Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

tuumorisoluja

in vivo

kohtaavat monentyyppisiä mikroympäristöihin sekä paikalle primaarikasvaimen ja paikoissa kaukaisten etäpesäkkeitä. Ymmärtäminen eri mekaanisia ominaisuuksia näiden mikroympäristöihin vaikuttavat biologia syöpäsoluja aikana taudin etenemistä on kriittinen tunnistaa molekyylikohteista syövän hoidossa.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä tutkimuksessa käytetään joustavaa polyakryyliamidigeeleillä substraateiksi solukasvun yhteydessä uudella proteomic lähestymistapa tunnistaa ominaisuuksia jäykkyys riippuvaisten syöpäsolujen linjat, jotka edistävät niiden ero kasvun pehmeillä ja jäykät pohjat. Verrattuna soluihin kasvavat jäykempi /jäykkä alustoille ( 10000 Pa), solujen pehmeä alustoille (150-300 Pa) oli pidempi solusykliä, johtuen pääasiassa laajentamista G1 vaiheen solusyklin, ja oli metabolisesti vähemmän aktiivisia, osoittaa vähentynyt solunsisäiset ATP ja selvä vähentäminen proteiinisynteesiä. Käyttämällä vakaa isotooppi merkintöjä aminohappojen kulttuuri (SILAC) ja massaspektrometria, mittasimme hinnat proteiinisynteesiä yli 1200 solun proteiinien kasvuolosuhteissa pehmeillä ja jäykkä /jäykkä alustoille. Havaitsimme solun proteiinien, joiden synteesit joko inhiboi etusijassa tai säilöttyjen pehmeällä matriiseja. Entinen luokan mukaan, jotka säätelevät solun tukirangan rakenteet (esim tubuliinit) ja glykolyysin (esim phosphofructokinase-1), kun taas jälkimmäinen ryhmä mukana, jotka säätelevät keskeiset metaboliatiet tarvitaan hengissä, esimerkiksi, nikotiiniamidi fosforibosyylitransferaasin, säätelijä NAD pelastaa polku.

Johtopäätökset /merkitys

Matkapuhelinverkko ominaisuuksia jäykkyys riippuvaisten syöpäsolujen kasvaa pehmeällä matriisit muistuttavat ominaisuuksista lepotilassa syöpäsoluja, esimerkiksi hitaan kasvun ja vähentää aineenvaihduntaa. Ehdotamme, että käyttämällä suhteellisen pehmeää geelit soluviljelyn substraattien mahdollistaisi molekyylien polkuja tutkittava olosuhteissa, jotka heijastavat eri mekaanisten ympäristöjen kohtaamista syöpäsolujen kun etäpesäkkeitä kaukaisiin kohtiin.

Citation: Tilghman RW, Blais EM, Cowan CR, Sherman NE, Grigera PR, Jeffery ED, et al. (2012) Matrix Jäykkyys säätelee syöpäsolun kasvuun Moduloiva Cellular Aineenvaihdunta ja proteiinisynteesiä. PLoS ONE 7 (5): e37231. doi: 10,1371 /journal.pone.0037231

Editor: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, Iso-Britannia

vastaanotettu: 14 helmikuu 2012; Hyväksytty: 16 huhtikuu 2012; Julkaistu: toukokuu 18, 2012

Copyright: © 2012 Tilghman et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustukset National Institutes of Health (NIH) -Kansalliset Cancer Institute (NCI) CA40042 (JTP) ja NIH 1U54 GM64346 (JTP ja JWF) (www.nih.gov) ja rahoitusta Coulter Foundation Translational Partners Award (www. whcf.org) (JTP). EMB tukivat NIH-NCI T32 CA09109. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Sensing mekaanisia ominaisuuksia soluväliaineen (ECM) on keskeinen säätelevä mekanismi erilaistumista ja lisääntymistä lukuisia solutyyppejä sekä

in vitro

ja

in vivo

. Runsaasti todisteita syytöksiä muutoksia signalointireittien jotka säätelevät solujen vasteessa microenvironmental vihjeitä kriittisinä tapahtumia kasvaimen aloittamista, etenemistä, etäpesäkkeitä ja ehkä kasvaimen lepotilamuotoja [1], [2]. Lisäksi lisääntyminen kudoksen jäykkyyden vuoksi paikallinen kertyminen tiheä, silloitettu kollageeni matriisi on tunnusmerkki syövän etenemisen pehmeiden kudosten ja on perusta havaitsemiseksi monentyyppisten kasvainten fyysisen tunnustelu [3], [4].

