Krooninen sairaus

tiivistelmä

ataksia-telangiektasiassa mutatoitunut (ATM) on Ser /Thr proteiinikinaasi että on ratkaiseva tehtävä DNA vaurioita aiheuttama signalointi ja aloittamisen solusyklin Checkpoint signalointi vastauksena DNA: ta vaurioittavien aineiden kuten ionisoivaa säteilyä. Olemme aiemmin raportoitu ATM proteiinin tappio immunohistokemiallinen (IHC) 16% ihmisen mahasyövän (GC) kudosta. Oletimme, että

ATM

geenin intronin mutaatioiden kohteena mikrosatelliittien epävakaus (MSI) aiheuttaa ATM proteiinia tappio osajoukko GC. Tutkimme mononukleotidi mutaatiot intronin

ATM

geenin, ATM IHC ja MSI GC. Kymmenen ihmisen mahasyöpä solulinjoissa tutkittiin

ATM

geenimutaation at introneja, RT-PCR, suora sekvensointi ja immunohistokemia. GC kudoksia 839 potilasta analysoitiin MSI ja ATM IHC. Niistä 604 tapausta analysoitiin

ATM

mutaatiot intronit edellisessä eksonissa 6, eksonin 10 ja eksonin 20. Kaksi ihmisen GC solulinjoissa (SNU-1 ja -638) osoitti

ATM

introni mutaatioita, deleetio RT-PCR ja suoralla sekvensoinnilla, ja ATM-proteiinin menetystä IHC. Taajuudet on

ATM

mutaatio, MSI, ja ATM-proteiini tappio oli 12,9% (78/604), 9,2% (81/882) ja 15,2% (134/839), tässä järjestyksessä. Analyysi yhdistysten kesken MSI, ATM geenimutaatio, ja ATM-proteiini menetys paljastui erittäin rinnakkaisiin

ATM

geenin muutokset ja MSI.

ATM

intronin mutaatio ja ATM-proteiinia tappio havaittiin 69,3% (52/75) ja 53,3% (40/75) MSI positiivisia GC. MSI positiivisuus ja ATM-proteiinin menetys oli läsnä 68,4% (52/76) ja 48,7% (37/76) GC ATM introni mutaatio.

ATM

mutaatio ja ATM-proteiinin menetys oli ominaispiirteet vanhuuden, distaalinen sijainnin kasvain, suuri kasvaimen koon ja histologinen suoliston tyyppi. Tutkimuksemme voitaisiin tulkita, että

ATM

geenin mutaatio intronin voidaan kohdistaa MSI ja johtaa ATM proteiinin tappion valitussa ryhmässä GC.

Citation: Kim HS, Choi SI, Min HL, Kim MA, Kim WH (2013) Mutation at intronisekvenssejä Toistot on ataksia-verisuoniluomen mutaation (ATM) Gene ja ATM Protein tappio Ensisijainen mahasyövän kanssa microsatellite Epävakaus . PLoS ONE 8 (12): e82769. doi: 10,1371 /journal.pone.0082769

Editor: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, Korean tasavallan

vastaanotettu: 21 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 27 lokakuu 2013; Julkaistu: 06 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Basic Science Research Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama tiede, ICT Tulevaisuuden suunnittelu (NRF-2012R1A1A2004648). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ataksia-telangiektasiassa mutatoitunut (ATM) geeni on osa DNA-vaurioita vastaus (DDR) ja aktivoidaan DNA kaksinkertainen katkeamisen (DSB: t), ja signaloi solusyklin Checkpoint hidastaa kulkua solujen läpi sykli helpottamiseksi DNA korjaukseen. Geeni on paikannettu kromosomiin 11q22-23.

ATM

geeni on hyvin suuri, joka ulottuu genominen alue 150 kb, joka sisältää 66 eksonia, joiden koodaava sekvenssi 91668 bp.

ATM on sekaantunut vastauksissa DSB: ihin, joita esiintyy fysiologisesti erikoistuneissa solutyypeissä kuten itusolujen ja lymfosyytit. ATM-proteiini auttaa soluja tunnustaa ehjä DNA-säikeet. ATM-proteiini koordinoi DNA korjaukseen aktivoimalla entsyymejä, jotka korjaa rikkoutuneet säikeitä. Tehokas korjaus vahingoittuneiden DNA-juosteet auttaa säilyttämään vakautta solun geneettinen tieto [1].

ATM menetystä havaittiin 16% ihmisen GC kudoksen suuressa kohorttitutkimuksessa [2]. Inaktivointi

ATM

geeni voi olla yleinen tapahtuma inhimillisen mahasyövän (GC); kuitenkin liittyvät tapahtumat menetys

ATM

ilmaisun GC ei voitu selittää alhainen esiintyvyys

ATM

mutaatio. Useimmat

ATM

mutaatioita tunnistettiin ensisijaisesti GC solulinjoissa ja GC kudokset olivat pistemutaatioita [3].

