Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

tunnistaminen geenien kausaalisesti osallisena kasvaimen synnyssä on tärkeä tavoite syöpätutkimukseen. Arviolta 10-20% syöpään liittyvän geenin mutaatiot johtavat ohita yhden tai useamman eksonien koodatun selostukset. Kirjoittajat raportoivat strategiaa seuloa on globaalilla tavalla tällaisen eksonin-hyppimistä tapahtumia käyttäen kuviota perustuu Correlation (PAC). PAC-algoritmia on käytetty aiemmin tunnistamaan ilmentyvät differentiaalisesti silmukointivariantit kahden ennalta alaryhmiä. Kuten geneettisiä muutoksia syöpä ovat näytteessä erityisiä testasimme kykyä PAC tunnistaa poikkeuksellisesti ilmaistu eksonien samassa näytteessä.

Keskeiset havainnot

Koska proof-of-periaate, testasimme PAC strategia ihmisen syövän näytettä, joista täydellisen koodaavan sekvenssin kahdeksan syövän geenien oli seuloa mutaatioita. PAC havaittu seitsemän eksonipohjaisia ​​ohita mutaatiota 12 syöpäsolun linjat. PAC myös tunnistettu eksonipohjaisia ​​ohita mutanttien kliinisissä syövän näytteistä vaikka havaitsemiseen oli heikentyä heterogeeninen (villityypin) transkriptin ilmentyminen. PAC vähensi kandidaattigeenien /eksonien myöhempää mutaatioanalyysiin kahdella-kolmella kertaluokkaa ja oli olennainen tosi positiivisia. Tärkeää on, 112 satunnaisesti valitun harha eksonit, sekvenssianalyysillä tunnistettiin kaksi uutta eksonin ohittaminen tapahtumia, kaksi uutta pohja muuttuu ja 21 aiemmin raportoitu emäsmuutosten (SNP).

Johtopäätökset

Kyky PAC rikastamiseksi mutatoitunut selostukset ja tunnistaa tunnettujen ja uusia geneettisiä muutoksia vertailu vahvistaa sen soveltuvuutta strategia tunnistaa ehdokas syöpägeenit.

Citation: Schutte M, Elstrodt F Bralten LBC, Nagel YOS, Duijm E, Hollestelle A, et ai. (2008) eksoni Expression Arrays työvälineenä tunnistaa uusia Cancer Genes. PLoS ONE 3 (8): e3007. doi: 10,1371 /journal.pone.0003007

Editor: Christopher Arendt, Sanofi-Aventis, Yhdysvallat

vastaanotettu: 10 kesäkuu 2008; Hyväksytty: 31 heinäkuu 2008; Julkaistu: 20 elokuu 2008

Copyright: © 2008 Schutte et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Susan G. Komen Breast Cancer Foundation (BCTR0601309), Alankomaiden Cancer Society Koningin Wilhelmina Fondsista DDHK 2002-2687 ja Erasmus MC Mrace 2005.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä olemassa.

Johdanto

Syöpä ohjaa mutaatioita geeneissä, jotka säätelevät solujen lisääntymistä, niiden selviytymistä ja niiden eheyden. Näytöt pyritään tunnistamaan tällaiset syöpä geenit käyttävät usein kromosomikohdassa ja /tai toiminnalliset ominaisuudet voivat valita ehdokkaita geenien myöhempää mutaation analyysi [1] – [4]. Vaikka monet ehdokas syöpä geenilokukset on tunnistettu, työvoimavaltaiset mutaation analyysi haittaa vakavasti löytää vastaavan syöpä geeniä. Muut geeni haku strategiat ovat keskittyneet poikkeavasta geeniekspressiomalleja tunnistaa ehdokkaita. Esimerkiksi geeni mutantteja, jotka johtavat ennenaikaiseen lopetuskodonien tunnistettiin seulomalla geenejä, jotka on erityisesti ilmaistu seuraava kemiallinen esto nonsense välitteisen RNA rappeutuminen [5]. Lisäksi fuusio geenien eturauhassyövän tunnistettiin seulomalla vieraat havainnot suuri kohortti geenien ilmentymisen profiilien [6].

Ihmisen syöpä geenimutaatioita johtaa usein ohituksen yhden tai useamman eksonit koodatusta transkriptien [7] – [9]. Eksoni-ohita mutaatiot voivat aiheuttaa nukleotidi- substituutiot konsensus liitoskohdat tai deleetioita, jotka kattavat koko eksonit. Lisäksi, eksonin ohittaminen mutaatiot voivat aiheuttaa suhteellisen pieni geeninsisäinen insertioita, deleetioita tai duplikaatioita. Vaikka eksoni-ohita mutaatiot ovat noin 10-20% kaikista syöpään liittyvien geenimutaatioiden [4], [9] – [12], ei ole suuren suoritustehon menetelmä on ollut saatavilla seuloa tällaisia ​​mutaatioita. Tässä kuvaamme Pattern Based Correlation (PAC) lähestymistapana tunnistaa ehdokas syövän geenien seulomalla eksoni-ohita tapahtumia globaalilla tavalla. Yksityiskohtaiset mutaatio analyysi on sitten rajoitettu vain PAC-tunnistetaan poikkeavien eksonit. Koska proof-of-periaate, me tehokkuuden osoittamiseksi PAC strategian aiemmin tunnistettu eksonipohjaisia ​​ohita mutaatiot rintasyövän solulinjoissa ja kliinisissä aivokasvain näytteitä. Osoitamme myös, että PAC voi tunnistaa uusia eksonin hyppimistä tapahtumia taustalla geneettisiä muutoksia tunnettujen syövän geenien ja satunnaisesti valitun PAC-tunnistettu outlier eksonit.

