Krooninen sairaus

tiivistelmä

luonnollinen sytotoksinen reseptorit (NCRs) ovat ainutlaatuisia aktivoivat proteiinit ilmaisi pääasiassa pinnalla (NK) soluja. NCRs, jotka sisältävät kolme jäsentä; NKp46, NKp44 ja NKp30, kriittisesti mukana NK sytotoksisuutta eri tavoitteita, mukaan lukien laaja valikoima kasvainsolujen, jotka ovat peräisin eri alkuperää. Vaikka kasvaimen ligandien NCRs ei ole vielä tunnistettu, valikoivaa tavalla, jolla nämä reseptorit kohdistuvat kasvainsoluja voi tarjota erinomaisen perustan kehittää uusia anti-kasvain hoitoja. Potentiaalin testaamiseksi käyttö NCRs kuin syöpälääkkeitä, me syntyy liukoista NCR-Ig-fuusioproteiinien, joissa vakioalue ihmisen IgG1 fuusioitiin solunulkoisen osan reseptorin. Osoitamme, käyttämällä kahta erilaista ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, että hoito NKp30-Ig, dramaattisesti estää kasvaimen kasvua

in vivo

. Aktivoidut makrofagit osoitettiin välittävän ADCC vasteen vastaan ​​NKp30-Ig pinnoitettu eturauhasen solulinjoissa. Lopuksi Ig-fuusioproteiinien osoitettiin myös erotella hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu ja eturauhassyöpä. Tämä voi aikaansaada uusi diagnostinen liikennemuotojen vaikea tehtävä erotella näiden erittäin yleinen sairauksiin.

Citation: Arnon TI, Markel G, Bar-Ilan A, Hanna J, Fiman E, Benchetrit F, et ai . (2008) valjastaminen Liukoinen NK Cell Killer reseptorit varten sukupolven Novel Cancer immuuni Therapy. PLoS ONE 3 (5): E2150. doi: 10,1371 /journal.pone.0002150

Editor: Fu-Sheng Wang, Beijing Institute of Infectious Diseases, Kiina

vastaanotettu: 12 helmikuu 2008; Hyväksytty: 01 huhtikuu 2008; Julkaistu: toukokuu 14, 2008

Copyright: © 2008 Arnon et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Immuunijärjestelmän mekanismien ajatellaan antaa tärkeää suojaa syövän kehittymisen sairauksia. Tutkimukset ihmisen potilaiden ja hiirillä mallit ovat osoittaneet, että puutteet keskeisten immunologisia komponentteja johtaa lisääntynyt alttius kehittyä syöpä [1] – [3]. Luonnollisten tappajasolujen (NK-soluja) ovat tärkeä alaryhmä sytotoksisten lymfosyyttien, jotka kuuluvat synnynnäisen immuunivasteen ja parhaiten tunnusomaista niiden kyky spontaanisti tappaa viruksen tartunnan ja kasvainsoluissa [4]. Tehokkuus, jolla NK-solujen tuhota erilaisia ​​solulinjoja viittaa tärkeä rooli immuunitutkimusohjelmasta. Todellakin, varaamiseen kliiniset ja kokeelliset tulokset osoittavat, kuinka tärkeää on NK-aktiivisuuden syövän poistaminen

in vivo

; hiirillä, ehtyminen NK-solujen tulokset on merkittävästi lisääntynyt alttius kemiallisesti aiheuttama syöpä [1], kun taas leukemiapotilailla on vähentynyt NK-sytotoksisuutta todettiin tiukasti korreloivan parantaa taudin etenemiseen [5].

