Krooninen sairaus

tiivistelmä

silybin tai silibinin, eli flavonolignan eristetty ohdake siemenet, on yksi suosituimmista ravintolisiä ja on tutkittu laajalti antioksidantti, hepatoprotective ja syövän ominaisuuksia. Olemme visioi, että teho silybiinillä voitaisiin entisestään tehostaa sopivien muutos /s sen kemiallinen rakenne. Näin ollen, tässä, syntetisoimme ja tunnettu sarja silybiinin johdannaisia ​​eli 2,3-dehydrosilybiinillä (DHS), 7-

O

-methylsilybin (7OM), 7-O-galloylsilybin (7OG), 7,23 -disulphatesilybin (DSS), 7-

O

-palmitoylsilybin (7OP), ja 23-

O

-palmitoylsilybin (23OP); ja verrattiin niiden syöpälääkkeen tehoa käyttämällä ihmisen virtsarakon syöpä HTB9, paksusuolen syöpä HCT116 ja eturauhasen syöpä PC3-soluissa. Kaikissa 3 solulinjoissa, DHS, 7OM ja 7OG osoittivat parempaa kasvua estäviä vaikutuksia ja verrataan silybin, kun taas muut silybin johdannaisia ​​osoittivat vähemmän tai ei lainkaan tehoa. Seuraavaksi valmistetaan optisten isomeerien (A ja B) silybiinillä, DHS, 7OM ja 7OG, ja verrattiin niiden syöpälääkkeen tehoa. Isomeerit näistä kolmesta silybiinillä johdannaisten myös osoittautui tehokkaammaksi verrattuna vastaaviin silybin isomeerien, mutta jokaisessa ei ollut peräkkäistä silybin A- versus B isomeerin aktiivisuutta etusija. Lisätutkimukset in HTB soluissa havaittiin, että DHS, 7OM ja 7OG kohdistaa paremmin apoptoottista aktiivisuutta kuin silibinin. Klonogeeniset määrityksissä HTB9 soluissa vahvisti lisäksi, että sekä raseemiset seokset sekä puhtaita optisia isomeerejä DHS, 7OM ja 7OG olivat tehokkaampia kuin silybin. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat selvästi, että syövän tehoa silybiinillä voitaisiin merkittävästi tehostaa rakenteellisia muutoksia, ja tunnistaa vahvoja syöpälääkkeen tehoa silybiinillä johdannaisten, eli DHS, 7OM, ja 7OG, merkitsee, että niiden tehoa ja toksisuutta olisi arvioitava asiaankuuluvilla prekliinisen syövän mallien jyrsijöillä.

Citation: Agarwal C, Wadhwa R, Deep G, Biedermann D, Gažák R, Kren V, et al. (2013) Anti-Cancer teho silybiinillä Johdannaiset – rakenne-aktiivisuussuhde. PLoS ONE 8 (3): e60074. doi: 10,1371 /journal.pone.0060074

Toimittaja: Stephen J. Polyak, University of Washington, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 joulukuu 2012; Hyväksytty: 21 helmikuu 2013; Julkaistu: 28 maaliskuu 2013

Copyright: © 2013 Agarwal et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat NCI RO1 myöntää CA102514 ja CA112304, AMVIS CZ-US yhteistyöprojekti ME10027 opetus- Tsekin (VK ja RA), ja RVO61388971 (Institutional käsite Institute of Microbiology, Praha). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

silybin tai silibinin (C

25H

22o

10, CAS-nro 22888-70-6, kuva 1a) on suosittu ravintolisä eristetty siemenistä

silybum marianum

(L.) Gaertn (Family Asteraceae), joka tunnetaan Ohdakeöljyä. Ohdake uute merkitään silymarin on pitkä käyttöhistoria kansanlääkinnässä ja nyt usein käytetään ehkäisyyn ja /tai hoitoon maksahäiriöt kuten virushepatiitin, maksakirroosi alkoholin väärinkäyttöön liittyvät, maksavaurio huumeista teollisuuden toksiinit [1] – [3]. Silybin pidetään myös tehokas vastalääke vastaan ​​myrkytys kuoleman cap sieni (