Tulokset

Outlier eksonin tunnistamiseen Pattern Perustuen Korrelaatio (PAC) B

tässä tutkimuksessa olemme kehittäneet uuden lähestymistavan seulontaan eksonipohjaisia ​​ohita tapahtumia ihmisen syövän näytteissä. Koska mutaatiot syöpä usein ovat hyvin erilaisia ​​suhteessa niiden geeninsisäiset sijainti, yksittäiset kasvaimet ilmaisevat usein ainutlaatuisia RNA lajeja. Seulomalla mutaatioita, jotka johtavat ohita yhden tai useamman eksonien koodatun transkriptio edellyttää näin ollen seulonta ainutlaatuinen, eksoni-ohitettiin transkriptien tietyn näytteen kohortissa. Lyhyesti, eksoni-tason ilmentymisen profiilit tuotetaan käyttämällä Affymetrix Human eksoni Arrays, jotka määrittävät ekspressiotaso lähes kaikkien eksonien läsnä ihmisen genomin. Kuvio perustuva Correlation (PAC) algoritmia käytetään sitten laskea arvioidun ekspressiotaso kunkin eksonin (tai koetinsarjaa). Sitten tunnistaa harha eksonit vähentämällä ennustettu ilmentymistason eksonien niiden mitatusta ilmaisun taso, jossa arvojen verran nolla, kun mitatun ekspressiotason eksoni oli samanlainen kuin sen ennustetun ekspressiotason (muotoiltu yksityiskohtaisesti alla Methods). PAC-algoritmi on käytetty tunnistamaan ero liitos välillä ennalta ryhmien [13]. Tässä tutkimuksessa olemme testanneet PAC algoritmi sen kyky tunnistaa poikkeuksellisesti ilmaistu eksonien samassa näytteessä on hyvin määritelty kohortin solulinjoja tai kasvaimia. PAC normalisoi tehokkaasti vaihtelua geeniekspressiotasot näytteiden välillä ja, yhdessä näytteessä, normalisoi vaihtelua signaalin voimakkuuden välillä koetinsarjojen saman transkriptin (Fig. 1).

(A) Normalized ilmaus tiedot kaikki eksonit sisällä

PTEN

geeni. Jokainen eksoni koetinsarjaa edustaa piste kiinteän linjan; useita koetinsarjojen voidaan suunnata saman eksonin. (B) PAC normalisoi vaihtelua geeniekspressiotasot näytteiden välillä ja, yhdessä näytteessä, vaihtelua signaalin voimakkuuden välillä koetinsarjojen saman transkriptio. PAC laskenta mahdollistaa siten nopean havaitsemisen ohittaminen on

PTEN

eksonin 4 rintasyövän MDA-MB-468 johtuen

PTEN

c.253 + 1G T silmukointikohtamutaatio että me aiemmin oli havaittu [17].

PAC havaitsee eksonipohjaisia ​​ohita tapahtumia rintasyövän solulinjoissa

Testasimme toteutettavuus PAC strategian paneelin 12 ihmisen rintasyöpäsolujen linjat, jotka oli seulottu mutaatioita seitsemän tuumorisuppressorigeeneille:

BRCA1

,

CDH1

,

MAP2K4

,

PTEN

,

p16

,

p53

ja

RB1 ​​

[14] – [18], ja julkaisemattomat tulokset). Mutaatio analyysi suoritettiin sekvensoimalla koko koodaussekvenssit geenien ja analyysi kaikista mutaatioita sekä genomisen geenin fragmenttien ja transkriptit. Yhdessä 12 solulinjat sisälsivät seitsemän geenin mutantteja, että pitäisi olla havaittavissa PAC, sillä ne johtivat ohituksen kahdeksan eksonien neljästä eri tuumorisuppressorigeeneille (mutaatiot ovat yksityiskohtaisesti taulukossa 1). Olemme tutkineet PAC strategian eri cut-off tasoa, tunnistaminen harha eksonit, joita esitettiin alle 16-kertaiseksi, 8-kertainen, 4-kertainen, 2,8-kertainen ja 2,5-kertainen kuin niiden ennustettu ilmaisun tasolla (eli PAC arvot -4,0, -3,0, -2,0, -1,5 ja -1,3, vastaavasti). Outlier eksonit tunnistettiin ilman aiempaa tietoa mutaation tietojen.