DNA mismatch korjaus (MMR) järjestelmä korjaa virheet, joita saattaa syntyä DNA-replikaation, kun taas homologisen rekombinaation ja ei-homologisen end liittymällä osallistuvat korjaus DNA: n DSB. Mutaatiot DNA: n DSB korjaavien geenien kuten

ATM, MRE11, RAD50, NBS1

ja

ATR

, ovat oletettuja olevan merkitystä kehitettäessä ruoansulatuskanavan pahanlaatuisten kasvainten, joilla oli heikentyneen MMR toiminto. Peräsuolen kasvainten heikentynyt MMR-mekanismin, mutaatiot introni-mononukleotidi toistoja

ATM

ja

MRE11

havaittiin johtaa poikkeavaan liittämiseen, jonka jälkeen vähentää ilmentymistä villityypin proteiini [4 ].

Noin 10% GC liittyy mikrosatelliittien epävakaus (MSI). MSI viittaa muutoksia nukleotidisekvenssien määrä toistoja microsatellite alueilla sijaitsevat koodaavan alueen geenien, ja tulokset lukukehysmutaatioita. MSI on havaittu proteiinia koodaavat alueet tunnettuja kohdegeenien, kuten

TGF-pRII, IGFIIR, BAX

[5-7], ja

hRAD50

geenit [8].

hRAD50, BLM

, ja

BRACA1

geenit ovat poly (A) mononukleotidi toistuu sisällä koodausalueissa,

hMSH6

on (C) 8-suolikanavan

NBS1

on (A) 7-suolikanavan ja

ATM

on (T) 7 ärsytystä. Lukukehysmutaatioita näistä geeneistä vaihtelevalla ilmaantuvuus on raportoitu aikaisemmin [9-11].

Lisäksi lukuisat mutaatiot kertynyt vapaalla microsatellite sekvenssit, MSI tuottaa myös mutaatioita syövän geenien, eli niissä geenien aktiivista roolia monivaiheisessa prosessissa syövän. Vaikka toistuva sekvenssien koodaavan alueen geenit ovat lyhyempiä kuin tyypilliset mikrosatelliitti loci käytetään geenin kartoitus, niiden taipumus olevien spontaanin liukumisen virheet replikaation aikana on edelleen suurempi kuin toistuvajaksoinen sekvenssejä. Mutaatiot introni- toista raportoitu aiheuttavan heikentynyt ilmentymisen

MRE11

geeni [12,13]. Polypyrimidiinijuosteen toista mutaatiot

ATM

geeni voi häiritä oikean mRNA [14]. Ei ole kuitenkaan mitään todisteita siitä, että lisäys /poisto tapahtumisen näissä ei-koodaavat mononukleotidi sekvenssit vaikuttaa normaalia ATM-proteiinin funktion MSI liittyviä GC. Ihmisen GC kudoksen MSI, taajuus

ATM

mutaatio ja yhdessä menetys proteiinin toimintaa ei ymmärretä selvästi. Olemme arveltu, että mononukleotidi suolikanavan muutokset intronin

ATM

geeni liittyy menetys ATM-proteiinin funktion GC MSI.

Tässä tutkimuksessa mutaatiot introni (t) 15 sisällä

ATM

geenin välissä sekvenssi (IVS) edeltävän eksonin 6, joka johtaa 22 bp: n poistuman eksonin 6 ihmisen mahasyövän solulinjoissa . Esillä olevassa tutkimuksessa mutaatiot

ATM

geeni yhdessä läsnäolo MSI tutkittiin ihmisen GC solulinjoissa ja ensisijainen GC kudoksiin. Tuloksemme osoittivat, että

ATM

geenin introni mutaatio oli yleisempää GC MSI ja merkitsevästi liittyy menetys ATM proteiinin toiminnan.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tämä retrospektiivinen tutkimus tehtiin käyttämällä näytteitä yli hyllyt jälkeen patologisen diagnoosin, ja kaikki näytteet anonymisoidaan ennen tutkimusta. Tämä retrospektiivinen tutkimus hyväksyi Institutional Review Board of Seoul National University Hospital (H-1010-065-336) kanssa luopuminen tietoisen suostumuksen edellyttäen että nimettömäksi.