analyysi ihmisen syöpäsolulinjoja soluviljelmässä on lähes aina suoritetaan käyttäen soluja viljellään jäykästä muovista, tai, harvemmin, on Matrigel tai pehmeässä agarissa, mekaaniset ominaisuudet, jotka ovat huonosti määriteltyjä ja /tai vaikeasti moduloida. Olemme aiemmin kuvattu yksinkertainen suurikapasiteettisten menetelmä viljelemiseen kasvainsolujen biologisesti asiaan taipuisien alustojen käyttäen ECM konjugoitu polyakryyliamidia (PA) geelit, joka voi kestää kokonaisen jäykkyys alue kattaa kimmoisuusmoduulien 100 pascalia ([Pa] tai N /m2) -150000 Pa [5]. Tässä määrityksessä käytämme 96-määrityksen, joka paneelit PA geelit vaihteleva jäykkyys käyttäjän määrittämiä välein levyn poikki [6]. Olemme käyttäneet Tässä määrityksessä voidaan arvioida, kuinka muutokset jäykkyyden ECM moduloida biologisia ominaisuuksia kasvainsolujen, mukaan lukien lisääntyminen, morfologia ja muuttavat ominaisuuksia. Syöpä tutkituissa solulinjoissa jaettiin kahteen ryhmään perustuen niiden leviäminen profiileja: ”jäykkyys riippuvainen” linjat osoittivat yhä solujen kasvua solunulkoisen jäykkyys lisääntyi, kun taas ”jäykkyys itsenäinen” linjat kasvoi yhtä hyvin koko testattu kirjon matriisin jäykkyys. Tärkeää on, solut, jotka kasvoivat heikosti pehmeillä geeleillä näytteillä laski levittäminen ja siirtäminen näissä olosuhteissa ja kasvoivat huonosti vietäessä pehmytkudoksen ympäristön keuhkoissa. Jäykkyys riippuva keuhkosyövän A549 vastasi kulttuurin pehmeän geelit ilmaisemalla eriytetty epiteelin merkki E-kadheriinin ja vähentämällä ilmaus mesenkymaalisten transkriptiotekijän Slug. Vastaavasti, jäykkyys on myös havaittu moduloivan epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon normaaleissa epiteelisoluissa [7]. Nämä havainnot osoittavat, että mekaaniset ominaisuudet matriisin ympäristön merkittävä rooli säätelyssä leviämisen ja morfologiset ominaisuudet syöpäsolujen, ja että ”jäykkyys profiilin” on luontainen ominaisuus jokaisen tasyöpäsolulinja.

monet syöpäsolujen linjojen vastata joustavampia mikroympäristöihin lisääntyvien hitaammin; kuitenkin muutoksia solujen aineenvaihduntaan muutosten vuoksi jäykkyyttä microenvironment ei ole hyvin tunnettu. Solumuutoksia metabolisia prosesseja, kuten proteiinisynteesiä saattaa olla etenkin kun kasvainsoluja solmia ”lepääviä” tilaan, pääasiassa sivustoja kaukaisten etäpesäkkeitä, jossa solut on otettu käyttöön ulkomaisen mikroympäristölle [8], [9]. Tässä tutkimuksessa selvitettiin ominaisuuksia jäykkyys riippuvaisten syöpäsolujen linjat, jotka edistävät niiden ero kasvun pehmeillä ja jäykkä polyakryyliamidia alustoille. Verrattuna soluihin kasvavat jäykempi /jäykkä alustoille, solujen pehmeä alustoille (150-300 Pa) oli pidempi solusykliä, johtuen pääasiassa laajentamista G1 vaiheen solusyklin, ja oli metabolisesti vähemmän aktiivisia, osoittaa alentuneesta solunsisäisten ATP ja selvä vähentäminen proteiinisynteesiä. Tunnistaa proteiinit, jotka osoittavat ero synteesi hinnat, kun soluja viljellään pehmeillä vs. jäykkiä geelejä, käytimme äskettäin kehitetty soveltamisen vakaa isotooppi merkintöjä aminohappojen kulttuuri (SILAC) ja massaspektrometria mittaamaan määrien proteiinisynteesiä yli 1200 solun proteiinien olosuhteissa kasvun pehmeillä ja jäykkä /jäykkä alustoille [10]. Kun taas kokonaismäärässä proteiinisynteesiä vähenee merkittävästi jäykkyys-riippuvaisten solujen kasvatettu pehmeä alustoille, tunnistimme solun proteiineista, joiden synteesit inhiboi etusijassa viljelemällä pehmeillä alustoille ja proteiinit, joiden synteesit suhteellisen säilynyt kun kasvaa pehmeitä matriiseja. Entinen luokan mukaan, jotka säätelevät solun tukirangan rakenteet (esim tubuliinin alayksiköt) ja glykolyysin (esim phosphofructokinase P-1 ja ATP syntaasi), kun taas jälkimmäinen ryhmä mukana, jotka säätelevät keskeiset metaboliatiet tarpeen torjua vahingosta reaktiivisia happiradikaaleja, kuten aldo-keto-reduktaasin perheenjäseniä ja nikotiiniamidi nifosforibosyylitransferaasi-, säätelijä NAD pelastaa kautta. Solu ominaisuudet jäykkyys riippuvaisten syöpäsolujen kasvaa pehmeällä matriisit muistuttavat ominaisuuksista lepotilassa syöpäsolujen eli hitaan kasvun ja vähentää aineenvaihduntaa. Nämä tulokset tukevat ajatusta, että jäykkyys mikroympäristön voivat moduloida kasvainsolujen proliferaatiota moduloimalla olennainen solun prosesseja. Edelleen pehmeä levy teknologia voi tarjota ainutlaatuisen foorumin tutkimus syöpäsolujen meneillään dynaaminen sääntely jakautumista vasteena muutoksiin mekaanisten ympäristöön, mikä antaa oivalluksia, miten microenvironmental muutokset moduloida syöpäsolujen kasvua kokeellisissa eläinmalleissa ja potilailla.