kavalakärpässieni

) [2], [4]. Lisäksi silybin myös esittelee vahva antioksidantti kautta huuhteluilman hydroksyyliradikaaleja ja estämällä lipidiperoksidaation toimimalla ketjun rikkomatta antioksidantti [5], [6]. Viimeisten kahden vuosikymmenen aikana, lisäksi hepatoprotective ja antioksidanttivaikutuksia, silybin on osoittanut huomattavaa anti-syövän sekä syöpää chemopreventive tehoa prekliinisissä soluviljelmissä ja eläinmalleissa useiden epiteelisyöpien kuten ihon, virtsarakon, paksusuolen, eturauhasen, keuhkojen jne. [7], [8]. Perustuen nämä lupaavia tuloksia prekliinisissä tutkimuksissa, silybin on myös testattu ihmisen syöpäpotilaiden vaiheen I-II pilot kliinisissä tutkimuksissa, joissa se oli kuitenkin hyvin siedetty ja plasman ja kohde-kudoksessa hyötyosuuden [7], [ ,,,0],9] – [11]. Useat perinteiset toksisuustestejä ovat osoittautuneet myrkytön luonne silybiinillä, ja se on raportoitu olevan turvallisia ihmisravinnoksi [10], [12]. Perustuen sen osoittautuneet sekä uusia ennaltaehkäiseviä ja terapeuttinen teho syöpää vastaan, se olisi erittäin merkittäviä ja translaation arvoa, jos tehoa silybiinillä voitaisiin tehostaa entisestään kautta sopivan kemiallisen muutos /s rakenteeltaan, koska on selvää, että silybin on tehokas ”lyijyä rakenne”.

(a-h) Kemialliset rakenteet silybiinillä, silybin A, silybin B, 2,3-dehydrosilybiiniin, 7-

O

-methylsilybin, 7-

O

-galloylsilybin, 7,23-disulfaattitosylaatti silybin, 7-

O

-palmitoylsilybin, ja 23-

O

-palmitoylsilybin.

viime vuosina on ollut enemmän painoa ymmärtäminen yksityiskohtainen kemiallinen rakenne silybiinillä, tunnistaminen ja syntetisointi sen stereoisomeerit sekä arvioidaan niiden biologista tehokkuutta [13] – [17]. Silybin on nyt vahvistettu olevan 01:01 seos kahdesta optisten isomeerien eli silybin A ja silybin B (kuva 1b ja 1c). Lisäksi yksityiskohtaiset rooli vastaavien hydroksyyliryhmää ja osat silybiinillä on nyt hyvin tunnettu, ja että tieto on sallittu määrittää soveltuvat sivustoja suunnittelu ja synteesi uusien silybiinin johdannaisia ​​vaikuttamatta biologiseen aktiivisuuteen tuloksena konjugaattien [18] , [19]. Nämä tutkimukset ovat havainneet, että sopivin kantoja silybin muutokset ovat 7-OH ja /tai 23-OH [18], [19]; ja perustuvat näitä kriittisiä havaintoja, useita johdannaisia ​​silybiinillä on suunniteltu, syntetisoitu ja karakterisoitu [20] – [23]. Olemme esimerkiksi syntetisoitu ja karakterisoitu 7

-O

– ja 23

-O

asyyli-johdannaisten silibinin vaihtelevalla asyyliketjun pituudet, ja ovat vahvistaneet antioksidantti ja anti-virus toimia [20]. Vastaavasti, sarja silybiinillä galloyl estereitä on myös syntetisoitu, ja 7

-O

-galloylsilybin todettiin tehokkain yhdiste suhteen anti-angiogeeninen teho [21]. Olemme myös raportoitu, että anti-angiogeeninen tehoa B-isomeeri, 7

-O

-galloylsilybin on huomattavasti korkeampi kuin A-isomeeri [21]. Samoin silybin hapettumista tuote, 2,3-dehydrosilybiiniin, on myös syntetisoitu joka osoitti parempaa hapettumisenestopotentiaali kuin silybin; karboksyylihappojohdannainen 2,3-dehydrosilybiinillä, nimittäin 2,3-dehydrosilybinic happo, on osoittanut, parempi anti-lipidi-peroksidaatiota ja anti-radikaaleja toiminnan ja näyttää parempi vesiliukoisuus [22], [24]. Olemme myös laatineet suuren joukon

O

-alkyyli johdannaiset (metyyli ja bentsyyli) silybiinillä ja 2,3-dehydrosilybiini, ja ovat tunnistaneet joitakin uusia johdannaisia, joilla on vahva teho vastaan ​​P-glykoproteiinin välityksellä lääke effluksiaktiivisuus [23]. Yhdessä edellä tutkimukset selvästi ehdotti, että biologinen tehokkuus silybiinillä voitaisiin merkittävästi tehostaa sopivalla kemiallisella muunnoksia.

, että useat silybiinillä johdannaisia ​​ovat osoittaneet parempi aktiivisuus, että vanhempi molekyylin eri biologisten järjestelmien ja että silybin itse kykenee voimakas anti-syöpä tehoa, tässä tutkimuksessa, vertasimme syöpälääkkeen tehoa useiden silybiinillä johdannaisten (sekä nykyiset sekä uusittu) kolmessa eri ihmisen syöpäsolujen linjat, ja tunnistettu kolme silybin johdannaisten anti- syöpä aktiivisuus parempi kuin silybin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely, hoito ja reagenssit

