Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Haimasyöpä on tappava sairaus, jossa on 5-vuoden eloonjäämisaste vain 1-5 %. Kiihtyminen intraoperatiivisen histologinen tutkimus olisi hyödyllistä hallita paremmin haimasyöpä, mikä viittaa parannettu säilymiseen. Epälineaarisia optisia menetelmiä, jotka perustuvat kahden fotonin kiihtynyt fluoresenssi (TPEF) ja toinen harmoninen sukupolven (SHG) luontaisten optisen biomarkkereiden osoittaa kykyä visualisoida morfologian tuoreen kudosten liittyy histologia, joka on lupaava reaaliaikaiseen intraoperatiivinen arviointi haimasyövän .

menetelmät /Principal havainnot

tutkiakseen, onko epälineaarisia optisia kuvantamismenetelmiä on kyky luonnehtia haiman histologian solu- resoluutio tutkimme erilaisia ​​haiman kudoksista käyttämällä merkkivapaalla TPEF ja SHG. Verrattuna muihin rutiini menetelmiä näytteiden valmistelua, tuore kudokset ilman käsittelyä todettiin olevan sopivimpia epälineaarisia optisen kuvantamisen haiman kudoksista. Yksityiskohtaiset morfologia normaalin rotan haiman havaittiin ja liittyvät standardin histologisia kuvia. Suhteellisen runsaasti, alustava kuvia pieni määrä kemiallista-indusoidun haiman syöpäsoluissa osoitti näkyvää neoplastisten eroja sellaisten solujen morfologian ja soluväliaineen. Ihonalainen haiman ksenograftien edelleen havaittiin käyttäen epälineaarista optinen mikroskopia, osoittavat, että useimmat solut ovat leukosyyttejä on 5 päivää istutuksen jälkeen, kasvaimen solut alkavat lisääntyä on 10 päivää istutuksen jälkeen, ja solunulkoinen kollageeni kuidut tulevat epäjärjestyksessä kuin ksenograftit kasvaa.

Johtopäätökset /merkitys

tässä tutkimuksessa epälineaarisia optisen kuvantamisen käytettiin luonnehtimaan morfologiset yksityiskohtia tuoretta haiman kudoksista ensimmäistä kertaa. Osoitamme, että on mahdollista tarjota reaaliaikaista histologinen arviointi haimasyövän että epälineaarisia optisia menetelmiä, jotka aiheuttavat tilaisuus luonnehdinta etenemisestä spontaani haimasyövän ja edelleen sovelluksen ei-invasiivisia tavalla.

Citation: Hu W, Zhao G, Wang C, Zhang J, Fu L (2012) Epälineaarinen valomikroskooppi varten histologia Tuore Normaali ja syöpä Haiman kudokset. PLoS ONE 7 (5): e37962. doi: 10,1371 /journal.pone.0037962

Editor: Irene Georgakoudi, Tufts University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 helmikuu 2012; Hyväksytty: 26 huhtikuu 2012; Julkaistu: toukokuu 24, 2012

Copyright: © 2012 Hu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Major tieteellinen tutkimusohjelma of China (nro 2011CB910401), National Natural Science Foundation of China (nro 61178077), Program New Century Excellent Talents in University (nro NCET-08-0216), ja Fundamental tutkimus varat Central yliopistot (HUST: 2011JC046). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haimasyöpä on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvien kuolleisuutta maailmanlaajuisesti, ja sen kokonaispaksuus 5 vuoden pysyvyys 1-5% [1]. Parempi hoito voi osaltaan merkittävästi parantaa potilaiden eloonjäämisen [2]. Intraoperative kuulemisessa on lähinnä tutkimisen kirurgisen leikatun näytteen on tärkeää, että kirurgi määrittää sopivimmat hoitovaihtoehdot [3]. On kuitenkin sovelletaan aikarajoituksia. Yksi jäädytetty osio diagnoosi suuren tarkkuuden kestää 20 minuuttia, ja se on paljon pidempi kun useita jääleikkeille suoritukseen tarvitaan yhden mallin [3]. Reaaliaikainen histologia tuoreiden tai elävien kudosten ilman leikkaamista tai lisäkäsittely, ei ainoastaan ​​helpottaisi välittömästi perustamista tai vahvistus diagnoosin ja vaihe leikkauksen, jotka vaikuttavat kirurgisen, mutta mahdollistavat myös arvioida kaikkia kirurgisen marginaalit siten, että kasvain poistetaan kokonaan vaarantamatta normaali osa haima. Tarkka kirurginen marginaali arviointi mahdollistaa parantamiseen pysyvyyttä, koska positiivinen kirurginen marginaalit, esiintyy 37-50%: lla potilaista, joille tehdään kirurginen resektio ja eloonjäämisaste näistä potilaista vaihtelee 8 ja 14 kuukautta [4]. Reaaliaikainen havaitseminen morfologisten esiintymismallit resoluutiota yhden solun, joka on analogi histologia, osoittaa houkutteleva mahdollisuus optimaalista intraoperatiivista hallintaan haimasyövän suotuisa eloonjäämishyötyä.