NK-solujen aktivaation säätelee joukko pinnan reseptoreja, jotka joko indusoida tai inhiboida sytotoksista vastetta [4], [6]. Tärkein mekanismi, joka ohjaa NK estäminen perustuu tunnustamiseen MHC-luokan I molekyylien NK estävä reseptorit, kuten tappaja-Ig: n kaltaisen reseptorit (Kirs) ja CD94 /NKG2A monimutkainen. Tällä varmistetaan, että NK-solut jatkuvasti esti tappamasta terveitä soluja, jotka ilmentävät normaalin MHC-luokan I proteiineja [7]. Vaikka MHC-luokan I ilmentyminen on välttämätöntä estää NK sytotoksisuutta, alassäätöä ei riitä indusoimaan vasteen, kuten erityisiä aktivaatiosignaaleille tarvitaan myös. Nämä signaalit toimitetaan joukko lysis reseptorit, jotka tunnistavat ei-MHC-luokan I ligandit, ilmentyy kohdesolujen [8]. Siten NK-solut eivät ole vain pystyy havaitsemaan puuttuessa MHC-luokan I proteiineja, mutta on myös varustettu pinta-reseptoreihin, joilla erityisesti havaitsemisen tavoitteensa.

Tärkein NK aktivoivat reseptorit osallistuvat tunnustamista ja tappamista kasvaimia ovat NKG2D homodimeerin ja kolme luonnollista sytotoksista reseptorit (NCRs) NKp46, NKp44 ja NKp30 [8]. Suhteellinen osuus kunkin näiden reseptorien NK sytotoksisuutta kasvaimia on erilainen, mikä osoittaa, että on olemassa eri spesifisen lyysin ligandien [9]. Itse asiassa, useita stressin indusoima solun proteiineja on tunnistettu ligandeja NKG2D reseptori: MHC-luokan I ketju liittyviä antigeenejä (MICA ja MICB) ja UL16 sitovat proteiinit (ULBP1-4) [10].

Toisin kuin NKG2D, solun ligandien NCRs ei tällä hetkellä tunneta ja ainoa NCRs ligandit tunnistettiin tähän mennessä viruksen proteiineja [11] – [14]. Kuitenkin merkittävää näyttöä siitä, että solu-ligandeja NCRs olemassa ja että niiden ilmentyminen on kriittinen kyky NK-solujen tuhoamiseksi kasvaimia [9], [15] – [17]. Nämä havainnot tukevat kliiniset tutkimukset osoittavat useita tapauksia AML korrelaatio alhainen NCRs ligandien AML potilaiden ja huono ennuste taudin [18]. Lisäksi olemme hiljattain osoittaneet, että poistetaan yksi NCR-geeni, NKp46 hiiren homologi (NCR1), vähentää merkittävästi kykyä NK-solujen tyhjentää kasvainsolujen

in vivo

[19].

viime vuosikymmenen aikana, syöpä immunoterapian tutkimukset ovat laajasti keskittyneet pyrkimys hyödyntää erittäin erityinen luonne adaptiivisen immuunivasteen kehittämiseksi uusia hoitoja. Tämä lähestymistapa johti sukupolven useita humanisoituja vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja tietyn kasvaimen antigeenejä. Vaikuttava kliininen menestys vasta-pohjainen terapia avasi portin intensiivinen hakea lisää erittäin spesifisiä kasvainmerkkiaineet ja vuodesta 1995 useat vasta-aineita on hyväksytty kliiniseen käyttöön kun taas arvioidaan parhaillaan onkologiaan tutkimuksissa [20], [21] .

Jos haluat laajentaa tätä menetelmää, erilaisia ​​työkaluja on sovellettu yritetään tunnistaa uusia kasvain antigeenejä, jotka sopisi laajempaa syöpien ja silti säilyttää valikoiva tunnustamista. NCRs tarjoavat ainutlaatuisen esimerkki proteiineja, jotka ovat hankkineet niin laaja spesifisiä ja hyvin sovitettu tunnistamaan syöpäsoluja. Kääntää tämän potentiaalin muuttamista terapeuttinen työkalu, olemme luoneet immunoglobuliini (Ig) fuusioproteiinit, jotka sisältävät solunulkoisen osan reseptorin fuusioituneena vakioalue ihmisen IgG1. Näin ollen, on samanlainen kuin vasta-ainetta, joka perustuu kasvaimen hoidon lähestymistapa, teimme olettamuk- NCR-Ig-fuusioproteiinien, voidaan käyttää ”kohdennettuja ohjuksissa”; solunulkoiseen osaan tarjoaa kasvainspesifisyys, kun taas vakioalue ihmisen IgG1: n (Fc) mahdollistaa rekrytointi immuunijärjestelmän komponenttien, jotka parantavat tietyn kasvaimen poistamista. Tässä näytämme mahdollinen käyttö tällaisesta hoidosta käyttäen ihmisen eturauhasen syöpiä malleja.

