Krooninen sairaus

tiivistelmä

Molecular kohdistettuja hoitomuotoja ovat olleet painopiste viime kliinisissä tutkimuksissa hoitoon potilaat, joilla on uusiutuva epiteelin munasarjasyöpä (EOC). Suurin osa ei ole menestynyt yhtä monoterapioita parantaa eloonjäämistä näistä potilaista. Huono hyötyosuus puute ennakoivaa biomarkkereiden, ja läsnäolo useita eloonjäämisreittejä voivat kaikki vähentää menestyksen kohteena olevaan tekijään. Dasatinibi on tyrosiinikinaasi estäjä Src-perheen kinaasien (SFK) ja prekliinisissä tutkimuksissa osoitettu olevan merkittävää aktiivisuutta EOC. Kuitenkin, kun arvioitu kliinisen vaiheen 2 potilailla, joilla on uusiutuva tai jatkuva EOC, todettiin olevan minimaalinen aktiivisuutta. Oletimme, että synteettinen kuolleisuutta näytöt suoritetaan käyttämällä vakuuttavasti suunniteltu siRNA-kirjasto tunnistaa toisen päällä molekyylikohteista jotka voivat toimia synergisesti SFK esto ja parantaa dasatinibille tehoa. Käyttämällä järjestelmällistä lähestymistapaa, suoritimme ensisijainen siRNA seulonnan avulla kirjaston keskittynyt 638 vastaavien geenien verkosto, jonka EGFR, HER2 ja SFK-rakennustelineet proteiineja BCAR1, NEDD9, ja EFS seuloa EOC-soluilla yhdessä dasatinibille. Me seurattu validointitutkimuksissa lukien dekonvoluutiota seulonta, kvantitatiivinen PCR vahvistaa tehokasta geenien, korrelaatio geenien ilmentymisen dasatinibihoidon herkkyys, ja arviointi kliinistä merkitystä osumia käyttäen TCGA munasarjasyöpä tiedot. Hienostunut luettelo viidestä ehdokkaasta (

CSNK2A1

,

DAG1

,

Grb2

,

PRKCE

, ja

VAV1

) tunnistettiin kuten osoittaa suurimmat mahdollisuudet parantaa herkkyyttä dasatinibin EOC. Näiden,

CSNK2A1

, joka koodaa katalyyttistä alfa-alayksikkö proteiinikinaasin CK2, valittiin muita arviointi. Synergistinen aktiivisuus kliinisesti merkittävää estäjä CK2, CX-4945, dasatinibihoidon vähentämisessä solujen lisääntymisen ja lisäämällä apoptoosia havaittiin useiden EOC solulinjoissa. Tämä yleinen lähestymistapa parantaa lääkkeen tehoa voidaan soveltaa muihin kohdennettuja aineet, jotka ovat samalla tavalla osoittaneet huono kliinistä.

Citation: Pathak HB, Zhou Y, Sethi G, Hirst J, Schilder RJ, Golemis EA, et al . (2015) synteettinen letaalisuus Screen käyttäminen Kohdennettu siRNA kirjaston tunnistaa Herkistimiä dasatinibille terapian epiteelin munasarjasyöpä. PLoS ONE 10 (12): e0144126. doi: 10,1371 /journal.pone.0144126

Editor: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 16 syyskuu 2015; Hyväksytty: 15 marraskuu 2015; Julkaistu: 04 joulukuu 2015