Optiset menetelmät, hyödyntämällä ei-invaasio ja korkea tempo-spatiaalinen resoluutio, voidaan saavuttaa

in vivo

kuvantamisen ja tunnistava biolääketieteen tutkimuksissa. Raman-spektroskopia, joka perustuu eron energia tapahtumasta ja hajallaan fotonit, koska molekyyli tärinää, on herkkä muutoksia kemiallisen koostumuksen soluissa ja kudoksissa. Se on sovellettu erilaistumista normaalin ja syöpä- haiman kudoksia hiirimallissa [5]. Heijastuskyky ja fluoresenssispektroskopia voi tarjota biokemiallisia tietoja kudosten erottaa eri ihmisen haiman kudoksista, mukaan lukien normaalin haiman kudos, haimatulehdus ja haiman adenokarsinooma [6], [7]. Photon-kudos vuorovaikutuksen malleja on edelleen kehitetty määrällisiä yhteyksiä heijastavuutta ja fluoresenssimittaukset ja histologiset ominaispiirteet ihmisen haiman kudoksista, kuten ydin- koko [8], [9]. Kuitenkin spektrin parametrit on vaikea suoraan sovitettu morfologisiin ominaisuuksiin paljasti tavanomaisella histologinen tutkimus, erityisesti muutokset ydin- muodon ja organisaatio soluväliaineen. Tarkemmat luonnehdinta haiman morfologia solun resoluutio optisella menetelmien tarpeen parantaa havaitsemista haiman neoplasia, syytetään uusi keino reaaliaikaisen histologia.

Viime vuosina epälineaarinen optinen mikroskopia (NOM), lähinnä lukien TPEF ja SHG, on tullut tehokas väline tunnistamaan pieniä rakenteellisia ja toiminnallisia muutoksia solujen resoluutio. NOM etuna on alle mikronin erottelukykyaluetta millisekunnin ajallinen tarkkuus ja optinen leikkauksen kyky samea kudoksissa [10], [11]. Yksi tärkeä luonne tällaisen kuvantamisen on se, että endogeeninen optinen biomarkkereita kudoksissa voidaan käyttää kontrastin aikaansaamiseksi, mikä tekee mahdolliseksi havaita ihmisten sairauksien ilman kiinnitystä, leikkaamista tai värjäys. Luonnostaan ​​kahden fotonin kiihtynyt fluoresenssi (TPEF) biomarkkerit muun muassa vähäisempi nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi (fosfaatin) [NAD (P) H], ja flaviiniadeniinidinukleotidi (FAD) on sovellettu paljastaa solujen morfologia, koska NAD (P) H ja FAD ovat suuret fluoroforeja sytoplasmassa [12], [13]. Samaan aikaan kollageenin kuidut, jotka ovat tärkeitä rakenteellisia proteiineja soluväliaineen (ECM), voidaan toteuttaa luontaisia ​​toinen harmoninen sukupolven (SHG) prosessi biologisissa kudoksissa kuvastamaan ECM malli [12], [13]. Lisäksi solunsisäistä NAD (P) H ja FAD liittyy myös redox-suhde soluja, joita voidaan käyttää indikaattorina metaboliatasolla solujen [14], [15]. NOM on laajalti käytössä visualisoida solujen ja kudosten rakenteita eri syövän kudoksissa kuten munasarja-, virtsarakko-, maha- kudoksia, ja niin edelleen [14], [16] – [20].

ensinnäkin tietomme , tunnettu morfologiset yksityiskohtia haiman kudoksista käyttäen merkkivapaalla TPEF ja SHG tekniikoita. Kun pyritään arvioimaan mahdollisuuksia NOM yksityiskohtaista morfologiset luonnehdinta haiman kudoksista, haimme merkkivapaalla TPEF ja SHG tekniikoita normaaliin rotan haima ja liittyvät perinteisten histologinen värjäys kuvia. Eri rutiini keinoja valmisteluun yksilöt on verrattu hankkia optimaalinen epälineaarisia optisen kuvantamisen haiman kudoksista. Kemikaali aiheuttama haimasyöpä kudokset edelleen tunnettu ja verrattuna normaaliin haiman yksilöitä vahvistaa kykyä NOM paljastaa kasvainmuutoksia. Jotta voidaan arvioida mahdolliset tarran vapaan TPEF ja SHG tekniikoita luonnehtia eri vaiheissa kasvun haimasyövän, ihonalaista haiman tuumoriksenografteja talteen eri ajankohtina istuttamisen jälkeen analysoitiin kvantitatiivisesti perustuu niiden morfologisia ominaisuuksia.

