Krooninen sairaus

tiivistelmä

halkio transmembraaniproteiiniksi 1-Like (CLPTM1L), asuu alueella kromosomin 5 joille kopio vahvistuksenkertojan on todettu olevan yleisin geneettinen tapahtuma alkuvaiheessa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC). Tämä lokus on todettu useita genomin laajuinen yhdistys tutkimukset liittyvän keuhkosyövän sekä tupakoitsijoiden ja tupakoimattomien. CLPTM1L on todettu, että yli-ilmentynyt proteiini ihmisen munasarjan kasvainsolulinjoissa, jotka ovat resistenttejä sisplatiinille, joka on ainoa tietoa näin pitkälle funktio CLPTM1L. Tässä näemme CLPTM1L lauseke lisääntynyt keuhkojen adenokarsinooman verrattuna vastaaviin normaaleihin keuhkojen kudosten ja keuhkojen kasvainsolulinjoissa mekanismeilla ei yksinomaan kopioida vahvistuksenkertojan. Kun menetys CLPTM1L kertymistä keuhko- kasvainsolujen, sisplatiinin ja camptothecin aiheuttaman apoptoosin korotettiin suorassa suhteessa tasoon CLPTM1L knockdown. Bcl-x L kertymistä pieneni merkitsevästi hävitessä CLPTM1L. Expression eksogeenisen Bcl-x L lakkautetaan herkistymiseen apoptoottisiin tappaminen kanssa CLPTM1L knockdown. Nämä tulokset osoittavat, että CLPTM1L, joka on ilmentynyt proteiini keuhko- kasvainsolujen, suojaa genotoksisia stressin aiheuttaman apoptoosin säätelyn kautta Bcl-xL. Näin ollen tämä tutkimus implicates apoptoosin vastaisen CLPTM1L toiminto mahdollisena mekanismi alttius keuhkojen kasvaimien syntyyn ja kestävyys kemoterapiaa.

Citation: James MA, Wen W, Wang Y, Byers LA, Heymach JV, Coombes KR, et ai. (2012) toiminnallinen karakterisointi CLPTM1L kuin Lung Cancer Risk Candidate Gene vuonna 5p15.33 Locus. PLoS ONE 7 (6): e36116. doi: 10,1371 /journal.pone.0036116

Editor: Swati Palit Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 elokuu 2011; Hyväksytty: 30 maaliskuu 2012; Julkaistu 4. kesäkuuta 2012

Copyright: © 2012 James et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat jota NCI Cancer Center Support Grant # P30 CA91842, Human Protein Atlas projekti, ja NCI U19CA148127 avustusta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

CLPTM1L on saanut nimensä, perustuu sen homologiaa halkio transmembraaniproteiini 1, joka tunnistettiin hajotettiin perheen halkio [1]. CLPTM1L otettiin esimerkiksi säädelty transkripti on sisplatiinin kestävä munasarjojen tuumorisolulinja [2]. Kuitenkin tulosten tulkinta Tämän tutkimuksen on vaikeaa, koska ei ole seuraus mekanismia ja vaikutusta yliekspressio CLPTM1L vuonna sisplatiinin herkkyys oli ristiriitaisia ​​eri munasarjakasvain solulinjoissa, riippuen niiden ennestään tason vastustuskyvyn. Kuitenkin rooli CLPTM1L vastustuskyky sisplatiinia ehdotettiin. Mielenkiintoista on, että homologi CLPTM1 on havaittu ilmaistaan ​​korkeammilla tasoilla doksorubisiinia kestävä rinta- kasvaimia, ja ilmentyminen CLPTM1 ennustaa vastaus doksorubisiinille [3]. Tuoreessa tutkimuksessa todettiin, että geneettinen varianttia CLPTM1L geeni (rs402710) liittyy kertymistä DNA additiotuotteiden kasvainkudoksessa viereiseen keuhkokudoksessa [4]. Tämä sama SNP, muiden muassa alueella CLPTM1L ja tert geenien liittyy keuhkosyövän riskiä [5], [6], [7]. Tuoreessa tutkimuksessa kohdunkaulan syöpää integroimalla geeni annostus ja ilmaisun tietojen CLPTM1L /TERT lokuksen havaittiin olevan kopio vahvistuksenkertojan kasvaimissa ja ilmaisun malleja, jotka korreloivat kopio vahvistuksenkertojan [8]. Toinen tuore tutkimus paljasti, että kopio vahvistuksenkertojan poikki 5p, CLPTM1L ekspressio lisääntyi noin 5 kertaiseksi kohdunkaulan syövän solulinjoissa yli normaalin kohdunkaulan epiteelisolujen, kun taas ilmaus muiden geenien 5p15.33 ei muutettu [9]. Nämä oivalluksia toiminta CLPTM1L, ja se, että kopion numero voitto kromosomin alueen 5p sisältävien CLPTM1L on yleisin sytogeneettisten tapahtuma alkuvaiheessa ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [10] ovat pakottavia perusteita tutkimuksen roolin CLPTM1L keuhkosyövän sekä muita syöpätyyppeihin.