Vuodesta yhteensä 3,4 miljoonaa ydin koetinsarjojen että me rittää 12 solulinjojen (290000 ydin koetin sarjaa per näyte), PAC tunnistettu 21151 (0,6%) harha koetinsarjojen at PAC arvoon -4,0 ja 94590 (2,8%) harha koetinsarjojen at PAC arvoon -1,3 (Fig. 2A). Kaikki koetinsarjojen at PAC arvoihin -2,0 (34137 koetinsarjojen vastaa 31357 eksonit ja 10247 geenejä) luetellaan täydentäviä tietoja taulukossa S1. Kun kaikki PAC arvot piirretään taajuus histogrammissa, häntä kohti negatiivinen pää havaitaan (Fig. 2A). Tämä vino jakauma antaa karkean arvion väärien positiivisten eri PAC tasoilla. PAC seitsemästä täysin tunnettu tuumorisuppressorigeeneille vuonna 12 solulinjoissa mukana analyysi 1200 eksonien (1752 koetin sarjat). PAC oikein havaittu kuudessa kahdeksasta ohitetaan eksonit käytettäessä PAC arvo -4,0, seitsemän ohitetaan eksonit havaittiin hyvin PAC arvo -2.0 ja kaikki kahdeksan ohitetaan eksonit havaittiin hyvin PAC arvoon -1,3 (Fig. 2C). Tärkeää on, että määrä vääriä positiivisia poikkeavien eksonia pieneni huomattavasti klo PAC arvoon -4,0 verrattuna PAC arvoon -1,3, mikä nostaa todellisen positiivisen korko 9%: sta 24% tunnistetuista poikkeavien eksonit (Fig. 2D) . Vertailun, satunnaisotannalla 24/1200 eksonien on 85%: n todennäköisyydellä ei löydetä mitään oikeita positiivisia mutaation ja vain 10

-8 mahdollisuus löytää 6 tai enemmän. Sillä tiedetään syövän geenien käytetään Tutkimuksessamme todellinen positiivinen määrä lähestymistapamme siis selvästi suurempi kuin satunnainen eksoni valinta. Tässä suhteessa alentamista määrä vääriä positiivisia kandidaattigeenejä voi aluksi olla paljon hyötyä geenin hakuun hanke kuin tarkka tunnistaa kaikki oikeita positiivisia outlier eksonit. Yhdessä tuloksemme osoittavat, että PAC strategia on luotettava havaitsemisessa eksonipohjaisia ​​ohita mutantteja syöpäsolulinjoissa.

(A) ja (B) kokonaismäärä PAC-havaittu harha koetinsarjojen joukosta 290000 core koetinsarjojen 12 rintasyövän solulinjoissa ja 14 glioblastomas vastaavasti. (C) määrä ohitetaan eksonien havaita PAC prosentteina kaikista kahdeksasta ohitetaan eksonit läsnä rintasyövän solulinjoissa, tai prosentteina 36 ohitetaan

EGFR

eksonit läsnä glioblastomas (katso taulukko 1 ). (D) kokonaismäärä poikkeavien eksonien (true plus vääriä positiivisia) ja määrä oikeita positiivisia poikkeavien eksonit havaita PAC joukossa seitsemän kasvaimen synnyssä ja

EGFR

onkogeeni. Oikea positiivinen harha eksonit sisältävät kaikki PAC havaitut ohitettua eksonia ja kaksi missensemutaatioita (

PTEN

c.274G C CAMA1,

MAP2K4

c.551C G MDA-MB-134VI).

PAC suorituskyky näytteissä Epäyhtenäisiin transkriptioekspressiokuvio

Kuten muillakin geneettisten seulontamenetelmiä, PAC sopii parhaiten havaita homotsygoottinen geneettisiä muutoksia. Esimerkiksi pienin PAC arvon, kun 50% villityypin transkriptit ovat läsnä (kuten voi olla kyse heterotsygoottiseen geneettinen muutos) on -1.0. Hieman vaarantunut havaitseminen ohitettu eksonien at PAC arvoon -4,0 verrattuna PAC arvoon -1,3 (eli kuusi vs. kaikki kahdeksan ohitetaan eksonit) meidän paneelissa rintasyövän solulinjat voivat siksi ovat aiheuttaneet ilmaus toisen poikkeavasta transkriptio että edelleen sisältää (osan) eksonin. Todellakin, toinen

CDH1

transkriptio pituus vähäinen intensiteetti havaittiin CAMA-1 (Fig. 3A), silmukointikohdasta mutantti, joka oli havaittu vain PAC arvoon -1,3.

ohittaminen ja

CDH1

eksonin 11 rintasyövän solulinjassa CAMA-1 havaittiin vain nimellä PAC arvoon -1,3, mikä johtuu todennäköisesti ilmentymisen toisen poikkeavan transkripti variantti (*), joka havaittiin tavanomaisella RT-PCR: llä. (B) ekspressio

