusio transkriptien LCY66T näytteessä (vasemmalla). Sangerin sekvensoinnin RT-PCR-tuotteen validoitu kasvainspesifisiä in frame fuusio transkripti (oikealla). m: molekulaarinen merkkiaine. (B) Expression profiilit

EZR

ja

ROS1

in LCY66T. Aktiivinen ilmaus

ROS1

geeni havaittiin fuusion jälkeen piste. (C) SNP array CGH analyysi LCY66T. Kopioi numero koko kromosomi 6 on piirretty kuin log2 suhde.

RT-PCR ja Sangerin sekvensoinnilla analyysi 569 LADC yksilöitä Japani yksilöitä, mukaan lukien edellä mainitut tapaukset (343 tapausta varhaisen patologinen vaiheessa ja 226 tapauksissa pitkälle), tunnistettiin neljä tapausta kätkeminen tämä fuusio transkriptin (kuva S2). Kaikki neljä

EZR-ROS1

fuusio-positiivisia tapauksia oli naisia, ja kanna eikä

EGFR Twitter /

KRAS /HER2

mutaatioita eikä

EML4-ALK /KIF5B-RET

fuusioita. Kolme tapausta olivat huonosti eriytetty adenokarsinoomat tupakoimattomia, ja toinen oli kohtalaisen eriytetty adenokarsinooma tupakoitsijan.

Transforming aktiivisuus EZR-ROS1

EZR-ROS1

cDNA eristetty tuumorinäytesylinterin koodasi proteiinia 858 aminohappoa (kuvio 2A; GenBank /DDBJ hakunumero AB698667). Proteiini yhdistää FERM verkkotunnuksen [18] esriinin (EZR) kanssa transmembraani- ja kinaasi domeenien ROS1, mutta siitä puuttuu suurin osa kietoutunut-kela verkkotunnuksen EZR.

(A) Kaavamainen esitys EZR, ROS1 , EZR-ROS1, ja poistot /mutaatioita EZR-ROS1 geenejä. Verkkotunnus organisaatio näkyy. C-C: kelattu kela domain; TM: kalvon läpäisevä; C-ERMAD: C-terminaali ERM liittyvä verkkotunnus. (B) ROS1 fosforylaatio villityypin ja mutantti-EZR-ROS1 (E /R) ilmentävä NIH3T3 klooneja. Solulysaatit kustakin kloonista immunoblotattiin anti-V5-tag (ylhäällä) ja anti-fosforyloitu ROS1 (Tyr-2274, alhaalla) vasta-aineet. (C) tukahduttaminen ROS 1 kinaasiaktiivisuuden EZR-ROS1 by crizotinib estää STST3 aktivointi. NIH3T3-solut transfektoitu 1: tyhjän vektorin, 2: villityyppinen EZR-ROS1, 3: KD 4: DL1, 5: DL3 otettiin seerumia ja käsiteltiin 2 tunnin ajan DMSO tai 1 uM crizotinib, ja immunoblotattu asiaan vasta . β-aktiini käytettiin latauskontrollina. E /R: EZR-ROS1, p-E /R: fosforyloitua EZR-ROS1 havaitaan anti-fosfotyrosiini-2274-vasta-aineen ja ROS1. (D) Pehmeä agar pesäkkeiden muodostumisen villityypin ja mutantti-EZR-ROS1 ilmentävien NIH3T3-klooneja. Edustava kuva pesäkemuodostuksen kunkin kloonin piirretään yläosassa (asteikko bar, 100 m). Pesäkkeiden lukumäärä on saatu kunkin kloonin piirretään alareunassa. * P 0,05. (E) Crizotinib aiheuttama suppressio kiinnittymisestä riippumattoman kasvun NIH3T3-soluja, jotka ilmentävät EZR-ROS1. Pylväsdiagrammi, joka esittää prosenttiosuutta NIH3T3 pesäkkeiden aiheuttama

EZR-ROS1

tai

CCDC6-RET

hoidon jälkeen 200 nM crizotinib tai vandetanib osalta, jotka on muodostettu DMSO-käsiteltyihin soluihin. EZ-ROS: EZR-ROS1, C6-RET: CCDC6-RET. * P 0,05. (F) edustaja kuvat hiirten ihonalaisesti kanssa NIH3T3-solut, jotka ilmentävät villityyppistä, kinaasi domain-mutatoitu tai aminoterminaalinen-poistetaan EZR-ROS1. EML4-ALK-ilmentäviä NIH3T3-kloonia käytettiin positiivisena kontrollina. Kasvainten määrä per injektio kussakin transfektanttiyhdistelmän alla näkyy valokuvia.

