Krooninen sairaus

tiivistelmä

Transforming kasvutekijä (TGF) -β /Smad signaloinnin tärkeä rooli paksusuolensyöpä kehittäminen, etenemisen ja etäpesäkkeiden. Tässä tutkimuksessa osoitettiin, että microRNA-130a /301a /454 perhe on säädellään ylöspäin paksusuolensyöpä kudoksissa verrattuna pariksi viereiseen normaaliin limakalvo, joka on sama 3′-untranslational alue (3′-UTR) sitovia siemenet järjestyksessä ja ovat lähdettävä kohdistaa Smad4. Kolorektaalisyövässä HCT116 ja SW480-soluissa, yli-ilmentyminen miRNA-130a /301a /454 jäljittelee tehostaa solujen proliferaatio ja migraatio, vaikka estäjät näistä miRNA vaikuttaa solujen selviytymistä. Biologinen toiminta miRNA-130a /301a /454 koolonkarsinoomasoluissa on todennäköisesti välittävät tukahduttaminen Smad4, ja ylös-säätely miRNA korreloi Smad4 alassäätöä ihmisen paksusuolen syövissä. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että miRNA-130a /301a /454 ovat uusia onkogeenisiä miRNA myötävaikuttaa paksusuolen kasvaimien syntyyn säätelemällä TGF-β /Smad signalointi, jotka voivat olla potentiaalisia käyttömahdollisuuksia syövän hoidossa.

Citation: Liu L, Nie J, Chen L, Dong G, Du X, Wu X, et al. (2013) kasvaimia synnyttävän rooli mikroRNA-130a /301a /454 Human peräsuolen syövän kautta Targeting Smad4 Expression. PLoS ONE 8 (2): e55532. doi: 10,1371 /journal.pone.0055532

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 syyskuu 2012; Hyväksytty: 27 joulukuu 2012; Julkaistu: 05 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukevat avustusta National Basic Research Programs (2012CB518103), National Natural Science Foundation of China (31100554, 31270820, 81230061 ja 81121004), Nursery Foundation of PLA General Hospital (12KMM48), ja Peking Nova Program (Z12111000250000). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Colon syöpä on yksi yleisimmistä syövistä ja yleinen syy syöpään liittyvien kuolemien [1]. Huonon ennusteen ja etäinen hyökkäyksen ja muuttoliike, yleinen esiintyvyys paksusuolen syöpä on noin 5% ja 5 vuoden pysyvyys paksusuolen syöpäpotilaiden on erittäin alhainen [2]. Siten tunnistaminen uudet tavoitteet kehittämiselle ei-perinteisiä hoitoja on kiireellinen ja hyödyntävät edistymistä laaja ja syvä ymmärrys molekyylitason patogeneesin paksusuolensyöpä.

MikroRNA (miRNA) ovat laaja luokka pieniä ei-koodaavaa RNA: iden (18-25 nt), joilla on merkittävä vaikutus useisiin biologisiin prosesseihin, kuten kehitys-, erilaistuminen, kasvu, aineenvaihdunta, ja kasvaimen kehittymisen kautta suoran sitoutumisen 3’untranslational alue (3′-UTR) kohde-mRNA: iden [3] – [5]. MikroRNA voi säädellä geeniekspressiota kaksi tilaa, riippuen siitä, kuinka paljon täydentää mRNA tavoitteet, tukahduttaa käännöksen tai aiheuttaa mRNA: n hajoamisen [6], [7]. MikroRNA voivat toimia tuumorisuppressoreilla tai onkogeenien perusteella vai ei miRNA kohdistaa onkogeenien tai tuumorisuppressorigeeneille [8]. Sekä onkogeeniset miRNA ja kasvaimen tukahduttava miRNA on osoitettu ja kuvattu paksusuolen syövän synnyn ja etenemisen, kuten upregulated miR-135, miR-21, miR-17-92, ja miR-196a, ja vaimentua miR-34, miR-195, ja miR-365 [9] – [13]. Ilmaisu profiili miRNA on erittäin kudosten ja solujen tyyppi erityisiä, mikä osoittaa biologinen toiminnallinen merkittävyyden ilmaistaan ​​miRNA [14]. Kuitenkin selvittämiseen piirteet ilmaisun ja rooleista miRNA syövän biologian, erityisesti paksusuolen syövän, on yhä jatkuva prosessi.

