Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

tunnistaminen ennustava biomarkkereita on olennaista onnistuneen kehittämisen täsmähoitoihin. Insuliinin kaltainen kasvutekijä 1 -reseptorin (IGF1 R) on tutkittu mahdollisena terapeuttisena kohteena erilaisiin syöpiin. Kuitenkin viime aikoina kliiniset kokeet osoittivat, että anti-IGF1 R vasta-aine ja kemoterapia eivät ole tehokkaita hoidettaessa keuhkosyöpää.

Menetelmät /Principal Havainnot

Jotta voitaisiin määrittää biomarkkereita ennustamaan onnistuneen IGF1 R täsmähoitoihin, me arvioitiin anti-leviämisen vaikutusta figitumumab (CP-751871), humanisoitu anti-IGF1 R-vasta-aineen vastaan ​​yhdeksän maha- ja kahdeksan hepatosellulaarisia syöpäsolun linjat. Ulos 17 syöpäsolulinjoja, figitumumab tehokkaasti inhiboivat kolmen solulinjojen (SNU719, HepG2, ja SNU368), väheni p-AKT ja p-STAT3 tasoilla, ja indusoi G 1 pidätys annoksesta riippuvalla tavalla. Mielenkiintoista, nämä solut osoittivat yhteistyötä yli-ilmentymisen ja muuttanut liikkuvuutta IGF1 R ja insuliinin reseptorin (IR). Immunoprecipitaion (IP) määritykset ja ELISA vahvisti läsnäolo IGF1 R /IR heterodimeeriset reseptorit figitumumab-herkkien solujen. Hoidon figitumumab johti dissosiaatiota IGF1-riippuvaisten heterodimeeriset reseptorit ja inhiboi kasvaimen kasvun alentuneet heterodimeeristen reseptorien hiiren ksenograftimallissa. Seuraavaksi me todettiin, että sekä IGF1 R ja IR olivat N-sidottu glyosylated in figitumumab-herkkien solujen. Erityisesti massaspektrometria osoitti IGF1 R oli N-sidottu glykaanien at N913 kolmessa figitumumab herkkien solulinjoissa. Havaitsimme, että puuttuminen N-sidottu glykosylaatio N913 johti puute kalvo lokalisointi IGF1 R ja figitumumab välinpitämättömyys.

Johtopäätös ja merkitys

Tiedot viittaavat siihen, että taso N-sidottu glykosyloitu IGF1 R /IR heterodimeerinen reseptori on erittäin liittyy herkkyys anti-IGF1 R-vasta-aineen syöpäsoluissa.

Citation: Kim JG, Kang MJ, Yoon YK, Kim HP, Park J, Song SH, et al. (2012) Heterodimerisoituminen glykosyloidun Insulin-Like Growth Factor-1-reseptoreihin ja insuliini reseptoreihin Syöpäsolut Herkkä Anti-IGF1 R-vasta-aineen. PLoS ONE 7 (3): e33322. doi: 10,1371 /journal.pone.0033322

Editor: Frank T. Kolligs, University of Munich, Saksa

vastaanotettu: 29 lokakuu 2011; Hyväksytty: 07 helmikuu 2012; Julkaistu: 16 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus osittain rahoittama Korean terveydenhuollon 21 ja teknologian t K-hankkeeseen, terveysministeriö, hyvinvoinnin Perhe-, Korean tasavalta (A091081), ja tukee apurahan nro R31-2008-000-10103-0 päässä World Class University ohjelma MEST ja NRF. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

sen erittyy ligandeja, IGF1 ja IGF2, insuliinin kaltainen kasvutekijä 1 -reseptorin (IGF1 R) ilmentyy erittäin monissa ihmisen syöpäsoluissa, mukaan lukien mahalaukun (GC) ja maksasolusyövän (HCC) [1] – [ ,,,0],5]. Tämän seurauksena erilaisia ​​strategioita estämään IGF1 R signalointireitin on kehitetty kahden viime vuosikymmenen aikana [6]. Näistä syövänvastaisen terapeuttinen strategia käyttää täysin humanisoituja vasta on tullut tärkeä tutkimuksen painopiste [7], koska sillä on suuret mahdollisuudet tulla menestyksekäs vastaisen syöpähoitojen jotka voivat tehokkaasti estää syöpäsolujen lisääntymistä alhainen myrkyllisyys ja tarjota kliinisiä etuja annettuna yhdistettynä kemoterapia [8] – [14]. Täysin humanisoitu anti-IGF1 R monoklonaalinen vasta-aine (figitumumab) on testattu vaiheen III kliinisissä tutkimuksissa; ei kuitenkaan tilastollisesti merkittävää parannusta osoitettiin antamalla figitumumab yhdessä tavanomaisen kemoterapian potilaille, joilla on pitkälle edennyt ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [15].

Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että A-isoformi insuliinin reseptorin ( IR) on poikkeuksellisen yli-ilmentyy eri syöpätyyppeihin ja saattaa edistää kasvainten kasvua [16] – [19]. Tämä IR osakkeita korkea sekvenssihomologia IGF1 R, etenkin sisällä solunsisäinen kinaasialue [7], [20]. IR pro-reseptorit voivat muodostaa heterodimeerisiä reseptorit (t) kanssa IGF1 R pro-reseptorien posttranslationaalisesti, ennen pilkkomisreaktiot lähettämään kahta solunulkoista alfa- alayksiköstä ja kahdesta beeta alayksikköä, jotka sisältävät solunulkoisen kalvon yli, ja tyrosiinikinaasi domeenien [21]. Siksi, kun solut co-express IGF1 R ja IR, pro-reseptorit voivat heterodimerisoitua luoda IGF1 R /IR HRS [22] – [24]. Nämä HRS voidaan myös yli-ilmentyy eri tuumorisoluissa ja näytteet seurauksena sekä IGF1 R ja IR-yliekspressio [2], [25], [26]. Näin ollen suhteellinen runsaus IR vaikuttaa IGF aktivoitumisen kautta tuntia, joka reagoi sekä insuliinin ja IGF: t [27] – [29]. Syöpäsoluissa, joilla on korkea IGF1 R /IR tuntia, IGF1 ja IGF2 aktivoi alavirran signalointia polkuja heterodimeerisiä reseptorien sijaan homodimeerisissä IGF1Rs [30].

Useat tutkimukset ovat yrittäneet tunnistaa ennustavan biomarkkerit kanssa prekliinisen ja kliinistä merkitystä [15], [31], [32]. Tunnistaminen ennakoivan biomarkkereiden seurantaan tehoa IGF1 R täsmähoitoihin asianmukaisia ​​potilaille, mutta tarvitaan vielä. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että figitumumab hallussaan suuri affiniteetti IGF1 R /IR heterodimeeriset reseptorit sekä IGF1 homodimeerinä reseptorit ja estää IGF /IGF1 R signalointi akselin mahasyövän ja hepatosellulaarista karsinoomaa soluja. Lisäksi tuloksemme osoittivat, että toiminnallisia membraaniin sitoutunut IGF1 R /IR heterodimeerisiä reseptoreilla on tärkeä rooli IGF1- signalointi [26], [33] ja siksi voi olla biomarkkereita ennustamiseen herkkyyttä anti-IGF1 R vasta-aine.

tulokset

anti-proliferatiivinen vaikutus figitumumab

ensimmäisessä vaiheessa, arvioimme anti-proliferatiivista vaikutusta figitumumab, monoklonaalinen vasta-aine, joka estää ligandien sitoutumisen IGF1 R [12], on 17 syöpäsolulinjoissa (kuvio 1A). Jotkut solut pidetään herkkiä figitumumab, kuten SNU719, HepG2, ja SNU368, osoitti annoksesta riippuvaa vähenemistä solun elinkykyisyyden; IC

30-arvo figitumumab (kasvu estoja -30%) kunkin solulinjan oli 0,063 ug /ml, 0,062 ug /ml, ja 0,047 ug /ml, vastaavasti (taulukko 1).

) analyysi anti-proliferatiivista vaikutusta figitumumab mahalaukun ja maksasyövän soluja. Kaksi ryhmää syöpäsolujen, joista yhdeksän mahasyövän solulinjojen ja kahdeksan maksasyövän solulinjoja, käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla figitumumab (0, 0,1, 1, ja 10 ug /ml) 120 h kasvun estämiseksi kontrollisoluihin 30%. Solujen lisääntyminen määritettiin MTT-määritys. Kuusi jäljitellä kaivoja käytettiin kutakin analyysiä, ja ainakin kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin. Tietoja rinnakkaisten kuoppien esitetään keskiarvona jäljellä soluja. Bars = ± SE. B) vaikutus figitumumab annetun IGF1 R signalointireitille. Immunoblottaus analyysi suoritettiin tarkkailemaan annos-vaste vaikutuksen figitumumab (0,1-10 mikrog /ml) on IGF1 R signalointi. SNU638, SNU719, SNU354, HepG2, ja SNU368 solut altistettiin kasvavia pitoisuuksia figitumumab 72 tuntia. Tasot liittyvien proteiinien kanssa IGF1 R reitti ja niiden aktivoidut muodot analysoitiin. Erot suhteessa kontrolliin on esitetty. Kussakin paneelissa edustaja blots kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty. C) vaikutus figitumumab on solusyklin jakautumisen. Figitumumab-herkkien solujen (SNU719, HepG2, ja SNU368) käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla lääkkeen [0 ug /ml (musta pylväs), 0,1 ug /ml (harmaa pylväs), 1 ug /ml (valkoinen palkki), ja 10 ug /ml (tummanharmaa viivoitettu pylväs)] 48 tuntia ja sitten värjätään propidiumjodidilla, ja analysoitiin virtaussytometrialla. Prosenttiosuus solujen G