Solulinjat ja kudosnäytteiden

Kymmenen ihmisen mahalaukun syöpäsolu lines- SNU-1, SNU-5, SNU-16, SNU-216, SNU-484, SNU-601, SNU- 620, SNU-638, SNU-668 ja SNU-719 saatiin Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). Kaikki solulinjat kasvatettiin RPMI1640 täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Hyclone, Lorgan, UT, USA) ja antibiootteja (100 U /ml penisilliini G ja 100 ug /ml streptomysiiniä), 37 ° C: ssa kostutetussa 5% CO

2-inkubaattorissa. Solu-line kudoksen array slide valmistettu korjattu ja kiinteän ihmisen GC solulinjat saatiin immunohistokemiallinen (Superbiochips, Korea).

Formaliinifiksoidusta, parafinoidut GC kudosnäytteiden 839 potilasta joille tehtiin parantava gastrectomy varten ensisijainen mahasyöpä kohtelu 1

tammikuuta 2004 ja 31

st joulukuussa 2005 Seoul National University Hospital kerättiin. Potilaat mukana 577 miestä ja 262 naista, joiden keski-ikä oli 57,6 vuotta (vaihteluväli: 4-87 vuotta). Tiedot kasvaimen sijainti saatiin 835 tapauksista: ylempi kolmas 109, keskimmäinen kolmas 323, alempi kolmas 383, ja koko mahassa 20 tapauksessa. Perustuu Lauren luokittelun syövät olivat histologisesti luokiteltu suoliston kirjoita 381, diffuusi tyyppi 327, sekamuotoinen vuonna 123, ja määrittelemätön 8 tapauksissa. Niistä 839 tapauksessa oli 165 varhainen GC ja 674 oli kehittynyt GC. Imusolmuke etäpesäke oli läsnä 531 tapauksissa ja poissa 308 tapauksissa. Kaksisataa ja neljäkymmentäviisi potilasta diagnosoitu vaiheessa I, 254 kuten vaiheessa II, 291 kuten vaiheessa III, ja 85 kuten vaihe IV. Adjuvanttihoitoa leikkauksen jälkeen suoritettiin 533 potilaalla, joka sisältää 32 potilasta vaiheessa I, 153 vaiheessa II, 260 vaiheessa III, ja 82 vaiheen IV. Keskimääräinen seuranta-aika oli 49,3 kuukautta (vaihteluväli 0-85 kuukautta). Paikalliset toistumisen todettiin 185 (21,0%), kaukainen etäpesäke 85 (9,6%), ja kuolema tahansa syy 289 ulos 882 potilasta (32,8%). Potilaan selviytyminen tiedot, mukaan lukien päivämäärät ja kuolinsyitä, saatiin Korean Central Syöpärekisteri, terveys- ja hyvinvointi, Koreassa. Standard histopatologinen tutkimus sisältyy arvio syöpätyypin ja patologinen kasvain vaiheessa perusteiden mukaisesti perustetun 7. Edition AJCC Välivarastointi Manual [15].

DNA: n eristämistä ja MSI määritys

Tuumorikudos näytteet lasilevyille tutkittiin valomikroskoopilla. Alueen kasvaimen, jossa prosenttiosuus kasvainsolujen ylitti vähintään 50% kaikista soluista, jotka alue ja pariksi alueen normaalin limakalvon, jossa ei ole kasvainsoluja merkitty ja kaavitaan veitsen terä. Kaavinlämmönvaihdinta kudos kerättiin 1,5 ml: n mikroputkiin, jotka sisälsivät 50 ui kudosta lyysipuskuria (0,5% Tween 20 [Sigma, St. Louis, MO], 100 mM Tris-HCl-puskuria [pH 7,6], 1 mM EDTA: ta, ja 20 ug proteinaasi K [ ,,,0],Sigma]). Putkia inkuboitiin 24-48 tuntia 55 ° C: ssa, kunnes kudos sisältävää hajotuspuskuria tuli selväksi. Proteinaasi K inaktivoitiin inkuboimalla 95 ° C: ssa 10 minuuttia, ja uutettiin DNA säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. MSI on arvostettu loci BAT25, BAT26, D2S123, D5S346, ja D17S250. Kasvaimet luokitellaan MSI +, kun vähintään 2 (40%) ja 5 mikrosatelliittimarkkerin liittyi alleelien muuttunut koko kasvaimen DNA verrattuna DNA: n kanssa ei-kasvainkudoksessa.

havaitseminen mutaatioiden

ATM

on intronin mononukleotidi toistaa

PCR-monistus suoritettiin 10 ul: n tilavuudessa, joka sisälsi 1 ui genomista DNA: ta, 5 pmol kutakin eteenpäin ja taaksepäin-alukkeita, ja 5 ui Premix. Kolmekymmentä kolme PCR-sykliä suoritettiin työkiertoparametrin 95 ° C 30 sekuntia, 30 sekuntia lämpökäsittelylämpötilaan sopivat kullekin alukeparia ja 65 ° C 1 min, jota seurasi 10 min pidennys 72 ° C: ssa.

vaihtelu mononukleotidi toista

ATM

geeni havaittiin käyttäen PCR-pohjainen määritys. Perimän DNA monistettiin primers- F-CCTTTTTCTGTATGGGATTATGG, R-TGAACATCTTGTGAAGGTTTCAG varten exon6 (T) 15 (155 emäsparia), F-TCCTTTTAGTTTGTTAATGTGATGGA, R-GCTGTTGGGGTAGAAGCTGA varten exon10 (T) 15 (165 emäsparia), ja F-GCCAATGGAAGATGTTCTTGA, R- CATCTTGGTCACGACGATACA for exon20 (T) 15 (178 emäsparia).