tulokset

solusyklin etenemisen jäykkyyden-riippuvaisten solujen pehmeitä geelejä

Olemme aiemmin osoittaneet, että paneeli syöpäsolulinjojen voidaan erottaa perustuen kyky lisääntyä pehmeillä ( 1000 Pa) kollageenipäällysteisiin geelejä. A549-soluja (keuhkokarsinooma) ja MDA-MB-231-solujen (rintasyöpä) on luokiteltu ”jäykkyys riippuva” ja näyttelytila ​​kaksinkertaistaa ajat, jotka ovat vähintään 2 kertaa pitempi pehmeillä vs. jäykkä matriiseja. Sen sijaan ”jäykkyys riippumaton” mPanc96 soluja (haiman karsinooma) kasvaa yhtä hyvin pehmeä verrattuna jäykkä matriisit ja ovat samanlaisia ​​kaksinkertaistaminen kertaa näissä olosuhteissa ([5], julkaisemattomia havaintoja).

Ymmärtääksemme molekyylitason perustan hidas kasvu jäykkyys riippuvan syövän solulinjoissa pehmeillä matriisit, mittasimme keskeinen säätelijöinä solusyklin etenemisen sekä tarvittava aika solujen poikittain solusyklin pehmeillä tai jäykkä alustoille. Sykliini D1 on kriittinen solujen solusykliin, ja menetys sykliini D1 ilmentymisen on merkkiaine soluja, jotka ovat poistuneet solusyklin ja ovat lepotilassa [11]. Lisäksi sykliini D1 ilmentyminen on osoitettu säätelevän matriisin jäykkyys läpi FAK-riippuvainen aktivaatio Rac transformoimattomilta soluissa [12]. Ilmaisu sykliini D1 jäykkyys riippuvaisten syöpäsolujen mitattiin sen määrittämiseksi, onko solut poistua solu- syklin, kun viljeltiin pehmeitä geelejä. Jäykkyys riippuva A549 tai MDA-MB-231-soluja viljeltiin 150 Pa, 4800 Pa, tai 19200 Pa, geelit, 2 tai 5 päivää, ja sykliini D1 ilmentyminen mitattiin western blot. Molemmat solulinjat vielä ilmaistu sykliini D1 vaikka viljeltiin pehmeä (150 Pa) geeleissä (kuvio 1). Nämä tiedot osoittavat, että jäykkyys riippuvaiset solut eivät poistu solusyklin myös pehmeässä geelit, jossa soluilla kasvun hidastumisesta.

A549-soluja ja MDA-MB-231-soluja viljeltiin 150 Pa, 4800 Pa, tai 19200 Pa polyakryyliamidigeeleillä 2 tai 5 päivää. Solut hajotettiin ja analysoitiin Western blot ilmentämiseen sykliini D1 (yläpaneeli). Ilmentyminen GAPDH analysoitiin latauskontrollina (alapaneeli). Blot edustaa kolmen kokeen.