EGFR

transkriptit havaittiin glioblastoma näytteiden Real-Time RT-PCR: llä käyttämällä alukkeita, joiden tarkoituksena on pariutua sisällä eksonin 2-7 poistetaan alueella

EGFRvIII

isoformin ( harmaat pylväät) tai sen ulkopuolella deleetioalueella (mustat palkit). Erot Ct-arvojen välillä transkriptio fragmentit ovat ohjeellisia

EGFRvIII

isoformin ekspressiotasoja. Kaikki viisi näytettä kanssa

EGFRvIII

isoformin myös ilmaissut merkittäviä määriä villityypin

EGFR

selostukset, todennäköisesti vaarantaa arvojen havaitsemiseen PAC (merkitty ”havaittu” ja ”ei havaittu”). Villityypin, näytteitä normaali selostukset; Controls, hyvänlaatuisen aivot yksilöitä.

edelleen aasit suorituskyvyn PAC näytteissä kanssa heterogeeninen (villityypin ja mutantti) transkriptin ilmentyminen, suoritimme PAC 14 kliinisistä glioblastooma yksilöt (valittu sisältämään 70% kasvain ytimet), jotka oli genomista amplifikaatioita

EGFR

onkogeeni. Glioblastomas kanssa

EGFR

monistuksissa usein mukanaan geeninsisäiset poisto eksonien 2 7, jolloin ilmaus konstitutiivisesti aktiivinen

EGFRvIII

isoformi [8], [19]. Kuitenkin glioblastomas ilmentävät

EGFRvIII

isoformi myös usein ilmaista villityypin

EGFR

selostukset. Tämä heterogeeninen

EGFR

ilmentyminen liittyy monistumisen

EGFR

lokuksen ennen poistamista eksonien [20], vaikka ei-pahanlaatuisten solujen glioblastooma yksilöt voivat myös ilmaista

EGFR

. Neljästätoista glioblastooma näytteet tässä tutkimuksessa käytetyt, kuusi ilmaisi

EGFRvIII

(yhteensä 36 väliin eksonit), joista viisi on myös ilmaissut merkittäviä määriä villityypin

EGFR

selostukset määritetty kvantitatiivisen Real-Time PCR (qPCR) (Fig. 3B) (riittämätön RNA pysyi kuudennen näytteen

EGFRvIII

ilmaisun suorittamiseksi qPCR).

Vuodesta yhteensä 4,1 miljoonaa ydin koetin asetetaan, jotka me analysoitiin näiden 14 näytteen (290000 ydin koetin sarjaa per näyte), PAC tunnistettiin 1646 (0,04%) harha koetinsarjojen at PAC arvoon -4,0 ja 39936 (1,0%) harha koetinsarjojen at PAC arvoon -1,3 (Fig. 2B). PAC näin määritellyt kolme kymmeneen kertaa vähemmän harha eksonien glioblastomas verrattuna rintasyövän solulinjoissa (Fig. 2A). Kaikki koetinsarjojen at PAC arvoihin -2,0 (11287 koetinsarjojen, joka vastaa 10903 eksonit ja 6264-geenit) on lueteltu täydentävät tiedot Taulukko S1. Tämä pienempi määrä poikkeavien eksonien glioblastomas saattaa liittyä niiden homogeeninen histopatologian ja niiden hyvin samankaltaisia ​​geeniekspressioprofiilien [13], [21], läsnäolo ei-neoplastisten solujen kasvain näytteissä, tai se voi heijastaa näytteenotto harhat takia pieniin kohortin kokoja.

PAC on

EGFR

geenin 14 glioblastomas mukana analyysi 392 eksonien (434 koetin sarjat). PAC havaittu kaksi kuudesta

EGFRvIII

ilmentävien kasvainten (12 36 ohitettu eksonit) at PAC arvot -2,0 ja pienempi (taulukko 1 ja kuvio. 2C). Niistä kaksi glioblastomas kanssa

EGFRvIII

joka oli havainnut PAC, yksi oli merkittävästi (so 5 kertaa) enemmän mutantti kuin villikannan

EGFR

selostukset. Tässä kasvain, Ct-arvo ero oli 2 välillä qPCR fragmenttien sisältä (mitataan vain villin tyypin

EGFR

selostukset) ja ulkopuolella (mittaus sekä villityypin että

EGFRvIII

selostukset)

EGFR

eksoni 2-7 deleetioalueella (Fig. 3B). Toinen glioblastooma oli samanlainen ilme tasoero villin tyypin ja

EGFRvIII

selostukset (Ct arvon ero ~1.5) kuin kolme glioblastomas, joita ei ollut havainnut PAC, mutta oli pienempi yleinen

EGFR

transkriptipitoisuuksissa. Näyttää siltä, ​​että PAC havaitseminen

EGFRvIII

isoformin määräytyy ilmaisee yleisesti taso

EGFR

selostukset yhdistettynä suhde

EGFRvIII

ja villin tyypin

EGFR

selostukset, jossa näytteitä liian korkea

EGFR

transkriptipitoisuuksissa voi paeta PAC havaitsemisen takia kyllästymisestä koetinsarjojen mukana. Nämä tulokset osoittavat, että PAC strategia voi havaita eksonipohjaisia ​​ohita mutanttien kliinisissä syövän näytteitä, jos suhde mutantti /villityypin transkripti taso on korkea ja kun koetin sarjat ovat lineaarisen tunnistusalueella mikrosirun.