tarkastella kasvaimia synnyttävän aktiivisuuden

EZR-ROS1

fuusio

in vitro

, loimme vakaa NIH3T3-kloonit ekspressoivat villityypin EZR-ROS1 ja kinaasi-dead-mutantin EZR-ROS1 (KD), jossa ATP-sitova lysiini jäännös mutatoitu metioniini (K491M), sekä mutantteja, joilla on sarjaan poistettu aminoterminaalinen FERM verkkotunnuksia (DL1, DL2 ja DL3, kuvio 2A). Autofosforylaation spesifisten tyrosiiniryhmien on ratkaiseva tapahtuma aktivointi erillisten signaalitransduktioreaktioteiden, ja Tyr-2274 ja ROS1 on erityinen autofosforylaatiokohta oleellista aikaansaada kinaasiaktiivisuuden transformaatioon [19]. Transformaatiossa määrityksissä, fosforylaation Tyr-2274 (vastaa Tyr-785 villityypin EZR-ROS1 fuusio) havaittiin villityypin EZR-ROS1-ilmentävän kloonin, mutta sitä ei ole havaittu kinaasi-dead (KD) ja Poistetaan (DL) mutantit; tämä tarkoittaa, että aminoterminaalinen osa on FERM (1-88 aminohappoa), on tarpeen ROS1 kinaasin aktivaation (kuvio 2B). Villityypin

EZR-ROS1

muttei kd /DL mutanttien nimenomaan aiheuttama aktivointi STAT3 alavirran signalointia, ja tuotti merkittävästi ankkurista riippumaton kasvu (kuvio 2C, D). Ankkurointi riippumattoman kasvun aiheuttama

EZR-ROS1

tukahdutettiin käsittelemällä crizotinib, TKI vastaan ​​ALK /MET /ROS1, kun kasvu aiheuttama toinen onkogeenin keuhko-,

CCDC6-RET

[11] ei ollut (kuvio 2E). Päinvastoin, vandetanib, TKI vastaan ​​RET /EGFR /VEGFR oli tehokas estämään pesäkkeiden muodostuminen CCDC6-RET ilmentävien solujen, mutta ei EZR-ROS1 ilmentäviä soluja. Kuten kuviossa 2C on esitetty, crizotinib hoito tukahdutti fosforylaation EZR-ROS1, ja estää aktivointi STAT3.

Seuraavaksi NIH3T3-solut ihon alle injektoitiin heikentyneisiin hiirissä. Villityypin EZR-ROS1-ilmentävien kloonien poikkeuksetta kasvaimia (6/6), kun taas yksikään KD: n ja DL-mutanttien-ilmentävien kloonien kasvaimia (kuvio 2F), joka vahvistaa, että

in vivo

tuumorigeenisen aktiivisuus

EZR-ROS1

vaatii ROS1 kinaasiaktiivisuutta.

kehittäminen LADC in EZR-ROS1 siirtogeenisiä hiiriä

edelleen arvioimista roolin

EZR-ROS1

in keuhkojen karsinogeneesin, olemme muodostaneet transgeenisiä hiiriä, jotka ekspressoivat fuusioproteiinia säätelyn alaisena tyypin 2 keuhkorakkuloiden epiteelin-spesifinen pinta-C-geenin promoottori [20] (kuvio 3A). Saimme neljä itsenäistä riviä (TGA, B, C ja D) eri kopioluku siirtogeenin (kuva S3) ja havaittiin keuhkojen adenokarsinooma kyhmyt kaikilla radoilla tarkasteltiin paitsi TGD. Analyysi fuusioproteiinin ekspressiotaso joukossa ei paljastanut mitään ilmentymistä TGD (kuva S4). Syntyvyys siirtogeenin-positiivisten jälkeläisten oli alhainen TGC (Siirtogeeniekspressio-positiivinen F1 jälkeläisten lukumäärä: yhteensä F1 määrä, 01:03), ja emme onnistuneet pitämään yllä TGC linja, niin me lähinnä analysoitiin yksi rivi (TGA), joka satamat noin neljä kappaletta siirtogeenin. RT-PCR ja immunoblot-analyysi todentaa keuhko-spesifinen