DNA-vaurioita, kuten aiheuttamat genotoksisten kemoterapia-aineiden, indusoi apoptoosin kautta kaksijuosteiseen tauko liittyy kinaasien ja myöhempi transkription säätely apoptoottisten effektorit pääasiassa p53 [11]. Bcl-2-perheen jäsentä säätelee p53 kuten Bax ovat keskeisiä aktivoituminen apoptoosin tämän reitin ja toimi, läpäiseväksi mitokondrion kalvon [12]. Anti-apoptoottisten Bcl-2-perheen jäsen Bcl-xL suojaa syöpäsolujen p53 indusoi apoptoosin [13] ja toimii sitoutumisen kautta, ja inaktivointi Bax [14] ja sitovat proteiinit, jotka rekrytoivat Bax ja mitokondrion kalvon [15]. Bcl-x L on usein yli-ilmentyy keuhkojen kasvaimet, on yhteydessä huonoon ennusteeseen [16], [17], ja sillä on tärkeä rooli resistenssin genotoksisia kemoterapeuttisten aineiden keuhko- ja muiden syöpätyyppien [18], [19], [20] , [21], [22], [23].

Vaikka yhteyden CLPTM1L syöpään on ehdottanut kopio vahvistuksenkertojan, genomin laajuinen yhdistys ja tutkimuksia munasarjakasvain solulinjoissa; funktio CLPTM1L ja sen rooli kasvainten synnyssä ei toistaiseksi tunneta. Kirjoittajat raportoivat, että CLPTM1L on yleisesti yli-ilmentynyt antiapoptooppinen tekijä keuhkokasvaimia. Knockdovvn CLPTM1L nauhoituksen NSCLC soluissa johtaa lisäykseen herkkyydessä genotoksisia stressiä välittämä apoptoottisia tappaminen ja vähentää ilmentymistä Bcl-x L tavalla riippuvainen annoksen CLPTM1L ilmaisun. Lisäksi ilmaus eksogeenisen Bcl-x L poistetaan herkistyminen genotoksisille stressin aiheuttaman apoptoosin mukaan CLPTM1L knockdown. Tämä suojaava vaikutus ei ole yksinomaan sisplatiinin välitteistä tappamista. Pikemminkin CLPTM1L toimii epäsuorasti yleisenä estäjänä mitokondrioiden reitin apoptoosin kautta Bcl-xL sääntelyä. Nämä tulokset osoittavat rooli CLPTM1L kemoterapeuttisessa resistenssin keuhkojen kasvainsoluissa, ja ehdottaa rooli CLPTM1L keuhkojen kasvaimien syntyyn kautta suojaa apoptoosin lisäämällä kertymistä Bcl-xL.

Tulokset

Expression of CLPTM1L Lung kasvaimet

Koska raportit kopioluvun voitto keuhkosyöpä, GWAS todisteita, ja lisääntynyt ilmentyminen CLPTM1L sisplatiinin resistenttien munasarjojen kasvainsolut, etsimme onko CLPTM1L yliekspressoitiin keuhkokasvaimia. Expression of CLPTM1L mRNA NSCLC potilaiden kasvaimissa verrattiin sovitetun kasvaimeen viereisiin kudoksiin qPCR. CLPTM1L korotettiin keskimäärin 2,24 kertainen päästäisiin yleiseen merkitys ero ilmentymistä 30 Vaihe I pienisoluista keuhkosyöpää (p = 0,0028, kahden otoksen Studentin T-testi) (kuvio 1A). Vaikka TERT ilme oli keskimäärin 1,76 kertaa suurempi kasvainkudoksessa kokonaiseroja TERT ilmaisua ei pääse merkitystä ja eivät korreloi merkitsevästi CLPTM1L ilme (r

2 = 0,0018, p = 0,994) (kuvio S1A). Otos koostui 22 adenokarsinooma ja 8 okasolusyöpä potilaat Taulukossa S1 kuvataan tunnetut ominaisuudet tutkimuspopulaatiosta. Ei ollut eroja kasvaimen yli-ilmentymisen välillä okasolusyöpää ja adenokarsinoomat (tietoja ei ole esitetty). Analyysi ilmaisun microarray tietoja 148 keuhkotuumorisolulinjoissa linjat ja 59 ”normaali” solulinjat kuolemattomiksi TERT- ja Cdk4 vahvistivat nämä tulokset, paljastaen 2,02 kertainen keskimääräinen ero CLPTM1L ilmaisun verrattuna kuolemattomia solulinjoja (p = 1.48E-9, Two -häntäistä Studentin t-testi) (kuvio 1 B). Tämä data osoittaa myös, että ilmentyminen CLPTM1L lisääntyy kasvainsoluissa muiden mekanismien kuin kopioluvun vaihtelua, koska analyysi ei kuitenkaan kasvainsolulinjojen kanssa kopioluvun vaihtelu edelleen merkittäviä (p = 1.28E-8, kaksi-tailed Studentin T-testi) ja samaa suuruusluokkaa (1,83-kertainen) (kuvio 1 C). Kopioi numero muutos oli identtinen välillä CLPTM1L ja TERT geenejä. Kuitenkaan mitään korrelaatiota CLPTM1L ilmaisun ja tert ilmentyminen havaita kasvainsolulinjoja (r