PAC suorituskyky havaitsemaan toistuvia harha eksonit

PAC suorituskykyä voidaan myös tehtäväkseen toistuvat outlier eksonit. Tällaiset usein ohitetaan eksonien johtaa aliarvioimiselta eksoni /transkriptio suhde PAC algoritmin ja niin lisäävät PAC arvoja. Siksi arvioitiin suorituskykyä PAC havaitsemisessa toistuvia harha eksonit mukaan toisti korvaaminen

EGFRvIII

ilmentävät näytteitä näytteitä että ilmaista vain villityyppistä

EGFR

(Fig. 4A). Kun kuusi 14 näytettä ilmaista

EGFRvIII

, poistamisen eksonien 2-7 GBM67 ei havaitse PAC. PAC-arvot tosiaan lyheni suhteet villityyppisen versus mutantti näytteitä. Kuitenkin lasku oli suhteellisen pieni ja tuloksena tunnistettiin vain yksi kuudesta poistetaan eksonit kun suhde oli laskenut yhden mutantti näytteen joukossa 14 näytettä. Olemme myös simuloitu PAC havaitsemista toistuva mutaatioiden kaksi rintasyöpäsolulinjoissa, joista HCC1937 oli ohitettu

RB1 ​​

eksonin 22, ja olimme jo pystyttävä tunnistamaan mutantti joukosta kaksi näytettä ajoittain jopa viisi mutanttien joukosta kuusi näytettä (Fig. 4B). Nämä simulointi kokeet osoittavat, että PAC toimii hyvin tunnistamaan toistuvat eksonipohjaisia ​​ohita mutaatioita.

(A) Simulation koe määrittää PAC suorituskyky havaitsemaan toistuvia eksonipohjaisia ​​ohita esiintymistiheys kliinisistä glioblastooma näytteistä, jossa mutantti näytteet ilmaista

EGFRvIII

isoformin poistamisen eksonien 2 kautta 7. kohortti 14 glioblastomas sisälsi kuusi mutantti näytteiden korvattiin villityypin näytteiden avulla toistona, perustuu niiden vasemmalta oikealle kuviossa. 3B. Poistaminen

EGFR

eksonin 6 näytteessä GBM67 havaittiin ainoastaan ​​ainutlaatuinen mutantti näyte. (B) Simulaattori koe määrittää PAC suorituskyky havaitsemaan toistuvia eksonipohjaisia ​​ohita tapahtumien joukossa rintasyövän solulinjoissa käyttämällä villityypin solulinjan CAMA-1 ja

RB1 ​​

eksoni 22 häviämämutantti HCC1937. Kaksi solulinjat analysoitiin erilaisissa kohortin kokoja, joko villityypin tai mutantti solulinja yhdestä näytteestä. Mutantti Näyte havaittavissa vielä PAC arvoon -2,0 viisi toistuvia mutanttien joukossa kuusi näytettä. Keskimääräinen ekspressiotaso

RB1 ​​

eksoni 22 putosi alle PLIER 50, kun yli viisi mutantteja simuloitiin, esteenä PAC analyysi (katso materiaalit ja menetelmät).

Detection nukleotidikorvauksia ja Uuden perintöaineksen muutokset PAC

suorituskyky PAC arvioitiin edelleen analysoimalla poikkeavien eksonien valitaan kaikille hakijoille PAC arvoon ≤-2.0 rintasyövän solulinjoissa ja kliinisistä glioblastooma näytteitä. Yhteensä 44 ja 68 harha eksonit seulottiin rintasyövän solulinjoissa ja glioblastooma näytteitä vastaavasti. Sekvenssianalyysi monistettiin PCR poikkeavien eksonit tunnistettiin kaksi uutta eksonin ohittaminen tapahtumia ja kaksi uutta geeniperustan muutoksia glioblastooma näytteissä, sekä eräille aiemmin raportoitu emäsmuutoksista (homotsygoottinen SNP) rintasyövän solulinjoissa (n = 5) ja glioblastoomissa ( n = 16). RT-PCR kokeilun tulokset on esitetty yksityiskohtaisesti täydentävät tiedot Taulukko S2.