Detection poikkeavan silmukoinnin

ATM

Kokonais-RNA (2,5 ug) ihmisen mahasyöpä solulinjoissa valmistettiin Trizol-reagenssia (GIBCO-BRL) käytettiin ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi Superscript II Reverse Transcriptase (GIBCO-BRL) ja oligo-d (T)

12-18-aluketta. Alikvootti reaktioseos monistettiin PCR: llä syntetisoimaan eri segmenttejä ATM cDNA.

PCR-monistus suoritettiin 20 ul: n tilavuudessa, joka sisälsi 1 ui käänteistranskriptoidaan cDNA, 5 pmol kutakin eteenpäin ja taaksepäin-alukkeita, ja 10 ui Premix. Kolmekymmentäviisi sykliä PCR: ää suoritettiin työkiertoparametrin 95 ° C 30 sekuntia, 30 sekuntia lämpökäsittelylämpötilaan sopivat kullekin alukeparia ja 72 ° C 1 min, jota seurasi 10 min pidennys 72 ° C: ssa. PCR-tuotteet ajettiin elektroforeesilla 2% agaroosigeelillä, joka sisälsi etidiumbromidia ja visualisoitiin UV-valon alla. β-aktiini on käytetty sisäisenä standardina.

kolme RT-PCR-alukeparia, jotka ovat peräisin

ATM

sekvenssejä (GenBank NM_000051), jota käytetään oli F-TGGTGCTATTTACGGAGCTG ja R-TTCGAAAGTTGACAGCCAAA havaita selostukset eksonin 5-7 (tuote koko: 347 bp), F-TCCCTTGCAAAAGGAAGAAA ja R-TACTGGTGGTCAGTGCCAAA eksonille 9-11 (tuote koko: 504 emäsparia), ja F-TGGAGAAGAGTACCCCTTGC ja R-GATTGACTCTGCAGCCAACA eksonille 19-22 (tuote koko: 415 emäsparia ).

Sekvensointianalyyysi

Sekvensointi suoritettiin dideoksi-ketjun päättymisen menetelmällä käyttämällä DNA-sekvensoinnin kittiä (Applied Biosystems) ja ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Monistetut PCR-tuotteet puhdistettiin entsymaattisesti käyttämällä presequencing (Amersham Life Science, Cleveland, OH, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden, ja sitten sekvensoitiin suoraan käyttäen BigDye Terminator menetelmää (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sekvensointireaktiot ajettiin ABI 3100 automaattisen sekvensserin (Applied Biosystems, Biosystems, Foster City, CA, USA), ja saadut tiedot analysoitiin käyttämällä DNA-sekvenssianalyysi, 3,7-ohjelmisto (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Uudet tiedot on talletettu GenBank (hakunumero: KF704396).

immunohistokemia

edustaja kasvain-lohko-ja solu-linjajärjestelmä osat 4 um paksuus poistettiin parafiini ja niihin lisätään arvostellaan alkoholia. Antigeeni haku saavutettiin paine -cooking näytteet 0,01 mol /l sitraatti- puskurissa 5 min. Kani monoklonaalinen vasta-aine (klooni Y170 saatu Epitomics, Burlingame, CA, USA) käytettiin immunohistokemiaa. ATM värjättiin tumassa normaalin mahan limakalvon, stroomasolut, ja lymfosyytit. Intensiteetti luokiteltiin 0 (täysin negatiivinen), ± (epäselvä värjäytyminen, signaali havaitaan vain suuritehoisia mikroskopiaan × 40 okulaari), + /3 (heikko positiivinen), ++ /3 (kohtalaisen positiivinen) ja +++ /3 (voimakkaasti positiivinen, lähes yhtä lymfosyyttien ja neutrofiilien). Kriteerit negatiivista tapausta asetettiin alle 10% soluista värjättiin heikko positiivinen (+ /3) tai suurempi intensiteetti, joka on yli 90% soluista osoittaa täysin kielteisesti (0) tai epäselviksi värjäys (±) [2 ].

tilastollinen

SPSS 15.0 paketti käytettiin tilastollisia analyysejä. Chi-square testi ja Coxin suhteellisten riskien mallia käytettiin. Kaikki P-arvot ovat kaksipuolisia ja P-arvot 0,05 pidettiin merkittävinä, että tilastollisia menetelmiä tässä tutkimuksessa.