Koska jäykkyys riippuvaisten A549-solut eivät poistu solusyklin kun päällystetty pehmeällä geelit, ja vain -5% soluista apoptoosiin näissä olosuhteissa [5 ], me arveltu, että nämä solut ovat etenemässä solusyklin hitaammin kuin silloin, kun ne kasvavat jäykkä alustoille. Tutkia pahenemisnopeuden erityisillä vaiheiden solusyklin, jäykkyys riippuva keuhkosyövän A549 viljeltiin pehmeillä (150 Pa) tai jäykkä (19200 Pa) geelejä kaksi tai viisi päivää ja sitten pulssitettiin 30 minuuttia kanssa nukleotidianalogissa bromideoksiuridiinia (BrdU) merkitä solupopulaation olevien DNA-synteesin. Vietetty aika kunkin vaiheen solusyklin määritettiin FACS seurata BrdU-positiivisten väestön solujen edetessä kautta S ja G2 vaiheisiin ja kertynyt G1 vaiheessa [13]. Kuten kuviossa 2 on esitetty, solut pehmeällä geelit eteni hitaammin läpi G1 vaiheen solusyklin verrattuna samoihin soluihin, jotka kasvavat jäykkä matriisit (kuvio 2), noudattavat yleistä vähenemistä solun aineenvaihduntaan tai anabolisia prosesseja, jotka vaikuttavat solujen ”kasvu” vaiheessa solusyklin. Koska solusyklin profiilit ovat samanlaisia ​​2 ja 5 päivää pehmeä geelit, on todennäköistä, että tämä edustaa vakaan tilan mittaus, toisin kuin mahdollisuus, että solujen kasvu vähitellen hidastuu ajan myötä. Perustuen lasketusta pituudesta solusyklin solujen kasvaa pehmeitä vs. jäykkiä geelejä, 5 päivän kuluttua suhde solujen pehmeillä versus jäykkä matriisien olisi 1:4.3. Samassa suhteessa kasvun pehmeän versus jäykkiä geelejä (1:4.3) havaittiin manuaalisesti laskemalla solujen lukumäärä läsnä viiden päivän siten validoida BrdU pulssi-chase laskelmat.

A549-soluja pulssitettiin BrdU 30 minuuttia seuraavan kasvun pehmeillä tai jäykkiä geelejä 2 päivää. A. Leimaus solut BrdU solusyklin analyysi. Soluja pulssi BrdU: lla 30 minuuttia, ja BrdU-positiivisia väestöstä seurataan ajan mittaan, kun se siirtyy vaiheiden läpi solusyklin. B. sirontakuvaajaan histogrammit BrdU-leimattujen solujen pehmeillä (yläpaneeli) tai jäykkä (alapaneeli) geelit, värjättiin DNA-pitoisuus (X-akseli) ja BrdU (Y-akseli). Ajat ilmoitetaan ovat ajat, tunteina, kun BrdU pulssin. C. solusyklin etenemisen analyysi suoritettiin sirontakuvaaja histogrammien soluista kasvatettu geelit 2 päivää (vasen) tai 5 päivää (oikealla).

Cellular aineenvaihdunta jäykkyys-riippuvaisten solujen viljelty pehmeät geelit

G1 vaihe solusyklin paljolti riippuvainen solujen aineenvaihdunnan tapahtumissa ja on kriittinen synteesi rakenteellisia proteiineja ja entsyymejä, jotka edistävät sukupolvi uuden soluelimiin ja kokonaiskasvu solun. Koska G1 vaiheen solusyklin jatkettiin jäykkyyden-riippuvaisten solujen kasvatettu pehmeä geelit, me arveltu, että siellä voi olla metabolisia muutoksia olosuhteissa kasvun pehmeää substraatteja. Viljellään jäykkyys riippuva A549 tai MDA-MB-231-solut pehmeillä geeleillä 2 päivää johti noin 50% lasku ATP-tasot verrattuna soluihin kasvavat jäykkiä geelejä (kuva 3). Kuten pidentäminen G1 vaiheessa alhaisempi solun ATP ovat yhdenmukaisia ​​lasku solujen aineenvaihduntaan, kun jäykkyys riippuvaisten soluja viljellään pehmeillä geeleillä.

ATP-tasot mitattiin A549-soluja (vasemmalla) tai MDA-MB-231-soluja (oikealla) seuraavasti kulttuuriin polyakryyliamidigeeleillä ja 2 päivää. Data edustaa keskiarvoa kahdesta kokeesta suoritettiin kolminkertaisesti ± S.E., solujen pehmeillä (300 Pa) tai jäykkä (19200 Pa) geelejä. Yhteensä ATP-tasot normalisoitiin solujen määrä. * P 0,05.