Copyright: © 2015 Pathak et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: tutkimuksen rahoittivat osittain avustusta National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/) (CA140323) ja Kansas Bioscience Authority (https://www.kansasbioauthority.org/) Eminent Scholar Program AKG. HBP on monitieteinen Naisten Health Research Scholar läpi BIRCWH K12 Program University of Kansas Medical Center sponsoroi avustusta National Institute of Child Health and Human Development (https://www.nichd.nih.gov) (K12 HD052027 ). JH on vastaanottaja Madison Lila Self Graduate Fellowship (https://selfgraduate.ku.edu/). EAG: n työtä tukee avustusta National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/) (CA181287). Tekijät myöntävät tukea National Cancer Institute (https://www.cancer.gov/) Cancer Center Support avustuksia P30 CA168524 (University of Kansas Cancer Center) ja P30 CA006927 (Fox Chase Cancer Center). AKG on Chancellors Distinguished Chair in Biomedical Sciences Endaumentin professori. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjojen syöpä on toiseksi yleisin gynekologinen syöpä vaivaava naisilla Yhdysvalloissa [1]. Kanssa noin 14.000 kuolemaa ja 22000 uutta tapausta arvioidaan vuosittain, munasarjasyöpä on korkein kuolleisuus-uuteen tapauksessa suhde kaikkien gynekologiset syöpäsairauksia [1]. On olemassa kolme päätyyppiä munasarjakasvaimia luokiteltu perustuen niiden kudoksen alkuperän (pintaepiteelissä, strooman endokriiniset solut, ja itusolujen), jossa on epiteelin karsinoomien osuus 90% munasarjojen maligniteettien [2]. Näitä kasvaimia ovat yleensä edelleen jakaa perustuu niiden solun morfologiassa, neljä yleisintä alatyyppiä on vakavasta, endomet-, kirkas solu, ja mucinous, jokaisen alatyypin on erilaiset synnyssä, Chemo herkkyydet, ja ennusteet [2, 3]. Tällä hetkellä tavanomaista hoitoa naisten diagnosoitu pitkälle tauti on optimaalinen debulking leikkaus seurasi taxane- ja platinapohjaisen kemoterapian (yleensä paklitakseliin tai doketakseliin yhdistettynä karboplatiinin) [2]. Huolimatta suotuisa hoitovaste tähän ensimmäiseen hoitoon, ~ 75% potilaista lopulta uudestaan ​​ilmenee kasvain, joka lopulta tulee hoito-resistenttejä. Hoitovaste on usein harvemmin potilailla, joilla on uusiutuva sairaus ja lyhytkestoisempi verrattuna hoidon aloitukseen. Vaikka parantunut viime vuosikymmenen aikana, yleinen 5 vuoden eloonjäämisaste munasarjasyöpäpotilaalle on edelleen vain 44% [1]. Koska muita molekyyli- luonnehdintoja sairauden alatyyppejä ja ymmärtämään paremmin niiden kliinisen biologian ja ennakoivan biomarkkereiden tulevat saataville, henkilökohtaisen lääketieteen voidaan antaa parantaa hoitotuloksia sisällyttämällä kohdennettuja hoitomuotojen [3-6].

Molecular kohdennetut hoidot ovat tällä hetkellä merkittävä painopiste kliinisiä kokeita potilailla, joilla on uusiutuva munasarjasyöpä [7-11]. Src-perheen kinaasien (SFKs), näkyvin jäsen yhdeksästä jäsenestä perheen ollessa SRC kinaasia, jotka solukalvoissa kuin reseptorityrosiinikinaaseilla usein yli-ilmentynyt ja aktivoida erilaisia ​​ihmisen syövissä ja solulinjoissa [12], joka sisältää valtaosa myöhäisvaiheen vakavien, mucinous, ja endomet- epiteelin munasarjojen kasvaimia ja EOC solulinjat [13-16]. Ne ovat avainasemassa säätelyssä signaalinvälityksessä solun pinnan reseptoreihin [17-19] ja siksi moduloivat monissa solun toimintoja, kuten kasvaimen etenemistä ja etäpesäkkeiden erilaisissa ihmisen kasvaimia ja ne ovat saaneet uutta kiinnostusta mahdollisina kohteina hoitoa [20-23 ]. Dasatinibi on suun kautta ATP-kilpailukykyinen estäjä on SFKs ja BCR-ABL-fuusio- proteiinin sekä muiden kasvaimeen asiaan kinaasien [24, 25]. Dasatinibi on yksi kolmesta hoitokeinot potilaille äskettäin diagnosoitu Philadelphia-kromosomi-positiivinen krooninen myelooinen leukemia [26]. Se jatkaa tutkittava antituumorigeenistä aktiivisuutta erilaisia ​​hematologisen ja kiinteät kasvaimet (https://www.clinicaltrials.gov/). Olemme äskettäin raportoitu tulokset Gynecologic Oncology Group (GOG) tukema kliinisen vaiheen 2, GOG170M, arvioidaan dasatinibi hoitoon potilailla, joilla on uusiutuva tai jatkuva EOC tai ensisijainen vatsakalvon syöpä [27]. Dasatinibi oli minimaaliset aktiivisuutta ainoana lääkkeenä näillä potilailla [27], samanlainen tulokset monet aikaisemmat GOG-170-sarja Vaihe 2 kliinisissä kokeissa muiden kohdennettujen tekijöille monoterapioita ([4], www.GOG.org).