0 /G

1, S, ja G

2 /M vaihetta on esitetty. Sarakkeet edustavat keskiarvoa kolmesta itsenäisestä kokeesta; Bars = ± SE. *

P

arvojen 0,05, **

P

arvojen 0,01. D) vaikutus figitumumab kasvainten kasvua hiirillä HepG2 ksenograftit. HepG2-soluja (1 x 10

7) injektoitiin oikeaan kylkeen nude-hiirten (n = 5). Hoidon figitumumab (125 ug /ml [6,3 mg /kg kehon paino], kerran viikossa 3 vk) sai alkunsa heti, kun tuumorin tilavuus oli noussut 200 mm

3. Mitään merkittäviä kehon painon aikana havaittiin tutkimuksen aikana. Kasvaimet mitattiin mittaharpilla säännöllisin väliajoin. Kiinteät ympyrät = hoidon ajoneuvon ohjaus yksinään (kontrolli), Avoimet kolmiot = hoidon figitumumab. Erot ryhmien välillä (kasvaimen kokoa verrokkihiirten ja näiden käsiteltyjen hiirien figitumumab) verrattiin päivästä 17 loppuun asti hoidon aikana (päivä 21) käyttämällä kaksipuolista Studentin

t

testi . *

P

arvojen 0,05; **

P

arvojen 0,01 verrokkiin nähden.

Figitumumab häiritsee IGF1 R signalointi pääasiassa AKT ja STAT3 polkuja ja indusoi G

1 pidätys

tutkia mekanismi, jonka avulla figitumumab estää soluproliferaatiota, tutkimme, oliko eroja alavirran välinen signalointi herkkien ja resistenttien solujen läsnä seerumin jälkeen pitkäaikaisen hoidon sarja annoksilla figitumumab (kuvio 1 B). Tässä kokeessa vain figitumumab-herkkien solujen osoittivat merkittävästi alentuneet p-AKT ja p-STAT3 annoksesta riippuvaisella tavalla; kuitenkaan ei tapahtunut muutoksia tasojen p-ERK. Havaitsimme myös, että figitumumab vähentynyt taso totaalisoluproteiinia IGF1 R in SNU719 soluissa, mikä viittaa siihen, että down-regulation tämän reseptorin voisi edustaa vasta-aine-välitteisen hajoamisen prosessi [8]. Me tutkimme, figitumumab aiheuttama säätely alaspäin IR ilmaisun sekä IGF1 R tasoilla muissa soluissa useissa eri ajankohtina. Mielenkiintoista, figitumumab aiheutti nopean laskua yhteensä IGF1 R tasojen jälkeen 3 tunnin SNU668 ja SNU739 soluja (IR-negatiiviset solut), mutta eivät merkittävästi alas-säädellä joko IR- tai IGF1 R ilmentymistä muissa solulinjoissa (kuvio S1). Sen sijaan figitumumab ei alas-säädellä Pakt, Perk tai pSTAT3 resistenttien soluissa.

Määritä IGF1 R signaali riippuvuutta herkkien solujen, me seuraavaksi suoritetaan kokeiluja siRNA vaientaa IGF1 R lauseke (kuva S2A). Tulokset osoittivat, että IGF1 R sekvenssispesifisiä siRNA aiheuttama syvällinen IGF1 R alassäätöä vaikuttamatta IR ilmaisun ja osoittivat selvän yhteyden kyky siRNA ja figitumumab estävän fosforylaatiota erityinen alas-stream signaaleja, kuten p-AKT ja p- STAT3, vain herkkien solujen. Tutkimme myös vaikutuksia IGF1 R Knockdown proliferaatioon herkkien solujen ja vahvisti, että hiljentäminen IGF1 R ilmentyminen johti antiproliferatiivinen vaikutus herkkiin soluihin (kuvio S2B). Lyhyesti, nämä tulokset osoittivat, että antiproliferatiivisia vaikutuksia figitumumab ovat nimenomaan välittyvät alas-säätely AKT ja STAT3 signalointireitteihin sijaan ERK signalointireitille herkkien solujen, joilla on vahva IGF1 R signalointi riippuvuus.

analysoimiseksi edelleen mekanismeja, joilla figitumumab inhiboivat ja selviytymisen syöpäsolujen teimme virtaussytometrianalyysin (kuvio 1 C). Figitumumab indusoi samanlaisen annoksesta riippuva nousu prosentteina SNU719, HepG2 ja SNU368 solu G1-vaiheen. Kuitenkin, ei ollut lisääntynyttä apoptoosin (prosenttia sub-G1-soluja; tuloksia ei ole esitetty). Tämä analyysi osoitti, että figitumumab vähentynyt solujen elinkykyä läpi solusyklin inhibitio ilman aiheuttamaan apoptoosin.