vaikutus jäykkyyden proteiinisynteesiin soluissa viljelty pehmeillä geeleillä

Koska pitkittynyt G1 vaiheeseen ja lasku ATP-tasot soluissa viljelty pehmeä geelit määritimme onko matriisi jäykkyyttä voidaan säädellä netto proteiinisynteesiä jäykkyys-riippuvaisten solujen. Arvioimaan maailmanlaajuisten muutosten proteiinisynteesiä, ja tunnistamaan proteiineja, jotka saattavat olla eri tavalla syntetisoitiin pehmeä versus jäykkä olosuhteissa, käytimme äskettäin kehitetty soveltamisen vakaa isotooppi merkintöjä aminohappojen soluviljelmissä (SILAC) yhdessä massaspektrometrialla [10 ]. Jäykkyys riippuvaisten A549-soluja ja jäykkyys riippumaton mPanc96 soluja kasvatettiin SILAC median kahden sukupolven muoville kudosviljelymaljoihin täysin merkitä proteomiin kanssa ”heavy” aminohapot (kuvio 4A). Sitten solut maljattiin joko pehmeitä tai jäykkiä geelejä ja edelleen viljeltiin ”raskas” aminohapot vielä 4 päivää. Soluja inkuboitiin sitten 24 tunnin ajan ( ”pulssi”) on ”kevyt” media (normaali kudos elatusaineet), ja solun proteiinit eristettiin kustakin näytteestä ja eroteltiin SDS-PAGElla. Proteiinit läsnä pehmeä ja jäykkä näytteet analysoitiin ottamalla kymmenen geelileikkeistä kustakin proteiinia radan ja altistamalla kukin trypsiinillä hajotusta. Netto proteiinisynteesiä aikana 24 tunnin ”pulssi” mitattiin määrittämällä suhde raskas valon peptideihin massaspektrometrialla proteiineille pehmeä ja jäykkä näytteitä. Alustava kokeilu A549-soluja viljeltiin muovi- tuotti raskaan valoon suhteet (H /L-suhteet) peptidien, jotka olivat samanlaisia ​​kuin A549-solut viljeltiin jäykkiä geelejä (0,6246 ± 0,2326 muoville vs. 0,5482 ± 0,1785 varten jäykkiä geelejä). Kuvio 4B esittää boxplots H /L suhde proteiinien tunnistettu A549 ja mPanc96 solujen pehmeä ja jäykkiä geelejä käyttäen SILAC. Keskimääräinen raskas /kevyt suhde peptidien A549 pehmeillä geeleillä oli merkitsevästi korkeampi (p 0,05) kuin solujen jäykkiä geelejä, mikä osoittaa, että verkko proteiinisynteesiä väheni soluissa pehmeillä geelit, (eli vähemmän valoa amino hapot sisällytettiin pulssin aikana solussa kasvaa pehmeä substraatille verrattuna jäykkä alustoille). Sen sijaan, raskas /kevyt suhteet peptidien mPanc96 soluissa ei ollut merkitsevästi erilainen solujen välillä kasvaa pehmeitä tai jäykkiä geelejä (p 0,05) (kuvio 4B).

A549-soluja altistettiin SILAC analyysi määrittää hinnat proteiinisynteesiä pehmeillä tai jäykkiä geelejä. A. Yleiskuva SILAC menettelyn. A549-soluja viljeltiin pehmeillä tai jäykkiä geelejä 4 päivää läsnäollessa ”raskas” media, jota seuraa 24 tunnin inkubointi ”kevyt” media. Solut hajotettiin, solun proteiinien pilkottiin trypsiinillä, ja saadut peptidit analysoitiin massaspektrometrialla. B. Boxplots raskaiden valoon (H /L) suhde proteiinien A549-solut (vasen) tai mPanc96 soluja (oikealla) kasvatettu jäykkä (19200 Pa) tai pehmeä (150 Pa) alustoille. H /L-suhde jakaumat ovat huomattavasti toisistaan ​​jäykkä ja pehmeä A549-soluja mutta ei mPanc96 soluja käyttämällä kaksisuuntaisella parittomalla t-testillä. Laatikot sisältävät datan välillä 25 ja 75 persentiilin, ja linja laatikon sisällä ilmaisee mediaanin. Katkoviiva yläosassa kuvaajan merkitsee yläraja, jonka yläpuolella vieraat havainnot katkaistu.

massaspektrometria analyysi tunnistettu 631 ainutlaatuista proteiinien A549-soluja ja 729 proteiineja siinä mPanc96 soluissa (taulukot S1 ja S2). Suhteellinen hinnat synteesin (H /L-suhteet) yksittäisten proteiinien verrattiin sitten solujen välillä kasvatettu jäykkä ja pehmeä olosuhteissa määrittämään proteiineja, joita differentiaalisesti ”ilmaistaan” tai kääntää. Koska jakaumat H /L suhde vaihteli jäykkä ja pehmeä kokeita, H /L suhde ja arvioitu vaihtelevuus normalisoitiin itsenäisesti A549 ja mPanc96 näytteitä (katso menetelmät), ja tunnistimme proteiineja merkittävästi erilainen H /L suhde (p 0,05 ) käyttäen t-testejä. Kuvio 5 esittää scatterplots normalisoidun H /L-suhde näytteiden välillä kasvua jäykkä ja pehmeä substraatteja. Proteiinit, joilla on merkittävästi pienempi H /L-suhde (säilötty synteesi) pehmeässä verrattuna jäykkiä geelejä on merkitty punaisella ja proteiineja, joilla on huomattavasti suurempi H /L-suhde (hitaampi synteesi) pehmeässä kuin jäykkiä geelejä näkyvät vihreinä. Katkoviiva osoittaa odotetun H /L-suhde alle hypoteesia, että proteiinit säilyttää sama H /L-suhde suhteessa keskiarvoon.