Suurin geneettisten muutosten tunnistaa PAC oli yhden nukleotidin muutokset sekä rintasyövän solulinjoissa (viisi tunnettujen SNP) ja glioblastomas (kaksi uutta pohja muutokset ja 16 tunnettujen SNP). Lisäksi kahdella kymmenestä aiemmin havaittujen kasvaimia synnyttävän pistemutaatioita, jotka eivät johda eksonin ohittaminen tapahtumia myös PAC havaittu omassa kohortissa rintasyövän solulinjoissa:

MAP2K4

c.551C G MDA-MB-134VI ja

PTEN

c.274G C CAMA-1; [16], [17] (Fig. 5). Yhden nukleotidin epäsuhta on käytetty määrittämään hybridisaatio spesifisyys muilla Affymetrix microarray alustoille. Vastaavasti yhden nukleotidin substituutioita syöpä voi myös aiheuttaa heikentynyt hybridisaatio koettimien microarray ja siten havaita harha eksonit PAC. Todellakin, kaikki PAC havaittujen pohja muutoksia ja SNP: tä keskitetysti sijaittava koetinryhmää valinta-alueen ja päällekkäisiä useat sen yksittäisten koettimien (Fig. 5).

(A) PAC ennustaa ohita 5′ loppuun

PTEN

eksonin 5. CAMA-1 rintasyövän solulinjaa. Tämä solulinja sisältää nukleotidin vaihdon sisällä tunnistettu eksoni. Tämä pohja muutos ei aiheuta eksonin ohittaminen mutta sijaitsee keskeisellä paikalla kaikki kolme koettimet koetinsarjaa (B). Keskeinen sijainti viittaa siihen, tämä mutaatio aiheuttaa alentunut affiniteetti koettimista eksoni-array.

Yksi PAC tunnistettu uusi eksonin ohittaminen tapahtumia oli ennustettu johtaa poistetaan neljän 3′ eksonit

EGFR

(Fig. 6A). Tämä eksonin ohittaminen tapahtuma johtui genomisen deleetion määritettynä käyttäen semi kvantitatiivinen PCR genomi-kasvain-DNA. Verrattuna 5 ’päähän

EGFR

lokukseen GBM157, 3′-pää näytti vähemmän vahvistusta (ACt -2,5), kun taas muut näytteet osoittivat yhtä suuri vahvistus välillä 5′ ja 3 ’geenin päähän (ACt 0,3 ± 1,9). Vastaavia 3 ’deleetiot

EGFR

on havaittu aiemmin glioomis- [19]. Toisen eksonin-hyppimistä tapahtuma ennustaa PAC johtaisi poisto eksonin 30

FCGBP

cDNA (Fig. 6B). Tämä deleetio aiheuttaa lukukehyksen, joka on ennustettu johtavan katkaistun proteiinin. Koska eksoni 30 vahvistettiin RT-PCR ja sekvenssianalyysi (Fig. 6C). Novel tunnistettu yhden emäksen muutoksia ovat yhden emäksen muutos 1934C G (S645C)

EGFR

geenin (Fig. 6A ja D), ja yhden emäksen muutos 946G A (G316R)

TLE2

geenin (Fig. 6E). G316R (946G A) mutaatio

TLE2

on suoritettu ”patologiset” by PMut (mmb2.pcb.ub.es:8080/PMut/) ja ”ei siedä” by SEULOA BLINK (blocks.fhcrc. org /sihdata /SIFT_BLink_submit.html). Yhteenvetona uusi eksonin ohittaminen tapahtumia ja emäsmuutosten tunnistettiin analysoimalla valikoituja poikkeavien eksonien vahvistaa soveltuvuutta PAC tunnistaa ehdokas syöpägeenit.

(A) PAC havaitseminen uusia geneettisiä muutoksia

EGFR

. PAC ennusti ohita neljän viimeisen eksonin GBM157 ja 5’eksonin 17 GBM172. Semikvantitatiivinen PCR genomi-DNA vahvistettiin deleetion GBM157 (ei esitetty). (B) PAC ennustaa eksonin 30

FCGBP

geenin GBM60. (C) RT-PCR vahvisti

FCGBP

eksonin ohittaminen tapahtuma GBM60; muut kasvaimet eivät näytä tätä eksonin ohittamisen. (D) suora sekvensointi tunnistaa yhden emäksen muutos

EGFR

vuonna GBM172 (kuten ennustettu PAC, ks. 6A). (E) vahvistaminen PAC ennustettu muutos

TLE2

geenin GBM60. Nukleotidisekvenssi korvaaminen päällekkäinen yksittäisiä koettimet koetinsarjaa.