Antituumoriaktiivisuus of figitumumab on ksenograftin kasvaimen malli

Seuraava haetaan lisätodisteita figitumumab aktiviteetti

in vivo

käyttämällä HepG2 perustaa ksenograftit johtuen niiden herkkyys figitumumab

in vitro

. Vaikutuksen arvioimiseksi on figitumumab kasvaimen kasvuun

in vivo

, ksenograftikasvaimissa kasvatettiin kateenkorvattomissa nude-hiirissä. Kuten esitetään kuviossa 1 D, toistuva viikoittain antamisen kerta-annoksen figitumumab (6,3 mg /kg kehon paino) ja eläimille, joissa HepG2-kasvaimia tuottanut huomattavaa tuumorin kasvun inhibition 21 d figitumumab annostelun ja inhiboi merkittävästi kasvaimen kasvua päivänä 17 ( P 0,01). Lisäksi testasimme vaikutus figitumumab on IGF1 R-sukua olevien molekyylien jälkeen 1 d figitumumab hoitoon. Figitumumab tehokkaasti vähensivät fosforyloidun IGF1 R ja insuliinireseptorisubstraatti 1 (kuvio S3A). Yhdessä nämä tulokset osoittivat, että hoito yksi annos figitumumab esti kasvainten kasvua estämällä IGF1 R ja insuliinireseptorisubstraatti 1 aktivointi.

yli-ilmennetään IGF1 R ja IR muoto IGF1 R /IR heterodimeerisiä reseptoreihin figitumumab-herkkien solujen

tunnistaa tavoitteeksi ennustamiseksi herkkyyttä figitumumab ilmentyminen IGF1 R liittyvien proteiinien ja loppupään signalointimolekyylejä analysoitiin rinnakkain Western blottauksella. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että figitumumab-herkkien syöpäsolujen kaikki yli-ilmentynyt IGF1 R; pohjapinta ekspressiotasot IR olivat myös paljon suurempi verrattuna muihin resistentit solut (kuvio 2A). Perustuen tuoreessa raportissa [31], odotimme että figitumumab olisi nimenomaan estää solujen kasvua yli-ilmentävät IGF1 R tai sen fosforyloitua muotoa, mutta ei niitä, jotka ilmentävät liikaa IR koska figitumumab ei sitoudu IRS [12]. Kuitenkin IR proteiini tasot olivat reagoiva figitumumab kuin mikään muu proteiini. Kuten kuviossa 1A on esitetty, anti-proliferatiivista vaikutusta figitumumab oli heikompi yliekspressoiviin soluihin vain IGF1 R, kuten SNU668 ja SNU739, kuin soluissa, jotka yli-ilmentävät sekä IGF1 R ja IR. Tämä havainto viittasi siihen, että eri

in vitro

herkkyydet solujen figitumumab liittyy sekä IGF1 R ja IR-säteilyä, mikä puolestaan ​​voi vaikuttaa tasoon IGF1 R /IR heterodimeeriset reseptorit [2].

) immunoblot-analyysi yhteensä IGF1Rβ ja IRβ proteiinin tasoja. Kahdenlaisia ​​maha- ja maksasyövän solut otettiin talteen 24 tuntia maljauksen jälkeen ja immunoblottauksella anti-IGF1Rβ vasta-ainetta, anti-IRβ-vasta-aineen, ja anti-α tubuliinia vasta-aine tehtiin. Molemmissa soluissa, edustavien blots kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty. B) analyysi läsnäolon IGF1 R /IR heterodimeerinen reseptori (t) käyttäen immunosaostuksella. Solun kokonaisproteiinista (1 mg) soluista käytettiin immunosaostus anti-IGF1 R-vasta-aine, erotettiin SDS-PAGE vakiojännitteellä (80 V) ja Western blotattiin anti-IRβ vasta-aine. Sitten blotti tislattiin ja uudelleenseulottiin anti-IGF1Rβ vasta-aineen C) kvantitatiivinen analyysi IGF1 R homodimeeri, IR homodimeeri, ja IGF1 R /IR-heterodimeerin tasoja käyttäen ELISA. Hajotuspuskuria (100 ui), joka sisälsi yhtä suuren määrän proteiineja (50 ug /kuoppa) 11 syöpäsolulinjasta lukien MCF7-solut (positiivinen kontrolli) maljattiin anti-IGF1 R-vasta-aine-päällystettyihin kuoppiin ja detektoitiin anti-IR toteamisvasta-ainetta. Anti-IR-vasta-aine-päällystettyihin kuoppiin, IR-proteiinin standardeja, ja anti-IR toteamisvasta-ainetta käytettiin standardeja heterodimeerisen reseptorin ELISA. Absorbanssi mitattiin 450 nm: ssä. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM nanogrammoina reseptoriproteiinia per 50 ug kokonaisproteiinia. Solulinjat on lueteltu niiden herkkyys figitumumab. Bars = ± SE. D) vaikutus figitumumab on IGF1- välittämä IGF1 R /IR tuntia. Soluja pidettiin seerumin puutteessa 24 tunnin ajan ja käsiteltiin sitten figitumumab, IGF1, tai ne jätetään hoitamatta. SNU719 soluja inkuboitiin figitumumab (10 ug /ml) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa, jota seuraa stimulointi IGF1 (100 ng /ml) 30 minuutin ajan. Immunosaostus suoritettiin anti-IGF1 R-ainetta ja Western blotattiin. Syöttö = kokosolulysaattia ilman IP.