H /L suhde proteiinien yksilöityjen sekä jäykkä ja pehmeä näytteet pidon kukin muut A549-soluja (vasemmalla) ja mPanc96 soluja (oikealla). H /L suhde kuviosta 4 olivat quantile normalisoitu ja t-testit suoritettiin käyttäen arvioitua vaihtelua (ks menetelmät) tunnistaa yksittäisiä proteiineja suhteellisen eri synteesi hinnat välillä jäykkä ja pehmeä näytteitä. Proteiineja, jotka syntetoidaan nopeammin (suhteellisesti pienempi H /L-suhde ja p-arvo 0,05) pehmeässä näytteistä (verrattuna jäykkää näytettä) näkyvät punaisina, ja proteiineja, jotka syntetisoidaan hitaampaa pehmeitä näytteitä näkyvät vihreinä.

Vuodesta proteiinit tunnistetaan massaspektroskopia, me erotetaan proteiineista, joissa havaittiin merkitsevästi erilainen H /L suhde (p 0,05) solujen välillä viljeltyjen jäykkä ja pehmeä geelit (taulukko S3 A549- solujen Taulukko S4 mPanc96 solut). A549-solut, useita proteiineja, joilla on yhteisiä biologisia toimintoja ryhmittyneet luokkaan hitaammin synteesin pehmeillä geeleillä (taulukko 1). Näihin sisältyvät proteiinit, jotka osallistuvat proteiinisynteesiä kuten ribosomaalisen proteiinien ja venymä tekijöistä. Alayksiköt mikrotubulusten (tubuliinit) myös ryhmittyneet luokkaan hitaammin synteesin pehmeillä geeleillä. Kiinnostavaa kyllä, kaksi proteiinia ratkaisevan rooli ATP tuotannon näytetään myös hitaampia synteesi hinnat pehmeä geelit: 6-phosphofructokinase tyypin C (PFKP-1) ja alayksikköä ATP nopaliinisyntaasin. Nämä tiedot viittaavat siihen, että kun A549-soluja viljellään pehmeä mikroympäristön, osajoukko proteiineja – mukaanlukien, käännös- ja mikrotubulusdynamiikan – syntetisoidaan hitaammin verrattuna keskimääräiseen synteshastighet kuin silloin viljeltiin jäykkiä geelejä.

vastoin, proteiineja, joilla oli korkeampi synteesi hinnat kuin suurin osa solun proteiinien, kun päällystetty pehmeällä geelit sisältyvät jäsenten aldo-keto-reduktaasin perhe, jotka ovat mukana suoja reaktiivisia happiradikaaleja, ja nikotiiniamidi-fosforibosyylitransferaasi, joka on tärkeää säilyttää fysiologisen tason nikotinamidijohdannaisten kofaktoreita (eli NADPH), jotka ovat tärkeitä näiden redox reaktioita (taulukko 2). Lisäksi proteiineja rooleja endosytoosin ja rakkula kaupan, erityisesti annexins ja Rab proteiinit, todettiin myös säilytettävä A549-solua pehmeällä geelit. Tiedot Tässä taulukossa viittaavat siihen, että kun A549-soluja viljellään pehmeä mikroympäristön, synteesiä proteiineja, jotka ovat tärkeitä säätelyssä reaktiivisia happiradikaaleja ja kalvo dynamiikkaa on säilynyt.

Samanlaisia ​​A549-soluihin viljeltiin pehmeillä geeleillä, useita ribosomaaliset proteiinit syntetisoitiin myös hitaammin mPanc96 soluja, jotka viljeltiin pehmeitä geelejä (taulukko 3). Toisin kuin A549-soluja, useita proteiineja rooleihin kääntämisen todettiin myös olevan suurempi synteesi hinnat mPanc96 soluissa viljeltynä pehmeillä geeleillä (taulukko 4). Lisäksi, vaikka A549-solut osoittivat proteiinien mukana rakkulan ihmiskaupan ja oksidatiivisen stressin reitit olevan säilynyt synteesi hinnat pehmeä geelit, proteiinit mukana näissä prosesseissa, kuten coatomer alayksiköitä ja superoksididismutaasi vastaavasti syntetisoitiin hitaammin mPanc96 soluissa viljelty pehmeät geelit (taulukko 3), mikä viittaa siihen, että nämä prosessit saattavat vaimentua, kun mPanc96 solut kasvavat pehmeässä mikroympäristöihin. Mielenkiintoista on, että useita proteiineja, jotka osallistuvat säätelyyn soluväliaineen adheesiota ja aktiini dynamiikka, kuten Rae perheenjäsen RhoG, fascin, ja ylösalaisin formin-2, havaittiin olevan korkeampia synteesin, kun mPanc96 soluja viljellään pehmeällä geelit (taulukko 4), lisäksi nämä kaksi proteiinia (sitraattisyntaasin ja malaattidehydrogenaasi), joka on ratkaiseva rooli sitruunahappokierron tärkeä aineenvaihduntaa varten ATP: n ja aminohappojen esiasteita. Nämä tiedot viittaavat siihen, että kun jäykkyys riippumaton solulinja mPanc96 viljellään pehmeä mikroympäristön, on vähentynyt synteesissä osallistuvien proteiinien rakkulan kaupan ja oksidatiivisen stressin polkuja, kun on kasvu proteiinien synteesiin osallistuvien aktiini dynamiikka ja sitruunahappokierron.