2 = 0,0126, p = 0,175) (kuvio S1B). Ekspression analysointi suoritettiin myös eri keuhkojen kasvain alatyyppejä. Adenokarsinooma solulinjat osoittivat keskimäärin 2,15 kertaa suurempi CLPTM1L ilmentymistä normaalissa kuolemattomia solulinjoja (p = 3.59E-7, kaksi-tailed Studentin T-testi) ja pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat osoittivat keskimäärin 2,07 kertaa suurempi ilmentyminen (p = 1,15 E-9, kahden otoksen Studentin T-testi) (kuvio 1 D). Näin ollen, lisääntynyt CLPTM1L ekspressio näyttää olevan ominaisuus keuhkotuumoreiden riippumatta alatyypin.

A) CLPTM1L transkripti kertyminen mitattuna qPCR keuhkojen adenokarsinooma kudoksissa suhteessa keskiarvoon vastaaviin normaaleihin kasvaimen viereiseen kudokseen 30 potilasta, jotka osoittavat 2.23 kertaiseksi keskimääräinen kasvu ilmentyminen kasvaimen kudoksissa. B) CLPTM1L transkriptin kerääntyminen mitattuna microarray keuhkojen tuumorisolulinjoja suhteessa keskimääräiseen ei-transformoitujen kuolemattomaksi tehtyjä solulinjoja, jotka osoittavat 2,02-kertainen keskimääräinen lisäys ilmentymisen tuumorisolulinjoissa. C) Cell line ekspressiotietojen lukuun ottamatta kasvainsolulinjoissa kanssa kopioluvun vaihtelun osoittaminen 1,83 kertainen lisäys tuumorisolulinjoissa. D) Solulinja jaettu adenokarsinooma solulinjojen ja pienisoluinen keuhkosyöpä solulinjat. Mustat palkit edustavat keskiarvoja. p-arvot saatiin käyttäen kaksisuuntaista Studentin t-testi.

CLPTM1L resistenssin Genotoksiset Stressi aiheuttaman apoptoosin Lung tuumorisoluissa

Koska lisääntyneen ilmentymisen CLPTM1L liittyy keuhkokasvaimia, pyrimme moduloimaan CLPTM1L tasoilla keuhkoadenokarsinooma solulinjojen ja määrittää vasteen genotoksinen tekijöille. Knockdovvn CLPTM1L A549 ja H838 keuhkoadenokarsinooma solulinjoissa suoritettiin käyttämällä kolmea riippumatonta virus- shRNA vektorit ja johti alueella tehokkuus jopa 90% mitattuna kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR: llä ja immunoblottauksella (kuvio 2A ja B). Vaikutus CLPTM1L Knockdown tappaa sisplatiinia määritettiin näissä solulinjoissa. Solut laskettiin metallilla yhtä monta kertaa noin 50% konfluenssiin, ja niistä määritettiin elinkelpoisuutta solulaskennan kuluttua 48 tunnin sisplatiinihoitoon. Tappamisen keuhkojen kasvainsolujen sisplatiini lisättiin hävitessä CLPTM1L annoksesta riippuvalla tavalla, jotka vaihtelevat 53% elinkelpoisuuden A549-soluja pelkällä vektorilla 12% elinkelpoisuuden solujen shCLPTM1L-3 (kuvio 2C). Samoin me aiheutti apoptoosia A549- solujen vakaa knockdovvn CLPTM1L käyttäen kiinilla topoisomeraasi I -estäjä A549-solut maljattiin yhtä paljon ja niistä määritettiin elinkelpoisuutta MTS-määritys 48 tunnin kuluttua hoidon camptothecin. Jälleen menetys CLPTM1L kautta shRNA Knockdown herkistyneet keuhko- kasvainsolujen annosriippuvainen apoptoottista tappamista tavalla yhdenmukainen taso CLPTM1L ilmentymisen (kuva S2), mikä osoittaa, että anti-apoptoottiset vaikutukset CLPTM1L ei ole yksinomaan sisplatiinia. Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin H838-soluissa, mikä osoittaa, lisääntynyt herkkyys kamptotekiini indusoi tappamisen yhteydessä knockdovvn CLPTM1L ilmentymisen (kuvio 2D). Yhdenmukaisesti näiden havaintojen, eksogeenisen yli-ilmentyminen CLPTM1L in H1299-soluissa, jotka on määritetty ilmaista suhteellisen alhainen endogeenisen CLPTM1L transkriptin verrattuna A549-solut microarray-analyysi (tietoja ei esitetty), johti lisääntymiseen solujen elinkelpoisuuden 27%: lla vektori yksin 36% kanssa CLPTM1L yli-ilmentyminen (p 0,04) käsittelyn jälkeen camptothecin suhteessa dimetyylisulfoksidin liuotinkontrolleista (kuvio 2E).