microRNA-130ac /301ab /454/721 perheellä on sama 3′-UTR sitova siemen sekvenssi. Äskettäin miR-130 /301ab on raportoitu olevan yliaktiivista useiden syöpätyyppien, kuten maksasyövän, nonsmall keuhkosyöpä, krooninen myelooinen leukemia, haimasyöpä ja rintasyöpä [15] – [21]; kuitenkin, miR-130a /301a säätyy alas kroonisen lymfaattisen leukemian ja sirppisoluanemia [22], [23], mikä osoittaa, monimutkaisuus ja monimuotoisuus roolien miR-130a /301a kasvainten synnyssä. Kuitenkin ekspressiokuvion ja rooli miR-130a /301a /454 koolonin karsinogeneesissä on tuntematon.

Tässä tutkimuksessa selvitettiin ilmaisua ja roolit miR-130a /301a /454 paksusuolen syövän kehittymisessä. Osoitimme, että miR-130a /301a /454 on säädellään ylöspäin kliinisesti resektoitiin ihmisen paksusuolen syöpä kudoksiin ja koolonsyöpäsolulinjaa, ja nämä miRNA osoittavat onkogeeninen ominaisuuksia koolonkarsinoomasoluissa

in vitro

ja

in vivo

. Mekanismit roolit miR-130a /301a /454 paksusuolen syövän kehittymisessä tutkittiin myös. Siten meidän tiedot korostavat merkitys miR-130a /301a /454 /perhe syövän synnyssä ja ehdottaa potentiaalisia käyttömahdollisuuksia syövän hoidossa.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaiden ja kudosnäytteiden

Kirurgisesti-poistetun paksusuolen syöpä kudoksiin ja pariksi viereisen normaali limakalvo kudokset kerättiin 35 paksusuolensyöpä potilaiden General Hospital PLA (Peking, Kiina), ja käytettiin kvantitatiivista käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio (qRT- PCR) ja immunoblottaus-analyysi. Kirurgisesti-resektoitiin kudokset jäädytettiin nopeasti nestetypessä analyysiin asti. Kaikki näytteet, jotka on saatu tietoinen suostumus potilaiden ja kokeet hyväksynyt eettinen komitea yleinen sairaala PLA. Kaikki osallistujat toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen osallistumaan tähän tutkimukseen.

RNA ja qRT-PCR

Yhteensä-RNA, kuten miRNA, eristettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen) mukaan valmistajan ohjeiden . Sillä miRNA-analyysi, poly-A real-time qRT-PCR: ää käytettiin. Eristetty RNA polyadenyloituina käyttäen poly-A-polymeraasia (New England Biolabs) mukaan valmistajan protokollaa. Sitten poly-A-pyrstö RNA käänteiskopioitiin käyttäen IMPROM käänteistranskriptaasi (Promega), seuraten valmistajan protokollaa, ja miR-RT-aluketta (Invitrogen). MIR-RT-aluke oli: 5′-GCGAGCACAGAATTAATACGACTCACTATAGG (T) 18VN-3 ’. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen SYBR Green PCR Mix (Qiagen), mukaisesti valmistajan protokollan [12], kanssa seuraavia alukkeita: miR-130a, 5’-TTCACATTGTGCTACTGTCTGC-3 ’; miR-301a, 5’-GCTCTGACTTTATTGCACTACT-3 ’; miR-454, 5’-ACCCTATCAATATTGTCTCTGC-3 ’; yleispohjamaaliksi, 5’-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3 ’; U6-F, 5’-CGCTTCGGCAGCACATATACTA-3 ’, U6-R, 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCA-3’. Suhteellinen ilmentyvyys miR-130a /301a /454 normalisoitiin sisäisen valvonnan (U6) käyttäen 2

-ΔΔCt syklin kynnys menetelmä.