Materiaalit ja menetelmät

eläinmallit

kemikaali aiheuttama haimasyövän malli, joka kehittää spontaanisti pahanlaatuinen syöpä haimassa käytettiin vertailussa neoplastisten kudosten normaaleissa kudoksissa. Kokeet hyväksynyt Ethic komitean Tongji Medical College, Huazhong tiede ja teknologia. Eläinten hoito toimitettiin menettelyjen mukaisesti esitetty ”Guide for Care ja käyttö Laboratory Animals” julkaiseman Yhdysvaltain National Institutes of Health. Uros Sprague-Dawley rottia (100-125 g) saatiin Experimental Animal Center of Tongji Medical College (Wuhan, Kiina). Kasvaimet aiheutettiin mukaan aiemmin perustettu protokolla [21]. Lyhyesti, anestesia indusoitiin höyrystetyn eetterillä, minkä jälkeen 10 min myöhemmin lihakseen pentobarbitaalia (20 mg /kg) ja ketamiinin (50 mg /kg). Rotat tehtiin keskiviivan laparotomy altistumiseen haiman pään segmenttiin. Parenchyma leikattiin suuntaisesti aikana sappitiekivistä, ja tasku kehitettiin haiman parenchyma klo viillon sivustolla. 5 mg DMBA kiteitä istutettiin ja paikallaan avulla 6-0 PROLENE kukkaro merkkijono ommelta. Kasvaimet kerättiin ja kuvattiin 9 kuukauden kuluttua induktion. Vastaleikattu kudoksiin yhteensä 12 (10 normaali ja 2 kemiallisia aiheuttama syöpä) rotat mittausta ja verrattiin.

Kateenkorvattomia (nu /nu) hiirten BALB /c-taustalla, ostettu Shanghai Laboratory Animal keskus (Shanghai SLAC Laboratory Animal Co. Ltd), käytettiin perustamiseen ihonalaisen haiman kasvain malli. Kokeet seurasi hyväksymiä Institutional Animal Ethics komitean Huazhong tiede ja teknologia. Kuudesta kahdeksaan viikkoa vanhoja koiraspuolisia hiiriä nostettiin erityisissä taudinaiheuttajista vapaat (SPF) olosuhteissa, joissa lämpötila pidetään noin 21 ° C ja kosteus 60-70% keinovalossa 12 tuntia. Kasvaimen ksenografteja kehitettiin perustettu PANC-1-solulinja (ATCC, Rockville, MD) [22]. Noin 6 x 10

6 PANC-1-soluja istutettiin ihonalaisesti vasempaan aihion ja ihonalaisen kasvaimen ksenografteja kerättiin 5, 10, 20, 30 päivää istutuksen jälkeen, vastaavasti. Kaikkiaan 20 hiiriä tuumoriksenografteja (5 hiirtä kussakin vaiheessa) käytettiin kuvantamisen ja kvantitatiivisen analyysin.

valmistelu haiman yksilöiden

eläimet lopetettiin yliannoksella Isofluraanin, ja sitten haiman kudokset leikeltiin pois ja kuvaamisen. Ennen kuvantamisen, juuri poistettu kudoksissa, mukaan lukien normaalin rotan haima, kemiallinen aiheuttama haimasyöpä kudosten ja ihonalaisen kasvaimen ksenografteja, inkuboitiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS). Puolet kustakin näytteestä sen jälkeen välittömästi mittausta ja kerätä kaikki kuvat oli valmis 1 tunnin kuluttua leikkely. Toinen puoli kustakin näytteestä käytettiin histologista analyysiä.

tutkimiseksi optimaaliset olosuhteet epälineaarinen optinen kuvantaminen haiman kudoksista, epälineaarinen optinen kuvat kylmävarastoida, kiinteä, ja kryosäilöttiin rotan haiman kudoksista verrattiin kanssa tuoreen kudosten vastaavasti, koska rakenne kudoksia voidaan ylläpitää tallenteen, ja se on raportoitu, että luontainen fluoresoivat komponentit (NAD (P) H ja FAD) voidaan havaita suurella tarkkuudella alle -80 ° C [23]. Kylmä tallennettu haiman kudoksia säilytettiin 4 ° C: ssa 4 tuntia, 12 tuntia ja 24 tuntia sen jälkeen, kun leikkaaminen, vastaavasti. Kiinteän kudokset käsiteltiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 19 tunnin ajan. Kylmäsäilytetty kudokset jäädytettiin -196 ° C: ssa nestemäisessä typessä ainakin 30 minuutin ajan. Kaikki kudokset siirrettiin PBS käsittelyn jälkeen ja sitten kuvata huoneenlämpötilassa.

