Krooninen sairaus

tiivistelmä

Estrogeeni ja tamoksifeenin (an antiestrogeeni) saavat aikaan toimia aktivoimalla estrogeenireseptorin (ER) kautta, genomista ja ei-genomisia mekanismeja ja ovat osallisina kehittämisessä kohdun limakalvon syöpä. Aiemmat raportit ovat osoittaneet, että estradioli ja tamoksifeeni aiheuttaa leviämisen ihmisen kohdun limakalvon syövän soluihin GPR30 (ei-genomiset ER) signalointireitin. Tässä osoitamme, että fosforylaatio polttoväli adheesiokinaasi (FAK) on mukana solujen vaeltamiseen aiheuttama estradioli, tamoksifeeni ja G1 (a GPR30 agonisti) kautta transmembraanisen ER (GPR30) endometriumin syövän solulinjoissa tai ilman ERa (Ishikawa ja RL95 -2). Lisäksi GPR30 välittämiä solun muuttoliike edelleen lakkautettiin antamalla joko RNA interferenssin kohdistamista GPR30 tai FAK-estäjä. Lisäksi olemme vahvistettu, että signaloinnin GPR30 ja fosforyloitu FAK on todellakin välittyy EGFR /PI3K /ERK-reitin. Kliinisesti merkittävä korrelaatio tasojen GPR30 ja phophorylated FAK (pFAK) havaittiin ihmisen kohdun limakalvon syövän kudoksissa matalalla tai ilman ERa Lisäksi ehdotetaan, että estrogeenin aiheuttama fosforylaatiota FAK ja solumigraation Todennäköisimmin laukaisi GPR30 aktivointia. Nämä tulokset tarjotaan uusia näkemyksiä ymmärtämiseksi patofysiologisia toimintoja GPR30 ihmisen kohdun limakalvon syöpää.

Citation: Tsai C-L, Wu H-M, Lin C-Y, Lin Y-J, Chao A, Wang T-H, et al. (2013) Estradioli ja tamoksifeenin aiheuttamaan soluissa Migration kautta GPR30 ja aktivointi Focal Adhesion Kinase (FAK) endometriumin Syövät Low tai ilman Nuclear estrogeenireseptorien α (ERa). PLoS ONE 8 (9): e72999. doi: 10,1371 /journal.pone.0072999

Editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Italia

vastaanotettu: 22 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 16 heinäkuu 2013; Julkaistu: 09 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 Tsai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Grants NSC-96-2314-B-182-016 ja NSC-97-2314-B-182-014-MY3 (jotta HSW) ja NSC-99-2321-B-182A-003-MY3 (CLT ) National Science Council, Taiwan; ja CMRPG381671 (ja HMW) Chang Gung Memorial Hospital. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Estrogeenit sitoutuvat ja aktivoivat estrogeenireseptorin (ER) säätelemään kohdegeenien transkriptiota [1] kautta genomista ja ei-genomisia mekanismeja. Genominen (tai klassinen) estrogeeni-herättänyt vastaukset ovat kautta tumareseptoreja ERa ja ER [2]. ERa on reseptori vastaa 17β-estradioli (E2) aiheuttaman signaloinnin, kun taas toiminta ER vastustaa kuin ERa [3]. Genominen ER signalointi toimii ligandi-riippuvaisen transkription tekijöitä, jotka sitoutuvat suoraan estrogeenin vaste-elementit (eres) promoottorialueella kohdegeenien ja kestää yleensä tuntien tai päivien tuottaa fysiologiset vaikutukset soluissa [4]. Sitä vastoin ei-genomiset ER-signalointi tapahtuu solukalvon läpäisevä reseptori estrogeeni [2], [5].

G-proteiiniin kytketty reseptori 30 (GPR30) on toiminnallinen kalvo reseptori osallistuu ei-genomista estrogeenin signalointi [6] – [8]. GPR30-välitteisen estrogeeni signalointi stimuloi cAMP-tuotantoa ja solunsisäisen Ca

2+ mobilisointi, ja myöhemmin aktivoi eri kinaasien, joka edistää solujen kasvua ja muuttoliike [2], [9], [10]. Rintasyöpäsoluissa puuttuu keskeiset vaatimukset, GPR30 välittää säätely ylöspäin c-fos-proteiinin läsnä ollessa estrogeenien, mikä johtaa solun proliferaation edistäminen [11]. Lisäksi, sekä estradiolin ja tamoksifeeni indusoida

c-fos

ja solujen lisääntymisen kautta GPR30 (ei-genomiset ER) signalointireitin erilaisissa syövissä [12], [13]. Lisäksi on myös ilmeistä, että yli-ilmentyminen GPR30 osoittaa huonon ennusteen kohdun limakalvon, munasarjojen ja rintasyöpiä [14] – [16].