Ihmisen virtsarakon syöpä HTB9 soluja, paksusuolen syöpä HCT116-solut ja eturauhasen syöpä PC3-solut hankittiin American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). HTB9 ja PC3-soluja viljeltiin RPMI1640-väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia ja 100 U /ml penisilliini G ja 100 ug /ml streptomysiinisulfaattia 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa. HCT116-soluja kasvatettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 100 U /ml penisilliini G ja 100 ug /ml streptomysiinisulfaattia 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa. Kaikki soluviljelyn materiaalit olivat Invitrogen Corporation (Gaithersburg, MD). Solut maljattiin ja käsiteltiin 40-50% konfluenssiin eri annoksilla silybiinillä tai sen johdannaisten (5-60 uM väliaineessa) liuotetaan alun perin DMSO halutun ajanjaksojen alle seerumin kunnossa. Yhtä suuri määrä DMSO: ta (ajoneuvo) oli läsnä kussakin hoitoon, mukaan luettuna kontrolli; DMSO-konsentraatio ei ylittänyt 0,1% (v /v) mitään hoitoa. Lopussa halutun hoitoja, eri analyysit suoritettiin, kuten on kuvattu myöhemmin. Primaarisen vasta-aineen ja cPARP ja anti-kani-peroksidaasi konjugoitu sekundaarinen vasta-aine hankittiin Cell Signaling (Beverly, MA). Vasta-aine tubuliinin oli peräisin Neomarkers (Fremont, CA). Hoechst 33342, kristalliviolettia ja propidiumjodidilla (PI), olivat Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). ECL tunnistusjärjestelmä ja anti-hiiri peroksidaasiin konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineella oli GE Healthcare (Buckinghamshire, UK). Kaikki muut reagenssit saatiin niiden kaupallisesti saatavilla erittäin puhdasta luokka.

Kemian

Silymarin kuin perusaineena kaikille peräkkäisten tuotteiden saatiin Liaoningin Senrong Pharm. Co., Ltd (Panjin Liaoningin maakunnassa Kiinassa). Optisesti puhdas silybin A ja silybin B saatiin, kuten on kuvattu aiemmin [25], [26]; erityisesti uusi preparatiivinen erotusmenetelmä kehittämiä äskettäin [25], [26], joka perustuu lipaasin katalysoima entsymaattinen syrjintää molempien silybin stereoisomeerien, mahdollisti valmistelua kaikki johdannaiset mainittu tässä työssä optisesti puhtaassa muodossa suuresta mittakaavassa. Menetelmiä synteesin, synteesikaavioissa ja analyyttiset tiedot vahvistavat rakenteen aiemmin syntetisoitu ja on raportoitu silybin johdannaiset (jotka arvioitiin niiden syövän vastaista aktiivisuutta tässä tutkimuksessa) on esitetty yhteenvetona menetelmiä S1 ja kuviot S1, S2, S3, S4, S5, ja taulukot S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, vastaavasti. Lyhyesti, 2,3-dehydrosilybiiniin (DHS) A ja B valmistettiin emäksen-hapetuksella vastaavan silybiinin A ja B, kuten on kuvattu äskettäin [22], [24]; 7-

O

-Methylsilybin (7OM) A ja B valmistettiin emäskatalysoitu metylaatio vastaavien silybiinin A ja B [23]; ja 7-

O

-palmitoylsilybin (7OP), 23-

O

-palmitoylsilybin (23OP) ja 7-

O

-galloylsilybin (7OG) sekä silybin A B syntetisoitiin, kuten on kuvattu aikaisemmin meille [20] – [23].

valmistus 7,23-disulfaatti silybin [silybin-7,23-diyyli

bis

(vetysulfaattina), DSS], ja karakterisointi Massa- ja NMR Spectra

sekoitettuun liuokseen, silybiinin [silybiiniä A, silybin B tai luonnollista silybin A B (01:01), 200 mg, 0,43 mmol] DMF: ssä (2 ml), Py⋅SO

3 (200 mg, 1,26 mmol) lisättiin. Reaktio sammutettiin sen jälkeen, kun 1 h Stiring 40 ° C: ssa lisäämällä EtOH: ssa (0,5 ml). Lyhyen sekoittamisen jälkeen reaktioseos ladattiin silikageelipylvääseen ja kromatografoitiin liuottimen kanssa EtOH /MeOH /CH

2CI

2 /vesi (2/1 /9 /0,3), jolloin saatiin vaaleankeltainen öljyä, joka lyofilisoitiin, jolloin saatiin otsikon mukaista yhdistettä joko puhtaana diastereomeeri A tai B tai seos A B (CCA 160 mg, 60%) vaaleankeltaisena lyofilisaatin.

massaspektrit syntetisoidun yhdistettä mitattiin matriisi laserdesorptio /ionisaatio reflektroni aika-of-lennon MALDI-TOF massaspektrometrillä ULTRAFLEX (Bruker-Daltonics, Bremen, DE). Positiiviset spektrit kalibroidaan käyttämällä ulkoista monoisotooppinen [M + H] + ioni ihmisen angiotensiini I 1296,69

m /z

, MRFA peptidi 524,26

m /z

ja CCA matriisin huipun 379,09

m /z

. 10 mg /ml liuosta, jossa oli α-syano-4-hydroksi-kanelihappo tai 2,5- dihydrobentsoehapon 50% MeCN /0,3% etikkahappoa käytettiin MALDI matriisi. A1 ui näytettä liuotetaan veteen, annettiin kuivua ympäristön lämpötilassa ja yli-noudattaen, jossa on 0,3 ui matriisiliuosta kohteessa. MALDI-TOF positiivinen tai negatiivinen spektrit kerättiin reflektoritoimintatilaa. MS (MALDI-TOF):

m /z

(%) = 643 (17, M

+. + H), 561 (32), 547 (36), 545 (100), 481 (25), 465 (69).