Nonlinear optisen kuvantamisen

Nonlinear optisen kuvantamisen suoritettiin käyttäen modifioitua järjestelmää, joka perustuu kaupallisiin mikroskoopilla (Fluoview 1000, Olympus , Japani) varustettu Ti: Sapphire laser (Mai Tai, Spectra-Physics), joiden toistotiheys on 80 MHz: n (Fig. 1). 750 nm: n laserin ulostuloa järjestelmää käytettiin viritykseen, ellei toisin mainita. Keskimääräinen laser teho pinnalla näytteen oli noin 15 mW. Pyyhkäisynopeus on 10 mikrosekuntia /pikseli. Emittoidun signaalit keräämän keskittymällä tavoite (60 x /1,2 NA vesi-upotus, Olympus). Kaksi kaistanpäästösuodattimien (FF01-380 /14-25 ja FF01-445 /45-25, Semrock) käytettiin ennen valomonistinputket havaita SHG ja TPEF signaalit, vastaavasti. SHG signaali vahvistettiin omaisuutta aallonpituusriippuvuus, koska ei ollut mitään signaalia havaittu 380/14 nm alueella aallonpituuksilla pidempi kuin 780 nm. 3D-volyymi-mallinnus ImageJ (National Institute of Health, Bethesda, Maryland) käytettiin kuvan esityksen.

kvantitatiivinen analyysi ydinvoiman koko ja kollageenin

Kunkin vaiheen ihonalaisen haiman tuumoriksenografteja, 80 solut epälineaarinen optinen kuvat visuaalisesti valittu ja halkaisijat ytimen manuaalisesti mitattu arvioimiseksi ydin- kokoja. Keskimääräinen ydin- koot ihonalaisen haiman tuumoriksenografteja talteen eri vaiheissa laskettiin vastaavasti.

kollageenin analyysin sisältö kollageenisäikeiden kunkin näytteen arvioitiin osuus määrä pikseleitä, että kollageenin kuidut osuus kokonais- määrä pikseleitä kuvan. 40 aksiaalinen peräkkäisten kuvien pinnalta laskettiin saada keskimääräinen pitoisuus arvo kaikille näytteille. Harmaustason yhteistyössä esiintyminen matriisi (GLCM) menetelmä, joka on tekstuurianalyysiin perustuva menetelmä arvio toisen kertaluvun yhteinen ehdollinen tiheysfunktio [24], [25], käytettiin luonnehtimaan morfologiaa kollageenin kuituja.

tilastollinen merkittävyys laskettiin ANOVA lineaarinen kontrastia SPSS ohjelmistoa (SPSS). Kaikki p-arvot 0,05 tai vähemmän katsottiin merkittäviksi mainita sellaisenaan tekstissä.

Histologinen analyysi

Haiman fiksoitiin 10% neutraaleja puskuroituun formaliiniin, ja parafiiniin upotetut leikkeet jonka paksuus on 5 um valmistaa rutiininomaisesti. Kudoksen osat myöhemmin värjättiin hematoksyliinillä-eosiinilla ja Masson kolmivärimenetelmä, vastaavasti. Hematoksyliini- eosiini-värjäys käytettiin arvioitaessa solun morfologiassa, ja Massonin Trichrome-väriaineella, käytettiin havaitsemiseen kollageenisäikeiden haiman kudoksista. Histologinen kuvat hankittiin käyttäen optista mikroskooppia (IX81, Olympus, Japani) varustettuna 20 x ilmaa tavoite ja väri digitaalinen teollisuuden kamera (DFK 41BU02, Imaging Source Europe GmbH, Saksa).