Materiaalit ja menetelmät

Solut

Käytimme ihmisen eturauhassyövän solulinjaa DU145 ja ihmisen eturauhasen syövän solulinja PC3 /

Luc

, joka oli valmistettu kuten edellä on kuvattu [14]. Lyhyesti, PC3.38, klooni ihmisen eturauhasen adenokarsinoomasolulinja, joka on johdettu PC3 (ATCC, CRL-1435), infektoitiin yhdistelmä-rLNC /

Luc

retrovirus (ilmentävät lusiferaasigeeni alavirtaan CMV-promoottori) ja valitaan G418 (400 ug /ml) tuottaa PC3 /

Luc

klooni. Stabiili lusiferaasin ilmentymistä soluviljelmässä rutiininomaisesti vahvisti käyttäen CCCD kameraa.

fuusioproteiinit ja virtaussytometria-analyysi

tuotanto NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, NKp46D1-Ig ja CD99- Ig on kuvattu aiemmin [13]. Ohjaa ihmisen IgG1-proteiinin (hlgG1 kappa, PHP010) hankittiin Serotec (Oxford, UK).

immunohistokemia

eturauhaskudokset, sekä hyperplasic ja pahanlaatuiset, kiinnitettiin formaliiniin. Mikroaaltolämmitykselle formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin kudosleikkeiden sitraattipuskurissa suoritettiin hakea antigeenejä. Sitten leikkeitä värjättiin eri NCR-Ig tai kontrolli-Ig: tä (8 ug /ml, lopullinen konsentraatio) ja sen jälkeen biotinyloitua vuohen anti-humaani-Fc: tä (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA). Havaitsemiseen, avidiini-biotiini-peroksidaasikompleksin menetelmää käytettiin kanssa Vectastain kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Värjäys luokiteltiin prosentteina positiivisia eturauhasen solujen (hyperplasic tai pahanlaatuinen) kokonaismäärästä 100 solua. Olemme myös arvioitiin Värjäytymisen intensiteetti kuin 0 = ei, 1 = heikko, 2 = kohtalainen ja 3 = voimakas. Värjätyt leikkeet analysoitiin kaksi patologia. Immunohistokemialliset tuloksia pidettiin positiivisena, kun prosenttiosuus positiivisesti värjättyä eturauhasen solujen ylitti 50% ja voimakkuus oli suurempi kuin 1.

kasvaimen istutuksen ja hoidon

DU145 mallissa s.c. pistetään nude-hiirissä ihmisen eturauhasen kasvain linjan DU145 (4 x 10

6). Kaksi viikkoa injektion jälkeen, kun kasvaimet tuli näkyviin, hiiriä käsiteltiin NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, ohjata humaani IgG1 tai PBS: ää. Hoidot annettiin 5 kertaa (päivinä 2, 7, 15, 25 ja 34) ja jotka sisältyvät ensimmäisen suuremman annoksen proteiinien (20 mg /kg) ja sen jälkeen pienemmät annokset (10 mg /kg). Kasvaimen etenemistä arvioitiin kolmen päivän välein mittaamalla halkaisija kasvaimia.

PC3 /

Luc

malli, nude-hiiriä (4-8 viikkoa vanhoja) injektoitiin 15 x 10

6 PC3 /

Luc

solujen sc tilaan vasempaan kylkeen kunkin hiiren. Kolme viikkoa tuumorin implantaation jälkeen, hiiriin ruiskutettiin i.p. 4 ug /kg NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, ohjata humaani IgG1 tai PBS: ää joka toinen päivä ajan 3-4 viikkoa.

