Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

TMEFF2 on proteiini, joka sisältää yhden EGF-kaltaisen domeenin ja kaksi follistatin-, kuten moduulit. Biologinen toiminta TMEFF2 edelleen epäselvä ristiriitaisten raporttien mukaan sekä positiivinen ja negatiivinen yhdistyksen välillä TMEFF2 ilmaisun ja ihmisen syöpien.

Menetelmät /Principal Havainnot

Kirjoittajat raportoivat, että solunulkoinen domeeni TMEFF2 vuorovaikutuksessa PDGF-AA. Tämä vuorovaikutus edellyttää aminopään alueella solunulkoisen domeenin, joka sisältää follistatin moduulit ja voi välittää EGF-kaltaisen domeenin yksin. Lisäksi solunulkoinen domeeni TMEFF2 häiritsee PDGF-AA-stimuloitu fibroblastien proliferaatiota annoksesta riippuvaisella tavalla. TMEFF2 ilmentyminen säädeltiin vähentävästi ihmisen aivoissa syöpien ja korreloi negatiivisesti PDGF-AA ilme. Tukahdutti ilmentymistä TMEFF2 liittyy sen hypermetylaation useissa ihmisen kasvain tyypit, mukaan lukien glioblastooma ja syöpien munasarjojen, peräsuolen, paksusuolen ja keuhkojen alkuperää. Analyysi gliooma alatyyppejä osoittaa, että TMEFF2 hypermetylaation ja vähentynyttä ilmentymistä liittyy osajoukon ei-Proneuraaliset gliooma, jotka eivät näy CpG-saarekkeen methylator phentoype.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä tiedot ovat ensimmäisiä näyttöä siitä, että TMEFF2 voi toimia säätelemään PDGF signalointi ja että se on hypermetyloitunut ja vaimentua vuonna gliooman ja useita muita syöpiä, mikä viittaa siihen, merkittävä rooli tämän proteiinin etiologiassa ihmisen syövistä.

Citation: Lin K, Taylor JR Jr, Wu TD, Gutierrez J, Elliott JM, Vernes JM, et al. (2011) TMEFF2 Onko PDGF-AA sitovan proteiinin kanssa Metylaatiospesifinen Associated geenien in Multiple Cancer Tyypit Sisältää Gliooma. PLoS ONE 6 (4): e18608. doi: 10,1371 /journal.pone.0018608

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 01 joulukuu 2010; Hyväksytty: 07 maaliskuu 2011; Julkaistu: 29 huhtikuu 2011

Copyright: © 2011 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat Genentech. Rahoittaja oli rooli tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista, ja valmistelu käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kaikki kirjoittajat olivat työntekijöitä Genentech, kun tämä työ on suoritettu. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

TMEFF2, joka tunnetaan myös tomoregulin [1], TPEF [2], HPP1 [ ,,,0],3] ja TENB2 [4], koodaa transmembraanisen proteiinin, joka sisältää yhden epidermaalisen kasvutekijän (EGF) kaltainen domeeni ja kaksi follistatin kaltainen moduulit [1], [4] – [6]. Biologinen toiminta TMEFF2 edelleen heikko ristiriitaisia ​​raportteja eri ryhmiin. Liukoiset muodot TMEFF2 solunulkoisen domeenin on raportoitu heikosti edistää erbB-4 /HER4 tyrosiinifosforylaation MKN 28 mahasyövän soluihin [1], ja edistää selviytymistä keskiaivojen dopaminergisten neuronien primääriviljelmässä [6]. Todisteeksi sen myönteinen rooli solujen lisääntymisen, kohonnut TMEFF2 ilme on liittynyt suurempi eturauhassyövän laatu ja hormoni riippumattomuutta useat ryhmät [4], [7], [8]. Sen sijaan muut ovat raportoineet down-regulation of TMEFF2 androgeeni-riippumaton eturauhassyöpävieraslajisiirteissä, sekä kasvun esto indusoi ektooppinen ilmentyminen TMEFF2 androgeeni-riippumaton eturauhassyöpäsolulinjoissa [5]. Lisäksi, 5′-alueen TMEFF2 geenin usein hypermetyloitunut joidenkin syöpien [2], [3], [9] – [16], mikä viittaa mahdolliseen tuumorisuppressori rooli TMEFF2 näissä syövissä.