Tulokset ja keskustelu

visualisointi morfologisen yksityiskohtia normaalin rotan haima

haima on tärkeä rauhanen sekä exocrine ja hormonaaliset toimintoja (Fig. 2A) ohuella kuitumaisen sidekudoksen kapseli, joka enwraps haiman parenchyma. Eksokriinisessä osa haima koostuu rypäleen kaltaisia ​​klustereita haiman asinaarisolujen nimeltään acini, jotka syntetisoivat ja erittävät ruoansulatusentsyymien pohjukaissuoleen kautta duktaalisia järjestelmiä. Haiman tiehytsoluja osoittavat pyramidin muotoinen apikaalisella solulimassa sisältävien -tsymogeeni rakeita ja näkyvästi ydin sijaitsee lähellä basolateraalisessa solukalvon. Hormonitoimintaa osa haiman osuus on noin 1-2% koko haiman massa, ja se koostuu hajallaan haiman saarekkeiden, jotka sisältävät klustereita erilaisten hormonia tuottavat solut.

(A) anatominen organisaatio normaalin rotan haima koostuu exocrine acini ja hormonaaliset haiman saarekkeiden. RBC: punasolujen. (B) epälineaarinen optinen kuva normaalin rotan haiman kuvantamisen syvyys 6 um. Punainen värikoodatut rakenne on kollageenia, ja vihreä väri fluoresoiva komponentti. Mittakaava on 30 pm. (C) epälineaarinen optinen kuva normaalin rotan haiman kuvantamisen syvyys 23 um. Tähdet, nuolenpää ja nuolet osoittavat ytimien asinussolut, kollageeni kuidut, tässä järjestyksessä. (D) epälineaarinen optinen kuva normaalin rotan haiman kuvantamisen syvyys 27 um. Pilkullinen ympyrän osoittaa rakenteessa haiman acini. (E) Haiman acini voidaan havaita hematoksyliinillä ja eosiinilla kuva. (F) Masson kolmivärimenetelmä kuva näyttää pienen määrän kollageenisyistä jaetaan ympäri acini normaalien rotan haiman näytteitä.

epälineaarinen optinen kuvan kuvantamisen syvyys 6 pm esittää kuitumaisen sidekudoksen kapseli pinnalla haiman (Fig. 2B), kuten on osoitettu SHG signaalin. Haiman parenchyma, fluoresoivien solutumissa näkyvät tummina ja pyöreä alueet sijaitsevat lähellä basolateraalisessa solukalvon (tähdellä kuvassa. 2C) ja yksittäiset haiman basaalisoluissa (arrowheads kuvassa. 2C) solut voidaan selkeästi yksilöity pintakerros acini (kuvantaminen syvyys 23 um). Lisäksi pieni määrä kollageenin kuituja (nuolet kuviossa. 2C) jaetaan soluväliaineen ympärille acini, joka on vastaavasti Massonin trikromilla-värjätty kuvia (Fig. 2F). Kuvio 2D osoittaa, että asinussolut on järjestetty kuvioksi (pisteviiva ympyrä) samanlainen rakenteellinen kokoonpano exocrine acini (Fig. 2A) syvään kerrokseen (kuvantaminen syvyys 27 um). Rypäleen kaltainen klustereiden asinussoluista voidaan havaita myös vastaavassa hematoksyliini- eosiini-värjättyä mikroskooppikuvia (Fig. 2E). Kuitenkin, verrattuna epälineaarinen optinen mikroskooppinen kuvia, histologiset kuvat on vaikea visualisoida kuitu- kapselin ja 3-D-konformaation asinussoluista. Täydentävä elokuva on myös näyttää syvyyden ratkaistu pinon haiman (Video S1). Lisäksi 3-D järjestely asinussoluista on edelleen vahvistettu värjäämällä ytimet fluoresoivaa väriainetta (kuvio S1). Tuloksemme osoittavat, että epälineaarinen mikroskopian etuna on 3-D visualisointi haiman ilman kudosta viipalointi tai co-rekisteröinti yli histologisia menetelmiä.

normaali haiman saarekesolujen on raportoitu läpitunkemat tiheä kapillaarit ja ympäröi ohut kollageeni kapseli ja glial arkki, joka erottaa hormonitoimintaa solut exocrine komponentti [26]. Kuitenkin, ei ollut mitään mallia samanlainen saarekkeet läsnä epälineaarinen optinen kuvia, mahdollisesti siksi, että harvan asutuksen saarekkeiden. Suurempi pinta-ala kuvantaminen väriaineilla voi helpottaa edelleen tunnistamista rakenteen haiman saarekkeiden.