Imaging kasvaimen PC3 /

Luc

ksenografteja

Kaikki hiiriä seurattiin kasvaimen ilmentymisen ennen ja lopussa hoidon menettelyjä. Vain ne hiiret, jotka 21 päivän kuluessa injektion ilmaisivat havaittavissa koko kasvain, kuten arvioimana CCCD kamera, valittiin edelleen manipulointia. Ennen kuvantaminen, hiiret nukutettiin 4% kloraalihydraatilla (Fluka-Sigma, Israel). Viisi minuuttia ennen kuvausta, hiiriin ruiskutettiin i.p. kanssa 126 mg /kg kehon painoa vesiliuosta Beetle lucifering (Promega Corp., Madison, WI). Hiiret sijoitettiin sitten valoa tiukka kamari CCCD kamerajärjestelmän (Roper Scientific, Princeton Instrument, Trenton NJ) ja valokuvattiin ensin täydennetty ohjattu valo ottamiseksi harmaa-asteikon elin viite kuvaa. Fotonit säteilevä hiiren sitten havaittiin täydellisessä pimeydessä, kerätään ja integroitu ajaksi 2 min. Pseudo värikuva edustaa valotehon (sininen vähiten voimakas ja punainen kuin voimakkain). Mittaukset ovat integrointi kokonaissummasta signaalien havaitaan, vähennettynä taustalla integroitu säteilevän valon yhtä alueella samalla hiiren.

Farmakokinetiikka analyysi

in vivo

Nainen CB17.SCID hiiriin injektoitiin ip kerta-annoksella (5 mg /kg kehon paino) NKp46D2-Ig tai NKp30-Ig. Tasot fuusioproteiinien seerumissa määritettiin eri ajankohtina, kuten 0 (ennen annosta) 0,25, 0,5, 1, 2, 6, 24, 48, 96, 168, 216, 264 ja 336 tuntia annoksen jälkeen annon. Kullakin ajanhetkellä, 3 hiiret tapettiin verinäytteet kerättiin erottaminen putket, jotka inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia ennen sentrifugointia (jotta hyytymistä). 30 minuutin jälkeen, putket sentrifugoitiin välittömästi (10 minuutin ajan 10,000rpm huoneenlämmössä), ja seerumi kerättiin. Tasot NKp30-Ig tai NKp46D2-Ig-fuusioproteiinien seerumissa analysoitiin käyttäen standardi-ELISA-määrityksessä.

apoptoosimäärityksessä

PC3 /

Luc

tai DU145-soluja (50000 /ml) inkuboitiin 5, 10 tai 50 ug /ml NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, NKp46D1-Ig tai PBS: ssä 2 tunnin ajan jäillä. Cross -linking-vasta-aine (ihmisen IgG1) oli kuin lisättiin lopullisina konsentraatioina, että yhtä kymmenesosaa määrän fuusioproteiinia lisättiin aiemmin (0,5, 1 tai 5 ug /ml). Soluja kuin inkuboitiin 37 ° C: ssa 48 tuntia ja prosenttiosuus apoptoottisten solujen määritettiin käyttämällä standardia anneksiini V /PI-analyysi.

Makrofageja-välitteisen tappamista määrityksissä

efektorisolujen käytimme peritoneaalimakrofageille johdettu CD1 nude-hiirissä 5 päivän thioglycolate injektion. Haettu makrofagit olivat kuin aktivoidaan 2 tunnin ajan LPS: llä (1 mg /ml). Radioaktiivinen merkintä PC3 /

Luc

tai DU145 soluja (1 * 10

4 /hyvin tasainen 96-kuoppaisella levyllä) inkuboitiin LPS-aktivoitu makrofagit osoitetussa E:T suhteet. Spesifinen lyysi määritettiin 48 tunnin kuluttua.

Tulokset

tunnustaminen pahanlaatuisen ensisijainen ihmisen eturauhassyövän NKp30 ja NKp46

NKp46 ja NKp30 ovat constrictively ilmaistaan ​​pinnalla lepää kuin sekä aktivoitu NK-solujen ja ovat vallitsevasti lopetukseen osallistuvan erilaisten kasvainsolulinjojen

in vitro

. Koska solun ligandeihin näiden reseptorien ovat vielä tuntemattomia, tiedetään vähän niiden ilmentämiskuviota ja jakelun eri patologinen asetuksia.