NMR-spektrit mitattiin Bruker AVANCE III 400 (havainto esiintyvistä 400,13 MHz

1 H, 100,62 MHz

13C) in DMSO

d

6

(Sigma Aldrich) 30 ° C: ssa. Jäännösliuotin signaalia käytettiin sisäisenä standardina ((δ

H 2.500, δ

C 39.60). Kemialliset siirtymät ja vuorovaikutus vakiot kirjattiin spektreistä, joista painotusfunktiot (eksponentiaalinen negatiivinen eksponentti ja Gauss-toiminto) on sovellettu. kemialliset siirtymät ilmaistaan ​​δ-asteikko (ppm) ja vuorovaikutus vakioita Hz. Digital resoluutio mahdollistaa ilmaisemiseen kemialliset siirtymät protonien kolmella ja hiiltä kahden desimaalin tarkkuudella, vastaavasti, ja protoni-protoni vuorovaikutus vakiot yhden desimaalin tarkkuudella. moninaisuus hiilisignaalit määritettiin protoni-muokattu HSQC- spektrien. Signaali toimeksianto perustuu 2D NMR-kokeet – COSY, HSQC, HMBC, joka suoritettiin käyttäen vakio-ohjelmaa (Bruker Biospin GmbH, Rheinstetten, DE).

1 H ja

13C-NMR-spektrit sekä optisesti puhtaan silybinA-7,23-diyyli

bis

(vety sulfaatti) ja silybinB-7,23-diyyli

bis

(vety sulfaatti), joita ei ole raportoitu Tähän mennessä, on esitetty taulukoissa 1 ja 2, vastaavasti.

Cell Growth määritykset

kussakin tapauksessa solut maljattiin noin 40-50% konfluenssiin ja käsiteltiin kanssa silybin tai sen johdannaisten tai puhtaiden isomeerien kunkin yhdisteen alle seerumin kunnossa kuten edellä. Sen jälkeen, kun 24 ja 48 h hoitoja, solut kerättiin lyhyt trypsinisaatiolla ja pestään PBS: llä. Solujen kokonaismäärä määritettiin laskemalla kullekin näytteelle kahtena hemosytometrillä alle käännettyä mikroskooppia. Jokainen hoito ja ajankohta oli kolme itsenäistä levyä.

apoptoosimäärityksessä

Quantitative apoptoottisen solukuoleman silybin ja sen johdannaisten HTB9 soluissa mitattiin Hoechstin määritys edellä kuvatulla [27]. Lyhyesti, kun haluttu hoitoja, solut kerättiin ja värjättiin sitten DNA-sitovan väriaine Hoechst 33342 ja PI. Apoptoottisia soluja kvantitoitiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia (Axioskope 2 plus-HBO 100, Zeiss, Jena, DE) laskemalla solua /mikroskooppisia kenttä (400 x) kuudella kenttiä kullekin näytteelle (kolmena kappaleena). Apoptoottiset solut osoittivat kirkkaan sininen (varhainen apoptoottinen) tai oranssi-punainen fluoresenssi (myöhäinen apoptoottiset), joka erottaa nekroottinen soluista osoittaa kirkkaan punaisen fluoresenssin (PI-värjätty).

Western-blottaus

Western blotting, lysaatit (80 ug) denaturoitiin 2 x SDS-PAGE-näytepuskuriin ja erotettiin 8% Tris-glysiini-geeleihin. Erotetut proteiinit siirrettiin nitroselluloosakalvolle minkä jälkeen salvattiin 5% rasvatonta maitojauhetta (paino /tilavuus) Tris-puskuroidussa suolaliuoksessa (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1% Tween 20) 1 h huoneen lämpötilassa. Blokkauksen jälkeen membraanit tutkittiin primaarisen vasta-aineen 2 h ajan huoneenlämpötilassa ja sitten yön yli 4 ° C: ssa, jota seuraa asianmukainen peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa ja visualisoitiin ECL tunnistusjärjestelmä. Kussakin tapauksessa blotit tehtiin päällekkäisvalotuksia filmin varmista, että bändi tiheys on lineaarisella alueella. Kaikkien tulokset, -autoradiodiagrammi /bändit skannattiin Adobe Photoshop 6.0 (Adobe Systems Inc., San Jose, CA). Tasapuolisen proteiinia lastaus, kukin kalvo oli riisuttu ja uudelleen koetettiin α-tubuliinin vasta-aine.