Tulokset osoittavat, että luontainen TPEF fluoresenssin haiman solujen ja SHG signaalin kollageenisäikeiden soluväliaineessa voi visualisoida morfologiaa haiman solujen ja solunulkoisen komponentteja käyttämällä epälineaarisia optisella mikroskopialla.

alkuperä luontainen kontrasti

Se on hyvin dokumentoitu kirjallisuudessa, että pääasialliset lähteet TPEF signaalin sytoplasmassa ovat NAD (P) H ja FAD kanssa emissiospektrin huippu 460 nm ja 530 nm, vastaavasti [13], [14], [27]. Olemme havainneet, autofluoresenssi on alueella 500-550 nm viritysaallonpituudella 750 nm ja havaittiin, että intensiteetti on huomattavasti pienempi kuin alueella 425-470 nm (tuloksia ei ole esitetty). Koska luontainen fluoroforin osoittaa vahvaa emissio 425-470 nm kanava viritettynä 750 nm, me spekuloida, että luontaisen fluoresenssin haiman kudosten tulee pääasiassa NAD (P) H, ja FAD on vähäinen osuus luontaisia ​​päästöt.

kollageeni on raportoitu osoittavan ei-centrosymmetrical rakenne, jolloin se ensisijainen tekijä on SHG signaalin biologisten kudosten [13], [28]. Mukaan morfologia ja jakautuminen kuitujen paljasti SHG kuvien alkuperä SHG signaalin haima odotetaan olevan kollageenin kuidut soluväliaineen.

ihanteelliset olosuhteet luontainen kuvantamiseen haiman kudoksista

on raportoitu, että pitoisuus NAD (P) H ja FAD liittyy redox suhde, joka on herkkä muutoksille solujen aineenvaihduntaa ja verisuonten hapensaantia [29]. Siksi olemme kuvaamisen 4 ° C lämpötilassa, kiinteä, ja cyropreserved haiman kudoksista tutkia optimaaliset olosuhteet epälineaarinen optinen kuvantaminen haiman kudoksista. Verrattuna tuoreen kudosten (Fig. 3A), epälineaarinen optinen kuvia haiman kudoksista varastoidaan 4 ° C: ssa 4 tuntia esittävät morfologiaa haiman rauhasrakkuloista alempi kontrasti (Fig. 3B). Vain muutama haiman soluja voidaan havaita intensiteetin laskua fluoresenssin haimakudoksessa varastoidaan 4 ° C: ssa 12 tunnin ajan (Fig. 3C)), kun taas luontaisen fluoresenssin hyvin vähäinen, ja solut voidaan tuskin tunnistaa niille tallennetut 4 ° C: ssa 24 tunnin ajan (Fig. 3d). Vähentäminen intensiteetti luontaisen fluoresenssin ja menetys haiman soluja voi johtua lasku elinkelpoisuus haiman kudosten alla menetyksen hapen ja ravinnon jälkeen resektion. Erityisesti prosessi autodigestiosta aiheuttama vahinko on haima voi todennäköisesti nopeuttaa vahinkoa haiman kudoksista.

luontaisen fluoresenssin (A) tuoreen kudoksiin, kudosten varastoidaan 4 ° C: ssa (B) 4 tuntia, (C) 12 tuntia, ja (D) 24 tuntia, (E) kiinteitä kudoksia, sekä (F) jäädytetyt kudoksissa havaittiin. Mittakaava on 30 pm.

Kuva 3E esittää, että organisaatio ehjä haiman acini säilytettiin kuluessa tallentamisesta. Kuitenkin intensiteetti fluoresenssin väheni merkittävästi, mahdollisesti johtuen proteiinien denaturointi prosessin aikana kiinnitys ja muutokset sammuttaja pitoisuuksina [29]. Vertailun vuoksi kylmäsäilytetyt haiman kudoksista osoitti vieläkin alhaisempi fluoresenssin kuvassa 3F, koska solun NAD (P) H voi kadota, koska solujen kuolemaan jälkeen jäädyttää ja sulattamisen huoneenlämpötilaan aikana kuvantamisen.

yllä olevat tulokset osoittavat, että morfologiaa haiman kudoksia voidaan tarkimmin rajaamalla kuvantamisen tuore kudoksiin ilman ylimääräistä käsittelyä. Sen vuoksi tuoreita haiman kudoksista inkuboitiin PBS: ssä käytettiin myöhemmässä analyysissa. Olemme myös tutkineet optimaalisen virityksen aallonpituus epälineaarinen optinen kuvantaminen haiman kudoksista, koska luontaisen fluoresenssin on suhteellisen heikko. Viritysaallonpituus on virittänyt 730-840 nm alueella suorittamaan haimakudoksesta kuvantaminen. Todettiin, että 750 nm: ssä oli optimaalinen aallonpituus mikroskooppisen kuvantamisjärjestelmän käytimme. Laserteho pinnalla näytteiden testattiin saavuttaa kuvia korkealla signaali-kohina-suhde. Kun kyseessä on keskimääräinen teho on noin 15 mW, ei ollut näkyvää valon aiheuttaman vaurion tai fotobleknande hankinnan jälkeen sarja peräkkäisiä aksiaalinen viipaleet.