A) knockdovvn CLPTM1L ilmentymisen A549 kautta vakaa shRNA. Vahvistus Knockdown Western blot (upotus). B) knockdovvn CLPTM1L ilmentymisen H838-soluissa kautta vakaa shRNA. Vahvistus Knockdown Western blot (upotus). C) Suhteellinen solujen elävyys A549-solujen CLPTM1L Knockdown 48 tunnin kuluttua hoidon median tai sisplatiinia. D) Suhteellinen solujen elinkelpoisuus H838-solujen kanssa CLPTM1L Knockdown 48 tunnin kuluttua hoidon DMSO ajoneuvon tai 1 uM camptothecin. E) Suhteellinen solujen elinkelpoisuus H1299 solujen CLPTM1L yli-ilmentyminen 48 tunnin kuluttua hoidon DMSO ajoneuvon tai 10pM camptothecin. Virhepylväät edustavat yhtä keskihajonta keskiarvosta biologisten kolmena rinnakkaisena.

anneksiini V immunofluoresenssilla havaittiin virtaussytometrialla käytettiin markkerina varhaisen apoptoosin A549-soluja tai ilman CLPTM1L pudotus ja sisplatiinihoitoon. Havaitsimme annosriippuvaisen apoptoosin lisääntyminen menetys CLPTM1L (kuvio 3A). Kun taas vain 16% soluista pelkällä vektorilla oli apoptoottisia, kun 10 uM sisplatiinin hoidon 24 tunnin ajan, 76% solujen shCLPTM1L-3 olivat apoptoottisia. Kestävyys sisplatiinin aiheuttamaa apoptoosia havaittiin olevan verrannollinen määrään CLPTM1L transkriptin kerääntyminen näissä soluissa, jossa r

2 0,9808 (p = 2 x 10

-8) välillä prosenttia Knockdown ja prosenttiin apoptoottisia soluja ( Kuva S3A). Sisplatiini pitoisuudet alarajat herkkyys käytettiin sallimaan päätöslauselman herkkyyksiä myönnettyjen eri CLPTM1L knockdown. DNA: ta vaurioittavat aineet sisplatiini ja nitrosamiini-4- (metyyli-nitrosamino) -1- (3-pyridyyli) -1-butanonia (NNK) sekä aiheutti kertymistä DNA-juosteen katkoksia riippumatta CLPTM1L ilmentymisen havaitaan COMET menetelmällä (kuvio S4) . Näin ollen havaittu herkkyyden lisääntyminen tositivity sisplatiinin hävitessä CLPTM1L johtuu vaikutusta apoptoosin tai apoptoottisten signaloinnin pikemmin kuin vaikutus akuutin DNA-vaurioita. Herkkyys sisplatiinin indusoiman apoptoosin lisääntyi myös menetyksen CLPTM1L ilmentymisen shRNA on H838 kasvainsoluissa (kuvio 3B), mitataan kolorimetrisellä kaspaasi 3/7 aktiivisuuden määrityksessä. Jälleen vastustuskykyä sisplatiinin aiheuttamaa apoptoosia oli verrannollinen määrään CLPTM1L transkriptin kertymisen soluihin, jossa r

2 0,8847 (p = 1,3 x 10

-4) välillä prosenttia Knockdown ja suhteellinen kaspaasi 3: n aktiivisuuden (kuvio S3B). Ulkonäkö solujen viljelmässä on sopusoinnussa lisääntynyt herkkyys sisplatiinin indusoiman apoptoosin, kun menetys CLPTM1L (kuvio 3C).

A) anneksiini V: n sitoutumisen virtaussytometrialla A549-solujen CLPTM1L pudotus 48 tunnin kuluttua hoidon sisplatiinilla . B) Suhteellinen kaspaasi 3/7 aktiivisuutta H838 solujen CLPTM1L Knockdown 48 tunnin kuluttua hoidon sisplatiinilla. Virhepylväät edustavat yhtä keskihajonta keskiarvosta. ** – P 0,01 * – p 0,02 kaksisuuntaisella Studentin T-testi. C) micrographs A549-solujen CLPTM1L Knockdown 24 tunnin kuluttua hoidon 50pM sisplatiinin osoittaa lisääntynyt genotoksinen solukuolemaa hävitessä CLPTM1L.