Koska nämä tiedot heijastavat vain synteesin proteiinien ja yleiseen tasoon proteiinien määritetään tasapaino synteesin ja hajoamisen, pyrimme testata, onko tämä muutos proteiinisynteesin tosiasiallisesti vaikuttavat solujen määriä näitä proteiineja. Lysaatit A549 ja mPanc96 soluja viljellään pehmeitä tai jäykkiä geelejä alistettiin western blot aktiinin, proteiini, joka oli osoittanut mitään merkittäviä muutoksia suhteellisessa synteesissä viljeltynä pehmeillä geelit, ja kaksi proteiineja, jotka osoittivat korkea herkkyys jäykkyys, nimittäin tubuliinia ja phosphofructokinase-1. Tasot proteiinien normalisoituivat GAPDH latauskontrollina, koska ei ollut merkittävää eroa suhteellisen synteesissä GAPDH pehmeiden ja jäykkiä geelejä (p = 0,55, katso taulukko S1, rivi 275). Kuten kuviossa 6 on esitetty, aktiini ilmaistiin samalla tasolla, kun viljeltiin pehmeitä tai jäykkiä geelejä, kun taas tasojen tubuliinia ja PFKP-1 olivat alemmat pehmeät geelit A549-soluissa, mikä viittaa siihen, että alhaisempi synteesin näiden proteiinien havaittiin että SILAC data heijastuu alhaisempi näiden proteiinien soluissa. Sen sijaan mPanc96 solut eivät osoittaneet muutoksia tubuliinia tai PFKP-1 tasot viljeltynä pehmeillä geeleillä. Nämä tiedot osoittavat, että ainakin proteiineja tutkitaan (tubuliinia ja PFKP-1), joka on hitaampi synteesi vastaa alhaisempi solun.

. Tasot aktiini, tubuliinin ja phosphofructokinase-1 A549-soluissa viljelty pehmeillä (150 Pa) tai jäykkä (19200 Pa) geelit analysoitiin western blot. Alapaneeli pitoisuuksia GAPDH latauskontrollina. B. tasot aktiinin, tubuliinin ja PFKP-1 mPanc96 soluja viljellään pehmeitä tai jäykkiä geelejä, kuten analysoitiin Western blot. Alapaneeli pitoisuuksia GAPDH solulysaateista latauskontrollina. C. kvantitointi western blot tulokset (A) ja (B). Tasot Kunkin proteiinin normalisoitiin määrä GAPDH kussakin näytteessä. Tasot proteiinin näytteistä valmistettiin jäykkiä geelejä asetettiin 100%: iin, ja tasot proteiinin pehmeä näytteissä näkyvät prosentteina ilmentymistä näiden näytteiden. Tulokset osoittavat, keskiarvo ± keskivirhe vähintään kolmen kokeen. * P 0,05 verrattuna tasoon aktiinin ilmentymistä.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että jäykkyys soluväliaineen säätelee solujen aineenvaihduntaa ja proteiinisynteesiä syövän solut. Jäykkyys riippuvainen syöpäsolulinjoilla A549 ja MDA-MB-231 ylläpitää ilmentymistä sykliini D1, kun viljellään seerumia polyakryyliamidigeeleillä, jotka ovat mekaaniset ominaisuudet samanlainen kuin pehmytkudoksen, kuten keuhko- tai rinnan. Huolimatta sykliini D1 ilmentymisen, A549-solut, kun niitä viljellään pehmeillä geeleillä, osoittavat pidentäminen G1 vaiheen solusyklin, mikä viittaa siihen, että voi olla virheitä synteesissä rakenne- ja entsymaattisen tarvittavien komponenttien siirtyminen S-vaiheeseen . Näin ollen, jäykkyys-solulinjojen osoittavat alhaisempi solun ATP-tasot, kun viljelty pehmeitä geelejä. Lisäksi proteiinisynteesiä A549-soluja on hitaampaa tässä tilassa, jossa synteesi erityisiä rakenteellisia proteiineja ja glykolyyttiset entsyymit, kuten tubuliinin phosphofructokinase, ja ATP syntaasia erityisen herkkä lasku solunulkoisessa jäykkyyttä. Proteiineja, jotka olivat vähemmän herkkiä muutoksen jäykkyyden sisältyvät entsyymit, kuten aldo-keto-reduktaasin ja nikotiiniamidi nifosforibosyylitransferaasi-, jotka ovat mukana aineenvaihduntaan ROS tuotteita.