vertailu normaalista ja syöpä- haiman kudoksista

kemiallinen aiheuttama haimasyöpä kudokset oli kuvattu ja liittyy histologiseen kuvien (Fig. 4). Verrattuna normaaliin haima, suurempia ydin- koko ja merkitty vaihtelua ydin- koko ja muoto voidaan havaita kemiallisessa aiheuttama haimasyöpä kudoksiin, mikä osuu yhteen tyypilliset ominaisuudet syöpäsolujen. Lisäksi tiheys kollageeni kuitujen kasvanut, joka muistuttaa intensiivinen strooman fibroosia ilmenee haiman syöpäpotilailla [30]. Ilmeinen erot morfologinen ulkonäkö normaalin ja kemian aiheuttama haimasyövän kudoksissa osoittaa, että epälineaariset optiset menetelmät osoittavat kyky havaita uudisvaurioiden epänormaali haiman kudoksissa.

(EN) haimasyövän soluja eri koko ja muoto sekä lineaarisia kollageeni kuidut voidaan tunnistaa epälineaarisen optisen kuvan. Punainen värikoodatut rakenne on kollageenia ja vihreän värin fluoresoiva komponentti. Mittakaava on 30 pm. (B) toinen hematoksyliinillä ja eosiinilla kuva ja (C) nämä Masson kolmivärimenetelmä kuva näyttää morfologiaa syöpä haiman kudoksista vastaten (A).

Kasvu ihonalainen haiman tuumoriksenografteja

ihonalainen haiman tuumoriksenografteja korjattu 5 päivää inokulaation jälkeen pääosin aaltoileva kollageenin kuituja ja pieniä soluja, jotka voivat olla leukosyyttejä (Kuva. 5A). Vertailun solut tuumoriksenografteja talteen 10 päivää inokulaation jälkeen osoittavat suurennettu ytimiä, mikä osoittaa, että syöpäsolut alkavat lisääntyä (Fig. 5B). Lisäksi kollageenin kuidut ovat lineaarisia ja järjestetty säteilevä päässä syöpäsoluja, jotka voivat vaikuttaa kasvaimen pervasion pitkin kuituja. Määrät kasvainsolujen lisääntynyt kasvainkudoksessa talteen 20 päivää inokulaation jälkeen (kuvio. 5C), kun se väheni, jotka kerättiin 30 päivää inokulaation jälkeen (kuvio. 5D), mikä tarkoittaa, että on olemassa nekroosia keskellä kasvaimen . Kuten ksenografteissa kehittää, kollageeni kuidut saavat hajanainen, ja epäsäännöllinen, ja tiheys kuitujen väheni, mikä saattaa liittyä halventava ja remontin soluväliaineen aikana kasvun tuumoriksenograftien.

haiman tuumoriksenografteja talteen eri vaiheissa, mukaan lukien (A) 5 päivää, (B) 10 päivää, (C) 20 päivää, ja (D) 30 päivää istutuksen jälkeen, oli kuvattu ja niihin liittyvien tavanomaisten histologia. SHG kuvia (punainen värikoodi), The TPEF kuvat (vihreä väri-koodattu) ja 3-D päällekkäin SHG /TPEF kuvat näkyvät Kolmen ensimmäisen sarakkeen vastaavasti, kun taas hematoksyliinillä ja eosiinilla kuvia ja Masson kolmivärimenetelmä kuvia näkyvät kahdessa viimeisessä sarakkeessa. Kaikki 3-D kuvat ovat 211 um x 211 um x 50 um. Mittakaava on 30 pm.

histologinen kuvat osoittavat, että laajaa kuolion on läsnä tuumoriksenografteja korjattu 5 päivää inokulaation jälkeen, ja useimmat solut ovat neutrofiilit, jotka sisältävät kolme tai neljä ydin- lohkoa (Fig. 5A). Tällä 10 päivää istutuksen jälkeen, useimmat solut ovat kasvainsoluja, ja runsas pitkä lineaarinen kollageeni kuidut ovat läsnä (Fig. 5B). Tällä 20 päivää istutuksen jälkeen, suuri tiheys kasvainsolujen voidaan nähdä ja suhteellisesti alhaisempi pitoisuus kollageenisäikeiden tapahtuu (Fig. 5C). Lopulta 30 päivän kohdalla implantaation jälkeen, hajallaan nekroosia voidaan havaita Keski kasvaimen (Fig. 5D). Olemme havainneet, että tulokset etiketin vapaan TPEF ja SHG kuvantamisen ovat yhdenmukaisia ​​perinteisiä histologinen värjäys menetelmiä.