asetukseen Bcl-x L Expression on Essential CLPTM1L Vaikutukset Apoptosis

tutkimiseksi mekanismi CLPTM1L suojaa apoptoosin, mittasimme proteiinin tasot apoptoottisten sääntelyviranomaisten käsittelemättömiä A549-soluja verrattuna sisplatiinia. Arviointiin vaatimuksen CLPTM1L varten apoptoosin säätelyyn, tehokkain knockdown konstruktien A549-soluja (SH2 ja SH3) arvioitiin. Hoito A549-solujen kanssa 20 uM sisplatiinin indusoiman kertymistä p53 ja pro-apoptoottisen p53 tavoite, Bax, ja vähentynyt kertyminen anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-2, mukainen DNA-vaurio indusoi luontaiset apoptoottisen reitin (kuvio 4A). Expression näistä apoptoottisten sääntelijöiden ei vaikuttanut knockdovvn CLPTM1L yksin. Kuitenkin, anti-apoptoottisen proteiinin Bcl-x L, kun taas ei vaikuta sisplatiinihoitoon A549-soluissa, oli vähentynyt, kun CLPTM1L tasot squelched mukaan shRNA ilmaisua. Knockdovvn CLPTM1L kanssa shRNAs vähensi Bcl-proteiinin tasot 81% ja 76% vuonna sisplatiinilla käsitellyissä soluissa (p 0,003, kahden otoksen Studentin T-testi) mitattuna kolme itsenäistä Länsi analyysejä (kuva 4B). Siksi pysyvästi ilmensivät eksogeenista Bcl-soluissa ja ilman knockdovvn CLPTM1L arvioida roolia Bcl-XL CLPTM1L suojaa apoptoosin. Re-Bcl-xL: n varmistettiin Western blot (kuvio 4C). Vaikka knockdovvn CLPTM1L nousi apoptoosin tyhjän vektorin transfektoiduissa soluissa 71%, ulkoiset Bcl-xL poisti CLPTM1L riippuvaista apoptoosia (kuvio 4D). Kestävyys genotoksisten stressin aiheuttaman apoptoosin tiiviisti vastasi Bcl-xL tasoja, ja Bcl-x L saattamisen kumosi kokonaan herkistymiseen genotoksisten stressiä apoptoosin CLPTM1L.

A) Western blot apoptoottisen sääntelyviranomaisten A549-solujen CLPTM1L knockdown jälkeen sisplatiinihoidolle osoittaa vähentynyt Bcl-ilmentymisen hävitessä CLPTM1L. Bcl-x L-blotteja kaksi erillistä edustavan klonaalisen populaatioissa A549-solujen CLPTM1L pudotus (# 1 ja # 2) on esitetty. B) Graafinen esitys Bcl-ilmentyminen solujen CLPTM1L Knockdown kolmesta eri klonaalinen populationsA549. Virhepylväät edustavat yhtä keskihajonta keskiarvosta. * – P 0,003 Studentin T-testi C) Western-blotit vahvistaa ulkosyntyisen Bcl-A549-solujen CLPTM1L knockdown. D) Suhteellinen elinkelpoisten solumäärää A549 solujen CLPTM1L Knockdown ja kohdunulkoinen Bcl-x L ilmaisun jälkeen hoidon sisplatiinilla osoittavat poistamista apoptoottisen vaikutuksen CLPTM1L menetyksen yhteydessä kohdunulkoinen Bcl-x ilmaisua.

Keskustelu

Survival solujen käynnissä DNA-vaurioita genomisista epävakautta tai genotoksinen stressi johtaa kertymiseen geneettisten vaurioiden luonteenomaiset ihmisen kasvaimista. Kumoaminen solusyklin Checkpoint ja apoptoottisten suojatoimia replikaation vaurioitunut DNA on tunnusmerkki syöpä. Tuloksena suojautumisen DNA aiheuttaman vaurion apoptoosia sisältää sekä alttius valitsematta somaattisen mutaation ja laski herkkyyttä sädehoitoa ja kemoterapiaa. Aiemmin viitattu tutkimus Zienolddinny et al. ehdottaa, että CLPTM1L polymorfismit voivat vaikuttaa DNA-vaurioiden kertyminen [4]. Perustuen havaintojemme on todennäköistä, että suojaa apoptoosin CLPTM1L edistää kertyminen DNA-vaurioita, en näin alttiutta kasvaimien syntyyn. Vaihtoehtoinen hypoteesi on, että CLPTM1L on rooli tunnustamista tai korjaus DNA-vaurioita, jotka vaikuttavat kertymistä tällaisen vahingon. Toinen on se, että CLPTM1L suoraan vaikuttaa määrä DNA-vaurion joka on aiheutunut genotoksisten aineiden. Tuloksemme (kuva S4) esittää, että CLPTM1L ilmaisu ei vaikuta suoraan akuutin DNA aiheutunut vahinko sisplatiini tai NNK. Lisäksi nykyinen tutkimus osoittaa, että CLPTM1L on apoptoottisen roolin alavirtaan DNA-vaurioita ja säätelyn kautta Bcl-ilme, joka on omiaan vaikuttamaan kertymistä DNA-vaurioita. Havainto ero kertyminen Bcl-x L, kun modulaatio CLPTM1L ilmaisun, sekä uudelleen käyttöön apoptoosin kestävä fenotyypin ekspression eksogeenisen Bcl-x L, antaa todisteita siitä, että CLPTM1L toimii ylävirtaan Bcl-xL: n resistenssin on genotoksinen stressi aiheuttamaa apoptoosia. In eksogeenisen Bcl-x L ekspressiokokeissa, näyttää siltä, ​​että vähemmän Bcl-x L on ilmaistu vektori, joka sisältää soluja kuin havaittiin aiemmissa kokeissa, vaikkakin vähentynyt kertyminen soluihin, joissa CLPTM1L pudotus näkyy edelleen. Samanaikaisesti apoptoottinen tappaminen on hieman vankempi vektori sisältävien solujen havaittiin aiemmissa kokeissa, mutta suuntaus lisääntynyt herkkyys hävitessä CLPTM1L ja Bcl-xL säilyy. Tärkeintä, tämä tutkimus osoittaa, että anti-apoptoottisen funktion CLPTM1L ei ole rajattu sisplatiinin herkkyys, mutta on yleinen esto mitokondrioiden reitin apoptoosin.