klonogeeninen Pitoisuus

HTB9 solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja sallitaan liittää levyt 24 h. Sen jälkeen, riippuen hoito-protokollaa, soluja käsiteltiin kunkin yhdisteen välein 72 h tai käsitelty vain 2 tunnin välein 24 tunnin ajan. Lopussa ilmaistu jakso, solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä, kiinnitettiin metanoli ja jääetikkaa (03:01) 10 minuutin ajan ja värjättiin sitten 1% kristallivioletilla metanolissa 15 minuuttia, mitä seurasi pesu deionisoidulla vedellä. Pesäkkeitä, joiden yli 50 solusta, laskettiin.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen SigmaStat 2,03 ohjelmistoa (Jandel Scientific, San Rafael, CA). Aineisto analysoitiin yksisuuntainen ANOVA seurasi Tukey t-testiä, ja tilastollisesti merkitsevä ero harkita

p

≤0.05.

Tulokset

Effect silybiinillä ja sen johdannaiset Cancer Cell Growth

ensin verrattuna kasvua estävä vaikutus silybiinin ja sen johdannaiset (kemiallisten rakenteiden esitetty kuviossa 1) DHS, 7OM, 7OG, DSS, 7OP ja 23OP ihmisen syöpäsolulinjoissa virtsarakon , paksusuolen ja eturauhasen alkuperä, nimittäin HTB9, HCT116 ja PC3 vastaavasti; etenkin, silibinin on osoittanut voimakasta syöpälääkkeen tehoa ennalta syövän malleja virtsarakon, paksusuolen ja eturauhasen syöpiä [7], [8]. Kuten on esitetty taulukossa 3, ja HTB9 solujen 30 ja 60 uM annoksilla, DHS, 7OM ja 7OG olivat tehokkaampia kuin silybin jälkeen 24 ja 48 tunnin hoitoja kannalta solujen kasvun inhibition; kuitenkin on ekvimolaariset konsentraatiot, kasvua estäviä vaikutuksia muut johdannaiset, nimittäin DSS, 7OP, ja 23OP, olivat epäjohdonmukaisia ​​ja joko yhtä suuri tai pienempi kuin silybin. Vastaavasti HCT116-soluissa, DHS, 7OM ja 7OG olivat tehokkaita inhiboimaan solujen kasvua verrattuna silybiiniin ja muut silybin johdannaiset (taulukko 3). PC3-soluja, silybin johdannainen (30 ja 60 uM annosta) osoitti yhtä suuri tai parempi kasvun inhibitio kuin silybin 24 tunnin kuluttua hoidon (taulukko 3). Jälleen DHS, 7OM ja 7OG olivat paljon tehokkaampia kuin silybin tai muut johdannaiset 24 ja 48 h hoitoja kannalta solujen kasvun inhibition; mutta vaikutus muiden silybiinillä johdannaiset (DSS, 7OP, ja 23OP) oli suurelta osin menetetty 48 tunnin ajan pisteen (taulukko 3). Yhdessä nämä tulokset osoittavat selvästi, että vain DHS, 7OM ja 7OG johdannaiset silybiinillä on paljon voimakkaampi syövän tehoa kuin vanhemman rakenne, ja sen vuoksi ainoastaan ​​nämä kolme johdannaisia ​​käytettiin myöhemmissä tutkimuksissa.

Vaikutus silybiinillä ja sen johdannaisten apoptoosin vuonna HTB9 Solut

Seuraavaksi vertasimme vaikutus silybiinillä ja sen kolme aktiivisin johdannaisten (DHS, 7OM ja 7OG) 30 uM annoksen induktioon apoptoottisen solukuoleman HTB9 soluja. Kuten on esitetty kuviossa 2A-pohjapaneelin, 24 h hoidon, silybiiniä ja sen johdannaiset lisäsi merkittävästi apoptoottisen solukuoleman HTB9 solussa, ja 7OG oli voimakkain apoptoosin. Kuitenkin Western blot analyysit apoptoosin merkki cPARP kasvoi voimakkaasti vain 7OG (kuva 2A-yläpaneeli). Paremmin tehoa silybiinillä johdannaisten oli selvästi havaittavissa 48 tunnin kuluttua hoidon jossa DHS, 7OM ja 7OG lisäsi merkittävästi apoptoottisten solupopulaation (kuvio 2B-alapaneeli) sekä lisääntynyt taso cPARP vuonna HTB9 soluissa (kuvio 2B-ylempi paneeli). Nämä tulokset vahvistettiin lisäksi voimakas ja parempi syövän tehoa DHS, 7OM ja 7OG verrattuna silybiiniin vastaan ​​HTB9 soluja.