Valtaosassa näistä yhden aineen tutkimuksissa potilaiden valinta perustuu tiettyyn biomarkkereiden ei tehty, jotka ovat voineet parantaa havaitun hoitovaste. Lisäksi dysregulaatio ja integrointi useita eloonjäämisreittejä ovarioiden [4] tekemään yhden aineen hoitojen altis periksi opinnäytetöitä aktivoitu verkkoihin. Siksi nykyisessä tutkimuksessa tavoitteenamme oli kokeellisesti tunnistaa ja vahvistaa toisen päällä molekyylitasolla (t), joka voi auttaa herkistää munasarjasyöpäsoluja dasatinibille ja siten parantaa sen tehokkuutta. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi, me aluksi suoritetaan Sirna (siRNA) -välitteisen geenien avulla kirjaston kohdistaminen proteiini verkkojen merkitystä munasarjasyövän ja SFK toiminto. Tämä kirjasto keskittyi reseptorityrosiinikinaasit (RTK: t), mukaan lukien epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) ja HER2; niiden effektorit SHC1 ja SHC3; ja kolme CAS-perheen proteiinit, NEDD9, BCAR1, ja EFS, jotka suoraan sitovat ja vaikuttaa SFK ja BCR-ABL, ja joissakin tapauksissa on osoitettu vaikuttavan dasatinib vastaus [28-31]. Käytimme tätä kirjastoa tunnistamiseen synteettisesti tappavia yhdistelmiä, jotka parantavat herkkyyttä EOC solujen dasatinibille. Sitten systemaattisesti kaventuneet meidän osuma listan ensisijaisen näytön ja tunnistettu useita ehdokas dasatinibi herkistävät aineet (

CSNK2A1

,

DAG1

,

Grb2

,

PRKCE

, ja

VAV1)

. Näistä

CSNK2A1

syntyy yksi niistä näkyvämpi herkistymistä vaikutuksia siRNA näytöt ja sen ekspressiotasoja havaittiin ennustavan dasatinibin herkkyys paneelia EOC solulinjoissa. Lisäksi

CSNK2A1

yliekspressoitui lähes 2-kertaiseksi potilailla, joilla vakavasta cystadenocarcinomas. Siksi

CSNK2A1

katsottiin lupaavin kohde joukossa viisi osumia eston lisäämiseksi dasatinibille aktiivisuutta.

In vitro

lääkeyhdistelmä tutkimukset suoritettiin käyttäen Dasatinibin CX4945 (silmitasertib), ensimmäinen ja ainoa kliinisesti merkityksellisiä CK2 estäjä [32], osoittivat merkittäviä synergia poikki paneelia EOC solulinjojen vähentämään leviämisen ja lisäämällä apoptoosin. Kohdennettua, järjestelmällistä lähestymistapaa, että olemme ottaneet tässä tutkimuksessa tunnistaa toisen päällä herkistävät aineet parantamiseksi dasatinib tehoa voidaan soveltaa myös muihin kohdennettuja aineet, jotka ovat samalla tavalla osoittaneet huono kliinistä.

Tulokset

tunnistaminen dasatinibin herkistävä osumia

ensisijainen seulonta EOC solulinjan suoritettiin käyttäen räätälöityä, siRNA kirjasto keskitytty kohdistamaan signalointia proteiini verkko keskittyy EGFR, HER2, SHC1, SHC3, NEDD9, BCAR1 , ja EFS. Tämä tapa kirjasto koostui 1276 siRNA-dupleksit kohdistaminen 638 ihmisen geenit (pooli kaksi siRNA: iden per geeni per kuoppa). Suunnittelu ja kehittämistä tämän verkko-keskittynyt siRNA seulonta kirjastossa aiemmin kuvanneet Astsaturov

et al

. [33]. Valitsimme tämän kirjastoon, koska se kohdennettua monia signalointi proteiineja, jotka toimivat ylävirtaan, alavirtaan tai rinnakkain SFK, kun otetaan huomioon sen vuorovaikutus RTK [34, 35] ja sen näkyvä rooli helpottaa signaalinvälityksessä RTK [17-19], antamalla meille eniten merkitystä ja todennäköisimmin kohdistaa yhdistettynä eston SFK.

Käytimme tätä kohdennettua kirjaston seulontaan EOC solulinjan, A1847, joka on peräisin potilaasta, jolla käsittelemättömän, erilaistumaton munasarjakarsinooma [ ,,,0],36, 37], niiden geenien tunnistamiseksi, jotka tarjoavat resistenssin SKF inhibition kautta dasatinibihoidon hoitoon. Tämä solulinja valittiin, koska se tarjosi johdonmukainen, toistettavissa transfektio data kovassa seulontaan olosuhteissa siRNA-pohjainen näyttö ihmisen druggable genomi [38] ja koska se oli herkkä dasatinibille suhteessa muihin EOC solulinjoja (Pathak ja Godwin , julkaisemattomat tulokset). Oletimme, että tunnistaminen toisen sivuston tavoitteita, joita edelleen herkistävät herkkää solulinjaa varmasti antaa jonkin verran herkistyminen vastustuskykyisempiä solulinjoja. Kuvio 1 on yleinen kaavamainen yleisen kokeellisen suunnittelun (katso materiaalit ja menetelmät yksityiskohdat osasta seulonnan). Seuraavat tilastollinen analyysi normalisoidut solun elinkelpoisuuden saadut tiedot seulontaan, että A1847-soluja, kun läsnä on siRNA + dasatinibin tai siRNA + dimetyylisulfoksidia (DMSO, ajoneuvon, joita käytetään liuottamaan dasatinibihoidon), herkistymistä-indeksi (SI) laskettiin kunkin siRNA allas. Kaikkiaan 84 geenien SI-arvo ≤ 0,85 ja väärä löytö määrä (FDR) 10% muodostaen ~ 13% geeneistä kohteena tätä kirjastoa valittiin sisällytettäväksi seuraavalla kierroksella seulonta (S1 taulukko, ensiölajittimesta).