verihiutaleiden kasvutekijät (PDGF) ei ainoastaan ​​tärkeitä rooleja kehitys- ja fysiologisia prosesseja, mutta myös suoraan liitetty ihmisen syöpään ja muut proliferatiiviset häiriöt (tarkistetaan [17] ja [18]). Ihmisen genomi sisältää neljä PDGF ligandeja, PDGF-A, B, C ja D, ja kahden reseptorin, PDGFRα ja PDGFRβ Kaikki PDGF voivat muodostaa toiminnallisen disulfidilinkattua homodimeerejä, kun taas vain PDGF-A ja B on osoitettu muodostavan funktionaalisen heterodimeerejä. PDGFRs toimivat myös homo- ja hetero-dimeerit, jotka eroavat niiden affiniteetit eri PDGF dimeerejä (tarkistetaan [17] ja [18]). Α-alayksikköä PDGFR on osoitettu sitoutuvan PDGF-A, B ja C ketjut, kun taas β-alayksikön uskotaan sitoutuvan ainoastaan ​​B ja D ketjuja. Biologinen indusoimat vasteet eri PDGF ligandien riippuu suhteellisesta numerot reseptorialayksikköön tietyssä solutyypissä ja erityiset PDGF-dimeerien läsnä.

Follistatin moduuli sisältävät proteiinit on aiemmin osoitettu kykenevän sitomaan ja moduloivat erilaisia ​​kasvutekijöitä, mukaan lukien jäsenten transformoivan kasvutekijä beeta (TGF-β perheen, PDGF, ja verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) [19] – [24]. Tähän mennessä, kuitenkaan, ei sitoutumiskumppani on raportoitu TMEFF2. tässä raportissa olemme tunnistaneet PDGF-AA kasvutekijä, joka on vuorovaikutuksessa TMEFF2. Lisäksi osoitamme, että solunulkoisen domeenin TMEFF2 häiritsee PDGF-AA-stimuloi fibroblastien proliferaatiota annoksesta riippuvalla tavalla . Tuloksemme ovat ensimmäisiä todisteita siitä, että TMEFF2 voi toimia säätelemään PDGF signalointi, ja antaa uudet mekanistinen oivalluksia näennäisesti ristiriitaiset roolit TMEFF2 ihmisen syövissä. Lisäksi osoitamme ensimmäistä kertaa, että ilmaus TMEFF2 on vaimentua vuonna gliooman ja useita muita syöpiä ja että downregulation korreloi DNA: n metylaatio. Yhdessä nämä tiedot viittaavat tärkeä rooli TMEFF2 kehittämisessä ja etenemiseen ihmisen syöpien.

Tulokset

solunulkoista TMEFF2 vuorovaikutuksessa PDGF-AA

TMEFF2 ennustetaan sisältää transmembraaninen (TM) domeeni, jossa on aminopään (NT) signaalipeptidin sekvenssin (SP) (Fig. 1A). Rekombinanttiproteiineja, jotka sisältävät solunulkoisen domeenin (ECD) TMEFF2 fuusioitu FLAG-tunniste (TECD-FLAG) tai Fc-osaan ihmisen immunoglobuliinin gamma (hFcγ (TECD-Fc) on karboksi-terminuksessa (CT) ilmennettiin nisäkässoluissa ja puhdistettiin soluviljelmän supernatanteista (Fig. 1 B). puhdistettu TECD-FLAG ja TECD-Fc juoksi ennustetussa noin 55 kDa: n ja -70 kD SDS-PAGE pelkistävissä olosuhteissa, vastaavasti (Fig. 1 c). NT-sekvensointi puhdistettuja proteiineja paljasti, että signaalipeptidi pilkottiin tähteiden 40 ja 41 sekä rekombinanttiproteiineja (Fig. 1 D).