(A-B) HTB9-soluja käsiteltiin 30 uM annos silybiinillä (SB), 2,3-dehydrosilybiinillä (DHS), 7-

O

-methylsilybin (7OM), ja 7-

O

-galloylsilybin (7OG). Sen jälkeen kun 24 tai 48 tuntia kunkin hoidon, solut kerättiin ja apoptoottisten väestö määritettiin Hoechstin määrityksessä yksityiskohtaisesti ”Materiaalit ja menetelmät”. Baarissa kaaviot, kukin data-pisteen edustaa keskiarvoja ± SD 3 näytettä. (A-B, western blot insertti) Solut kerättiin myös seuraavat silybin tai sen johdannaisia ​​hoitoa ja analysoitiin cPARP proteiinin tason Western-blottauksella. Kussakin tapauksessa kalvot olivat myös riisuttu ja uudelleen koetettiin α-tubuliinin vasta tarkistaa Proteiinilisäyksen. * P≤0.001.

Effect of Pure optisten isomeerien silybiinillä ja sen johdannaisten Cancer Cell Growth

Kuten edellä mainittiin, että silybin on seos (1:01 suhde) optisten isomeerit silybin A ja silybin B, me seuraavaksi valmistetaan suuria määriä näitä kahta silybiinillä isomeerejä ja hyödyntää niitä syntetisoimaan suuria määriä niiden johdannaisten DHS (A ja B), 7OM (A ja B) ja 7OG (A ja B) on yhteenveto menetelmiä edellä. Näitä puhtaita optisia isomeerejä silybiinillä ja niiden johdannaiset arvioitiin sitten niiden syöpäsolujen kasvua estäviä vaikutuksia. Kaikissa kolmessa syöpäsolulinjoissa, eli HTB9, HCT116 ja PC3, puhtaiden isomeerien (30 ja 60 uM annosta) DHS, 7OM ja 7OG olivat tehokkaampia kuin vastaaviin isomeeri silybiinillä jälkeen 24 ja 48 tunnin hoitoja (taulukko 4) . Kun verrataan solun kasvua estäviä vaikutuksia isomeeri A versus isomeeri B ja niiden johdannaisista, ei peräkkäistä havainto voitaisiin kuitenkin silybin B isomeeri ja sen johdannaiset tuntui tehokkaampi kuin isomeeri ja sen johdannaiset (taulukko 4).

Seuraavaksi verrattuna kasvua estäviä vaikutuksia pienemmillä annoksilla (5 ja 10 uM) optisten isomeerien silybiinillä (silybiinin A ja silybin B) sekä sen johdannaiset DHS (A ja B), 7OM (A ja B) ja 7OG (A ja B) HTB9 soluissa. Kuten kuviossa 3, 5 uM annoksen välinen ero silybin ja sen johdannaiset oli vähemmän silmiinpistävä. Kuitenkin 10 uM, ero tehoa silybiinillä isomeerejä niiden johdannaisten isomeerien käynyt selväksi kanssa vahvemman kasvun esto johdannaisilla verrattuna vanhemman rakenteita, erityisesti 48 tunnin kuluttua hoitojen (kuva 3). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että samanlainen parempi aktiivisuus raseemisen silybiinin isomeerien eli DHS, 7OM ja 7OG verrattuna vanhemman raseeminen silybin, johdannaiset puhdasta silybiinin isomeerien A ja B ovat myös tehokkaampia kuin niiden puhdasta silybin A ja B-isomeerit .

HTB9 soluja käsiteltiin 5 ja 10 uM annoksilla silybiiniä A, 2,3-dehydrosilybiiniin A, 7-

O

-methylsilybin A, 7-

O

-galloylsilybin A tai silybin B, 2,3-dehydrosilybiiniin B, 7-

O

-methylsilybin B, 7-

O

-galloylsilybin B. kuluttua 24 tai 48 tuntia kunkin hoidon, yhteensä solujen määrä määritettiin yksityiskohtaisesti ”Materiaalit ja menetelmät”. Baarissa kaaviot, kukin data-pisteen edustaa keskiarvoja ± SD 3 näytettä. * P≤0.001; # P≤0.01; $ P≤0.05.

Vaikutus raseemisten seosten ja Pure optiset isomeerit silybiiniä ja sen johdannaisten Colony Formation HTB9 Solut