Koska se on yleisesti tiedossa, että IGF1 R ja IR voivat muodostaa heterodimeerejä, kun molemmat ovat samanaikaisesti yli-ilmennetään johtuen niiden erittäin homologisia rakenteita [2], suoritimme immuunisaostuskokeissa kohteeseen onko IGF1 R vuorovaikutuksessa IR muodostaa heterodimeerin figitumumab-herkkien solujen. Kuten kuvassa 2B on esitetty, solut yli-ilmentävät sekä IGF1 R ja IR, kuten SNU719, HepG2, ja SNU368, sisälsi IGF1 R /IR-heterodimeerejä. SNU601 solulinja, joka osoitti vaatimaton herkkyyttä figitumumab, sisälsi myös IGF1 R /IR heterodimeerejä. Sen määrittämiseksi, onko figitumumab tunnistaa edullisesti IGF1 R /IR heterodimeeriset reseptorit herkkien solujen [12], suoritimme immunosaostuskokeissa käyttäen figitumumab, kuten vasta-aineen, jota käytetään immunosaostus. Merkittäviä tasoja sekä IGF1 R ja IR figitumumab-herkkien solujen havaittiin figitumumab immunosaostumissa, mikä viittaa siihen, että tämä vasta-aine on ylivoimainen kyky tunnistaa sekä IGF1 R homodimeeri ja IGF1 R /IR heterodimeerin pääasiassa herkkien solujen (kuva S4).

Meillä on myös määrällisesti mitattuna IGF1 R, IR, ja IGF1 R /IR HR tasot käyttäen spesifisiä ELISA vasta-aineiden kanssa, jotka tunnistavat spesifisesti IGF1 R tai IR eivätkä rajat reagoivat keskenään. Vertasimme 11 syöpäsolun linjat, mukaan lukien MCF7 (kuva S5), joka on arvioitu aikaisemmassa tutkimuksessa [2]. Tasot IR vaihtelivat 0,08-2,3 ng /50 ug solun kokonais-proteiineja, ja IGF1 R vaihtelivat 0,50-10,6 ng /50 ug solun kokonais-proteiineja (Taulukko 2). Nämä tulokset osoittivat, että ilmentyminen IGF1 R ja IR olivat samanlaisia, ja useimmat ELISA tulokset korreloivat läheisesti Western blotting tulokset (kuvio 2A). Solutasolla on IGF1 R /IR HRS vaihteli 0,39-0,99 ng /50 ug solun kokonaisproteiinista. Taso HRS oli korkeampi herkkien solujen kuin resistenttien solujen (kuvio 2C), mikä viittaa siihen, että ekspression taso IGF1 R /IR heterodimeerisen reseptorin korreloi merkitsevästi lääkkeen herkkyys.

muodostuminen IGF1 ligandista riippuvan IGF1 R /IR-heterodimeerin inhiboi anti-IGF1 R-vasta-aineen

määritellä tarkemmin mekanismi antiproliferatiivinen figitumumab liittyvän toiminnan IGF1 R /IR-heterodimeerin ekspression, tutkimme myös muutoksia ligandista riippuvalla heterodimeerinen-reseptorin ilmentymisen (kuvio 2D ). Olemme havainneet, että heterodimeerejä sidottu IGF1 ligandeja, mutta tämä IGF1 ligandista riippuvaa muodostumista tukahdutettiin figitumumab herkkien solujen. Vuonna SNU368, näytti siltä, ​​että figitumumab vaimentaa ei ainoastaan ​​IGF1 ligandien sitoutumisen tuntia, mutta myös ilmaus IGF1 R /IR HRS puuttuessa IGF1 ligandin. Heterodimeerinen reseptorin tasot SNU638 ja SNU354 solut olivat kuitenkin melko vakaana läsnäollessa figitumumab. Lisäksi ei ollut havaittavissa insuliinista riippuvainen heterodimeeri muodostumista tai dissosiaatio vuoksi figitumumab. Fosforylaation vastauksena 100 nM insuliinia ei myöskään vähentää figitumumab (kuva S6). Yhdessä tulokset tästä koe osoitti, että IGF1 R /IR-heterodimeerien vastannut hyvin IGF1, ja esto IGF1 jonka figitumumab aiheuttama alaspäin säätely IGF1 ligandista riippuvan IGF1 R /IR heterodimeerin muodostumista lääkkeen herkkien solulinjoissa.