(A) hydropatiakäyrää of TMEFF2 proteiinin perusteella algoritmi Kyte ja Doolittle [53] ja ennustettu verkkotunnuksen perustuva rakenne NT sekvensointi rekombinantti TECD tässä tutkimuksessa ja Horie et al., 2000 [6]. SP, signaalipeptidi; FS I, follistatin kaltainen domeeni I; FS II, follistatin-kaltaisen domeenin II; EGF, epidermaalinen kasvutekijä kaltainen domeeni; TM, transmembraanidomeeni; N-Gly, mahdollista paikkaa N-välitteisen glykosylaation; GAG, potentiaalinen sivusto glykosaminoglykaanin kiinnityksen. (B) Kaavamainen esitys rekombinantin TECD-FLAG ja TECD-Fc-fuusioproteiineja kohdakkain täyspitkän TMEFF2 (TMEFF2-FL). (C) Puhdistettu TECD-FLAG ja TECD-Fc analysoitiin SDS-PAGElla pelkistävissä olosuhteissa Coomassie-sinisellä värjäyksellä. (D) NT-sekvensointi puhdistettua TECD-FLAG ja TECD-Fc paljasti pilkkomiskohdan signaalipeptidin. Aminohapposekvenssi tunnistettiin NT sekvensoinnilla on alleviivattu. Nuolenkärki osoittaa signaalipeptidin pilkkomiskohdan.

Koska follistatin (FS) moduuli sisältävät proteiinit on osoitettu olevan vuorovaikutuksessa PDGF ligandien [19], tutkimme kyky kunkin 3 dimeerisen muodot PDGF ligandeja, PDGF-AA, BB ja AB vuorovaikutuksessa ECD TMEFF2 käyttäen entsyymi-immunologiset määritykset (ELISA). Käyttäen biotinyloitua anti-PDGF-A-vasta-ainetta, havaitsimme annoksesta riippuvaisen sitoutumisen, kun 1-10 ng /ml PDGF-AA lisättiin immobilisoitua TECD-FLAG. Heikko sitoutuminen havaittiin käyttämällä PDGF-BB ja biotinyloitua anti-PDGF-B-vasta-aineen, kun taas mitään merkittävää sitoutumista ei havaittu PDGF-AB käyttäen biotinyloitua anti-PDGF-A-vasta-ainetta (Fig. 2A). Vaikka oli vain hieman tausta välinen sitoutuminen PDGF-AA ja päällystämättömän muovikuoppiin, sitoutuminen PDGF-AA immobilisoituun TECD-FLAG oli verrattavissa sen sitoutumisesta immobilisoituun anti-PDGF-vasta-aine samoissa olosuhteissa (Fig. 2A) . Ei-spesifinen sitoutuminen havaittiin erilaisia ​​muita proteiineja tarkasteltu, kuten EGF-reseptorin perheen jäseniä (EGFR, HER2, HER3- tai HER4) ja tuumorinekroositekijän reseptorin (TNFR) fuusioitunut hFcγ. Lisäksi mitään merkittävää sitoutumista ei havaittu välillä TMEFF2 ECD: itä itseään, kun TECD-Fc käytettiin analyytin. Positiivisena kontrollina, anti-FLAG-monoklonaalisella vasta-aineella osoitti annoksesta riippuvaa sitoutumisen TECD-FLAG-päällystettyihin kuoppiin Fig. 2B).

(A) sitoutuminen dimeerisen PDGF ligan- TECD-FLAG päällystettyihin kuoppiin. PDGF-AA, AB tai BB levitettiin TECD-FLAG päällystettyihin kuoppiin (umpinaiset symbolit) tai nollakoekuoppien (avoimet symbolit) ja havaittiin biotinyloidulla anti-PDGF-A (PDGF-AA AB) tai PDGF-B (varten PDGF-BB) vasta sen jälkeen streptavidiini-HRP. Anti-PDGF pAb päällystettyihin kuoppiin käytettiin positiivisena kontrollina PDGF-AA sitoutuminen (x). (B) sitoutuminen kuuden rekombinantti-Fc-merkitty ECD: itä ja anti-FLAG mAb TECD-FLAG päällystettyihin kuoppiin. HRP-konjugoitu anti-hiiri, ja anti-ihmisen Fcy käytettiin havaitsemaan anti-FLAG mAb ja Fc-merkittyjen proteiinien, vastaavasti. (C) TECD-Fc pantiin kuoppiin, jotka on päällystetty PDGF-AA, AB tai BB ja detektoitiin HRP-konjugoidulla anti-ihmisen Fcy. (D) TECD-Fc ja muut Fc-merkitty ECD eri transmembraani- proteiineja pantiin PDGF-AA päällystettyihin kuoppiin ja detektoitiin HRP-konjugoidulla anti-ihmisen Fcy. TNFR, tuumorinekroositekijän reseptorin; PDGFRβ, PDGF-reseptori β; mOX40, hiiren OX40. Virhe pylväät edustavat standardipoikkeamat välillä kaksoiskappaleet. Edustaja kuvaajat vähintään kolmen itsenäisen kokeen on esitetty.