Seuraavaksi verrattiin vaikutus raseemisten seosten ja puhtaiden isomeerit silybiinillä ja sen kolme tehokkain DHS, 7OM ja 7OG johdannaiset pesäkemuodostuksen HTB9 soluja. Ensimmäisessä kokeessa käytimme annoksella 20 uM kaikkien yhdisteiden ja havaitsimme täydellinen inhibitio pesäkkeiden muodostumisen silybiiniin sekä sen johdannaiset (tuloksia ei ole esitetty). Siksi seuraavaksi käytettiin alempia annoksia raseemiset seokset sekä puhtaat isomeerit silybiiniä ja sen johdannaiset. Kuten kuviossa 4A on esitetty, DHS, 7OM, ja 7OG (5 ja 10 uM annoksiin joka 72. h) esti pesäkemuodostusta HTB9 soluja, ja kaikki kolme johdannaiset olivat tehokkaampia kuin silybiiniin sekä annoksilla. Vastaavasti hoito (5 ja 10 uM annosta), jossa puhtaita isomeerejä (A ja B) DHS, 7OM ja 7OG myös inhiboivat voimakkaasti pesäkemuodostusta HTB9 solut; isomeerit kaikkien kolmen johdannaiset olivat lopullisesti tehokkaampia verrattuna vastaaviin isomeerien silybin A ja silybin B (kuvio 4A). Kaikista puhtaiden isomeerien tässä määrityksessä, 7OG-B osoitti korkeinta tehoa (kuvio 4A).

(A) HTB9 soluja (~1000 solua) maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin joka 72 h 5 ja 10 uM annosta silybiinillä (SB), 2,3-dehydrosilybiiniin (DHS), 7-

O

-methylsilybin (7OM), 7-

O

-galloylsilybin (7OG), silybin A (SB-A), 2,3-dehydrosilybiiniin A (DHS-A), 7-

O

-methylsilybin A (7OM-A), 7-

O

-galloylsilybin A ( 7OG-A) tai silybin B (SB-B), 2,3-dehydrosilybiiniin B (DHS-B), 7-

O

-methylsilybin B (7OM-B), 7-

O

-galloylsilybin B (7OG-B). 11

päivänä solut käsitellään ja pesäkkeet, joissa on enemmän kuin 50 solusta, laskettiin. (B) HTB9 soluja (~1000 solua) maljattiin 6-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin 2 h välein 24 h 20 uM annoksen silybiinillä (SB), silybin A (SB-A), 2,3-dehydrosilybiiniin A (DHS -A), 7-

O

-methylsilybin A (7OM-A), 7-

O

-galloylsilybin A (7OG-A) tai silybin B (SB-B), 2, 3-dehydrosilybiinillä B (DHS-B), 7-

O

-methylsilybin B (7OM-B), 7-

O

-galloylsilybin B (7OG-B). 7 päivän jälkeen solut käsiteltiin ja pesäkkeet, joissa on enemmän kuin 50 solusta, laskettiin. Baarissa kaaviot, kukin data-pisteen edustaa keskiarvoja ± SD 3 näytettä. *, P≤0.001; #, P≤0.01; $, P≤0.05.

toiseen hoito-ohjelmassa, HTB9 solut altistettiin 20 uM annoksen silybiinillä tai isomeerien silybiinillä ja sen johdannaiset (DHS, 7OM, ja 7OG) 2 tuntia, ja sen jälkeen lisättiin tuoretta väliainetta lisättiin ilman yhdisteitä, ja sama käsittely-protokollaa 24 tunnin välein. Nämä kokeelliset olosuhteet perustuivat havaintomme valmiisiin kliininen tutkimus, jossa olemme raportoineet silybin puoliintumisaika ja plasmassa syöpäpotilaiden samaa luokkaa eli 20 uM silybin noin 2 h [28] Kuten kuviossa 4B, alla nämä käsittelyolosuhteet, tehokkuus kaikkien yhdisteiden oli vaarantunut jossain määrin, mutta silti 7OG ja DHS säilyttää korkeammat estävää tehoa vastaan ​​HTB9 pesäkkeiden muodostumista. Tämä määritys vahvisti, että 7OG on tehokkain joukossa kaikki silybin johdannaiset seurasi DHS ja 7OM.

Keskustelu

Syöpä on yksi johtavista syistä kuolleisuuden ja sairastavuuden ympäri maailmaa. Yhdysvallat yksin, yhteensä 1.638.910 uutta syöpätapausta ja 577190 syöpäkuolemaa heijastettiin esiintyvän vuonna 2012 [29]. Käytön lisääntyessä kuvantamisen työkaluja ja biomarkkereita, monet syövät diagnosoidaan varhaisessa vaiheessa, jossa terapeuttiset vaihtoehdot ovat melko rajalliset johtuen luontaisen sivuvaikutuksia liittyvät näihin hoitoihin. Näillä potilailla syöpä kemopreventiossa ja /tai intervention myrkyttömiä aineita, kuten silybin voisi olla houkutteleva vaihtoehto vaihtoehto yhdistettynä valpas-odotusajan. Lisäksi syövän kemoterapiaan rajoittaa usein mukanaan akuutti myrkyllisyys erityisesti maksatoksisuus, mikä johtaa annoksen vähennyksiä tai viivytyksiä terapiassa, mahdollisesti lisää riskiä uusiutumisen [8]. Silybin on pitkä käyttöhistoria sen hepatoprotective etuja, ja siksi sitä voidaan käyttää yhdessä kemoterapeuttisten aineiden kuten hepatoprotectant [8]. Lisäksi alentaa toksisuutta, silybin voisi lisätä tehoa kemoterapeuttisten syöpälääkkeiden [30]. Tässä suhteessa olemme raportoineet, että silybin voimakkaasti synergizes ihmisen eturauhasen karsinooma solujen doksorubisiinille, sisplatiinipohjaisen, carboplatin-, ja mitoksantroni aiheuttama kasvun esto ja apoptoottisen kuoleman [31] – [33]. Samanlaisia ​​synergiavaikutuksen silybiinillä doksorubisiinin ja sisplatiini on raportoitu myös erilaisissa muissa syöpäsolulinjoissa [34] – [37]. Muita yhteisiä elementtejä vaikuttamatta olennaisesti kohti syövän synnyn ovat krooninen tulehdus ja oksidatiivisen stressin [38]. Siksi hedelmiä ja vihanneksia, jotka ovat runsaasti antioksidantteja sekä tulehduskipulääkkeet suositellaan syövän kemopreventiossa strategioita [38]. Silybin on osoittautunut tulehdusta ja antioksidanttisia ominaisuuksia [38], joka tarjoaa ylimääräisen perustelut sen soveltamista syövän ehkäisyyn ja interventio.