Soluviljely ja transfektio

ihmisen paksusuolen syövän solulinjat HCT116, HCT15, HT29, LoVo ja SW480 saatiin American Type Culture Collection (ATCC), ja RPMI-1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia (FBS), penisilliiniä ja streptomysiiniä, kostutetussa ilmakehässä 5% CO

2 37 ° C: ssa. MiRNA matkii ja miRNA inhibiittorit syntetisoitiin GenePharma (Shanghai, Kiina). MiRNA transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen).

Analyysi solujen elinkelpoisuuden

in vitro

solujen elinkelpoisuus HCT116 tai SW480-soluissa arvioitiin käyttämällä Cell Counting Kit -8 (CCK-8, Dojindo, Japani) menetelmällä. Lyhyesti, käytetty alusta korvattiin tuoreella alustalla, joka sisälsi 10 ui CCK8 reagenssin osoitettuina ajanjaksoina transfektion jälkeen. Sitten soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 h, ja elävien solujen lukumäärä arvioitiin mittaamalla absorbanssi 450 nm: ssä.

Cell migraatiokokeessa

HCT116 transfektantit nälkiinnytetään seerumin 12 h RPMI-1640-väliaineeseen, joka sisälsi 0,1% FBS: ää. Seerumin puutteessa solut trypsinoitiin ja suspendoitiin uudelleen RPMI-1640, joka sisälsi 0,1% FBS: ää, sitten 1 x 10

5 solua lisättiin ylempään kammioon (8 um huokoskoko, Corning) 24-kuoppalevyille seerumittomassa elatusaineessa (500 ui). Kun oli inkuboitu 24 tuntia 37 ° C: ssa, 5% CO

2, siirrettyjä soluja alapinnan kalvon värjättiin 0,1%: violetti värjäys liuosta 30 minuutin ajan, ja laskettiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia.

tuumorigeenisyystesti määritys nude-hiirissä

Kaikki kokeet, joissa käytetään eläimiä tehtiin mukaisesti National Institute of Health Guide for Care ja käyttö Laboratory Animals, luvalla tieteellisen Investigation hallitus General Hospital PLA. Tuumorigeenisyyden määritys suoritettiin kuten on raportoitu aiemmin [12]. Negatiivinen kontrolli tai miR-130 /301a /454 jäljittelevät transfektoidut HCT116 tai SW480-soluja (1 x 10

7) suspendoitiin 0,1 ml: aan PBS: ää, injektoidaan sitten subkutaanisesti kummallakin puolella posterior kylkeen saman 4-viikko- old BALB /c kateenkorvattomia nude-hiirissä. Kahdeksan nude-hiiriä kuhunkin ryhmään kuuluvan ja kasvaimen kasvua mitattiin päivittäin käyttäen jarrusatulat. Kasvaimen tilavuus laskettiin seuraavalla kaavalla: tilavuus = pituus x leveys

2 x 0,5. Ekspression miR-130 /301a /454 Tuumorinäytteissä ilmoitettuina aikoina havaittiin käyttämällä qRT-PCR-määritystä.

3’UTR lusiferaasireportterigeenin määritys

Ihmisen Smad4 3’UTR lusiferaasireportteriplasmidi ja plasmidi, joka sisälsi miR-130a /301 a /454 kohdepaikkaan deletoitu tai mutatoitu Smad4 3’UTR konstruoitiin kuten aiemmin on kuvattu [13]. Kaikki rakenteet vahvistettiin DNA-sekvensoinnilla. Lusiferaasireportteri–määritykset suoritettiin, kuten on raportoitu aiemmin [13]. Lyhyesti, Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin 48 tuntia transfektion jälkeen käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega), seuraten valmistajan ohjeita. Data normalisoitiin jakamalla

tulikärpäsen

lusiferaasiaktiivisuutta

Renilla

lusiferaasiaktiivisuus.

immunoblottauksella

hajotettiin proteiini uutteet tehtiin natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidia geelielektroforeesi (SDS-PAGE), siirrettiin nitroselluloosamembraaneille ja sitten blotattiin, kuten on raportoitu aiemmin [24]. Anti-Smad4-vasta-aine hankittiin Cell Signaling Technology. GAPDH-vasta-aineen ja toisen vasta-aineet saatiin Santa Cruz Biotechnology.