Tulokset

Mutaatio introni mononukleotidi toistoa ATM geenin ihmisen mahalaukun syöpäsolulinjoja

Niistä 10 ihmisen mahasyövän solulinjoissa, SNU-1 ja SNU-638 luonnehdittiin MSI positiivinen,

ATM

geenimutaatioita positiivinen ja ATM menetystä IHC. In SNU-1 ja SNU-638, 22 emäsparin deleetio eksonista 6 havaittiin RT-PCR: llä, ja se vahvistettiin myöhemmin sekvenssianalyysillä (kuvio 1). SNU-5, SNU-16, SNU-484, SNU-601, SNU-620, SNU-668, ja SNU-719 olivat MSI negatiivisia ja oli villityypin

ATM

geeni. Vaikka SNU-216 oli MSI negatiivinen, se kanna mutaatiot

ATM

geeni, ja oli vahva ATM ilmaisun havaita IHC (taulukko 1).

(A) BAT26 (sininen) ja BAT25 (vihreä) osoittivat vakaata malli SNU-5 (ylempi) ja epävakaa malli SNU-1 (alempi). (B) ATM-geeni PCR-tuotteiden inintervening sekvenssin (IVS6) (oranssi), IVS10 (sininen), IVS20 (vihreä) osoitti normaalin pituus SNU-5 (ylempi) ja lyhentää in SNU-1 (alempi). (C) RT-PCR

ATM

eksonin 6, eksonin 10, ja eksonin 20 mahasyövän solulinjoissa. SNU-1 ja 638 osoittivat 22-emäsparin deleetion eksonissa 6. (D) suora sekvensointi IVS 6. SNU-5 on normaali soittojärjestys ja SNU-1 on 22 häviämä alleviivatun sekvenssit. (E) immunohistokemia ATM proteiinin mahasyövässä solulinjoja. Negatiivinen SNU-1, epäselviksi in SNU-638, lievä positiivinen SNU-16 ja vahva positiivinen SNU-5. (F) Kaavioesitys 22 emäsparin deleetio eksonin 6

ATM

(882del22).

MSI

ATM

geenimutaatio introni mononukleotidi toistuu

ATM

sekvensointi

ATM

RT-PCR

ATM IHC

Bat 26

Bat 25

IVS 6

IVS 10

IVS 20

Exon 6

eksoni 10

eksonin 20

eksonin 6

eksonissa 10

eksonin 20

SNU-1 +++++ 22-bp delnono22-emäsparin delnonoNegativeSNU-5 —– nonononononoPositiveSNU-16 —– ndndndnononoPositiveSNU-216 – +++ nononono nonoPositiveSNU-484—–ndndndnononoPositiveSNU-601—–ndndndnononoPositiveSNU-620—–ndndndnononoPositiveSNU-638+++++22-bp delnono22-emäsparin del nonoNegativeSNU-668 —– ndndndnononoPositiveSNU-719 —– ndndndnononoPositiveTable 1. mikrosatelliittien epävakautta tila ja

ATM

geeni profiilit ihmisen mahasyövän solulinjoissa.

IVS, välisekvenssin ; IHC, immunohistokemia. CSV Lataa CSV

Mutaatio intronin mononukleotidi toistoa

ATM

geeni ja mikrosatelliittien epävakautta mahasyövässä kudoksessa

taajuus introni mutaation

ATM

geenin määritettiin kuten 12,9% (78/604). Taajuus

ATM

geenimutaatio oli 9,3% (50/540) intronissa edeltävän IVS 6; 11,0% (59/534) intronissa edellisessä IVS 10 ja 8,8% (46/523) intronissa edeltävän IVS 20; niiden joukossa, IVS 6 ja IVS 10 päällekkäin 39, IVS 10 ja IVS 20 35, IVS 10 ja IVS 20 34, IVS 6, IVS 10 ja IVS 20 31 tapauksessa (taulukko 2). Taajuudet MSI positiivisuus oli 9,2% (81/882) ja ATM-proteiini tappio oli 15,2% (134/839) Tutkimuksessamme GC. Vuonna 596 tapauksissa yhdistysten keskuudessa MSI (kuvio 2A), ATM geenimutaatio (kuva 2B), ja ATM-proteiinin menetys (kuva 3) analysoitiin.