EZR-ROS1

mRNA ja proteiinin ilmentyminen, ja osoitti fosforylaation EZR-ROS1 fuusioproteiinia (kuvio 3B). Vaikka endogeeninen

Erzin

oli läsnä kaikissa monissa kudoksissa, endogeeninen

Ros1

-transcript havaittiin ainoastaan ​​vatsassa, munuaisissa ja keuhkoissa. Proteiinin ekspressiotasot endogeenisen ROS1 olivat hyvin heikko verrattuna tasot fuusio geenin siirtogeenisiä hiiriä (kuvio S4). Jopa neljän viikon ikäisiä, useita leesioita yli 1 mm halkaisijaltaan havaittiin siirtogeenisissä hiirissä, ja kasvaimet käytössä yli 40% leikattu pinta keuhkojen (kuvio 3C ja kuvio S5). Tietokonetomografia tutkimus havaittu useita kyhmyjä molemmissa keuhkoissa, ja hiiret osoittivat alennettu eloonjäämistä (kuvio 3D, E). Histologinen tutkimus keuhkojen kasvainten siirtogeenisen hiiren linjat yleensä osoittaneet adenokarsinooman kanssa papillaarinen /lepidic kasvumalli (kuvio 3C). Näitä leesioita osoitettiin olevan invasiivisia adenokarsinooman, joilla on kohtalainen mitoosi aktiivisuus paljastui positiivinen Ki-67 värjäyksen (kuvio S6A). Kuitenkin joissakin tapauksissa TGB linjat, havaitsimme kertyminen sytoplasman musiinia kasvainsoluissa (kuvio S6b).

(A) Kaavamainen esitys

SP-C /EZR-ROS1 /polyA

siirtogeenin. (B) ekspressio eksogeenisen

EZR-ROS1

geenin siirtogeenisiä hiiriä. RT-PCR: llä (ylhäällä) ja immunoblot-analyysi (alhaalla) ja hiiren kudoksissa paljasti, että EZR-ROS1 nimenomaisesti ilmaistu keuhkoihin kaksi siirtogeenisiä hiiriä (TgA21 ja TgA25). HT: sydän, LV: maksa, ST: vatsa, SP: perna, KD: munuainen, LG: keuhko (C) edustaja histologinen analyysi Keuhkovaurioita siirtogeenisiä hiiriä. Värjäys hematoksyliini-eosiinilla osoittaa laajaa vaurioiden sekä 4 viikon ikäisiä ja 15 viikkoa vanhoja fuusio-positiivisia hiirillä. Tg: fuusio-positiivinen, CR: fuusio-negatiivinen. Mittakaava, 100 pm. (D) Tietokonetomografia (vasemmalla) keuhkoista TgA04 hiiren viikolla 19. Tehostettu vaurioita molemmissa keuhkoissa havaittiin. Useita nodular haavaumia (oikealla) havaittiin keuhkopussin pinnalla keuhkoihin TgC01 hiiren ruumiinavauksessa. (E) Eloonjäämiskäyrät siirtogeenisten ja kontrollihiirten luotu käyttäen Kaplan-Meier-menetelmää.

läsnäolosta huolimatta useita kasvaimia keuhkoissa ja siirtogeenisiä hiiriä, emme onnistuneet havaitsemaan etäpesäkkeiden ruumiinavauksessa vuonna TGA, B ja C-hiiriä. Siten on todennäköistä, että ilmaus

EZR-ROS1

ei yksin riitä tekemään syöpäsolut metastasoitunut.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa tunnistettiin

EZR- ROS1

niin keskeinen kuljettaja onkogeeni keuhkojen syövän synnyn. Erzin ilmentyy kaikkialla monissa kudoksissa.

EZR-ROS1

fuusio havaitaan RNA sekvensoinnilla LADC tapauksissa 5 ’osuuden

EZR

aiheuttaa poikkeava yliekspressio kinaasidomeeni

ROS1

. Ei ilmeistä vaikutus transkriptio tasot 3′-osa

EZR

havaittiin. Tämä saattaa olla katsoa aiheutuvan ylimääräisen ilmentymisen villityypin