A-F. Yleinen kaavio kokeellisen työnkulun ensisijaisen ja toissijaisen siRNA seulontaa ja myöhempää validointi ja hienosäätö tehtyjä kokeita tunnistaa toisen päällä sensitizers dasatinibilla. Tiedot kunkin koesarja annetaan myöhemmin kuvissa ja täydentävä kuvat ja taulukot koko Results osiossa.

poistaminen vääriä positiivisia osumia

Jotta voitaisiin poistaa mahdolliset vääriä positiivisia hittejä aloitusnäyttö, jotka voivat johtua off-tavoite vaikutukset perin käytetty siRNA: t, me koottu uusi kirjasto, joka sisältää neljä yksittäistä siRNA (1 siRNA /kuoppa) kohdistaminen kukin 84 geenien tunnistettu ensisijainen näyttö. Tämän uuden kirjaston de-mutkikas siRNA: t, teimme toisiolajitin kolmena kappaleena ja laskettu SI arvo kullekin siRNA kuten tehtiin ensisijaisen näytön. S1 Kuvio esittää korrelaatio 2 3 näytöt sekä ajoneuvon ja dasatinibin hoitoja. Mietimme geenejä dasatinibi herkistävä vain, jos ne tuottivat keskimäärin SI-arvo ≤ 0,85

ainakin

kaksi neljästä yksittäisten siRNA: t kohdistettu tietyn geenin kaikkien kolmen biologisen rinnakkaisten kokeiden (S1 taulukko, toista näyttöä). Näiden pohjalta tiukempia kriteerejä, poistimme 44 mahdollisia vääriä positiivisia osumia yksilöity aloitusnäyttö.

Lopun 40 osumaa, me yhdistettiin kaksi parasta siRNA: t kohdistaminen kunkin geenin (

i

.

e

. ne, joilla on kaksi alinta SI arvot tunnistaa toisen näytöt) ja transfektoitiin A1847 soluissa tämän optimaalisen altaan kaksi tehokkainta siRNA (2 siRNA /kuoppa /geeni) tai negatiivinen kontrolli siRNA , GL2, kohdistaminen tulikärpäsen lusiferaasi-geeni. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen suoritimme kvantitatiivinen RT-PCR määrittää mRNA-tasot soluissa kohteena geeni-spesifisten siRNA allasta suhteessa tasojen soluissa kohteena negatiivisen kontrollin siRNA. Me katsota paikan tavoite vain ne siRNA-altaat, jotka vähennetään geeniekspressiota ainakin 70%. Näiden kriteerien perusteella, että qRT-PCR-tuloksiin, me kaventunut osumien luettelo dasatinibia herkistävä osumia ja 31 geenejä (S2 taulukko).

erityisyys dasatinibia herkistävä osumia

Koska dasatinibin estää muita tyrosiini- kinaasien lisäksi SFKs, kuten BCR-ABL, c-KIT, ja PDGFR-[24], seuraavan kerran määritetty taso spesifisyyden 31 osumien herkistävät EOC solujen SKF inhibition. Käytimme altaan kaksi parasta siRNA: t kohdistaminen kunkin geenin (tunnistettu de-konvoluutio tutkimukset) ja seulotaan 31 osumaa yhdessä dasatinibin tai yhdessä toisen tyrosiinikinaasiestäjä imatinibi, jotka pääasiassa suunnattu BCR-ABL, PDGFR, ja ckit, rajoitettu aktiivisuus vastaan ​​SFKs [39, 40]. siRNA-välitteinen geenien yhdessä imatinibin johti vain 2 31 osumaa osoittaa herkistyminen vaikutus ≤ 0,85, kun taas kaikki 31 siRNA altaat syntyy SI arvot ≤ 0,85, kun seulotaan yhdessä dasatinibia (S3 taulukko). Kaksi osumaa tunnistettiin imatinibiryhmässä yhdistelmä näyttö (

GAB1

ja

JUP

) katsottiin olevan yhteinen herkistimiä dasatinibihoidon ja sen tähden poistetaan lisätutkimuksia, jalostus dasatinibiryhmän erityisiä tappolista edelleen 29 osumaa.