ATM

intronin mutaatio ja ATM-proteiinia tappio havaittiin 69,3% (52/75) ja 53,3% (40/75) MSI positiivisia GC. MSI positiivisuus ja ATM-proteiinin menetys oli läsnä 68,4% (52/76) ja 48,7% (37/76) GC ATM introni mutaatio. MSI positiivisuus ja ATM introni mutaatio havaittiin 35,7% (40/112) ja 33,0% (37/112) GC ATM-proteiinin menetys (taulukko 3). Taajuus ATM IHC tulokset osoittivat merkittävästi suuremman ATM menetys alaryhmässä MSI positiivinen ja

ATM

mutaatio positiivinen GC (kuvio 4A). Kolmekymmentä kolme 596 tapausta (5,5%) on kaikki kolme molekyyli- ominaisuudet (kuva 4B).

Sijainti

Toistot (villityyppi) B Intron mutaatio GC

Intron mutaatio MSI positiivinen GC

Intron mutaatio ATM IHC negatiivinen GC

ATM

IVS 6 (T)

1550/540 (9,3%) 42/50 (84,0%) 29/111 (26,1%)

ATM

IVS 10 (T)

1559/534 (11,0%) 47/59 (78,7%) 29/111 (26,1%)

ATM

IVS 20 (T)

1546 /523 (8,8%) 34/46 (73,9%) 22/107 (20,6%)

ATM

IVS 6 tai IVS 10 tai IVS 20 (T)

1578/604 (12,9%) 53/76 (69,7%) 37/112 (33,0%) Taulukko 2. Incidencies on

ATM

geenin introni mutaatio syöpien (GC).

IVS, välissä sekvenssi; MSI, mikrosatelliitti epävakautta; IHC, immunohistokemia. CSV Lataa CSV

Ala kaista osoitti epävakaus BAT26 (sininen) ja BAT25 (vihreä). (B) Alempi kaista osoitti mutaation välisekvenssin 6 (IVS6) (sininen).

(A) Negatiivinen. (B) Epäselviä (+/-). (C) Heikko positiivinen (1 + ~ 2 +). (D) Vahva positiivinen (3 +).

ATM IHC

MSI

ATM

mutaatio

N

Negative

Positiivinen

NegativeNegative49768 (13,7%) 429 (86,3%) Positive244 (16,7%) 20 (83,3%) Subtotal52172 (13,8%) 449 (86,2%) PositiveNegative237 (30,4%) 16 (69,6%) Positive5233 (63,5%) 19 (36,5%) Subtotal7540 (53,3%) 35 (46,7%) Negative52075 (14,4%) 445 (85,6%) Positive7637 (48,7%) 39 (51,3%) Total596112 (18,8%) 484 (81,2%) Taulukko 3. taajuus ATM-proteiinin ilmentymistä alaryhmiin mikrosatelliittien epävakaus (MSI) asema ja

ATM

intronin mutaatio.

CSV Lataa CSV

(A) taajuudet ATM proteiinin tappion immunohistokemiallisesti mahan syöpä alaryhmiä MSI tila ja

ATM

introni mutaatio. (B) Venn-kaavio näyttää kuinka monta mahasyövän tapaukset päällekkäisiä molekyyliominaisuudet joukossa korkean tason mikrosatelliittien epävakaus (MSI-H),

ATM

intronin mutaatio, ja ATM-proteiinin menetys.

ennusteeseen viittaavia korrelaatiot

ATM

geenimutaatiokoe GC

GC potilaalla on

ATM

geenimutaatio liittyi vanhuuteen, suuri kasvain koon, distaalinen sijainnin, suoliston tyyppi, syvempi invaasio, ja pienempi toistumisen korko. GC potilaalla on negatiivinen ATM IHC liittyi vanhuuteen, suuri kasvain koon, hyvin kohtalaisen eriytetty tyyppi, ja suoliston tyyppi Laurenin luokittelun (taulukko S1). Chi-neliö testi

ATM

geenimutaatio tilaansa ATM IHC negatiivisten ja positiivisten ryhmien ennusteeseen viittaavia muuttujia suoritettiin. ATM IHC negatiivinen ryhmä,

ATM

mutaatio positiivinen GC liittyivät vanhuuteen (P = 0,032) ja distaalisen sijainti (P ​​= 0,045). ATM IHC positiivinen ryhmä,

ATM

geenimutaatio liittyi hyvin tai kohtalaisesti eriytetty tyyppi GC (P = 0,022) (taulukko S1).