Tilastollinen analyysi

Data on esitetty keskiarvona ± S.D. Tilastolliset vertailut koeryhmään analysoitiin Student

t

-testaukset, ja kaksisuuntaista p-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä. Korrelaatio miR-130a /301a /454 ilmaisun ja Smad4 proteiinin taso analysoitiin Pearsonin korrelaatiokerrointa analyysi r ja p-arvot, kuten on osoitettu.

Tulokset

MiR-130a /301a /454 on säädellään ylöspäin paksusuolensyöpä kudoksissa ja solulinjoissa

tutkia rooleja miR-130a /301a /454 ihmisen paksusuolen syövän kehitystä, olemme havainneet ilmentymistasoissa 35 paria ihmisen paksusuolen syöpä ja viereisten normaali limakalvo kudoksiin. Mukaan qRT-PCR-analyysi, tasot miR-130 /301a /454 ilmentyminen oli huomattavasti kasvainkudoksissa verrattuna viereiseen normaaliin limakalvon kudoksissa (Fig. 1A-C). Lisäksi, miR-130 /301a /454 nostettiin koolonsyöpäsolulinjoissa (HCT116, HCT15, HT29, SW480, ja LoVo, Fig. 1 D-F). Lisäksi oli positiivinen korrelaatio joka toinen miRNA keskuudessa miR-130a /301a /454 (Fig. 1G-I), joka osoittaa yhteinen ilmaus profiili tässä miRNA perheen paksusuolensyöpä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-130a /301a /454 on säädellään ylöspäin koolonkarsinoomasoluissa, joilla voisi olla merkitystä ihmisen paksusuolen syövän kehitystä.

ilmentyminen miR-130a /301a /454 tutkittiin qRT -PCR 35 pariksi ihmisen paksusuolen syöpä ja viereisen normaalin limakalvon kudoksissa (A, B, C), ja koolonsyöpäsolulinjoissa kuten (D, E, F). Ilmaisu Mir-130a /301a /454 normalisoitiin U6 kussakin näytteessä. Tiedot esitetään erikseen ihmisen näytettä (A, B, C), tai keskiarvona ± S.D. (N = 3) solulinjoissa (D, E, F). **,

p 0,01

. (G, H, I) Tilastollinen analyysi korrelaatio joka toinen miRNA keskuudessa miR-130a /301a /454 suoritettiin käyttäen Pearsonin korrelaatiokerrointa analyysi.

r

ja

p

arvot näkyvät osoitettu.

MiR-130a /301a /454 parantaa solujen elinkelpoisuutta ja muuttoliike koolonsyöpäsolulinjaa

korkea ilmentyminen miR-130a /301a /454 paksusuolen syövän kudoksissa ja solulinjoissa sai meidät tutkimaan biologisen toiminnan näiden miRNA paksusuolen syöpä. CCK8 testi osoitti, että palauttaminen miR-130a /301a /454 merkittävästi parannettu leviämisen paksusuolensyöpä HCT116 tai SW480-soluissa (kuvio. 2A ja B), kun taas yli-ilmentyminen joko estäjän vastaan ​​miR-130a /301a /454 pienentää solun elinkelpoisuutta sekä paksusuolen syövän soluja (Fig. 2C ja D) Nämä kolme miRNA näytteillä samanlaiset kasvua edistäviä vaikutuksia paksusuolen syöpiä, eikä keskinäistä asetusten joukossa miR-130 /301a /454 havaittiin (Fig. 2E ja F). Lisäksi miR-130 /301a /454 edistetty soluvaelluksen HCT116-soluissa, analysoituna Transvvell- solu migraatiokokeessa (Fig. 2G, vasen paneeli). Sen sijaan knockdovvn miR-130a /301a /454 tukahdutettiin soluliikkuvuus paksusuolen syöpäsoluissa (Fig. 2G, oikea paneeli). Nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-130a /301a /454 edistää paksusuolen syövän solujen kasvua ja muuttoliike toimii siten onkogeeninen miRNA paksusuolen syöpä.