Eturauhassyöpä on useimmin diagnosoitu kiinteä kasvain miehillä Yhdysvalloissa ja toinen johtava syy syöpäkuolemista länsimaissa [22]. Valitettavasti ei ole olemassa tehokkaita hoitoja saatavilla tänään kohtalokas hormoni tulenkestävät sairauden vaiheesta. Sen testaamiseksi ihmisen eturauhasen kasvaimet tunnustettu NCRs me värjätään PC3 /

Luc

ja DU145 solulinjoissa NKp30 ja NKp46 proteiinit ovat fuusioituneet ihmisen IgG1. Olemme aiemmin osoittaneet, että sitoutumiskohta NKp46 eri kasvaimia sijaitsee kalvon proksimaalisessa toimialueen ja höyryn alueen reseptorin (D2), ja että ilmentyminen D2 fuusioituna ihmisen IgG: tä (NKp46D2-Ig) mahdollistaa paremman tunnustamista tavoitteen soluihin [13]. Kuten kuviossa 1 a ja b, sekä PC3 /

Luc

ja DU145-solut spesifisesti värjättiin NKp30-Ig ja NKp46D2-Ig, mutta ei ohjaus CD99-Ig (harmaa histogrammit), mikä osoittaa, ilmaisu ligandien näiden kahden NK aktivoivat reseptoreita eturauhassyövän solulinjoissa.

(a, b) NKp30-Ig ja NKp46D2-Ig sitoutuvat spesifisesti ihmisen eturauhasen solulinjoissa. PC3 /

Luc

(a) ja DU145 (b) solulinjat värjättiin NKp30-Ig, NKp46D2-Ig tai ohjata CD99-Ig: n, ja sen jälkeen PE-konjugoitua hiiren anti-ihmis-lgG1-vasta-aine. Harmaa histogrammit edustavat taustavärjäyksen torjumalla CD99-Ig-fuusioproteiinia ja mustan tyhjän histogrammit edustavat värjäystä joko NKp30-Ig tai NKp46D2-Ig, joka ilmoitetaan päällekkäin histogrammin. Tämä luku edustaa yhtä kokeessa kolmesta suoritettu. (C) immunohistokemiallinen värjäys ensisijainen ihmisen eturauhasen adenokarsinooma ja hyvänlaatuinen eturauhasen liikakasvu (BPH) by NKp30-Ig ja NKp46D2-Ig. Palojen formaliinikiinnitetyt ja parafiiniin upotetut ihmisen eturauhasen adenokarsinooma (yläpaneeli) ja BPH (alempi paneeli) on antigeeni-noutaa mikroaaltouuni-sitraatti hoitoa. Objektilasit värjättiin sitten NKp30-Ig, negatiivinen kontrolli CD99-Ig tai NKp46D2-Ig, jota seurasi biotinyloitu vuohen anti-ihmis-Fc ja avidiini-biotiini-HRP-kompleksin. Alustan HRP oli AEC (punainen väri) ja objektilasit vastapäivään värjättiin hematoksyliinillä. Kuviossa esitetään edustava värjäys on X400 suurennuksella. Nuoli NKp30-Ig värjäytymisen adenokarsinooma (ylhäällä vasemmalla paneeli) osoittaa edustavan solukalvojen värjäytymistä. Värjäytymisvoimakkuus huippu vasemman ja oikean yläkulman paneelit pidetään 2 (katso menetelmät). (D) Expression of NKp30 ja NKp46 ligandien on runsaasti pahanlaatuisiin eturauhasen kasvaimia. Leikkaukset eri potilaat kärsivät hyvänlaatuinen (

n

= 8) tai pahanlaatuinen (

n

= 9) eturauhaskasvaimissa valmistettiin ja värjättiin kuten edellä. Värjäys suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Analyysi värjäytymisen intensiteetti (0-3) ja prosenttiosuus värjätään kasvainsolujen suoritettiin kaksi patologia. Positiivinen värjäys määriteltiin kun värjäämällä voimakkuus oli yli 1 ja käsitti vähintään 50% soluista, kuten on kuvattu ”aineisto ja menetelmät”.