Sen varmistamiseksi, että sitoutuminen havaittiin on todellakin johtuu vuorovaikutuksesta PDGF-AA ja TMEFF2-ECD, me sitten immobilisoidaan PDGF ligandien levyt ja sovelsi TMEFF2-ECD fuusioitu eri tag, TECD-Fc, kuten analyytin. Vastaa tuloksia, jotka saatiin immobilisoidulla TECD-FLAG, TECD-Fc osoittivat merkittävää annoksesta riippuvaa sitoo ainoastaan ​​immobilisoituun PDGF-AA, mutta ei AB, BB, CC ja DD (Fig. 2C, täydentävää Fig. S1A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin käyttämällä etiketin vapaan ForteBio alustan (Menlo Park, CA) mitata PDGF sitoutumisen biotinyloitua TMEFF2-FLAG immobilisoidaan streptavidiinilla päällystettyjä anturi. PDGF-AA-menetelmää osoitti vahvinta sitoutuminen TMEFF2, kun taas PDGF-BB, AB, CC, ja DD osoitti vähentää huomattavasti affiniteetit (tuloksia ei ole esitetty). Rekombinantti liukoinen PDGF-reseptorin α ekstrasellulaarista domeenia (SRa), toisaalta, osoitti annoksesta riippuvaa sitovat kaikkia 3 immobilisoituun PDGF dimeerit AA, AB ja BB (täydentävä Fig. S1B), kun taas PDGF-reseptori βECD-Fc (PDGFRβ- Fc) fuusioproteiini ei pystynyt sitomaan PDGF-AA (Fig. 2D), yhtäpitävä raportoidun spesifisyys näiden reseptorien [25] – [27].

TMEFF2 vuorovaikutuksessa PDGF-AA kautta FS moduulin sisältävä alue, kun ekspressoidaan nisäkässolujen pinnalla

määrittää, onko ECD TMEFF2 voi olla vuorovaikutuksessa PDGF-AA, kun ekspressoidaan nisäkässolujen pinnalla, transfektoimme 293-soluja, jotka sisälsivät täyspitkän TMEFF2 (TMEFF2-FL), tai katkaistun TMEFF2 ilman solunsisäistä domeenia (TMEFF2-ΔICD) (Fig. 3). PDGF-AA ja PDGF-AB lisättiin sitten viljelyväliaineeseen ja sen annetaan sitoutua solun pinnalla 30 minuutin ajan. Sitoutumattoman PDGF ligandit pestiin sen jälkeen pois ja solulysaatit altistettiin immunosaostus joko polyklonaalista vasta-ainetta (pAb) tunnustetaan sekä PDGF-AA ja AB-dimeerit tai pAb tunnustetaan ECD TMEFF2. Kuten on esitetty kuviossa. 3 täydentävää Fig. S8, anti-PDGF-A-vasta-aine voi tunnistaa denaturoidun PDGF-A monomeerin anti-PDGF-immunosaostumien soluista inkuboitiin joko PDGF-AA ja PDGF-AB: n, mikä viittaa siihen, että sekä PDGF dimeerejä sitoutunut solun pintaan joko vuorovaikutusta spesifisten reseptorien kanssa tai soluväliaineen (ECM) proteiineja. Kuitenkin, PDGF-A havaittiin anti-TMEFF2 immunosaostumien vain soluja inkuboitiin PDGF-AA, mutta ei niitä inkuboitiin PDGF-AB. Lisäksi, PDGF-AA oli läsnä anti-TMEFF2 immunopresipitaattien soluista, jotka ilmentävät joko täyspitkä TMEFF2 tai ICD-katkaistu TMEFF2. Tämä on sopusoinnussa ELISA tulos osoittaa, että PDGF, AA, mutta ei PDGF-AB osoitti annoksesta riippuvaista sitoutumisen ECD TMEFF2.