(A, B) Colon syöpä HCT116 ja SW480-solut transfektoitiin kontrolli-RNA tai miR-130a /301a /454 matkivat kuten. Solujen elinkelpoisuus havaitaan ilmoitettuina ajankohtina transfektion avulla CCK8 määrityksiä. *,

p

0,05. (C, D) inhibiittori miR-130 /301a /454 transfektoitiin HCT116 ja SW480-soluja, ja solujen elinkykyisyys havaitaan ilmoitettuina ajankohtina käyttäen CCK8 määrityksiä. *,

p

0,05. (E, F) tasot ilmentymisen kahdessa miRNA joukossa miR-130 /301a /454 havaittiin qRT-PCR-määrityksissä, kun matkivat tai inhibiittori muiden miRNA transfektoitiin HCT116-soluissa. (G) HCT116-solut transfektoitiin kontrolli-RNA, miR-130 /301a /454 matkivat tai miR-130 /301a /454-estäjän. Lukumäärä siirtynyt solujen laskettiin ja on esitetty. Data on esitetty keskiarvona ± S.D. (N = 3), ja yhdessä edustavassa kokeessa. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa. *,

p

0,05.

MiR-130a /301a /454 edistää tumorigenecity

in vivo

vahvistettiin lisäksi kasvain -edistää vaikutukset miR-130a /301a /454

in vivo

. Negatiivinen kontrolli-RNA, miR-130 /301a /454 matkivat tai inhibiittori transfektoitujen paksusuolen syöpäsoluissa, ruiskutettiin kahdeksaan nude-hiiriin, kuten on kuvattu. Kuten on esitetty kuviossa. 3, miR-130 /301a /454-transfektoitujen HCT116 ja SW480-soluissa oli nopea kasvaimen muodostumisen verrattuna negatiiviseen kontrolliin transfektanttien, kun taas knockdovvn miR-130a /301a /454 aiheuttanut viivästyneen kasvaimen muodostumisen (Fig. 3A-F). Tasot miR-130a /301a /454 ilmaisu todensi qRT-PCR määritykset kasvain näytteistä ilmoitettuina aikoina (Fig. 3G ja H). Nämä tulokset osoittavat, että miR-130a /301a /454 merkittävästi parannettu tuumorigeenisyystesti paksusuolen syöpäsoluissa nude hiiren ksenograftimallissa.

Effect of miR-130a /301a /454 tuumorigeenisyystesti nude hiiren ksenograftimallissa. Ohjaus RNA, miR-130 /301a /454 matkivat tai miR-130 /301a /454-inhibiittori-transfektoitujen paksusuolensyöpä HCT116-solut (A, B, C), ja SW480-soluja (D, E, F) injektoitiin subkutaanisti molemmin puolin posterior kylkeen saman nude-hiirten, vastaavasti (n = 8 ryhmää kohti). Kasvaimen kasvu käyrä näkyy osoitettu. *,

p

0,05. (G, H) Kasvaimen kudokset kerättiin kaksi hiirtä kussakin ryhmässä on ilmoitettu ajat, ja ekspressiotasoja miR-130 /301a /454 tutkittiin qRT-PCR-määrityksissä.

miR-130a /301 a /454 suoraan tukahduttaa ilmentymisen Smad4

perusteella miRNA kohde ennustuksen (https://www.targetscan.org), yli sata geenit ovat oletetun kohdegeenejä miR-130a /301a /454. Koska nämä miRNA pystyvät parantamaan tumorigenecity paksusuolen syöpäsoluissa