Matrix jäykkyys on ehdotettu olevan mekanismin taustalla kudostropismin syövän etäpesäkkeiden, koska kasvu sinoomasolulinjoja pehmeillä tai jäykkiä geelejä korreloi niiden kyky kasvaa pehmeässä tai jäykkä kudosten [5], [14]. Kuitenkin mekanismi (t), jotka säätelevät kasvua syöpäsoluissa kudosspesifisellä tavalla ovat epäilemättä monimutkaisia. Meidän havainnot viittaavat siihen, että yksi tapa, jolla jäykkyyden riippuvaisten syöpäsolujen voi vastata alle suotuisa kudos-matriisi ympäristö on vähentää niiden metabolinen tila, joka tarjoaa yhden mahdollisia mekanismi havaittu kudostropismin kasvainsolujen, ja ehkä kudos riippuva kasvain lepotilamuotoja.

kasvain lepotilamuotoja määritellään vaihe syövän etenemisen, joissa jäljellä tautia esiintyy, mutta on oireeton [15]. Lepääviä syöpäsolut voivat oleskella huomaamatta paikoissa kaukana primaarikasvaimen, kunnes myöhempi kasvu ja kliiniset toistumisen [16]. Viimeaikaiset tutkimukset tukevat sellaista mallia, että syöpäsoluja primaarikasvaimen levittää varhaisessa vaiheessa taudin etenemistä, niin että kun primaarikasvaimen havaitaan, voi olla lepotilassa syöpäsoluja jo kotipaikka kaukaisiin kohtiin [17]. Nämä solut ovat joko väliaikaisesti nonproliferatiivinen, tai on tasapainossa leviämisen ja solukuoleman, tai immuunijärjestelmä on pitää solujen määrä kurissa. Mielenkiintoista jälkimmäinen mahdollisuus on joutunut valvonnan takia tutkimukset osoittavat puutetta kasvaimen uusiutumisen syöpäpotilailla, jotka ovat läpikäyneet immunosuppressiivinen hoito [18].

Viimeaikaiset tutkimukset ovat sekaantuneet mikroympäristön keskeisenä säätelijänä kasvainsolun lepokauden ja toistuminen. Erityisesti, ominaisuudet soluväliaineen paikoissa etäpesäkkeiden voi olla tärkeitä rooleja tilan määrittämiseksi levittää kasvainsoluja [9]. Kuitenkin mekanistinen käsityksen siitä, miten lepotilan tapahtuu on niukkaa, koska lepotilassa syöpäsolut on vaikea havaita ja tutkia in vivo, ja siellä on niukasti in vitro malleja kasvainsolun lepotilan. Viime aikoihin asti, tällaiset mallit ovat rajoittuneet soluihin kasvatetaan suoni kalvoja (CAM) tai 3D-matriisi johdettu Engelbreth-Holm-Swarm kasvain (EHS matriisi, tai matrigeelin) [19], [20]. Matrigel on seos, laminiinin, kollageeni IV, ja nidogen, lisäksi erilaisia ​​proteaaseja, ja kasvutekijät, kuten TGF, FGF, EGF, PDGF ja IGF [21]. Koska se on peräisin kasvain, erityinen koostumus matrigeelin ei ole määritelty hyvin, ja se voi vaihdella erästä toiseen, tuottaa vaihtelua Koetulokset [22]. Vaikka mekaaniset ominaisuudet matrigeelin on analysoitu, ne myös kuuluvat vaihtelevuutta, koska sen polymeroinnin vaikuttaa sen koostumus ja muut koe tekijät kuten lämpötila [23]. Lisäksi, tällä hetkellä ainoa tapa muuttaa mekaanisia ominaisuuksia Matrigel on lisätä matriisin komponentteja, kuten kollageenia I [24], jotka voivat myös vaikeuttaa tulkintaa koetulosten.

Äskettäin in vitro mallien kasvain lepotilan on tullut lisäksi käyttöön polyakryyliamidigeelien kasvualaustoina [25]. Toisin Matrigel, polyakryyliamidi on vakaa, homogeeninen polymeeri, ja sen mekaaniset ominaisuudet eivät ole herkkiä lämpötilan muutoksiin [26]. Sen jäykkyys on helposti viritettävissä moduloimalla määrä bis silloittimen vaikuttamatta sen kyky sitoutua ECM molekyylejä sen pintaan [6]. Polyakryyliamidigeelien hydrogeelit voivat kattavat kirjon kimmoisuusmoduulien joka sisältää erilaisia ​​ihmisen kudoksia rasva luustolihasten [27], ja erilaisia ​​ECM molekyylit voidaan konjugoida sen pintaan, kuten kollageeni, fibronektiini ja polymeroimaton Matrigel. Lisäksi suuren läpimenon järjestelmä on äskettäin kehitetty, jotta seulonta pienmolekyylisalpaajien soluja viljeltiin polyakryyliamidigeeleillä kattavat erilaisia ​​kimmomoduuli [5], [6].