EZR

yli fuusiogeeni. Olemme paljasti myös, että ROS1 kinaasin aktivaation tässä fuusio vaatii N-pään FERM domeenin EZR. FERM assosioituu monia eri proteiineja, mukaan lukien fosfolipidit, rakennustelineet proteiinit EBP50 ja E3KARP, ja muut membraaniin liittyneet proteiinit, jotka voivat säädellä dimerisaatioon tai oligomeroimalla esriinin [21]. Monet fuusio kinaasiproteiinien, kuten ALK ja RET, näyttää konstitutiivinen tyrosiinikinaasiaktiivisuus johtuu dimerisaatio verkkotunnuksia aminopään fuusiokumppani [6], [22]. Kuitenkin toinen ROS1 fuusioproteiini, kuvio-ROS1, joka löytyy ihmisen glioblastooma, kolangiokarsinooma ja keuhkojen adenokarsinooma, ei osoittanut mitään dimerisaatio ominaisuuksia, sen sijaan olemassa olevat monomeerinä fuusioproteiinia huolimatta säilyttää kelatun kelan aloilla ja leusiinivetoketju [19 ]. Näin ollen molekyyli mekanismeista ROS1 aktivointi, jonka FERM verkkotunnuksen jää epäselväksi.

hiiret osoittivat syntymistä useita adenokarsinooma kyhmyt varhaisessa vaiheessa, ja nopea etenemistä kasvaimia. Nämä ominaisuudet ovat pitkälti samanlaisia ​​kuin

EML4-ALK

hiirimallissa [8]. Useat ryhmät raportoitu että mucinous seulamaisessa kuvio ja sinettisormus solu ovat ominaisia ​​histologiset piirteet E

ML4-ALK

positiivisia ihmisen keuhkosyövän [23] – [25]. Viime aikoina olemme tutkineet histopatologia

ROS1

-fusion positiivinen ihmisen keuhkosyövässä [16]. Vaikka muut tutkijat raportoivat, että sinettisormus solun ominaisuutta ei ollut yleinen

ROS1

-rearranged keuhkosyövässä [10], huomasimme, että 53%: ssa tapauksista kanna mucinous seulamaisessa tai sinettisormus solun samoja piirteitä kuin

ALK

-rearranged keuhkosyövässä mutta loput osoitti papillaarinen /lepidic kasvumalli.

EZR-ROS1

positiivisia kasvaimia näytti huonommin eriytetty, ja osoitti useammin histologisia piirteitä mucinous seulamaisessa tai sinettisormus solu. Meidän hiirimallissa

EZR-ROS1

keuhkosyöpä yleensä osoittaneet papillaarinen /lepidic kasvumalli, mutta joissakin tapauksissa havaitsimme kertyminen sytoplasman mucin kasvainsoluissa, mikä melko muistuttaa, että ominaisuus histologia raportoitu

ROS1

-rearranged keuhkosyöpä. Tällä hetkellä meillä ei ole vastausta, miksi vain osa hiirten kanna kasvainten mukiinia kertymistä.

EZR-ROS1

fuusio geeni nimenomaan havaittiin keuhkosyöpä yksilöiden naisten koskaan tupakoineet ilman

EGFR, KRAS,

ja

ALK

muutoksia. Arvioitiin, että ~ 2%: lla potilaista White ja Aasian keuhkosyöpä ikäluokat oli

ROS1

-rearrangements, joka esiintyy huomattavasti korkeammat nuoremmilla, savuton, naispuolisten henkilöiden [10], [11], [16]. Vaikka jokainen muutos on harvoin,

ROS1

fuusioita monenlaisia ​​5 ’kumppani geenejä (

CCDC6, CD74, EZR, kuvio, KDELR2, LRIG3, SDC4, SLC34A2 ja TPM3

) on raportoitu keuhkojen, aivoissa, sappiteiden, ja munasarjojen syöpiä [9] – [16], [26] – [28]. Nämä

ROS1

-rearranged kasvaimia voitaisiin kohdistaa terapeuttisesti erityisiä estäjät, mukaan lukien crizotinib [10], [14], [27], [29]. Kaksi LADC potilaalla oli merkittävä kliininen vaste crizotinib [10], [14]. Siten meidän

EZR-ROS1

keuhkosyöpä eläinmallissa voisi olla arvokas arvioimiseen terapeuttista potentiaalia näiden yhdisteiden ja uusia lääkkeitä sekä biologiset ominaisuudet

ROS1

-rearranged keuhkosyöpä

in vivo

.