Useita bändejä TMEFF2-FL ja TMEFF2-ΔICD havaittiin anti- TMEFF2 mAb johtuen eriasteisia glykosylaation ja proteoglykaanien kiinnitys [4]. mAb, hiiren monoklonaalinen vasta-aine; pAb, kanin polyklonaalinen vasta-aine; Ig LC, kevytketjun Ab käyttää immunosaostusta.

TMEFF2 sisältää 2 FS-moduulit ja EGF-kaltaisen domeenin. Leikellä, jotka domeenit TMEFF2 osallistuvat sen vuorovaikutus PDGF-AA, teimme Herpes simplex, tyyppi 1-glykoproteiinin D (gD) -epitooppi merkitty deleetiomutanttien TMEFF2 ja tutkittiin niiden kykyä sitoutua PDGF-AA, kun ilmaistaan ​​pinnalla 293 solut (Fig. 4 täydentävää Fig. S8). Kuten odotettua, PDGF-AA co-immunosaostettiin gD-merkityn täyspitkän TMEFF2 by anti-gD monoklonaalinen vasta-aine. Kuitenkin, kun gD-merkityn TMEFF2 mutanttien puuttuu joko NT FS I (gD-TMEFF2-ΔFS I) tai molemmat FS moduulit (gD-TMEFF2-ΔFS I /II) immunosaostettiin samalla anti-gD-vasta-aine, ei ole PDGF AA kaadettiin, vaikka molemmat mutantti TMEFF2 proteiinit tuotiin alas immunosaostumien. FACS-analyysi vahvisti myös kalvo ilmaus kaikkien 3 gD-merkittyjen proteiinien (Supplemental Fig. S2). Tämä viittaa siihen, että NT alueet sisältävät FS-domeeni vaaditaan PDGF-AA vuorovaikutuksen, kun taas EGF-domeenin yksin on riittämätön tämän vuorovaikutuksen. Tämän mukaisesti tulos, rekombinantti His-tandem-joukko EGF verkkotunnuksen TMEFF2 myöskään osoittanut spesifinen sitoutuminen PDGF-AA levyillä ELISA (tuloksia ei ole esitetty).

Useita bändejä TMEFF2 -FL ja TMEFF2-ΔFS I havaittiin anti-TMEFF2 mAb johtuen eriasteisia glykosylaation ja proteoglykaanien kiinnitys [4].

TMEFF2 moduloi PDGF: n stimuloimaa proliferaatiota NR6 fibroblastien

PDGF ligandit ovat tehokkaita mitogeenejä sidekudoksen soluja, mukaan lukien fibroblastit, sileät lihassolut, kondrosyyttien, ja jotkut endoteelisoluissa [17], [28], [29]. Havainto, että TMEFF2 vuorovaikutuksessa PDGF-AA at ng /ml pitoisuuksia sekä yhdistelmä-TMEFF2 ECD ja PDGF-AA sai meidät tutkimaan mahdollisuutta, että TMEFF2 voi säädellä PDGF-AA signalointi. Ensin kysytään PDGFRα, ainoa reseptori, joka sitoo PDGF-AA, voisi kilpailla TECD PDGF-AA sitova. Kuten esitetään Supplemental kuvassa. S1C, TECD-Fc-sitoutumisesta PDGF-AA Pinnoitettu levy estää liukoisen ekstrasellulaarisen domeenin PDGFRα, SRa, annoksesta riippuvalla tavalla, mikä osoittaa, että TMEFF2 ECD ja SRa sitoutuvat PDGF-AA on päällekkäisiä sivustoja.