yhteinen yliekspressio CLPTM1L kasvainten tukee käsitettä onkogeenisessä tai kasvain edistämällä roolia CLPTM1L keuhkojen syövissä. Proteiinin ilmentyminen tutkimuksia ja selityksin Human Protein Atlas hanke [24] vahvistavat havaintomme. Immunohistokemia ihmisen normaalia keuhkorakkuloiden solut ja keuhkokasvaimia osoitetut kielteiset ilmentymistä CLPTM1L normaaleissa kudoksissa, kun taas ilmentyminen 12 keuhkokasvaimia keskimäärin pistemäärä 1,91 asteikolla 0-3 (kuva S5). Pistemäärä 0 on negatiivinen, 1 on ”heikko”, 2 on ”kohtalainen” ja 3 on ”vahva”. Kuusi näistä potilaista oli diagnosoitu levyepiteelisyöpä ja kuusi oli diagnosoitu adenokarsinooma. Ei merkittävää eroa ilmaisun välillä patologioita havaittiin. Kaikkiaan 66 normaaleissa kudoksissa eri elimistä sai keskimäärin 0,98 (heikko). Mikään keuhkotuumoreiden testattu olivat negatiivisia. Keuhkosyövän solulinjat A549 (NSCLC) ja SCLC-21H (pienisoluinen) osoittivat vahvaa värjäytymistä ja kohtalainen värjäytyminen, vastaavasti.

Microarray tietoja kasvain ja kuolemattomia solulinjoja osoittaa, että muita menetelmiä kuin kopiomäärä voitto tulos kasvoi ilmentymisen osajoukko kasvaimia. Vuonna genomin leveä yhdistysten 5 p15.33 lokus tilit suurin panos keuhkosyövän riskiä kolme tunnettua loci ihmisellä [6]. 5 p lokus myös osallisena ihon okasolusyöpä ja melanooma [25], munasarjasyöpä [26], kivesten sukusolujen syöpä [27] ja kohdunkaulan syövän kopiomäärä voitto [8]. Kohdunkaulan syövän tutkimuksessa, CLPTM1L ilmi 5 p lokuksessa olevan ilmaisun malleja, jotka korreloivat kopiomäärä voitto. Toinen tuore tutkimus kopioluvun ja ilmaisun muutoksia kohdunkaulan syövän solulinjoissa ilmeni, että kopio vahvistuksenkertojan yli 5 p, CLPTM1L ekspressio lisääntyi noin 5-kertaisesti yli normaalin kohdunkaulan epiteelisolujen, kun taas ilmaus muiden geenien 5 p15.33 ollut muuttuneen [9]. Tert-geeni on myös tällä geneettisiä alueella. Analysoimiseksi SNP 5 p alueella, olemme havainneet, että keuhkosyöpä liittyvät SNP: t eivät liity telomeeripituuden (tietoja ei ole esitetty), kanssa kaksi muista tutkimuksista [28], [29]. Sitä vastoin tutkimuksessa Rafnar et al. osoittivat yhdistyksen (

p

= 0,017 ja 0,027, vastaavasti) välillä 5 p variantteja (rs401681 ja rs2736098) ja telomeeripituuden, vaikka tämä vaikutus havaittiin ainoastaan ​​kun naiset yli 75-vuotiailla homotsygoottista genotyypit olivat mukana [30 ]. Tietääksemme mitään yhteistä koodaus mutaatioita joko CLPTM1L tai TERT on tunnistettu. On todennäköistä, että molemmat TERT- ja CLPTM1L edistää alttiuteen tässä lokuksessa, jonka toinen perustaja vaikutus. Tuoreessa tutkimuksessa [5] säädetään monirivisille näyttöä siitä, että keuhkosyövän yhdistys rs31489 että CLPTM1L geeni on riippumaton havainto assosioiduttua rs2376100 että TERT geenissä. Tuorein tiheä genotyypitys tutkimuksessa 5 p15.33 löytyi useita yhdistykset 5p15.33, jossa alue yhdistyksen ollessa keskitettynä CLPTM1L [7]. Aikaisemmat analyysi osoittaa, että rs31489 on variantti voimakkaimmin liittyy familiaalinen keuhkosyöpään tässä lokuksessa. Nykyinen tutkimus osoittaa, että CLPTM1L myös tärkeä toiminnallinen rooli suhteessa syöpään, ja että tämä geeni voi olla ainakin osittain vastuussa yhdistyksen variantit 5p15.33 alueella keuhkosyöpään. Jatkuva pyrkimys määritellä tarkemmin geneettistä vaihtelua ajo keuhkosyöpää alttius tällä geneettinen alueella ovat tärkeä seuraava askel arvioitaessa suhdetta CLPTM1L ja muiden geenien alueella keuhkojen kasvain alttius.