Materiaalit ja menetelmät

Kliiniset näytteet

kudosnäytteiden keuhkosyövän potilaista saatiin National Cancer Center Biopankkiverkosto, Japani. Korkean molekyylipainon genomista DNA: ta ja RNA: ta uutettiin tuore Tuumorinäytteet ja ei-syöpä keuhkojen kudoksiin. Kirjallinen tietoinen suostumus saatiin kunkin potilaan. Tutkimuksen protokolla hyväksyi eettinen komitea National Cancer Center, Tokio, Japani.

Analyysi Whole-transcriptome Sequence Data

Lisää cDNA-kirjastot (150-200 bp) valmistettiin 2 ug kokonais-RNA: sta käyttäen mRNAseq Sample Preparation Kit (Illumina). Kirjastot tehtiin pariksi loppuun sekvensointi 50 bp on HiSeq2000 (Illumina), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Parilliset-end lukee kartoitettiin tunnettujen RNA sekvenssien RefSeq, Ensembl, ja LincRNA tietokantoja käyttäen Bowtie ohjelmaa kuten aiemmin on kuvattu [30].

RT-PCR, Genomic PCR ja sekvensointi

kokonais-RNA käänteiskopioitiin cDNA käyttäen Superscript III (Life Technologies). cDNA: n tai genomisen DNA alistettiin PCR-monistus käyttäen Ex-Taq (Takara Bio) ja alukkeita EZR-e10-CF1 (GAAAAGGAGAGAAACCGTGGAG) ja ROS1-E34-CR1 (TCAGTGGGATTGTAACAACCAG). PCR-tuotteet sekvensoitiin suoraan Sanger sekvensoinnilla käyttämällä BigDye Terminator Kit (Life Technologies).

SNP Array CGH Analysis

Kromosomi kopioi numero kasvainten määritettiin käyttämällä korkean resoluution SNP pakat ( GeneChip- Mapping 250K-NSP array, Affymetrix). Perimän DNA leimattiin ja hybridisoitiin SNP paneelit mukaan valmistajan ohjeiden ja kopioida numeroita laskettiin hybridisaatiosignaaleja käyttäen CNAG ohjelmaa [31].

vector kloonaus ja tuottaminen poistaminen ja Point Mutants

koodaava alue

EZR-ROS1

cDNA saatiin PCR-monistuksella LCY66 kasvain-cDNA käyttäen Phusion Taq-polymeraasia (New England Biolabs) ja alukkeita EZR-H1F1 (CACCATGCCGAAACCAATCAATGTCCGAGTT) ja ROS1-H1R1 ( ATCAGACCCATCTCCATATCCACTGTG).

EML4-ALK

cDNA ja

CCDC6-RET

cDNA monistettiin peräisin

EML4-ALK

positiivisten ensisijainen keuhkosyövän näytteestä (E13, A20) ja

CCDC6-RET

positiivisten ensisijainen keuhkosyövän näytteestä (C1, R12), tässä järjestyksessä. PCR-tuotteet subkloonattiin pcDNA3.1D-V5-His-plasmidi (Life Technologies). Korvaaminen lysiini metioniinin kodonin 491

EZR-ROS1

geenin suoritettiin käyttäen PrimeStar kohdennetun mutageneesin (Takara Bio). N-terminaalinen deleetio mutantit FERM domeenin

EZR-ROS1

cDNA konstruoitiin PCR: llä käyttäen alukkeita EZR-FERM-AF (CACCATGGTGGCTGAGGAGCTCATCCAGGACATC) ja ROS1-H1R1 varten DL1, EZR-FERM-BF (CACCATGATCAACTATTTCGAGATAAAAAACAAG) ja ROS1-H1R1 varten DL2, ja EZR-FERM-CF (CACCATGACCATCGAGGTGCAGCAGATGAAGGC) ja ROS1-H1R1 varten DL3. Plasmidit transfektoitiin NIH3T3-soluihin käyttäen Lipofectamine 2000-reagenssia (Life Technologies), ja stabiileja klooneja eristettiin G418-valinnan (0,7 mg /ml). Sillä pesäkemuodostusta, solut on upotettu ja viljeltiin 0,4% pehmeään agariin kolmena kappaleena, ja pesäkkeiden lukumäärä laskettiin sen jälkeen, kun 21 päivää. Kvantitointi kiinnittymisestä riippumattoman kasvun olosuhteissa, kanssa tai ilman crizotinib (S1068, Selleck) ja vandetanib (S1046, Selleck) jälkeen 9 päivää suoritettiin CytoSelect-96 -kittiä (Cell Biolabs). Yhdistettä lisättiin pintakerros pehmeän agarin joka 3 päivä.