valikoiva yli-ilmentyminen IR indusoi heterodimeerisen reseptorin muodostumista ja parantaa anti-proliferatiivista vaikutusta figitumumab

sen arvioimiseksi, onko vaikutus figitumumab rajoitettiin SNU719, HepG2, tai SNU368 soluja, teimme tutkimukset soluissa alhainen ekspressiotasot IR, kuten SNU739 ja SNU886 soluja, jotka on transfektoitu pcDNA3.1-IR, joka indusoi korkeita ilmentymisen IR. Kuten kuviossa 3A on esitetty, IR-ilmentymisen tasot transfektoitujen solujen kasvoi merkittävästi verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu pcDNA3.1 (-) tyhjän vektorin. Lisäksi, IGF1 R /IR HRS myös muodostettu IR-transfektoiduissa soluissa. Sen tutkimiseksi, IGF1 R /IR HR muodostumisen lisääntyneen IR proteiinin tasot voisivat parantaa lääkkeen herkkyyttä, suoritimme MTT määrityksissä. Tulos osoitti, että IR-transfektoidut solut olivat herkkiä lisääntyneen anti-proliferatiivista vaikutusta figitumumab (kuvio 3B). Nämä tulokset osoittivat, että kohonneet IR ja IGF1 R ansiosta syöpäsolut muodostavat IGF1 R /IR tuntia ja lisäsivät antiproliferatiivinen vastaus figitumumab.

A) vaikutus IR transfektion on IGF1 R /IR HR tasoilla IR- negatiivinen solulinjat. Solut transfektoitiin pcDNA3.1 (-) ekspressiovektori, joka sisältää villityypin IR cDNA. Vastaava määrä lysaatit soluista, jotka oli transfektoitu joko tyhjällä vektorilla tai pcDNA3.1 (-), joka sisältää IR-cDNA saatettiin immunosaostus anti-IGF1 R-vasta-ainetta ja sen jälkeen Western blot-analyysit IRβ ja IGF1Rβ. B) vaikutus IR-transfektion on figitumumab herkkyys. Transfektoidut solut maljattiin 96-kuoppalevyille, käsiteltiin figitumumab 5 d ja alistettiin MTT määrityksissä. Kiinteät kolmiosymboli katkoviivoin = tyhjän vektorin (pcDNA3.1-), Solid ympyrä symboleja linjat = pcDNA3.1 (-) IR. Bar = ± SE. Keskiarvot olivat peräisin kuudesta rinnakkaista. Kokeet toistettiin kolme kertaa.

N-sidottu glykosylaatio IGF1 R ja IR-herkkien solujen

lisäksi yhdistyksen välillä tuntia ja huumeiden herkkyys, Huomasimme myös, että N-välitteisen glykosylaation (NLG) on lisäksi tärkeä tekijä, joka vaikuttaa vaste figitumumab. Pyyhkinyt anti-IGF1Rβ alayksikköä paljasti kaksi isoformia noin 95 ja 105 kDa useimmissa soluissa; kuitenkin herkät solut osoittivat heikkoa 105 kDa ja vahvempi bändejä 115 kDa (kuvio 4A). Lyhyesti, IGF1Rβ in figitumumab-herkkien solujen liikkui hitaammin SDS-PAGE kuin että resistentit solut. Mielenkiintoista, taudille anti-IRβ alayksikköä tuotettu samalla taajuusalueella -kuvioltaan IGF1Rβ. Sen määrittämiseksi, onko eri molekyylimassan välillä herkkiä ja resistenttejä soluja eroista johtuen N-glykosylaatio, me entsymaattisesti deglykosyloituneet IGF1 R ja IR PNGage F, joka poisti kaiken tyyppisiä N-kytkettyjä glykaaneja. Hoidon PNGage F lisäsi elektroforeettinen liikkuvuus sekä IGF1Rβ ja IRβ kaikissa figitumumab-herkkien solujen (kuvio 4B), joka osoittaa, että IGF1Rβ ja IRβ herkällä solut olivat enimmäkseen N-sidottu glykosyloitu.

A) immunoblot-analyysi eri IGF1Rβ vaelluskäyttäytyminen SDS-PAGE. Elektroforeettinen liikkuvuus kuviot IGF1Rβ analysoitiin rinnakkain Länsi bloting. Kokeet toistettiin vähintään kolme kertaa samanlaisilla tuloksilla. B) analyysi N-glykosyloidun IRβ ja IGF1Rβ herkillä solulinjoissa entsymaattisella deglykosylaatio, jossa PNGage F. Kaikki näytteet inkuboitiin 37 ° C: ssa 12 h PNGage F. IGF1Rβ ja IRβ proteiinit analysoitiin rinnakkain Western-blottauksella. Täplät osoittaneet ovat edustajia kolmen erillisen kokeen.