Cell siirtymä tarvitaan hyökkäystä kasvaimia. Focal tarttuvuus kinaasi (FAK), ei-reseptori tyrosiinikinaasin ohjaamalla solujen signalointireiteissä solumigraation [17], on mukana muodostumista ja liikevaihdon fokaalisen adheesion sivustoja [18], [19]. Lisäksi, yliekspressio FAK on osoitettu osoittamaan invasiivisia mahdollisia ja huonon ennusteen eri ihmisen syövissä, [20].

Pitkäaikainen endogeeninen tai eksogeeninen estrogeenien ja tamoksifeeni (estrogeenin antagonisti) on yksi riskitekijöistä solujen lisääntymistä ja muuttoliike kohdun limakalvon syöpä [21] – [23]. Kuitenkin vaikutukset estrogeenin solujen migraatio kohdun limakalvon syöpiä, joilla on alhainen tai ilman ERa joita ei aiemmin tutkittu, vaikka aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että estrogeeni indusoi nopean fosforylaation FAK endometriumin strooman ja syöpäsolujen [23]. Noteworthily, se on vielä epäselvää, estrogeenit ja tamoksifeeni yksinkertaisesti stimuloida kohdun limakalvon soluista

in situ

tai jos ne myös tekevät nämä solut hyökätä paikallisessa sivustolla.

Tässä tutkimuksessa, osoitimme, että hoito estradioli (E2), G1 (a GPR30 agonisti) ja tamoksifeeni (4-hydroksitamoksi-, OHT) aiheuttama fosforylaation FAK at Y397 ja soluvaelluksen endometriumsyöpään solulinjoissa. Mekanistinen yhteys ja kliinistä merkitystä välillä GPR30 ja FAK signalointi osoitettiin myös.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille ja kudosnäytteiden

Neljäkymmentäyhdeksän potilailla, joille tehtiin leikkaus Chang Gung Memorial Hospital (CGMH) ja oli patologinen vahvistus kohdun limakalvon syöpä oli mukana. Kirjallinen suostumukset saatiin kaikille osallistujille. Tutkimuksen hyväksyi Institutional Review Board of Chang Gung Memorial Hospital (CGMH-IRB # 98-2576B).

Soluviljely ja reagenssit

RL95-2 solulinja, joka on johdettu hyvin erilaistunut adenokarsinooma kohdun limakalvon [24], saatiin American Type Culture Collection. Ishikawa solulinja, joka on hyvin erilaistunut kohdun limakalvon adenokarsinooma, on lahjoitus tri Nishida (Kasumigaura National Hospital, Japani) [25]. Ishikawa-soluja pidettiin vähintään essential medium (α-MEM), joka sisälsi 15% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS) sekä 100 U /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä. RL95-2-soluja viljeltiin Dulbeccon minimum essential (DMEM /F12), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Biological teollisuuden, Israel), 100 U /ml penisilliiniä ja 100 mg /ml streptomysiiniä. Molemmat soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO 2. Soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin ja siirretään seerumia 24 tuntia ennen käsittelyä 17β-estradioli (E2), G1 ja 4-hydroksitamoksifeeni (OHT: ta) ja medroksiprogesteroniasetaatin (MPA). E2, OHT, G1, MPA (Sigma), lapatinib (EGFR estäjä, GlaxoSmithKline plc, Lontoo, Iso-Britannia), FAK-estäjä 14 (Tocris Bioscience, UK) ja SRC estäjä 1 (sigma) liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO).

fosforylaatio-Kinase array

fosforylaatiota-kinaasin array (Proteome Profiler ™ array kit, R 0,0001) (taulukko 1). Kliinisesti tapauksissa heikkoa ilmentymistä ydin- ERa tutkittu paljastaa näyttöä lisääntyneestä taipumusta invaasio (lavastus välillä IB IVA). Lisäksi taso fosforyloidun FAK korreloi merkitsevästi ilmaus GPR30 ihmisen kohdun limakalvon syöpiä alhainen ERa (p 0,05) (kuvio. 5C), mutta ei tällaista korrelaatiota ei havaittu välillä ERa ja pFAK (Fig. 5D).