in vitro

ja

in vivo

, kohdegeenin säätelee miR-130 /301a /454 voi toimia kasvaimia estävä. Niistä oletetun kohdegeenien, Smad4 tärkeä tuumorisuppressorin mukana TGF-β /BMP signaloinnin, osoitettiin sisältävän konservoitunut oletetun miR-130 /301a /454 kohdepaikan, joka perustuu TargetScan ennustuksen (Fig. 4A). Onko vai ei Smad4 suoraan kohdistettu miR-130a /301a /454 ilmaisua, rakensimme lusiferaasireportterista sisältävien plasmidien Smad4 3′-UTR tai laakeri poisto /mutaatio oletetun miR-130a /301a /454 kohteessa. Kotransfektiolla kanssa miR-130 /301a /454 matkivat osoitimme, että lusiferaasiaktiivisuus villityypin Smad4-3’UTR toimittaja tukahdutettiin, kun taas kohde-sivuston deletoitu tai mutatoitu toimittaja ei voi kohdistaa miR-130a /301 a /454 kotransfektiolla (Fig. 4B). Huomattavaa on, että immunoblottaus analyysi osoitti, että miR-130a /301a /454 vähensi huomattavasti endogeenisen proteiinin ilmentymistä Smad4 verrattuna negatiiviseen kontrolliin RNA HCT116 ja SW480-solut (Fig. 4C). Smad4 toimii keskeisenä muuttimen transformoiva kasvutekijä (TGF) -β ja luun morfogeneettinen proteiini (BMP) signalointia, koska R-Smad muodostaa kompleksia, jossa Smad4 ja translokoituu tumaan säädellä geenin transkriptiota. Siksi pyrittiin määrittämään, ovatko nämä miRNA vaikuttaa TGF ja BMP signalointi toimintaa. miR-130a /301a /454 estäjän esiteltiin HCT116 transfektoitujen solujen TGF-β reportteri CAGA12-lux tai BMP reportteri BRE-lux. Kuten on esitetty kuviossa. 4D, miR-130 /301a /454 estäjä tehosti merkittävästi TGF ja BMP vasteita, kun konstitutiivisesti aktiivinen muoto TGF-β /BMP-reseptorin I (TβRI-ca /BMPRI-ca) koekpsressoitiin, mukana Smad4 säätelyä ylöspäin , mikä viittaa siihen, että miR-130a /301a /454 voi estää TGF-β /BMP signalointi estämällä Smad4 ilme.

(A) Ihmisen Smad4 saattaa olla molekyylitasolla miR-130a /301a /454. Sekvenssi rinnastukset miR-130a /301a /454 ja sen tavoite sivustoja 3’UTR Smad4, ladatut TargetScan (https://www.targetscan.org) esitetään. (B) HCT116-soluja kotransfektoitiin ihmisen Smad4 3’UTR

tulikärpäsen

lusiferaasireportteriplasmidin, miR-130 /301a /454 kohdesivustot deletoitu tai mutatoitu reportteri-konstrukti, yhdessä RL plasmideilla, ohjaus RNA, tai miR-130a /301a /454 matkivat, kuten on osoitettu. 48 h jälkeen

tulikärpäsen

lusiferaasin aktiivisuus mitattiin ja normalisoitu

Renilla

lusiferaasiaktiivisuus. (C) HCT116 ja SW480-solut transfektoitiin kontrolli-RNA tai miR-130a /301a /454 matkivat. 48 tunnin kuluttua ihmisen Smad4 ja sisäistä valvontaa GAPDH havaittiin immunoblottauksella (ylempi paneeli), ja tasot miR-130a /301a /454 ilmentyminen mitattiin qRT-PCR (alempi kuva). Densitometrian suhde Immunoblottausta näytettiin. (D) HCT116-solut kotransfektoitiin TGFp reportteri CAGA12-lux tai BMP reportteri BRE-lux yhdessä RL plasmidilla, ohjaus RNA tai miR-130a /301a /454 estäjä, ja TβRI-ca tai BMPRI-ca , kuten osoitettu. 48 h jälkeen

tulikärpäsen

lusiferaasin aktiivisuus mitattiin ja normalisoitu

Renilla

lusiferaasiaktiivisuus. Endogeeninen ilmaus Smad4 ja GAPDH havaittiin immunoblottauksella. TβRI-ca, konstitutiivisesti aktiivisen muodon TGF-β-reseptorin I; BMPRI-ca, konstitutiivisesti aktiivinen muoto BMP-reseptorin I (E) Smad4 ilmentymistä tyhjiin pCDNA vektorin tai Smad4 ilmentävä plasmidi stabiilisti transfektoidut HCT116-solujen havaittiin immunoblottauksella. (F, G) ohjaus tai Smad4 stabiilisti transfektoidut HCT116-solut transfektoitiin kontrolli-RNA, miR-130 /301a /454 matkivat (F), tai miR-130 /301a /454 estäjä (G), kuten on osoitettu. Solujen elinkelpoisuus havaittiin 96 tunnin kuluttua transfektion avulla CCK8 määrityksiä. *,

p

0,05.