Erityinen NLG sivusto IGF1 R in figitumumab-herkkien solujen

vieressä ratkaistava, onko vaihtelu NLG että IGF1Rβ alayksikön voisi olla toinen ehdokas biomarkkeri figitumumab herkkyys. Voidaan käyttää tietyn guldenia sivuston sisällä IGF1Rβ alayksikköä, käytimme yhdistelmä entsymaattisen de-glykosylaatiota ja massaspektrometriaa (MS) analyysi. Arvioituaan näytteet sekä herkkien ja resistenttien solujen tunnistimme paikkasidonnainen glykosylaatio Asn900 ja Asn913 joukossa viisi otaksuttu guldenia sivustoja (Asn747, 756, 764, 900 ja 913) on IGF1Rβ alayksikön. Muut guldenia sivustoja (Asn747, 756 ja 764), on ollut vaikea tunnistaa, koska läsnä on useita NLG sivustoja ja puute proteolyyttisen pilkkomiskohtia peptidisekvenssissä alueella (kuvio 5A). Siksi olemme keskittyneet Asn900 ja Asn913 jäämiä arvioida paikkakohtaisia ​​guldenia erot figitumumab herkät ja resistentit solut. Täydellinen peptidifragmentaatiota kuviot tryptinen peptidin (

897NPGNYTAR

904), jotka sisältyvät aikaisemmin N-glykosyloituja peptidi on Asn900 (lisättynä +1 Da, N + 1) havaittiin sekä herkkä ja vastus soluja, jotka käsitti Asn jäännös glykosylaatiokohta Asn900 (Kuva S7). Nämä tulokset osoittivat, että Asn900 oli glykosyloitunut sekä huumeiden herkkien ja resistenttien solujen. Kuitenkin peptidien guldenia at Asn913 havaittiin vain herkkä, mutta ei resistentit solut, mikä viittaa siihen, että tämä erityinen guldenia sivusto ei glykosyloituneita resistentit solut.

A) tunnistetiedot NLG sivuston täyttöaste IGF1Rβ alayksiköiden . IGF1Rβ alayksiköt sisältävät N-sidoksista glykosylaatiokohtaa (Asn747, Asn756, Asn764, Asn900, ja Asn913) on eristetty sekä huumeiden herkkä (SNU719, HepG2 ja SNU368) ja vastus (SNU638 ja SNU354) solut ja tunnistaa tandem MS kasvua 1,0 Da vastaavasta massa Asn seurauksena muuntaminen N-kytketty glykosyloidun Asn Asp. Kaikki guldenia klo Asn900 niin herkkä ja kestävyys solujen todettiin olevan miehitetty N-glykosylaatio (täytetty suorakulmio). NLG at Asn913 herkän solulinjojen (HepG2, SNU719, ja SNU368) todettiin olevan miehitetty N-glykosylaatio (täytetty suorakulmio), kun taas N-glycosites on Asn913 vastuksen solulinjojen (SNU638 ja SNU354) todettiin olevan tyhjillään N-glykosylaatio. (Avoin suorakulmio). B) vaikutus N913Q sivuston mutaatio elektroforeettinen liikkuvuus malleja IGF1Rβ. Huh7-solut (an IGF1 R-negatiivinen solulinja) transfektoitiin tyhjällä pcDNA3.1 (-) ekspressiovektori (Control), pcDNA3.1 (-), joka sisältää villityypin IGF1 R-cDNA (IGF1 R WT) tai pcDNA3.1 (- ) kanssa IGF1 R mutaatio tyypin cDNA (IGF1 R N913Q). Sama määrä solun lysaatti transfektoiduista soluista saatettiin sitten Western blot-analyysi IGF1Rβ. C) vaikutus N913Q sivuston mutaation muodostumiseen IGF1 R /IR heterodimeerisiä reseptoreihin. Sama määrä solun lysaatti transfektoiduista soluista saatettiin sitten immunosaostuksella (IP) ja anti-IGF1 R-vasta-ainetta ja sen jälkeen Western blot-analyysin IRβ ja IGF1Rβ. Syöttö = kokosolulysaattia ilman IP. D) vaikutus N913Q sivuston mutaation IGF1 R lokalisointi. Immunof- määritys suoritettiin tarkkailla lokalisoinnin IGF1 R. IGF1 R reaktiivisuus visualisoitiin CLSM (Mitta-asteikko: 30 um). Kuvat ovat näytetään. Green: IGF1 R, Blue: ytimiä. E) vaikutus N913Q sivuston mutaation figitumumab herkkyys. Huh7-solut transfektoitu tyhjällä pcDNA3.1 (-) vektori, vektori, joka sisältää villityypin IGF1 R-cDNA, tai vektori, joka sisältää IGF1 R (N913Q) mutaation tyyppi cDNA maljattiin 96-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla figitumumab 120 h (vasen ). Solujen elinkelpoisuus prosenttiosuudet 1 ug /ml figitumumab (oikealla). Kuusi jäljitellä kuopat Jokaisessa analyysissä, ja ainakin kolme toisistaan ​​riippumatonta koetta tehtiin. Tietoja rinnakkaisten kuoppien esitetään keskiarvona jäljellä soluja. *