Survival analyysi

Coxin suhteellisten riskien mallia käytettiin sekä yhden ja usean testejä. Univariate Coxin regressioanalyysi varten eloonjäämiseen ja taudista vapaan eloonjäämisen osoitti merkittäviä ennustearvo joidenkin vakiintuneiden ennustetekijöiden kuten imusolmuke etäpesäke, syvyys kasvain, ja Lauren n luokittelu histologisen tyypin. Potilas ryhmä, joka sai adjuvanttia chemotherpy oli merkitsevästi korkea suhteellinen riski kokonaisuudessaan (OS) ja sairauksien elinaika (DFS) (P 0,001, suhteellinen riski = 3,82 [95,0% CI, 2,81-5,18] OS ja P 0,001, suhteellinen riski = 5,63 [95,0% CI, 3,69-8,58] DFS). Ei kuitenkaan ole merkittäviä suuntauksia suhteellisen riskin (RR) havaittiin

ATM

introni mutaatio, MSI, tai ATM IHC menetys. Monimuuttujamenetelmin muuttujia syvyyttä kasvaimen, imusolmuke tila, Lauren: n luokittelu histologisen tyypin, adjuvanttihoitoa,

ATM

intronin mutaatio, ja ATM-proteiinin ilmentyminen suoritettiin. ATM introni mutaatio on alhaisempi suhteellinen riski rajatapaus merkitystä kokonaiselinaikaa (P = 0,05, suhteellinen riski = 0,60, [95,0% CI 0,36-1,00]) (taulukko 4).

Overall Survival

Tautivapaa elossaolo

Suhteellinen riski

95,0% CI

P arvo

N

Suhteellinen riski

95,0% CI

P arvo

N

Advanced Mahalaukun Cancer8.263.00-22.750.005965.051.81-14.130.00544Lymph solmun positive6.663.47-12.770.005963.201.58-6.480.00544Diffuse tyyppi histology1.431.06 -1.940.025961.611.09-2.360.02544Adjuvant chemotherapy0.990.57-1.730.985962.171.00-4.720.05544

ATM

intronin mutation0.600.36-1.000.055960.560.29-1.080.08544ATM proteiinia loss1.190.82-1.730 .355961.100.67-1.810.70544Table 4. Monimuuttuja Coxin regressioanalyysiä.

CSV Lataa CSV

keskustelu

Tuloksemme osoittivat, että mutaatiot introni toista

ATM

geeni johtaa poikkeava liittämiseen, mikä 22 emäsparin poistamisen ja ATM-proteiinin ilmentymisen menetyksen GC solulinjoissa. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​edellisen raportin [13] perusteella, joka liittyy silmukointioperaation vika

MRE11

edeltäjä transkriptio liittyy mutaatioita poly (T) 11 toista kuluessa välisekvenssin 4 (IVS-4), yksinomaan MMR-puutosta syöpäsolulinjoista ja ensisijainen kasvaimia. Tuloksemme paljasti, että ATM-proteiini tappio GC merkittävästi korreloi läsnä introni geenin mutaation

ATM

.

ataksia-verisuoniluomen potilaista, 70% -90% ja

ATM

mutaatiot ovat hölynpölyä, runko muutos, tai pleissauksia mutaatioita, jotka katkaista proteiini [16]. Mukaan COSMIC tietokantoihin (https://www.sanger.ac.uk/cosmic), mutaatiot koodaavat alueet

ATM

geenin havaittiin 5% (433 9249) erilaisten syöpien. Joukossa mahasyöpä osoitti mutaation ainoastaan ​​1,35% (1 74). Vaikka

ATM

geenimutaatiokoe GC ilmoitettiin aiemmin [3,9], tyhjentävä selitys rajoitti matalataajuista mutaation ja suhteellisen korkea esiintyvyys menettänyt ATM [2]. Tutkimuksessamme noin 70% MSI positiivisia GC osoitti merkittäviä

ATM

geenin introni mutaatio liittyy ATM-proteiinin menetys. Tuloksemme tukevat vahvasti, että introni-mutaatio

ATM

perussairaus MSI on yksi tärkeimmistä mekanismeista ATM menetyksen ihmisen GC. ATM menetys johtuu poikkeavasta liittämiseen liittyy introni lyhentäminen MSI positiivinen paksusuolen syövän solulinjoissa. Ejima et ai. etsinyt

ATM

geenimutaatioita käyttäen 62 oligonukleotidialukeparia, joka vastaa aluetta vaihtelevat eksoni 4 kautta eksonissa 65

ATM

ja sitä reunustavat intronit. Lyhentäminen mononukleotidi kirjoitusten

ATM

intronit osuus oli 34 (87%) 39 introni muutoksia. Kolmekymmentä-yksi heistä löydettiin 5 paksusuolen kasvainten solulinjoissa ottaa MSI (LS180, HCT15, HCT116, SW48, ja LoVo). He osoittivat myös alhainen ilmentyminen ATM proteiinin MSI positiivinen peräsuolen syövän solulinjoissa [14]. ATM ilmentyminen vähenee merkittävästi monissa rintakarsinoomissa, eikä löytänyt

ATM

mutaatio että solulinjassa [17]. Tämä osoittaa eri ominaisuuksia

ATM

geenin muutokset välillä maha ja rintasyöpiä.

lisäksi mutaatioita, tuumorisuppressorigeeneille voidaan inaktivoida metyloimalla sytosiinitähteiden sisällä CpG-saarekkeita, jotka sijaitsevat promoottori monia geenejä.