Lisäksi olemme määritetään, onko kasvua edistävät vaikutukset miR-130a /301a /454 ovat pääasiassa suunnattu Smad4 ilme. Smad4 ilmentäviä plasmidi stabiilisti transfektoidut HCT116-soluja valmistettiin, joka transkriptoidaan Smad4 mRNA ilman 3’UTR järjestyksessä. Näissä soluissa, Smad4 ilmentyminen on todettu lisääntynyt verrattuna kontrollisoluihin (kuvio. 4E); kuitenkin, miR-130 /301a /454 enää kohdennettua Smad4 ilmaisua, koska nämä solut puhtaaksi Smad4 mRNA ilman 3’UTR. Huomattavaa on, että kasvu-kasvava vaikutukset miR-130a /301a /454 merkittävästi tukahdutettiin Smad4-transfektoiduissa HCT116-solut (Fig. 4F). Lisäksi miR-130 /301a /454 estäjä ei tukahduttaa solujen elinkelpoisuuden näissä soluissa (kuvio. 4G). Nämä tulokset osoittivat lisäksi, että kasvua edistävää roolit miR-130a /301a /454 olivat pääasiassa estämällä Smad4 ilmaisun.

Kliininen korrelaatiota miR-130a /301a /454 tasoa ja Smad4 ilmaisun

ymmärtää kliinistä merkitystä miR-130a /301a /454 ja sen tavoite paksusuolensyöpä, määritimme tasot miR-130a /301a /454 ja proteiinin ilmentymistä Smad4 14 pareina paksusuolensyöpä näytteistä qRT- PCR ja immunoblottauksella, vastaavasti (Fig. 5A ja B). Kuten odotettua, Pearsonin korrelaatiokerrointa analyysi ehdotti, että Smad4 ilmentyminen korreloi käänteisesti miR-130a /301a /454 ilmentymisen paksusuolensyöpä kudoksissa (Kuva. 5C-E). Nämä tulokset tukevat käsitystä, että yli-ilmentyminen miR-130a /301a /454 johtaa Smad4 alassäätöä, estäen siten TGF-β signalointia välittämiä solun kasvun hidastuminen, joka edistää kehitystä paksusuolen syövän.

(A, B) ilmentäminen Smad4 ja GAPDH näytteitä sovitetun paksusuolen syöpä ja ei-neoplastisia limakalvon kudoksissa havaittiin immunoblottauksella (A). miR-130a /301a /454 ilmentymistä tutkittiin qRT-PCR (B). Neljä edustavia tapauksia esitetään. (C) suhteellinen taso Smad4 tai miR-130a /301a /454 lauseke normalisoitiin sisäisen GAPDH tai U6 ilme. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Pearsonin korrelaatiokerroin analyysi. Normalized miR-130a /301a /454 ja Smad4 proteiinin ekspressiotasot esitetään standardoitu arvoja.

r

ja

p

arvot näkyvät osoitettu.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että miR-130a /301a /454 on säädellään ylöspäin paksusuolensyöpä, ja edelleen osoittanut lisääntymistä edistävää vaikutusta miR-130a /301a /454 koolonkarsinoomasoluissa. MicroRNA-130a /301 a /454 on merkitty onkogeeninen miRNA paksusuolen syövän kehittymisessä ja etenemisessä, joka on yhdenmukainen rooleja muiden syöpien, kuten maksasyövän, nonsmall keuhkosyöpä, krooninen myelooinen leukemia, haimasyöpä ja rintasyöpä [15 ] – [21]. Kuitenkin miR-130a säätyy alas kroonisen lymfaattisen leukemian, ja voi moduloida solujen selviytymistä estämällä autophagy ohjelmaa [22]. Lisäksi plasman miR-301a on alassäädetty potilailla, joilla on sirppisoluanemia, verrattuna normaaliin valvontaa, joka liittyy PAI-1 tukahduttaminen [23]. Tunnetut ekspressiokuviot, mahdollisia kohteita, ja biologisia toimintoja tämän miR-130 /301a /454 perhe on esitetty yhteenvetona taulukossa 1 [15] – [23], [25] – [29]. Eri ilmaus ominaisuudet miR-130a /301a voi heijastaa erilaisia ​​rooleja miR-130/301 perheen eri syöpätyyppien. Näin ollen vapautuminen miR-130a /301a /454 olemassa selvä syöpätyyppejä, ja roolit tämän miRNA perheen syövän synnyn ja etenemisen voida yksinkertaisesti päätellä tuumorisuppressorina tai onkogeeni. Exploring ilmaisun profiilit ja roolit miR-130a /301a /454 paksusuolensyöpä suuresti laajentaa ymmärtäminen tälle tärkeälle miRNA perheen kasvaimien syntyyn.