P

arvojen 0,05; **

P

arvojen 0,01.

edelleen todentamiseksi guldenia konsensus sivusto (N913) ja sen toiminnallinen merkitys, sivusto-directed IGF1 R mutantti rakennettiin. Asn913 on korvattu glutamiinitähde, jolloin saadaan N913Q (Asn913 ln) mutantti. Arvioida toiminnalliset seuraukset mutaation, villityypin IGF1 R ja mutantti-konstrukti ilmennettiin tilapäisesti Huh7-soluissa. Kuten kuviossa 5B on esitetty, ilmentymisen tasoja villityypin ja mutantti-IGF1 R on transfektoituja soluja kasvoi merkittävästi verrattuna soluihin transfektoitiin tyhjällä pcDNA3.1 (-) -vektoriin. Kuitenkin N913Q mutaatio esiintyi 105 kDa: n vyöhykkeen, joka liikkui nopeammin kuin villityypin proteiinia, joka on tuotettu samanlaisen vaelluskäyttäytyminen proteiinin SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) on SNU719 soluissa. Nämä havainnot vahvistivat, että ~115 kDa herkkien solujen vastasi IGF1 R, joka oli guldenia at N913.

Mielenkiintoista, näyttää siltä, ​​että poisto N-sidottu sokereita N913 on IGF1 R ei ollut ilmeistä vaikutusta muodostumat of IGF1 R /IR tuntia. Pikemminkin tämä mutaatio vain vaikutti sen NLG tilasta reseptorin koska HR tasot olivat merkittävästi lisääntyneet mutantti IGF1 R-transfektoitujen solujen ja mutantti reseptori osoitti lisääntynyt maahanmuuttoluku SDS-PAGElla (kuvio 5C). Tämä tulos viittaa siihen, että poistaminen N-sidottu sokerin N913 sivustosta muuttanut SDS-PAGE ryhmittelyä profiilia IGF1Rβ mutta sillä ei ollut vaikutusta heterodimerisoitumisella IGF1 R ja IR.

guldenia säätelee IGF1 R lokalisointi solukalvon ja määrittää herkkyys figitimumab

seuraavan suoritetaan immunofluoresenssianalyysia onko mutaatio N913-konsensus-estää ilmentymisen solun pinnalla IGF1 R. Solut, jotka ilmentävät villityyppistä IGF1 R oli runsaasti solukalvon sitoutuneen IGF1 R taas mutanttimuotoon oli ensisijaisesti säilyy solujen sisällä suhteellisen vähän tai ei solukalvon lokalisointi (kuvio 5D). Arvioida toimintoja NLG-puutteellisia-IGF1Rs verrattuna villityypin muodossa, teimme MTT määrityksissä. Tulokset osoittivat, että anti-proliferatiivista vaikutusta figitumumab kasvoi yli-ilmentävät villityyppistä IGF1 R, kun taas solut, jotka oli transfektoitu mutantti-IGF1 R ei ole mitään muutoksia lääkeaineen herkkyys (kuvio 5E). Nämä tulokset viittaavat siihen, että puuttuminen N-sidottu sokereista N913 on IGF1 R johtuvat lähinnä sytoplasmisen reseptorin paikallistaminen taas villityypin IGF1 R näytti paikantuvan plasmamembraanin lisääntynyt herkkyys figitumumab. Siksi NLG on N913 näyttää olevan välttämätöntä toiminnallinen kalvoon sitoutuneen IGF1 R ja johtaa kasvaneeseen vastauksena anti-IGF1 R-vasta-aineen syöpäsoluissa.

Keskustelu

Figitumumab (CP-751871), on ollut aktiivisesti tutkittu potilailla, joilla on useita myelooma, mutta tunnistaminen biomarkkereita ja mekanismeja tarvitaan ennustaa hoidon vastauksia ja siten auttaa potilasta valinta maksimoimiseksi kliinistä hyötyä. Tiedot nykyisestä aiheen olettaa, että taso IGF1 R /IR HRS voi olla mahdollinen diagnostinen biomarkkereiden ennustamiseksi herkkyyttä anti-IGF1 R-vasta erityisesti GC ja HCC-soluissa. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että taso IGF1 R itse voi olla ennustearvo rinta-, keuhko-, ja peräsuolen syöpiä [31], [34]. Tutkimuksessamme kuitenkaan ole ilmentyminen IGF1 R yksin tai tasoja muiden IGF1 R liittyvien molekyylien, mukaan lukien insuliinireseptorisubstraatti 1, voitaisiin käyttää riittävän ennustaa figitumumab herkkyys (tuloksia ei ole esitetty). Sen sijaan havaitsimme, että tärkeä tekijä vastaus figitumumab näytti olevan suuri ekspressiotasot IR koska vain lääkeaine-herkkien solujen osoittivat korkeita IR sekä IGF1 R (kuvio 2A). ei.