Yhteinen yliekspressio CLPTM1L keuhkoissa kasvaimia ja toiminnallinen rooli genotoksisia stressin aiheuttaman apoptoosin tunnistaa CLPTM1L tärkeä tekijä, joka vaikuttaa selviytymisen DNA vaurioitunut kasvainsolujen ja mahdollisesti keuhkosyöpä alttius. Kohdistaminen CLPTM1L sekä Bcl-x L voi olla hyötyä lähestymistapoja kemopreventiossa ja keuhkosyövän hoitoon. Targeting nämä anti-apoptoottiset proteiinit voivat myös olla herkistymismahdollisuutta kasvainten perinteisiin kemoterapian ja sädehoidot.

Materiaalit ja menetelmät

RT-Quantitative Real-Time PCR

Patient Hyväksytty kasvain ja kasvaimeen vieressä normaalin RNA-näytteet saatiin kudoksen Core Washington Universityssä St. Louisissa alle protokolla hyväksymien Institutional Review Board at Washington University in St. Louis School of Medicine, Human Research suojelutoimisto. Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta osallistua tähän kudospankissa. RNA eristettiin solulinjoista käyttämällä Tri-zol-reagenssia ja protokollat ​​(Invitrogen, Carlsbad, CA). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qPCR) suoritettiin käyttäen menetelmää, kuten aikaisemmin on kuvattu (Chaparro, Wen et al. 2005). Lyhyesti, yksi mikrogramma kokonais- RNA: ta per näyte muutettiin cDNA: ksi käyttäen SuperScript Ensimmäisen Strand Synthesis järjestelmä RT-PCR: llä (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kvantitatiivinen RT-PCR-määritys tehtiin käyttäen SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA). Yksi mikrolitra cDNA: ta lisättiin 25 ul: n kokonaistilavuudessa reaktioseosta, joka sisältää vettä, SYBR Green PCR Master Mix, ja alukkeita. Kukin reaaliaikainen määritys tehtiin kahtena BioRad MyIQ kone. Tiedot kerättiin ja analysoitiin Stratagene Mx3000 ohjelmisto.

β-aktiini

geenin (Actb) käytettiin sisäisenä kontrollina laskea suhteellinen ilmentymistaso (ACk

T) kullekin näytteelle. Primer asettaa tehokkuus ja lineaarisuus laskettiin, ja normalisointi suoritettiin mukaisesti MIQE ohjeita. Taitteen muutos geenien ilmentyminen kasvainkudoksessa kudoksissa verrattuna pariksi normaaleissa kudoksissa laskettiin 2

d, missä d = ACk

T

normaali – ACk

T kasvain.

Microarray Analysis

Expression mikrosiruja suoritettiin käyttäen Illumina HumanWG-6 V3-alustaa, joka sisältää 48800-koettimien vastaa 20700 ainutlaatuisia geenejä. RNA: t (500 ng) leimattiin ja hybridisoitiin BeadChip joukoissa, kuten valmistajan ilmoitus (www.illumina.com). Array tietoja esikäsitellyt kanssa MBCB algoritmin (Ding, LH et ai, Nucl. Acids Research, 2008, 36: E58) ja differentiaalikaavojen määritettiin laskemalla kertaluokkamuutos ja T testi.

Cell Culture, pudotus ja yli-ilmentyminen

A549-soluja (ATCC, Manassas, VA), äskettäin todistaa oikeaksi Genetica Laboratories, Inc. (Cinncinati, OH), viljeltiin RPMI-1640 + 10% FBS: ää (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Solut transdusoitiin lentiviruksen lyhyen hiusneula-RNA (shRNA) perustuvia vektoreita on pLKO.1 vektori ja joka on suunniteltu nimenomaan kohdistaa ihmisen CLPTM1L transkripti (Sigma, St. Louis). Tyhjä vektori tai vektori kaatamalla CLPTM1L transkriptio oli ensimmäinen pakattu 293T-soluissa (Orbigen, San Diego, CA), jossa auttaja plasmidit ja transdusoida sitten A549-soluja 8 ug /ml Polybrene (Sigma, St. Louis, MO). Media korvattiin 24 tuntia transduktion jälkeen, ja solut jaettiin 1:04 48 tuntia transduktion jälkeen. 72 tuntia transduktion jälkeen solut kätkeminen lentivirus- konstruktiot valitun 1 ug /ml puromysiiniä 2-4 päivää, kunnes mock infektoituneita soluja olivat kuolleet. Elossa solut yhdistettiin.