kvantitatiivinen analyysi ydin- koko osoittaa, että halkaisija solutumien talteen 10 päivää inokulaation jälkeen osuu että korjattu 5 päivää (noin 6 um) ja ne korjataan 20 päivän jälkeen (pääasiassa vaihteli 10 um ja 13 um). Tämä osoittaa, että proporation kasvainsolujen neutrofiilien kasvaa, kun ksenograftit kasvaa (Fig. 6, s 0,001, ANOVA lineaarisen välinen kontrasti koko on 5 päivää, ja näiden jälkeen 20 päivää, n = 5 kussakin ryhmässä). Se paljastaa, että ydin- solujen kokoa voidaan saada käyttämällä epälineaarisia optisen kuvantamisen, mikä on tärkeää havaita syöpäsoluja. Tiheys kollageenisäikeiden on myös laskettu tuumoriksenografteja talteen eri vaiheissa vastaavasti. Voidaan nähdä, että määrä kollageenisäikeiden vähitellen pieneni, kun kasvain kasvaa ja tiheys 5 päivää erosivat huomattavasti sen jälkeen, kun 20 päivää (Fig. 7A). Kvantifiointiin rakenteellisten muutosten kollageenin kuitujen GLCM menetelmää käytettiin tekstuurianalyysiin. Korrelaatio on textural ominaisuus erotettu GLCM ja voidaan käyttää arvioimaan suuntaan tekstuurin. Kuten kuviossa 7B osoittaa, korrelaatio käyrät kasvainkudoksessa sadon 10 päivää, on pienempi kuin talteen 5 päivää, mikä vastaa enemmän epäjärjestykseen kollageenisäikeiden. CORR

50, lasketaan pikselin etäisyyden jossa korrelaatio laski 50% alkuperäisestä arvosta, on huomattavasti suurempi ksenografteissa korjattu päivänä 5 verrattuna korjattua 10 päivää, 20 päivää, ja 30 päivää (kuvio . 7B; p = 0,035, ANOVA lineaarinen kontrastia; n = 5 kussakin ryhmässä). Yllä määrälliset tulokset ovat sopusoinnussa ulkoasun epälineaarisia optisia kuvia.

ydin- koko 5 päivää on huomattavasti alhaisempi kuin 20 päivää ja 30 päivää. *, P 0,001, ANOVA lineaarinen kontrastia. Näytteen koko on 5 kussakin ryhmässä (5 hiirtä). +, Harha ruutuun-ja-hiuksenhienosti kaavio;

baareja

, kokonaislaajuus datan.

(A) Kollageeni tiheys pienenee tuumoriksenograftien kasvaa. Tiheys kasvaimia 5 päivää on merkittävästi korkeampi verrattuna niihin, jotka on 20 päivää (*, p = 0,033, ANOVA lineaarinen kontrasti) ja 30 päivää (**, p = 0,005, ANOVA lineaarinen kontrasti). +, Harha ruutuun-ja-hiuksenhienosti kaavio;

baareja

, kokonaislaajuus datan. (B) Organisaation kollageenisyistä muuttuu kasvun aikana ihonalaisen haiman tuumoriksenograftien. Yleinen vertailu korrelaatioarvot osoittaa suurin ero tuumoriksenografteja kerättiin 5 päivää, ja ne, korjattu jälkeen 10 päivää, kuten on esitetty Corr

50-arvo, etäisyys, jossa korrelaatio ylitti 50% alkuperäisestä korrelaatio. *, P = 0,035, ANOVA lineaarinen kontrastia. Näytteen koko on 5 kussakin ryhmässä (5 hiirtä). Virhe palkit ovat Keskihajonnan yläpuolella ja alapuolella kunkin datapisteen.

neutrofiilien ja nekroosia havaittiin ihonalaisen tuumoriksenografteja talteen 5 päivää johtuvat mahdollisesti tulehdusreaktiota aikana kasvaimen isäntä reaktion, koska on raportoitu, että jäljellä immuunijärjestelmän isäntä voi osallistua kasvaimen taantumiseen alkuvaiheessa inokulaation jälkeen tuumoriksenograftien [31].