korrelointi geenien ilmentymisen dasatinibille herkkyyden

jotta määritellä tarkemmin toisen päällä herkistimiä dasatinibille, pohjapinta geeni-ilmentymisen varten 29 dasatinibia herkistävä osumia mitattiin seitsemän EOC solulinjoja (A1847, A2780, C30, CP70, OVCAR5, SKOV3, ja UPN275) käyttäen 96☓96 dynaaminen taulukko on Biomark mikrofluidistiikkaan kvantitatiivinen PCR (qPCR) alustan (Fluidigm) (kuvio 2A). Nämä EOC solulinjat valittiin, koska ne näkyvät tasoerot dasatinibin herkkyys aiemmissa julkaisematon työ Pathak ja Godwin. Näin ollen, olemme saaneet tarkemman dasatinibin herkkyyden näissä solulinjoissa mittaamalla annos-vaste kunkin ja laskemalla sen elinkelpoisuuden, jonka dasatinibille pitoisuutena 1 uM (kuvio 2B). Suuruus korrelaatio (Spearman kerroin r) ja tilastollinen merkitsevyys (p-arvo) laskettiin jokaiselle geenin tunnistamiseksi mahdollisia geenejä, joiden ekspressiotasoja korreloi dasatinib herkkyys (S3 taulukko). Neljä tällaisia ​​geenejä (

BCAR3

,

CSNK2A1

,

PRKCA

, ja

PRKCE

) yksilöitiin ennakoivaa dasatinibin herkkyys, tilastollisesti merkitsevästi korrelaatio ilmaisu ja huumeiden herkkyys (p 0,05, S3 taulukko ja kuvio 2C). Näistä

CSNK2A1

ja

PRKCE

ne ovat käänteisesti verrannollisia dasatinib herkkyys (

i

.

e

., Alhainen näiden kahden geenin johtavat suurempi herkkyys dasatinibille) ja siksi ovat mahdollisia tavoitepisteistä (

e

.

g

., lääkkeet, jotka alentavat tasoa tai aktiivisuutta kasvainsoluissa voisi herkistää näiden solujen dasatinibille).

. Pohjapinta taso geenin ilmentymisen 29 dasatinibia herkistävä geenien seitsemässä EOC solulinjoissa mitattiin käyttämällä kvantitatiivista PCR suoritettiin 96☓96 dynaaminen sijaintipaikat Fluidigm Biomark mikrofluidistiikkaan alustalla. Näkyy on edustava lämpöä kartta dynaaminen taulukko. Delta C

t-arvot laskettiin jokaiselle geenin kussakin solulinjassa (katso materiaalit ja menetelmät lisätietoja). B. Tiedot annosvasteen dasatinibille seitsemän EOC solulinjoja ja solujen elinkelpoisuuden 1 uM dasatinibia laskettiin jokaiselle solulinjan prosenttiosuutena ajoneuvon käsitellyistä soluista käyttämällä GraphPad Prism. Näkyy on keskimääräinen ± keskivirhettä datapisteen. C. Delta C

t ja dasatinibi arkaluonteisuuden data (eli elinkelpoisuuden 1 uM lääkeaineen pitoisuus) tehtiin Spearman Korrelaatio analyysin avulla GraphPad Prism. Suuruus korrelaatio (Spearman r arvo) näkyy neljän geenien havaittiin tilastollisesti merkitsevä korrelaatio (p 0,05). Jokainen piste edustaa EOC solulinjan väri yhteensovitus koodi näkyy paneelissa 2B. Linjan kautta datapisteet on suuntaa antava. S3 Taulukossa luetellaan r ja p-arvot muiden geenien arvioitu mutta joissa ei ole ilmennyt merkitystä.

kliinistä merkitystä dasatinibin herkistävien

Geenit, joiden proteiini tuotteita poikkeavasti tuotetaan liikaa munasarjasyöpää sairastavilla potilailla voidaan mahdollisesti tavoitellut estäjien vähentää aktiivisuutta. Nämä proteiinit katsotaan kliinisesti merkittäviä terapeuttisia kohteita. Siksi olemme analysoineet geenien ilmentyminen saadut tiedot Cancer Genome Atlas (TCGA) tiedot portaali munasarjasyöpä [41], että 29 dasatinibia erityisiä herkistävät aineet luetellaan S3 taulukossa. Geenien ilmentyminen tietoja 518 vakavasta cystadenocarcinomas, suuret histologiset alatyypit EOC, ja munanjohtimen näytteitä 8 terveillä henkilöillä saatiin tietokannasta. Munanjohtimeen epiteeli on liitetty lähteenä alkuperän korkealaatuista serous munasarjasyöpä [42-45] ja näin ollen asianmukaista vertailuryhmä. Niistä 29 geeniä, jotka kartoitettiin, keskimäärin nousu geeniekspressiotasot yli 1,5-kertaisesti kasvain näytteissä suhteessa tavanomaiseen näytteissä havaittiin viisi geeniä (

CSNK2A1

,

DAG1

Grb2

,

VAV1

, ja

YES1;

kuvio 3 ja S4 taulukko). Mielenkiintoisesti kaksi näistä geeneistä (

CSNK2A1

ja

DAG1

) olivat myös viiden parhaan joukkoon osumia suhteessa tasoon herkistymistä dasatinibille havaittu, kun geenit vaiennetaan (S3 taulukko).