immunoblot-analyysi

kokosolulysaateille uutettiin CelLytic M reagenssilla (# C2978, Sigma), ja alistettiin SDS -sivu ja sen jälkeen imeyttämällä PVDF-kalvolle. Detection of Western blotit suoritettiin WesternBreeze Kemiluminesenssiin immunodetektio Kit (Life Technologies) käyttämällä ensisijaista vasta-aineita ROS1 (# 9202, Cell Signaling Technology), fosforyloitu-ROS1 (Tyr2274) (# 3078, Cell Signaling Technology), STAT3 (# 610189, BD), fosforyloitu-STAT3 (Tyr705) (# 9138, Cell Signaling Technology), p44 /42 MAPK (# 4695, Cell Signaling Technology), fosforyloitu-p44 /42 MAPK (Thr202 /Tyr204) (# 9106, Cell Signaling Technology) , Erzin (# 4135, Cell Signaling Technology), p53 (# 6243, Santa Cruz), ja b-aktiini (# A5441, Sigma).

vastustamisesta ROS 1 kinaasiaktiivisuuden EZR-ROS1 by Crizotinib

Transfektoituja NIH3T3-soluja (tyhjä vektori, villityypin EZR-ROS1, KD /DL-mutantit) ovat ilman seerumia 2 h, sitten lisättiin 2 tuntia 1% DMSO: ssa tai 1 uM crizotinib, sitten elatusaine oli muuttaa vakio 10% FBS: ia 10 minuuttia. Kokosolulysaateille alistettiin immunoblot-analyysillä.

ihonalainen elinsiirtojen heikentyneisiin Hiiret

yhteensä 1 x 10

6 solua injektoitiin ihon alle nude-hiiriin (BALB /c- nu /nu, CLEA Japani). Hiiriä tarkkailtiin päivittäin kasvaimen muodostumisen. Kaikki eläin menettelyt suoritettiin suostumuksella eläimen eettisen komitean National Cancer Center.

Generation ja tutkiminen

EZR-ROS1

siirtogeenisiä hiiriä

FLAG-merkitty

EZR-ROS1

cDNA subkloonattiin

SPC-iNOS

plasmidi (tri Hagiwara), joka sisälsi

SPC

promoottorin ja polyadenylaatiosignaalin, korvaamalla

iNOS

fragmentti cDNA. Ekspressiokasetti kanssa

SPC

promoottori leikattiin konstruktista ja injektoitiin pronukleaarinen vaiheen alkioiden C57BL /6J-hiiriä (Unitechin Japani). Kopioluku siirtogeenin määritettiin Southern blot -analyysi DNA: eläinten häntiä. Transgeenisten linjojen ylläpidettiin takaisinristeytyksessä C57BL /6-hiiret. Kokonais-RNA eristettiin elinten siirtogeenisiä hiiriä ja alistettiin RT-PCR-analyysi havaitsemiseksi

EZR-ROS1

, endogeeninen

Ros1

, endogeeninen

Erzin

ja

GAPDH

mRNA: t. Havaitsemiseksi EZR-ROS1 proteiini, endogeeninen ROS1 ja Erzin kudoksissa, hajotettiin homogenaatit alistettiin immunoblot-analyysillä käyttäen anti-ROS1, anti-Erzin ja anti-β-aktiini vasta-aineita. Tutkiminen keuhkotuumoreiden elävien eläinten suoritettiin röntgen- CT-laitteiston (tutkia mikro-CT, GE Healthcare). Keuhkojen kudokset kiinnitettiin 10% formaliinilla ja parafinoidut. Hematoksyliini-eosiini värjäystä ja immunohistokemiaa Ki67 suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [32].

tukeminen Information

Kuva S1.

havaitseminen

EZR-ROS1

genomista murtuessa risteyksessä. Elektroferogrammi varten Sangerin sekvensointia perimän fragmenttien kattaa

EZR-ROS1

murtuessa risteyksessä LCY66 kasvain. Genominen PCR-tuotteet monistettiin EZR-E10-CF1 ja ROS1-E34-CR1 alukkeet suoraan sekvensoitiin käyttämällä EZR-E10-CF1 pohjamaali. Numerot yläpuolella elektroferogrammi osoittavat perimän asemaa kromosomissa 6 (ihmisen genomi rakentaa 37,3). Genominen fragmentti 35 emäsparia