vieressä tutkittiin, mikä vaikutus TMEFF2-ECD on PDGF stimuloi leviämistä. Hiiren fibroblastisolulinja NR6 ekspressoi sekä PDGF-reseptoreiden α ja β [30], ja näytteille annoksesta riippuvaa proliferaatiota vasteena PDGF-AA ja PDGF-AB mitattuna BrdU (Fig. 5A, C). Kun 10 ng /ml PDGF-AA lisättiin, kun läsnä oli kasvavia pitoisuuksia Fc-merkitty TECD, BrdU estyi annoksesta riippuvalla tavalla pitoisuuksina 0,6 ja 2000 ng /ml TECD-Fc: tä (kuvio. 5B) . Tämä vaikutus oli samanlainen kuin SRa, joka inhiboi myös PDGF-AA-indusoitu BrdU vastaavassa pitoisuusalueella, vaikkakin hieman suurempi tehokkuus. PDGF-AB aiheuttama BrdU, toisaalta, ei vaikuttanut TECD-Fc samoissa olosuhteissa (Fig. 5D). Kiinnostavaa, SRa oli myös vähän vaikutusta PDGF-AB-indusoitua proliferaatiota, vaikka aikaisempien raporttien kanssa yhtäpitävä [31], PDGF-AB saattaa sitoa sRαwith affiniteetti samanlainen PDGF-AA (Supplemental Fig. S1B). Tämä voi johtua siitä, että kyky PDGF-AB sitoutua kaikkiin 3 PDGFR dimeerejä, αα, αβ tai ββ [26], kun taas PDGF-AA voi viestiä vain PDGFR αα dimers.It on mahdollista, että PDGF-AB voi olla korkeampi affiniteetti natiivin PDGF-reseptorin αβ dimeerit kuin SRoc tai että voi olla runsaampia PDGF-reseptorin αβ dimeerejä ja /tai PDGF-reseptorin ββ dimeerit näihin soluihin.

(A) (C) annosriippuvaisesti stimulaatio BrdU PDGF-AA ja PDGF-AB NR6 soluissa. (B) (D) vaikutukset kasvavien pitoisuuksien TECD-Fc: tä (täytetyt pylväät) tai PDGF SRa (avoimet pylväät), 10 ng /ml PDGF-AA (B) tai PDGF-AB: n (D) stimuloivat BrdU.

TMEFF2 ilmentyminen säädeltiin vähentävästi aivoissa syöpien ja korreloi negatiivisesti PDGF-A ilmaisu

5′-alue TMEFF2 geeni usein hypermetyloitunut joidenkin syöpien [2], [3], [9] – [16], mikä viittaa mahdolliseen tuumorisuppressoriproteiinia roolia TMEFF2 näissä syövissä. Vertailla ekspressiotasojen TMEFF2 ihmisen kudoksissa, olemme analysoineet Affymetrix microarray saadut GeneLogic, Inc. (Gaithersburg, MD), joka sisältää useita ihmisen tuumorin ja normaalin kudoksen näytteissä. Korkeimmat TMEFF2 ilmentymisen havaittiin eturauhasen ja aivojen kudokset (Supplemental Fig. S3, S4).

In situ

-hybridisaatiokokeissa vahvisti korkeita TMEFF2 mRNA: n ilmentymisen normaaleissa aikuisen ja sikiön keskushermostoa, sekä sekä pahanlaatuiset ja ei-pahanlaatuiset eturauhaskudoksiin (Supplemental Fig. S5). Keskimääräinen ekspressiotaso TMEFF2 on huomattavasti korkeampi eturauhassyöpäkudoksille verrattuna normaaliin eturauhasen kudoksia (Fig. 6A; Supplemental Fig. S3, S4), yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [7]. Sen sijaan, TMEFF2 esittelee huomattavasti alhaisempi keskimääräinen ekspressiotasot pahanlaatuisen aivojen näytteissä, erityisesti glioblastoomat (GBM), verrattuna normaaliin aivokudoksen (Fig. 6B; Supplemental Fig. S3, S4). Useimmat muut kudokset ilmaista TMEFF2 paljon alemmilla tasoilla kuin aivojen ja eturauhasen. Useat kudokset osoittavat myös suuntaus vähentynyt ilmaisun syöpien, kuten paksusuolen ja peräsuolen, ruokatorven ja mahan, tilastollisesti merkittävää eroa peräsuolen syövän näytteissä verrattuna normaaliin paksusuolen kudoksiin (Supplemental Fig. S3, S4). Nämä tiedot ovat yhdenmukaisia ​​mahdollinen tuumorisuppressoriproteiinia roolia TMEFF2 näissä kudoksissa.