Agilent geenien ilmentyminen tietoja TCGA 518 serous cystadenocarcinomas ja 8 munanjohtimen näytettä peräisin terveistä henkilöistä tiedusteltiin 29 dasatinibia herkistävä geenejä. Kuusi Agilent koettimia, jotka osoittivat ≥ 1,5-kertainen keskimääräisen geenien ilmentyminen vastaavien geenien kasvainnäytteet (harmaa laatikko) kontrolleihin verrattuna (valkoiset laatikot) on esitetty. Viikset Kunkin rasiakuvaaja edustaa lauseke arvot 5

th ja 95

th persentiilit. P-arvot laskettiin käyttäen parittoman kaksisuuntainen t-testi, jossa käytetään GraphPad Prism. S4 Taulukossa luetellaan keskimääräiset ilmaus arvot Agilent koestusjohtimia kasvain ja normaali näytteet kaikista 29 geenit.

In vitro

lääkeyhdistelmä dasatinibin ja CX-4945

Koska sen yli-ilmentyminen useimmissa munasarjojen kasvain näytteet, alhaisen SI arvo näytöstä, ja sen katalyyttinen luonne,

CSNK2A1

on ylhäältä ehdokas mahdollisia lääkkeiden seulontaan /kehittämiseen ja prekliinisissä tutkimuksissa yhdistettynä dasatinibille.

CSNK2A1

geeni koodaa katalyyttistä alfa alayksikköä proteiinikinaasi CK2, seriini-treoniinikinaasi, ja CK2 estäjä, CX-4945 (silmitasertib) [46-48], on äskettäin valmistunut vaiheen 1 kliiniset oikeudenkäyntiä mahdollisena syöpälääkettä [32]. Se on ainoa ATP-kilpaileva estäjä vastaan ​​CK2 on tämä asema. Siksi valitsimme CX-4945 tutkimaan vaikutuksia solujen kasvuun paneelissa vakiintuneiden EOC solulinjojen yhdistettynä dasatinibille. Soluja käsiteltiin kunkin yksittäisen aineen tai näiden kahden yhdistelmä lääkkeiden tietyssä moolisuhteessa yli konsentraatioalueella. Kuvio 4A esittää annos-vaste käyrät CX-4945 ainoana lääkkeenä (musta viiva) ja yhdistettynä dasatinibille klo 20: 1 moolisuhde (harmaa katkoviiva). Annos-vaste-käyriä kahdelle muulle moolisuhteissa arvioidaan (8: 1 ja 3: 1) on esitetty S2 kuviossa. Yhdistelmä Index (CI) arvot laskettiin kunkin kolmen suhteet ja on esitetty kuviossa 4B. Drug yhdistelmiä, jotka johtavat Chou-Talalay CI-arvot olivat alle 1 pidetään synergistisiä taas yhdistelmiä, jotka johtavat CI arvo on suurempi kuin 1, pidetään antagonistisia [49, 50]. Nämä tiedot viittaavat siihen, että lääkkeet toimivat synergistisesti proliferaation inhiboimiseksi poikki suurimman osan EOC solulinjoissa.

. Chou-Talalay menetelmä [78] käytettiin suorittamaan lääkeyhdistelmä tutkimuksia dasatinibin ja CX-4945. Pisteet edustavat keskiarvoa elinkelpoisuuden ± keskivirhettä seuraavien 72 h huumehoidon ilmoitettuina pitoisuuksina CX-4945 (•) ja CX-4945 + dasatinibi (◆; jatkuva moolisuhteessa 20: 1 CX-4945: dasatinibin ) eri EOC solulinjoista prosentteina ajoneuvon käsiteltyjen solujen. Käyrä sopiva viiva luotiin käyttäen ei-lineaarista regressioanalyysiä GraphPad Prism. Tiedot muiden moolisuhteet jotka arvioitiin on esitetty S2 kuvassa. B. annosvaste tietoja käytettiin laskettaessa Combination Index (CI) arvot kullekin solulinjan eri moolisuhteissa käyttäen CalcuSyn- ohjelmistojen [79]. CI-arvot olivat alle 1 viittaa siihen, että lääkkeet toimivat synergistisesti. Näkyy on keskimääräinen laskettu CI arvo ± standardivirhe keskiarvosta.