pBABEpuro ekspressiovektorin tai pBABEpuro: CLPTM1L, kloonattiin PCR: llä pOTB7-CLPTM1L, (Thermo Scientific), EcoRLIIa /Sali of pBabe-puro, transfektoitiin H1299 soluihin. Transfektoidut solut valittiin puromysiinin kunnes valetransfektoidut solut olivat kuolleet.

pSSFV Bcl-xL: n ekspressiovektorin (Addgene plasmidi 8749) tai tyhjä vektori transfektoitiin soluihin ja ilman knockdovvn CLPTM1L kuten edellä on kuvattu. Transfektoidut solut valittiin genetisiinillä (Invitrogen, Carlsbad, CA).

elinkyvyn

Solut, jotka ekspressoivat stabiilisti shRNA vektorit kuten edellä on kuvattu ympättiin 12-kuoppaisille kudosviljelymaljoille yhtä suuri tiheys noin 50% kolmena kappaleena. Sen jälkeen kun kiinnitys yön yli, minkä jälkeen 48 tunnin hoidon kanssa osoitti sisplatiinin (Sigma, St. Louis, MO) liuotettiin media, kamptotesiini (Sigma, St. Louis. MO), liuotettuna DMSO: hon (Sigma, St. Louis, MO) tai DMSO pelkkää liuotinta. DMSO pitoisuudet elatusaineissa pidettiin johdonmukaisesti ja olivat tai alle 0,08%. Solut analysoitiin elinkykyisten solujen lukumäärät trypaanisininen värjäys ja laskettiin Countess automatisoitu solu-laskuri (Invitrogen, Carlsbad, CA). Kampotekiiniosan määrityksiä, solujen elinkelpoisuus mitattiin Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (MTS) 24 kuoppaisille kudosviljelylevyille kolmena kappaleena. P-arvot määritettiin yksisuuntaista Studentin t-testi.

virtaussytometria

Määritettyjä solulinjoja käsiteltiin 24 tuntia osoitetuilla sisplatiinin 10 cm kudosviljelymaljoihin. 10

6 solut pestiin ja suspendoitiin PBS: ään ja värjättiin anneksiini V-FITC. Solut Värjäysliuos laimennettiin 500 ui PBS: ää ja analysoitiin Coulter virtaussytometria.

kaspaasi 3/7 Pitoisuus

Määritettyjä solulinjat maljattiin tiheydet 5 x 10

4 solua kuoppaa kohti 12-kuoppaiselle kudosviljelylevylle ja käsitellään kuten on osoitettu genotoksisia aineita kiinnityksen jälkeen yön yli. Kaspaasi 3 ja 7 aktiivisuus mitattiin käyttämällä SensoLyte® homogeeninen Rh110 caspase – 3/7 Assay Kit (AnaSpec, Fremont, CA).

Western-blottaus

Määritettyjä solulinjoja käsiteltiin sisplatiinin ilmoitettuina pitoisuuksina 6-kuoppalevyillä 72 tuntia. Solut hajotettiin 100 ul: lla 1 x NP40 hajotuspuskuria, joka sisälsi proteinaasi-inhibiittoreita, leikattiin 10 kertaa 28 gaugen neulalla, sentrifugoitiin 16000 x g 30 minuuttia, normalisoidaan proteiinin konsentraation määritettiin Bradfordin menetelmällä, ja supernatantti keitettiin 10 min. 20 ui normalisoitua lysaattia SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus-analysoidaan mainituilla vasta-aineilla. Seuraavia vasta-aineita käytettiin: kanin anti-CLPTM1L (Sigma, St. Louis, MO), kanin anti-beeta-tubuliini (Sigma, St. Louis, MO), hiiren anti-Bcl2 klooni 124 (Dako, Carpinteria, CA), kanin anti-Bax # 2774 (Cell Signaling, Boston, MA), hiiren anti-p53 (Ab-1) (Oncogene, San Diego, CA), Bcl-x – kani Bcl2L1 (Abcam, Cambridge, MA). Kvantitointi Länsi analyysien kolmesta riippumattomasta viljelmistä tehtiin käyttäen Image J ohjelmisto saatavilla verkossa NIH osoitteessa https://rsbweb.nih.gov. P-arvot määritetään yksisuuntaista Studentin t-testi.

COMET Pitoisuus

geelielektroforeesilla perustuva menetelmä havaitsemiseen DNA-vaurioita tehtiin muokattiin Olive, et al.

Nature pöytäkirjat

1, 23-29 (2006). -Soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuudet NNK, sisplatiinin tai DMSO liuottimena 0,1%: ssa 24 tuntia. Mikroskoopin oli esipäällystetty matalan sulamispisteen agaroosia (Sigma, St. Louis, MO), 1% dH2O ja kuivattiin. Yksi ml matalan sulamispisteen agaroosia 1% dH2O pidettiin 40 ° C: ssa, lisättiin 0,4 ml suspensiota, 2 x 10

4 solua /ml kylmään media. Agaroosi /solujen sekoitus (1 ml /dia) levitettiin esipäällystettyyn dioja.