(A) Affymetrix signaali voimakkuuden TMEFF2 ilmaisun eturauhassyövässä vs ei-syöpä kudoksiin perustuva GeneLogic tietoihin. (B) Affymetrix signaali voimakkuuden TMEFF2 ilmentymisen normaaleissa aivoissa vs aivosyövän kudoksiin perustuva GeneLogic tietoihin. Jokainen avoin ympyrä (A) (B) edustaa yksi potilas näyte. Laatikko-ja Whisker tonttien kuuluvat myös raakadatan osoittamaan keskiarvo ja 25. ja 75. prosenttipiste vaihtelee. Viikset piirretään 1,5 kertaa kvartiiliväli laatikosta. (C) (D) Normalized signaaleja TMEFF2 (C) ja PDGF-A (D) mRNA: n ekspression Proneuraaliset (PN), Proliferative (Prolif), tai Mesenkymaaliset (MES) alatyyppejä 36 gliooma näytteitä. Mean signaalit kunkin alatyypin näkyvät sisäkkeet. *

p

≤0.05; **,

p

≤0.005. (E) TMEFF2 ilmentyminen korreloi negatiivisesti PDGF-A ilmentymistä 133 (76 MD Anderson ja 57 UCSF) HGG näytteistä (Pearsonin korrelaatiokerroin r = -0,37). Jokainen akseli edustaa normalisoitu signaalit kunkin geenin. Kaikki ilme tiedot saatiin käyttämällä Affymetrix HG-U133A ja HG-U133B GeneChips anturiliittimestä 223557_s_at varten TMEFF2 ja 205463_s_at PDGF-A, vastaavasti.

Korkea laatu gliooma (HGGs) on luokiteltu kolmeen molekyyli- alatyyppiä perustuen samankaltaisuutta määritelty lauseke allekirjoitukset: Proneuraaliset (PN), Proliferative (Prolif) ja mesenkyymikasvaimia (MES) [32]. Proneuraaliset alatyypin ilmaisee liittyvien geenien normaalia aivojen ja prosessi neurogenesis. Tämä alatyyppi on liittynyt parempi ennuste [32], ja se on viime aikoina liitetty osajoukko kasvaimia, joilla gliooma-CpG-saarekkeen methylator fenotyypin (G-CIMP) ja isositraattidehydrogenaasin 1 (IDH1) mutaatio (katso alla) [33 ]. Sen sijaan kaksi muuta alatyypit ovat huonompi ennuste [32], ja on ominaista muistuttaa joko erittäin proliferatiivisen solulinjoja tai kudosten mesenkymaalista alkuperää, jossa geeni-ilmentymisen ohjelmien osoittaa soluproliferaation tai angiogeneesin, vastaavasti. Microarray-analyysi TMEFF2 vuonna joukko 36 HGG näytteistä, jotka sisälsivät 12 prototyyppisiä tapauksissa kunkin alaluokan [32], [34] paljasti merkittävästi korkeammat tasot TMEFF2 ilmentymisen PN alaluokkaan kuin Prolif ja MES alaluokkien (Fig. 6C). Mielenkiintoista, PDGF-A osoitti lähes peilikuva, vastapäätä trendi korkein ilmaisua MES-alaluokan (Fig. 6D). Tällainen suuntaus ei havaittu PDGF-B näissä näytteissä (tuloksia ei ole esitetty). Tarkempi analyysi microarray tietojen 76 HGG näytteissä MD Anderson Cancer Center (MDA) ja 57 HGG näytteitä University of California San Francisco (UCSF) ehdottaa negatiivinen korrelaatio TMEFF2 ja PDGF-A ilmentymistä molemmissa näytesarjaa (Fig. 6E ). Nämä tiedot ovat yhtäpitäviä sen hypoteesin kanssa, että PDGF-AA voi olla tärkeä kasvutekijä kehittäminen edellyttää ei-PN HGGs, ja että TMEFF2 ilmentyminen voidaan valita vastaan ​​näissä HGGs, jotka ovat riippuvaisia ​​PDGF-AA-signalointia.