vieressä arvioitiin vaikutuksia lääkeyhdistelmän solusyklin etenemiseen ja solukuolemaan käyttämällä propidiumjodidivärjäys (S3 kuvassa). Emme havainneet mitään merkittäviä muutoksia solusyklin vaihejakauman joko yksittäisen aineiden käytettyinä annoksina. Kuitenkin yhdistelmähoito prosenttiosuus kasvoi sub-G1-soluja useimmissa solulinjoissa, mikä viittaa siihen, että läsnä solujen apoptoosin (kuvio 5 ja S3 kuviossa). Siksi suoritetaan suora mittaus apoptoosin mittaamalla anneksiini V ja lohkaisu kaspaasi-3 ja -7 (kuvio 5). Molemmat tutkimukset osoittivat kohonneet apoptoosin yhdistelmän käsitellyissä soluissa suhteessa muihin hoitoihin. Monissa tapauksissa, kasvu sub-G1 ja apoptoottisten solujen populaation seuraavan yhdistelmän hoito oli suurempi kuin lisäaine osoittaa arvot suurempia kuin laskettu käyttäen Bliss riippumattomuuden malli [51].

Cell cycle ja apoptoosin tiedot kvantifioitiin varten osoitettuun taitettavan muutoksia suhteessa ajoneuvon käsiteltyjä soluja ja esitetään bar kaavioita keskimääräinen kertamuutosta ± keskivirhettä. Kaikissa kolmessa määrityksissä, yksi (das, 0,5 uM; CX-4945, 10 uM), ja yhdistelmä lääkehoidot (das, 0,5 uM; CX4945, 10 uM) oli 72 tuntia. P-arvot laskettiin käyttäen t-testiä vertaamalla yhdistelmähoito ryhmä kunkin yksittäisen aineen hoitoryhmässä. Katkoviiva osoittaa teoreettista arvoa, jos lääkkeet vaikuttavat additiivisesti laskettu käyttämällä Bliss riippumattomuuden malli (Bliss additiivisuuteen arvo = FC

Das + (FC

CX-4945 * (100-FC

Das)) /100 jossa FC on fold-muutos [51]. Havaitut arvot suurempia kuin Bliss additiivisuuteen arvo osoittaa synergiaa. Katso Materiaalit ja menetelmät ylimääräisiä määrityksen yksityiskohtia.

keskustelu

Dasatinibi on hyväksytty terapeuttinen hoitoon useita erilaisia ​​leukemia ja sitä käytetään kaikkialla maailmassa potilailla sekä äskettäin diagnosoitu ja aiemmin hoidettu näihin sairauksiin [26, 52-55]. lisäksi tutkitaan alkuvaiheen kliinisten kokeiden muissa elimissä ( https://www.clinicaltrials.gov/, [56]). Vaikka, kuten olemme aiemmin raportoitu, se osoitti vähän toimia ainoana lääkkeenä aiemmin hoidetuilla potilailla, joilla on uusiutuva EOC [27], se on kuitenkin voimakas estäjä SRC perheen ja BCR-ABL tyrosiinikinaaseista, joka on hyvin siedetty potilailla ja joille meidän tutkimukset antavat prekliinisissä perusteet arvioida yhdessä muiden kohdennettujen aineita. Lisäksi esto SFKs on ehdotettu mekanismi voimistaa kasvaimen vastainen aktiivisuus paklitakselin [57], lääkkeen käytetään yleisesti etulinjan hoito potilailla, joilla on EOC. Tunnistaminen tapoja parantaa dasatinib tehoavan EOC olisi merkittävä ja välitön kliinistä vaikutusta.

Tavoitteeseen edetään olemme ottaneet järjestelmällinen, järkevä lähestymistapa määriteltäessä toisen päällä molekyylikohteista joka herkistää EOC soluja dasatinibille. Olemme tunnistaneet viisi geeniä (

CSNK2A1

,

DAG1

,

Grb2

,

PRKCE

ja

VAV1

) ehdokkaaksi toisen site herkistäjät dasatinibille ja neljästä geenistä (

BCAR3

,

CSNK2A1

,

PRKCA

, ja

PRKCE

) ennustajina dasatinibin herkkyys. Vaikka

YES1

tunnistettiin mahdollisen toisen päällä herkistävä (kuvio 3 ja S4 taulukko), emme pitäneet sitä kannattava vaihtoehto yhdistettynä dasatinibille. Tämä johtuu siitä,

YES1

koodit YES, jäsen SFK suurella rakenteellisten ja toiminnallisten homologiaa muiden perheenjäsenten [58, 59]. Lisäksi Dasatinibi estää YES samalla selektiivisyys kuin muut SFK jäseninä [24]. Siksi emme pidä

YES1

toisena päällä molekyylikohteena koska se näyttää dasatinib suoraan estää YES1 jo. Lopuista ehdokkaita,

CSNK2A1

on alkuun ehdokas yhdistelmähoitoa tulosten pohjalta esitetään tässä tutkimuksessa. Sen tehtävä biologian solun ja munasarjasyöpä sekä sen vuorovaikutus SFK jäsenten käsitellään lyhyesti alla. Samanlainen keskustelu on säädetty jäljellä hitit tukevat tiedot.