extenuate havaintojemme analysoimme ilmaisun ligandien NKp30 ja NKp46 primäärienergian eturauhasadenokarsinoomaa ja eturauhasen hyvänlaatuinen liikakasvu (BPH) johdettu ihmisen potilaista. Formaliinifiksoidusta parafinoidut eturauhasen syöpien värjättiin NKp30-Ig, NKp46D2-Ig tai ohjaus fuusioproteiinit (esimerkiksi CD99-Ig). Kuvio 1 c esittää edustavia esimerkkejä värjätyt kudokset ja kuvio 1d esittää lyhyesti saadut tulokset 9 adenokarsinooma ja 8 hyvänlaatuinen eturauhasen syöpä kudoksiin. Kuten on esitetty, 7/9 ja 5/9 eturauhasen adenokarsinooman positiivisesti värjättiin NKp30-Ig ja NKp46D2-Ig, vastaavasti, mikä olisi osoitus ligandeina NKp30 ja NKp46 on pahanlaatuisia soluja. Ilmaisu näistä antigeeneistä kattoi 50-95% syöpäsoluja eriasteisia intensiteettiä ja osoitti sekä solunsisäinen ja membraani- jakelu (kuva 1c, nuoli vasemmassa yläreunassa paneelissa pistettä solukalvojen värjäytymistä). Sen sijaan kaikki BPH osat testataan värjättiin negatiivisesti by NKp30-Ig tai NKp46D2-Ig, koska useimmissa tapauksissa vähemmän kuin 10% soluista oli värjäytynyt ja intensiteetti oli palje 1. Tärkeää on, etteivät adenokarsinoomat eikä BPH leikkeet värjättiin torjumalla lg-fuusioproteiinia CD99-Ig (ja muiden valvonta proteiineja, tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittavat, että samalla tavoin kuin eturauhassyöpäsolulinjoissa kasvattaa viljelmässä, ensisijainen peräisin kasvaimet ilmentää selektiivisesti ligandeina NK lyysiä reseptorit NKp30 ja NKp46D2. Lisäksi ilmaisu näistä tuntemattomista ligandien indusoidaan vasta myöhemmissä vaiheissa sairaus, jossa adenokarsinooma jo kehittynyt.

NKp30-Ig estää kasvun eturauhassyövän solulinjaa DU145

in vivo

Ig-fuusioproteiinien on aikaisemmin hyödynnetty tehokkaita terapeuttisia aineita kliinisessä käytännössä [23]. Tässä me osoitamme, että molemmat NKp30-Ig ja NKp46D2-Ig sitovat spesifisesti ihmisen kudoksissa, jotka ovat peräisin eturauhas- syöpäpotilaille, että niissä on erityinen (vaikka Tuntematon) ligandeja (kuvio 1 b ja c).

Sen määrittämiseksi, onko NKp30 ja NKp46D2 fuusioitu ihmisen IgG1 voisi välittää tehokas anti tuumorivaste

in vivo

injektoimme nude-hiiriin ihmisen eturauhasen kasvain linjan DU145. Kaksi viikkoa injektion jälkeen, kun kasvaimet tuli näkyviin, (määritelty päivä 1 kuvassa 2) hiiriä käsiteltiin NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, ohjata humaani IgG1 tai PBS: ää (huomautus selitykset kuvioon 2 hoitojakson ja kasvun arviointi) . Sekä vertailu- vastaanottaa ihmisen IgG1: n (

n

= 10) tai PBS: ää (

n

= 10), eläimet osoittivat nopeaa kasvua kasvainten (kuva 2). Samoin NKp46D2-lg: llä käsiteltyjen hiirten (

n

= 9) osoitti asteittainen nostaminen kasvainten kokoa, mikä osoittaa ei ole terapeuttista vaikutusta. Sitä vastoin hoito NKp30-Ig (

n

= 10), johti merkittävä suppressio kasvaimen kehitystä; kuten toisen annon NKp30-Ig (päivänä 7), kasvainten koko pysyi vakiona kolme viikkoa ja vain kohtalainen etenemistä havaittiin seuraavina päivinä (kuva 2). Lisäksi 5 10 hiiriä, joihin injektoitiin NKp30-Ig, kasvaimet hävisivät toisen injektion jälkeen (päivä 7) eikä uudelleen näkyviin jopa kahden kuukauden kuluttua viimeisestä injektiosta.