TMEFF2 on hypermetyloitunut useita kasvaintyypeissä sen ilme korreloi negatiivisesti metylaatiotasoilla

hypermetylaatiota TMEFF2 geenin ihmisen syövissä on raportoitu eri kudoksissa, mukaan lukien peräsuolen, maha- ja ruokatorven syöpiä [2], [ ,,,0],3], [9] – [12], [16]. Nämä kudokset ilmentävät hyvin alhainen TMEFF2 jopa normaaleissa näytteissä, mikä merkitys geenisuppression vähemmän selvä näissä kasvaimissa. Koska metylaatiostatuksen TMEFF2 ei ole raportoitu gliooman ja useimmissa muissa kudoksissa, analysoimme kaikki julkisesti saatavilla olevat tiedot The Cancer Genome Atlas (TCGA), jossa tuloksia sekä Agilent ilmaisun ja Infinium metylaation taulukot [35]. Seitsemästä kasvaintyypeissä missä nämä tiedot ovat tällä hetkellä saatavilla vain glioblastooma, ja joskus munasarjojen ja peräsuolen syöpä näytteistä merkittäviä määriä TMEFF2 ilmentymisen (Fig. 7). Kaikki näytteet, joilla on korkea TMEFF2 ilmaisun vastaavat alhainen CpG-saarekkeen metylaation todetaan, kun taas näytteet metyloinnin beeta-arvo on suurempi kuin 0,1 on tukahdutettu ilmaus TMEFF2, mikä näkyy erityisesti GBM näytteistä (t-testi, p-arvo 4 × 10

-14). TMEFF2 ilme on tuskin havaittavissa lähes kaikissa paksusuolen adenokarsinooma, peräsuolen adenokarsinooma, keuhkojen adenokarsinooma ja keuhkon okasolusyöpä näytteitä. Vaikka suurin osa näistä kasvain näytteissä metylaatio beeta-arvot ovat yli 0,1, on olemassa riittävästi tietoa sen määrittämiseksi, onko eri kynnysarvot metylaation beeta-arvot ovat voimassa eri kasvain tyypit tukahdutetaan TMEFF2 ilmaisun, tai muita mekanismeja tukahduttaa sen ilmaisua. Kuitenkin yhdessä muiden julkaisuja TMEFF2 metylaation muissa elimissä, nämä tiedot ovat sopusoinnussa hypoteesin, että TMEFF2 vaimentuu kautta DNA-metylaation merkittävän osan ihmisen syövissä, kuten gliooma ja syöpien munasarjojen, peräsuolen, paksusuolen ja keuhkojen alkuperää.

metylointi tasot on piirretty x-akselin keskiarvo beeta-arvot kahden Infinium koettimet, cg06856528 ja cg18221862, ja mRNA: n ekspressiotasot saatu Agilent siru on piirretty y-akselilla.

Äskettäin osajoukko gliooma ominaisella promoottori DNA: n metylaatio muutoksia, kutsutaan G-CIMP, on tunnistettu yhteydessä TCGA GBM näytteiden [33]. Mielenkiintoista, G-CIMP-positiivisia kasvaimia kuuluvat osajoukko Proneuraaliset kasvaimia ja liittyvät läheisesti IDH1 mutaatio. Nämä kasvaimet ovat suotuisat ennuste sisällä GBM kokonaisuutena ja myös sisällä Proneuraaliset osajoukon. Ymmärtää suhdetta TMEFF2 metylaation ja G-CIMP allekirjoitusta, vertasimme TMEFF2 metylaatiostatuksen vastaan ​​joukko TCGA GBM näytteiden saatavilla G-CIMP ja IDH1 mutaatio tietoa. Niistä TCGA näytteistä analysoidaan Noushmehr et al. [33], 88 päällekkäin näytteiden että me analysoitiin käyttämällä julkisesti saatavilla aineisto. 76 heistä oli G-CIMP-negatiivinen ja 12 G-CIMP-positiivisia. Kaikki 76 G-CIMP-negatiiviset näytteet olivat negatiivisia IDH1 mutaatio, kun taas kaikki 12 G-CIMP-positiiviset näytteet olivat positiivisia IDH1 mutaation.