CSNK2A1

koodit katalyyttiseen alfa alayksikköä proteiinikinaasin CK2. Tämä proteiini on läsnä, konstitutiivisesti aktiivinen seriini /treoniini-kinaasi olennaisia ​​rooleja solujen elinkelpoisuutta ja jako ja tukahduttaminen apoptoosin [60-62]. CK2 on siveetön kinaasi, jolla on yli 300 mahdollisten substraattien [63] ja kaksoisrooli sekä solujen lisääntymisen ja kuolema tekee, joka on liitetty moniin sairauksiin [61]. CK2 proteiini tasot ovat koholla kaikista syövistä, jotka on tutkittu [62, 64]. TCGA tiedot munasarjasyövän osoittaa, että katalyyttinen alfa alayksikköä CK2 yliekspressoituu enemmistö munasarjakasvaimia (kuvio 3) ja MEK-MAPK-CK2 reitin on liitetty fenotyypin muutosten on soluviljelymalli edustavat asteittain kehittämisessä munasarjasyöpä [65]. CK2 on tunnistettu lupaava terapeuttinen kohde syövän hoidossa [62] ja CX-4945, kliinisessä vaiheessa CK2 estäjä, joka on arvioitu vaiheessa 1 tutkimuksissa osoitettiin synergoida gemsitabiinin ja platinapohjaisen kemoterapia-

in vitro

käyttäen munasarjasyövän solulinjoissa ja

in vivo

hiirellä ksenograftimallia munasarjasyöpä [51]. CK2 suhdetta SFK jäsenten on arvoituksellinen tutkimusten kanssa osoittavat, että CK2 voivat alas-säädellä toimintaa vähintään kolme SFK jäsentä (SRC, FYN, ja YES) kautta suoraan fosforylaatio niiden treoniiniryhmä [66, 67] kun taas toinen tutkimus osoittaa, että tyrosiinifosforylaatiota CK2 SFK jäsenten kasvattaa CK2 katalyyttinen aktiivisuus [68]. Miten nämä kaksi kinaasien vuorovaikutuksessa keskenään ja onko tämä on suora tai molekyyli saattajia kuten CDC37 [69] tai muut signaalinvälitysreittien ja miten niiden toiminta moduloitu ei ole täysin selvä tällä hetkellä. Yksityiskohtaiset mekanistinen tutkimuksia tarvitaan tarjota perusteellisemman kuvan ja auttaa tuottamaan perustelut miten synergiaa näiden kahden kinaasien saattaa esiintyä. Kuitenkin ylimääräinen prekliinisen kehityksen avulla Dasatinibin CX-4945 tai muiden asiaan estäjien kohdistaminen SFK ja CK2 hoitoon epiteelin munasarjasyövän ovat perusteltuja.

Koska aikaa ja rahaa sijoittaneet ja arvokkain resursseja kaikkea potilaat, tulee kehittää turvallisia, erittäin tehokkaita kohdennettuja lääkkeitä kuten dasatinibi ja muut vastaavat molekyylirakennetta suunnattu aineita, on välttämätöntä, että kaikki mahdolliset tavat parantaa näitä nykyisiä lääkkeitä voidaan arvioida. Tämä sisältää tunnistaminen rationaalinen lääkkeen yhdistelmiä, muotoiltuna vaihtoehtoiset reitit lääkeannostelun ja repurposing muihin sairauksiin, johon lääkettä ei ollut alun perin hyväksytty. Lopuksi tunnistaminen ennustava biomarkkerit vasteen on välttämätöntä kohdennettuja hoitomuotojen, jotta suurempaa tarkkuutta potilaiden valinnassa siten, että todellinen vaste mitataan tietyn lääkkeen ilman mutkistaa osallistuneiden potilaiden, jotka eivät reagoi, koska he eivät olleet sopivia ehdokkaita hyötyä tietylle lääkkeelle. Tässä tutkimuksessa olemme ottaneet keskitetympi lähestymistapa tunnistaa useita ehdokkaita yhdistelmähoitoa dasatinibihoidon, strategia, jota voidaan soveltaa muihin kohdennettuja aineet, jotka ovat samalla tavalla osoittaneet huono kliinistä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

epiteelikasvaimet munasarjasyövän solulinjoissa tässä tutkimuksessa käytetyt on aikaisemmin vahvistettu tai johdettu meille alla protokolla hyväksymä Fox Chase Cancer Center Institutional Review Board ja kirjallisen tietoisen suostumuksen (C30 ja CP70 alkaen vanhempien A2780 soluissa [70]; UPN275 [38]). [33].