ATM

geeni on uusi kohde epigeneettiset hiljentäminen sopimattoman metyloinnin proksimaalisesta promoottorialueen korreloi lisääntynyt säteilyherkkyyttä ja alhainen proteiinin ilmentymistä paksu- tuumorisolulinja [18] ja ihmisen glioomasolulinjaa [18]. ilman

ATM

geenimutaatioita.

MSI kohdentamista

ATM

geeni edustaa yhteyden MSI ja DNA: n korjautumista GC. Useat tutkimukset osoittavat, että toiminnallinen menetys ATM lisääntyy MSI ja ihmisen

ATM

geeni on tärkeä tavoite inaktivaatiomenetelmät MSI positiivinen GC solulinjoissa ja kudoksissa [19,20]. Syynä silmiinpistävän korkea esiintyvyys

ATM

geenin introni mutaatio MSI positiivinen GC saattaa johtua mononukleotidi toistoja (T) 15, ja pituus 13 nukleotidia tai enemmän olivat erityisen herkkiä tälle kohdennettua lyhentämiseksi [14 ]. Taajuus

ATM

geenin lukukehyksen (T) 7 eksonissa 6 koodaavan sekvenssin MSI positiivinen GC ilmoitettiin olevan vain 6% (2/36) [8], joka on paljon alhaisempi kuin meidän havainto.

On todettu, että ATM puute herkistää solut kasvua estäviä vaikutuksia PARP estäjä, olaparib, mahasyövän solujen alennetaan

ATM

ilmaisun [21]. Poly (ADP-riboosi) polymeraasin estäjät ovat tällä hetkellä arvioitu kliinisissä kokeissa vastaan ​​erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien paksusuolen syöpä [22]. GC, ATM puute tiedetään olevan ennustaja vastaus PARP inhibiittori [23-25]. Merkkiaine homologisen rekombinaation, Rad 51, tiedetään ennustavan merkkiaine neoadjuvant anthracylcine kemoterapian rintasyövässä [26] sekä PARP inhibiittorina GC [24].

Tuloksemme osoittivat, että ATM proteiini menetys ei ole aggressiivinen tekijä GC, vaikka se liittyy merkittävästi epäsuotuisa kehitys HR MSI negatiivinen GC. Tämä on verrattavissa muihin tutkimuksiin, jotka raportoivat ATM proteiinihäviöön haittavaikutuksena ennustetekijä [20]. Meidän tutkimuksissa

ATM

mutaatio ja ATM negatiivinen GC oli selvä ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia; kuitenkin, tämä ryhmä ei osoittanut eroa eloonjäämisessä muiden kanssa. Vuonna MSI negatiivinen ryhmä, HR GC ATM-proteiinin menetys oli huomattavan suuri, kuitenkin MSI positiivinen ryhmässä, HR GC ATM-proteiinin menetys ei ollut merkittävä. Tämä osoittaa, että MSI on mahdollinen molekyyli vaikuttava tekijä biologista käyttäytymistä GC. Siten Tutkimuksemme tukee että MSI tila voi vaikuttaa herkkyyttä PARP estäjä vaikuttamalla asemaa DNA-vaurioita vastaus proteiinin ilmentymisen kautta mononukleotidi toistuu muutoksia.

Yhteenvetona

ATM

geenimutaatiokoe GC on 12,9%, ja 33,0% GC kanssa

ATM

geenimutaatio liittyy ATM-proteiinin menetys. MSI positiivinen GC osoitti

ATM

mutaatio 69,7%. Tuloksemme viittaavat siihen, että tulos ATM menetyksen ja herkkyyttä kemoterapeuttisten yhdiste, olaparib, voidaan ymmärtää paremmin, jos tapaukset ovat kerrostunut perustuvat

ATM

geenimutaatio tila tai MSI.

Johtopäätökset

Tutkimus osoitti

ATM

geeni introni mutaatio on läsnä 69% MSI positiivisia GC ja 49%

ATM

introni mutaatio liittyy menetys ATM proteiinia. Nämä viittaavat siihen,

ATM

geenin intronin mutaatio kohteena mikrosatelliittien epävakaus liittyy ATM-proteiinin menetys osajoukko ihmisen mahasyöpä.

tukeminen Information

Taulukko S1.

ennusteeseen viittaavia korrelaatiot mahalaukun karsinooma kanssa ATM geenimutaatio ja ATM proteiinin ilmentymiseen.

doi: 10,1371 /journal.pone.0082769.s001

(DOCX) B