TGF-β signalointireitin on olennaisia ​​rooleja lukuisissa biologisia prosesseja. Smad4, keskeinen anturin TGF-β: n ja BMP-signalointireitin, toimii tärkeänä tuumorisuppressorigeenin. Smad4 mutaatioita tai deleetioita on laajalti havaittu eri syöpien, kuten paksusuolen ja peräsuolen, haiman, ja rintasyöpiä [30] – [32]; kuitenkin yksityiskohtainen mekanismi Smad4 inaktivaation on rajallinen. Olemme osoittaneet, että miR-130a /301a /454 tukahduttaa Smad4 ilme suoraan sitoutuu 3’UTR, kun huomasimme myös, että on olemassa muita miRNA konsensus sivustoja Smad4 3′-UTR (esim sivustoja miR-34a, asennuspalveli- 146a, ja miR-199, joka on tunnistettu alipaineensäätöventtiileillä of Smad4 mahasyövän ja glioblastooma) [33] – [35]. Siksi emme voi sulkea pois mahdollisuutta, että nämä miRNA osallistuvat myös alas-säätely Smad4 ilmaisun kehittämisessä paksusuolen syövän. Lisäksi emme voi sulkea pois sitä mahdollisuutta, että muut mahdollisia kohteita miR-130a /301a /454 voi hallita muita syöpää reittejä ja edistää paksusuolen syövän, yhtenä miRNA tiedetään kohdistaa useisiin mRNA: iden. Nämä olettamukset ilmoittaa tarpeesta lisätutkimuksia paljastaa koko ”targetome” on miR-130/301/454 perhe paksusuolen syövän synnyn ja etenemisen.

Indusoidut pluripotenttien kantasolujen (iPSCs) voidaan muodostaa pakko ilme transkriptiotekijöiden, kuten Oct4, Sox2, Klf4, ja c-Myc [36]. Erityiset miRNA on osoitettu olevan osallisena iPSC sukupolven, kuten miR-290 ja miR-302 [37] – [39]. Äskettäin Pfaff et al. [25] osoittivat, että miRNA perhe (miR-130/301/721) toimii tärkeänä säätelijänä iPSC induktion kohdistamalla homeobox transkriptiotekijän, Meox2. Sukupolvi iPSCs liittyy prosessin mesenkymaalisten-to-epiteelin siirtyminen (MET), siis tekijät asiakkuutta MET tai estää epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT) estämällä TGF-β signalointi on keskeinen rooli solujen uudelleenohjelmointi [40] . Olemme löytäneet uuden tavoite miR-130/301/454 perhe (Smad4), jossa on keskeinen tehtävä TGF-β signalointia, joka tarjoaa mahdollisuuden, että miR-130/301/454 perhe voi ohjata kyseeseen estämällä TGF-β /Smad4 aktiivisuus. Niinpä meidän tutkimukset ovat tuoda uusia näkymiä molekyylitason mekanismi ja ylikuulumisen kantasolujen sääntelyn ja kasvaimen kehittymisen.

Yhteenvetona tuloksemme vahvistavat, että miR-130a /301a /454 perhe on ratkaiseva tekijä erilaisissa syövän kehittymisen ja etenemisen. Siten miR-130a /301a /454 perhe voi edustaa lupaavaa molekyylikohteena varhaiseen toteamiseen syöpiä.