Yksi tärkeimmistä rajoituksista, jotka ovat estäneet silybin n terapeuttista käyttökelpoisuutta aikaisemmin, on sen hyötyosuus, mikä johtuu suurelta osin sen suuri multi-rengas rakenne ja alhainen vesiliukoisuus [22]. Useat silybin muotoiluja (fosfatidyylikoliini, nano-suspensiot, jne.) On testattu entisestään parantamaan hyötyosuutta ja nämä valmisteet ovat osoittaneet merkittävää parannusta silybin hyötyosuus [12]. Esimerkiksi silybin n formulaatio fosfatidyylikoliinia (kutsutaan Silipide ”, kauppanimi” Siliphos) testattiin eturauhassyövän ja paksusuolen syöpäpotilaiden ja paljasti korkeat plasman biosaatavuus [9] – [11]. Toinen lähestymistapa parantaa silybin hyötyosuus sekä biologinen teho on kautta sopiva kemiallinen muutos /s sen rakenteessa; etenkin, silybin rakenne sekä roolia sen funktionaalisia osia ovat hyvin tunnettu viimeaikaisissa tutkimuksissa [13], [18], [19]. Tältä osin olemme jo onnistuneesti syntetisoitu ja karakterisoitu sarja silybiinillä johdannaisista, jonka tunnuksena useat niistä ylivoimainen antioksidantti ja anti-angiogeeninen toimintaa ja todennut ne vesiliukoisia, verrattuna silybin [20] – [23]. Perustuen näitä tärkeitä havaintoja ja samansuuntaisen, täällä me syntetisoitiin ja ominaista toinen silybin johdannainen, nimittäin 7,23-disulfaattitosylaatti silybin (DSS), joka on potentiaalinen silybin aineenvaihduntatuote vaiheen II biotransformaation, ja verrattiin silibinin syövän vastaista aktiivisuutta DSS sekä useita aiemmin syntetisoitu silybin johdannaisia, kuten DHS, 7OM, 7OG, 7OP, ja 23OP. Tärkeimmät tulokset Näiden tehoa tutkimuksissa: a) 7OG, DHS, 7OM osoittivat johdonmukaisesti syöpälääkkeen tehoa paremmin kuin silybin, kun taas silybin johdannaiset DSS, 7OP ja 23OP osoittivat vähemmän tai epäjohdonmukainen tehoon; tukeminen yleisen rakenteen ja tehokkuuden suhteen; b) puhdasta optisten isomeerien 7OG, DHS, ja 7OM myös kohdistama parempi syövän tehoa verrattuna vastaaviin silybin isomeerien (A ja B); c) ei ollut peräkkäistä parempana välillä A ja B isomeerejä tehokkuuden kannalta silybiinillä tai sen johdannaiset; ja d) yleinen tehokkuus näiden silybiinillä johdannaisten riippui sekä tyypistä funktionaalisen ryhmän läsnä sekä niiden spatiaalinen lokalisointi.

Yhteenvetona tuloksista nykyisestä Tutkimus osoitti, että syöpälääkkeen tehoa silybin voitaisiin merkittävästi tehostaa sopivia muunnoksia sen kemiallinen rakenne, ja tunnistettu 7OG, DHS, ja 7OM tehokkaampia silybin johdannaisia. Tämä havainto on yhdenmukainen aiempien havaintojen osoittavat, että substituutio C-7 silybiinillä rakenteen voimakkaasti parantaa sen antioksidantti ja /tai antiradikaalina aktiivisuutta. Lisäksi koska tuloksemme kolme johtoa silybin johdannaiset olivat yhdenmukaisia ​​kolmessa täysin eri ihmisen syövän solulinjoissa, ehdotamme, että havaitut syövän vastainen aktiivisuus ei solulinjassa erityisiä.