(A) kliinisissä näytteissä ihmisen kohdun limakalvon syöpien, joilla on alhainen ilmentyminen ERa (histoscore = 10), suhteellisen korkea ilmentyminen GPR30 (histoscore = 270) ja pFAK (histoscore = 225) havaittiin (40-kertainen suurennus esineen linssi). (B) toinen histoscores Sekä GPR30 ja pFAK olivat matalammat ihmisen kohdun limakalvon syöpiä korkea ER (histoscore 45, vasen paneeli) verrattuna niihin, joilla on alhainen ER (histoscore ≤45, oikea paneeli). (C) oli positiivinen korrelaatio histoscores välillä pFAK ja GPR30 ihmisen kohdun limakalvon syöpiä alhainen ERa. (D) ei havaittu yhteyttä vuonna histoscores välillä pFAK ja ERa ihmisen kohdun limakalvon syöpää. NS: ei ole merkittävä.

Keskustelu

GPR30 on ehdotettu toimia steroidireseptoriperheen lokalisoitu joko solukalvoon tai solulimakalvostoon ja välittävät nopeaa toimintaa estrogeenin [21], [22]. On myös ilmeistä, että GPR30 laukaisee solujen lisääntymisen aktivaation kautta phosphokinases, esim. phosphatidyinositol 3-kinaasi (PI3K) ja mitogeeni-aktivoitu proteiinikinaasi (MAPK), vastauksena estrogeenin ja tamoksifeeni [7], [8], [11]. On kuitenkin olemassa joitakin raportteja, jotka osoittavat, että estrogeeni toimii itsenäisesti GPR30 tietyissä solutyypeissä [39] – [42]. Erityisesti tutkimus on osoittanut, että GPR30 on kyvyttömiä välittämään estrogeenin toimintaa, kuten epäonnistuminen aktivoimalla cAMP, ERK tai PI3K seuraavat estrogeenihoito, endoteelisolujen ilman ERa ja ER [41]. Esillä olevassa tutkimuksessa, knockdovvn GPR30 vuonna RL95-2 ja Ishikawa kohdun limakalvon syövän solut kumotaan E2 ja tamoksifeenin aiheuttama fosforylaatiota FAK ja poisti myöhemmin solujen vaeltamiseen (kuviot. 2E, 2F, 3E ja 3F), mikä osoittaa, että GPR30 pystyy välittämään estrogeenin toimintaa endometriumsyöpään soluissa tai ilman ydin- ERa.

Tamoksifeeni on selektiivinen estrogeenireseptorin modulaattori (SERM), joka toimii ERa antagonistina rinta mutta heikko estrogeenin kohdun limakalvoa. Anti-syövän hoitoon tamoksifeenia rintasyövän liittyy lisääntynyt kohdun limakalvon syövän [43] – [46]. Mekanistisesti tamoksifeenin aktivoi MAPK-reitin kautta GPR30 edistää lisääntymistä kohdun limakalvon syövän solujen [47]. Kuten solun proliferaation edistäminen, tamoksifeenin aktivoitu FAK väylän sekä RL95-2 ja Ishikawa kohdun limakalvon syöpä solujen (kuviot. 3A, 3B, 3C ja 3D). Lisäksi tulokset liittyy GPR30 ehtyminen osoitti, että GPR30 oli olennaista edistää tamoksifeenia aiheuttaman soluvaelluksen kohdun limakalvon syöpiä (kuviot. 3E ja 3F). Yhdessä tamoksifeenin kykenee herättävä solumigraatiota kautta GPR30 endometriumin syöpäsolujen kanssa tai ilman ydin- ERa.