Keskustelu

Olemme kehittäneet lähestymistavan, joka käyttää kuvio perustuva Correlation (PAC) seuloa syövän geenimutaatioita, jotka aiheuttavat eksoni ohita koodatussa selostukset. Osoitamme, että PAC tunnistettu oikein kaikki seitsemän aiemmin havaittujen eksonipohjaisia ​​ohita mutanttien rintasyövän solulinjoissa ja kaksi kuudesta mutanttien kliinisissä glioblastooma näytteistä. Oikean ja väärän positiivisen hinnat määritettiin eri sitovuusasteita. Tärkeää on, PAC tunnistettu useita uusia geneettisiä muutoksia, mukaan lukien vaikuttavat liittämiseen, jotka aiemmin oli mennyt huomaamatta. Nämä uudet geneettiset muutokset ovat joko tunnetulla syövän geenien (

EGFR

), johtaa lukukehyksen (

FCGBP

) tai sulatettu ”ei suvaita” geenitekniikan Ennustusalgoritmien PMut ja SEULOA vilkkua (

TLE2

). Muita kokeita tarvitaan, onko muutoksia uusi ehdokas syöpä geenit (

FCGBP

ja

TLE2

) ovat todellakin onkogeenisia. Huomattava määrä nukleotidikorvauksia jotka sijaitsevat koetinsarjaa valinnan alueella on myös PAC havaitsimme (Fig. 5). Tuloksemme siis luokitella PAC luotettava lähestymistapa seuloa ehdokas syövän geenien globaalilla tavalla.

geeniekspressioprofilointi tasolla yksittäisten eksonien on vasta äskettäin tullut toteutettavissa vapauttamalla eksonin taulukot. Tässä olemme tutkineet tehoa PAC tunnistaa eksonin ohittaminen mutantit, mutta strategiaa voidaan käyttää myös päätellä ensisijainen rakenne-geenin transkriptien [13], [22]. On tärkeää huomata, että PAC algoritmi, yksityiskohtainen alle Materiaalit ja menetelmät, on pohjimmiltaan yksinkertainen kaava, joka ennustaa harha eksonit perustuu kertaluokkamuutos eroja mitatun ja ennustetun eksonin ekspressiotasoja. Muita lähestymistapoja voidaan myös käyttää tunnistamaan harha (esim. n standardi poikkeamat tarkoittaa ilmaus taso) mutta täytyy selittää epälineaarisuus geeniekspressiotasot näytteiden välillä (erityisesti syövän geenien) ja rajallisen otoksen koko. Koska korkea oikeita positiivisia hinnat saatu PAC, emme lähemmin vaihtoehtoisten tilastojen lähestymistapoja.

PAC algoritmi on riippumaton joukko alustan tai organismi, joka mahdollistaa soveltaminen PAC strategian monenlaisia ​​biologisten järjestelmien . Useita algoritmeja eksonin tason ilmentymisen profilointi on kaupallisesti saatavissa, kuten Stratagene ArrayAssist (www.stratagene.com), Partek Genomics Suite (www.partek.com) ja Genomatix Suite (www.genomatix.de). Vaikka jokainen näistä ohjelmistopaketteja on suhteellisen suoraviivaista, tärkeitä etuja PAC ovat, että se mahdollistaa havaitsemisen ainutlaatuinen poikkeavien eksonien ilman aiempaa tietoa koodaavan geenin tai sen transkriptio rakennetta ja että se ei vaadi ennalta alaryhmiä näytteiden differentiaalikaavojen ja poikkeavien eksonien.

Kuten minkä tahansa globaalin seulontastrategia, PAC on sen edellytyksiä havaitsemiseksi outlier eksonit. Ensinnäkin, tunnistaminen harha eksonien edellyttää opintosuoritusotteensa ilmentymistason olevan lineaarisella tunnistusalueella eksonin array, joka määräytyy opintosuoritusotteensa ekspressiotaso sekä hybridisointitehokkuus ja spesifisyys koetinsarjojen mukana. Vaalipiirissä testinäytteet on toinen näkökohta, varsinkin kun sekä mutantti ja villityypin transkriptit voidaan ilmaista. Esimerkiksi rintasyöpä solulinjassa ryhmä koostui kahdesta silmukointikohtaan mutantit, jotka karannut havaitseminen PAC koska jokainen oli toinen transkriptio pituus voimakkaimman intensiteetin, joka johtui Kryptinen liitos (

BRCA1

c.5396 + 1G A MDA-MB-436 [14] ja

p16

c.150 + 2T C MDA-MB-436 (Nagel

et al.

, jätetty julkaistavaksi). Lisäksi PAC havaitseminen on

EGFRvIII

transkriptio isoformi kliinisissä glioblastomas määritettiin yleistä ilmentymistason

EGFR

selostukset, joka oli lähellä rajoja lineaarisen havaitsemisen kaikissa viidessä

EGFRvIII

glioblastoomissa , mutta myös suhde

EGFRvIII

isoformi verrattuna villityypin

EGFR

selostukset (Fig. 3B). seuraus on, että PAC suorituskyky voi vaarantua havaitsemisessa Peränpitäjänä eksoni kun villi tyyppinen selostukset edustavat yli neljäsosa kaikista transkriptien kyseisen geenin, joka voisi olla mahdollista esimerkiksi kasvain näytteissä on vähemmän kuin 75% kasvainsolujen. kuitenkin ekspressiotasot mutanttien ja villityypin alleelit ovat tyypillisesti suhteettomia niiden alleelin taajuus ja havaitseminen PAC näin taas määräytyy (suhteellinen) ilmentymistason poikkeavien transkriptio. PAC siis toimii parhaiten ilman villityypin transkripti ilme. Homotsygoottinen selostukset ovat pääasiassa keskuudessa tuumorisuppressorigeeneille, jossa usein yksi alleeli on mutatoitunut liittyy menetys toisen alleelin.