EZR

intronin 10 käännettiin sisällä intronin ennen fuusiota

ROS1

introni 33.

doi: 10,1371 /journal.pone.0056010.s001

(PDF) B Kuva S2.

havaitseminen fuusio geenin transkriptien kliinisistä näytteistä RT-PCR: llä. Edustavia RT-PCR tulokset osoittavat fuusio-positiivisia ja fuusio-negatiivinen tapauksissa käyttämällä alukkeita EZR-E10-CF1 ja ROS1-E34-CR1. M: molekulaarinen merkkiaine, NC: negatiivinen kontrolli. RT-PCR villityypin

EZR

transkripti (alukkeiden EZR-e4-CF1 ja EZR-E7-CR1) ja

GAPDH

(alukkeet GAPDH-F ja GAPDH-R) on myös esitetty.

doi: 10,1371 /journal.pone.0056010.s002

(PDF) B Kuva S3.

Kopioi numero analyysi siirtogeenisissä hiirissä. Genominen DNA eristettiin hännät siirtogeenisiä hiiriä syntyvät pronukleaarinen-vaiheen C57BL /6J-alkioita. Tämä gDNA saatettiin sitten Southern blot-analyysi, jossa PCR-monistettu SPC-promoottorin fragmentti 464 bp, käyttäen alukkeita SPC-pro-F ja SPC-pro-R, koettimena. Kontrollinäytteiden oikealla muodostuivat hiiren genomin DNA ilmoitetun kopiot siirtogeenin kohden diploidinen genomi. Tunnisteilla hiirten positiivisia siirtogeenin näkyvät yläosassa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0056010.s003

(PDF) B Kuva S4.

Gene ilmaisuja siirtogeenisiä hiiriä. Geenien merkitty vasemmalla puolella tutkittiin RT-PCR: llä tai immunoblot-analyysillä. RT-PCR, PCR syklit monistamaan kohde- geenejä merkitty oikealle puolelle. Erzin osoitti läsnä endogeenisen ilmaisua, mutta endogeenisen Ros1 ilme oli alhainen. : N ilmentyminen ei EZR-ROS1 fuusioproteiini havaittiin TGD linjan hiirissä (*). SW480 käytettiin negatiivisena kontrollina fuusion ilmentymisen. HT: sydän, LV: maksa, ST: vatsa, SP: perna, KD: munuainen, LG: keuhko.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0056010.s004

(PDF) B Kuva S5.

Lung kasvainten kehittymistä siirtogeenisiä hiiriä. Keuhkoissa TGA hiirillä tehtiin poikkileikkaus ja histologisesti tunnettu. Lukumäärä ja koko vaurioiden kartoitettiin fuusio-positiivisten hiiret (Tg) ja fuusio-negatiivisia hiiriä (CR) 4 viikon ja 15 viikon kuluttua syntymästä. (A) Kasvaimen leesiot luokiteltiin pitkin sen koko halkaisija (mm) ja laskettiin. (B) Kasvaimen käyttöaste laskettiin johdettu kasvaimen alueella.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0056010.s005

(PDF)

Kuva S6.

histologinen luonnehdinta keuhkotuumoreista siirtogeenisiä hiiriä. (A) värjäys hematoksyliini-eosiinilla hiiren keuhkot osoittivat invasiivisia keuhkoadenokarsinooma ympäröivän keuhkojen aluksen (a1). Suuremmalla suurennoksella kasvaimen (a2). Positiivinen Ki-67 värjäytymisen kasvain (a3). Mittakaava, 100 pm. (B) värjäys hematoksyliini-eosiinilla hiiren keuhkot osoittivat sytoplasman musiinia keuhkon adenokarsinooma soluissa (b1). Suuremmalla suurennoksella kasvaimen (b2). Mittakaava, 200 um.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0056010.s006

(PDF) B

Kiitokset

Kiitämme tohtori K. giwara (Saitama Medical University ) tarjoamiseksi SPC-iNOS plasmidi, Drs. Y. Nanya ja S. Ogawa (Tokion yliopisto) tarjoamiseksi CNAG ohjelmaa, ja Ms N. Okada, H. Shimizu, A. Kokubu, T. Urushidate, S. Ohashi ja W. Mukai erinomaisesta teknisestä avusta.