On näyttöä siitä, että estrogeeni laukaisee kasvutekijän reseptorin (EGFR) reitin kautta GPR30 rintasyöpäsoluissa [36 ]. Lapatinib on tyrosiini kinaasin estäjä EGFR ja estää EGFR alavirran signalointia syöpäsolun [48]. Tässä tutkimuksessa, lapatinibi tukahdutettu fosforylaatiota FAK indusoiman sekä E2: n ja tamoksifeenin endometriumin syövän soluissa (kuvio. 4E). Lisäksi knockdovvn EGFR siRNA esti myös E2- ja tamoksifeenin aiheuttama fosforylaatiota FAK endometriumin syöpäsoluissa (Fig. 4D). Nämä havainnot osoittivat, että EGFR on olennaista GPR30-välitteisen reitin ja edelleen tukevat käsitystä, että lapatinibi yhdessä tamoksifeenin voidaan käyttää potilailla, joilla rintasyöpiä kehittymisen ehkäisyyn endometriumsyövän [49].

Solun muuttoliike on tärkeä ominaisuus syöpäsoluja, joka vaikuttaa kasvaimen invasiivisia mahdollisten viereisiin kudoksiin. Parempi ymmärtäminen mekanismin solumigraation aiheuttama estrogeenit on välttämätöntä kehittää tehokkaita hoitomuotoja kohdun limakalvon syöpä. Tässä suhteessa, FAK on tunnustettu paikallistaa solukalvoon paikoissa fokaalisen adheesion kompleksien muodostumista ja toimii keskeisenä säädin solujen kulkeutumista ja solujen invaasiota, johon proteolyyttisen hajoamisen soluväliaineen [47]. Tulokset Tässä tutkimuksessa osoitti myös, että FAK polku oli tärkeä rooli välittämisessä migraatiota aiheuttama E2 ja tamoksifeeni vuonna RL95-2 ja Ishikawa kohdun limakalvon syöpä solujen (kuviot. 3A, 3B, 3C ja 3D). Lisäksi tutkimukset käyttäen inhibiittorit ja siRNA osoitti myös, että FAK riippuva solumigraatio välittyy EGFR, PI3K ja ERK (kuviot. 4A, 4B, 4C, 4D ja 4E). Yhdessä meidän tiedot osoittivat, että estrogeenin aiheuttama solumigraation välittyy aktivointi PI3K /ERK /FAK-väylän kohdun limakalvon syövän soluissa, joilla on alhainen tai ilman ydin- ERa: n.

Noteworthily, on myös mahdollista, että estrogeenin aiheuttama solumigraation välittyy sidekudoksen kasvutekijä (CTGF). Aikaisempi raportti on osoittanut, että CTGF on GPR30 kohdegeenin ja GPR30 signalointi edistää solujen maahanmuuton CTGF induktion in ER-negatiivinen ihmisen rintasyövän solujen [37]. Tämä polku on arvioitava edelleen selvittämiseksi mekanismi estrogeenista johtuvaa soluvaelluksen endometriumin syöpäsoluja.

Pathologically, tyypin 1 ihmisen kohdun limakalvon syövän estrogeeniherkkä ja on hyvä ennuste, kun taas tyypin 2 ihmisen kohdun limakalvon syöpiä eivät liity suurentunutta estrogeenin ja kuljettaa huonompi ennuste [50]. Esillä olevassa tutkimuksessa ihmisen kohdun limakalvon syöpä (n = 24), joilla on alhainen ERa havaittiin ilmentävän korkeampi GPR30 ja pFAK verrattuna niihin (n = 25), joilla on korkea ERa (Fig. 5B ja taulukko 1). Lisäksi GPR30 ja pFAK korreloivat positiivisesti ihmisen kohdun limakalvon syöpiä alhainen ERa, mutta mitään tällaista korrelaatio löytyi ERa ja pFAK (kuviot. 5C ja 5D). Nämä tulokset

in vivo

tutkimukset osoittivat, että kohdun limakalvon syövät alhainen ERa saattavat olla erittäin herkkiä estrogeenia. Näin ollen nämä kohdun limakalvon syöpiä, joilla on alhainen ERa voisi ilmaista korkeampi GPR30 ja pFAK jopa alhainen verenkierrossa seerumin estrogeenin ja lisäämättä eksogeenisten estrogeenia, mikä tarkoittaa, että niillä on potentiaalia hyökätä viereisiin kudoksiin.