vaikutus alleelin suhteilla korostettiin edelleen meidän simulaatioita toistuvien arvojen havaitsemiseen PAC: Tällä

EGFRvIII

isoformi GBM67 havaittiin vasta, kun se oli läsnä ainutlaatuinen harha joukossa 14 näytettä, kun taas sitä ei ollut havaittu alkuperäisestä PAC-näyttö, joka sisälsi viisi muuta

EGFRvIII

ilmentävien glioblastoomissa (kuvio . 4A). Kuitenkin tämä osa optimaalisen PAC suorituskyky ilmestyi eivät liity toistumisen poikkeavuuksien toistuvaksi harha oli helppo tunnistaa joukosta solulinjoja – vaikka läsnä viisi kuudesta solulinjojen (Fig. 4B). Simulointikokeiden ilmeni myös, että kahden solulinjan riittivät luotettavasti havaita harha eksonit ja että yli kahdeksan solulinjat eivät entisestään parantaa PAC suorituskykyä, kun taas kliininen kasvain näytteissä kymmenen ilmestyi minimiin vaan kaksikymmentä olisi edullista (Fig. 4).

Kuinka tehokas voi PAC olla mutaatioiden havaitsemiseksi syöpä genomien? Meidän valinta harha eksonien tunnistimme -20% (21/112) SNP, ~ 2% (2/112) uusi pohja muuttuu ja ~ 2% (2/112) eksonin ohittaminen tapahtumia. Kun mukaan lukien kaikki nukleotidisubstituutioita, väärien positiivisten määrä näissä kokeissa on ~76%. Laajemmassa, vahvistusta ja sekvensointi 1763 reaktioita yksittäisestä näytteestä (kaikki harha at PAC arvoihin -4,0) voidaan odottaa tuottavan jopa 34 uusia pohja muuttuu ja 34 eksonin ohittaminen tapahtumia. Siksi meidän lähestymistapaa voidaan luokitella erittäin tehokas seulontamenetelmä ehdokas syövän geenien, erityisesti verrattuna satunnaisessa eksonien. Lisätutkimukset olisi sitten suoritettiin sen selvittämiseksi tunnistetut muutokset ovat syy varten kasvainten muodostumista ja /tai etenemisen, esimerkiksi seulomalla lisää mutaatioiden (esim poistot, joiden mutaatiot) muissa Tuumorinäytteissä tai toiminnallinen analyysi tunnistettu mutantteja.

Materiaalit ja menetelmät

näytteitä

Meidän kokoelma 41 julkisesti saatavilla ihmisen rintasyövän solulinjoissa oli alistettu mutaatiostatuksesta näytöt seitsemän tuumorisuppressorigeeneille:

BRCA1

(Breast Cancer alttius geenin 1, OMIM 113705),

CDH1

(E-kadheriinin, OMIM 192090),

MAP2K4

(MAP kinaasikinaasin 4, eli

MKK4

; OMIM 601335),

PTEN

(Phosphatase ja Tensin Homologi; OMIM 601728),

p16

(CDK4-estäjä, eli

INK4a

,

CDKN2A

; OMIM 600160),

p53

(tuumoriproteiinia p53; OMIM 191170) ja

RB1 ​​

(retinoblastoomasolulinjassa alttius geenin 1, OMIM 180200) [14] – [18] (Nagel

et al.

toimitettu julkaistavaksi). Mutaatioanalyysi mukana sekvensoimalla koko koodaavan alueen näiden geenien genomista DNA: ta, sekä analyysi koodatun transkriptin. Kahdentoista rintasyövän solulinjat, joita käytetään tässä tutkimuksessa olivat: CAMA-1, EVSA-T, HCC1937, MDA-MB-134VI, MDA-MB-157, MDA-MB-435s, MDA-MB-436, MDA-MB- 453, MDA-MB-468, MPE600, OCUB-F ja SK-BR-5. Kliiniset glioblastooma näytteet jäädytettiin nestetypessä heti kirurgisen resektion potilailta Erasmus University Medical Center, kuten muualla on kuvattu [13]. Patologinen tarkastelu paljasti vähintään 70% kasvain ytimiä kunkin näytteen. Mutation analyysi

EGFR

onkogeenin (epidermaalisen kasvutekijän reseptori, OMIM 131550) on glioblastoomat suoritettiin tavanomaisella RT-PCR: llä ja sen jälkeen sekvensointi transkriptien näytteiden

EGFR

monistuksissa.