Male nude-hiirissä injektoitu ihmisen eturauhassyövän line DU145 (4 x 10

6), käsiteltiin NKp30-Ig (

n

= 10), NKp46D2-Ig (

n

= 9) , ohjata ihmisen IgG1 (

n

= 10), tai PBS: ää (

n

= 10). Päivä 1 on määritelty kahden viikon injektion jälkeen, kun kasvainten tuli näkyviin. Hoidot annettiin 5 kertaa (päivät 1, 7, 15, 25 ja 34, jotka on merkitty nuolilla), ja sisältyvät aluksi suuremman annoksen proteiinien (20 mg /kg), minkä jälkeen pienemmät annokset (10 mg /kg). Kasvaimen etenemistä arvioitiin kolmen päivän välein mittaamalla halkaisija kasvaimia. Käyrät osoittavat keskimääräinen halkaisija (mm) kasvainten kussakin ryhmässä mitattuna päivinä 1-45.

Hoito NKp30-Ig vähentää PC3 /

Luc

kasvaimen kasvua

in vivo

Opiskelu monimutkainen biologinen prosessi, kuten kasvaimen kasvua ja terapia vaikuttaa

in vivo

vaatii malli, joka on sekä herkkä ja tarkka havaitsemaan jo hienoisia kehitystä. Äskettäin uusi bioluminescence kuvantaminen teknologia, joka mahdollistaa ei-invasiivisia havaitseminen kasvainsolujen

in-vivo

ilmoitettiin [14], [24]. Tämä strategia nojaa engraftmentissa ihmisen syöpiä, jotka ekspressoivat stabiilisti reportterigeenin, kuten

lusiferaasin

(

Luc

), hiiriin. Lusiferaasin ilmentymistä mahdollistaa

in vivo

seuranta suhteellinen koko ja jakautuminen kasvaimia ja voi siten myös havaita metastaattisen kehitystä. Lisäksi tämä järjestelmä on erittäin herkkä ja luotettava havaitseminen pieniä kasvaimia, jotka ovat vaikeita tai jopa mahdotonta aistia muilla menetelmillä, kuten suora kasvaimen koon mitat tai FACS kasvainuutteiden [24]. Tästä syystä käytimme ihmisen eturauhassyövän solulinjaa PC3 leimattu vakaa lusiferaasin ilmentymistä geenin (PC3 /

luc

), joka oli aiemmin soveltaa muissakin samantyyppisissä

in vivo

mallit [14 ].

Voit seurata vaikutuksen NKp30-Ig ja NKp46D2-Ig fuusio proteiinien etenemistä PC3 /

luc

eturauhassyöpäsolulinja

in vivo

, me pistetään nude-hiirten kanssa PC3 /

luc

soluja. Kolme viikkoa injektion jälkeen (nimetty ”alkupiste”), kasvaimen kasvua arvioitiin, että CCCD kameralla ja niitä hiiriä ilmentävät kasvaimet, jotka olivat tarpeeksi suuria lähettämiseksi integroidun signaalin intensiteettiä 100 fotonin laskee ja edellä valittiin jatkokäsittelyä NKp30 -lg (

n

= 16), NKp46D2-Ig (

n

= 9) tai PBS kontrollina (

n

= 8). Hoito sisälsi i.p. injektion PBS: ää tai 4 mg /kg kehon painoa asiaa fuusioproteiinin, joka toinen päivä kuukauden ajan. Lopulta hoidon aikana (nimetty ”päätepiste”), kasvaimen koko arvioitiin uudelleen CCCD kameran.

Kuten kuviossa 3a ja tiivistää kuviossa 4b, hiirten käsittely NKp30-Ig oli dramaattinen vaikutus kasvaimen kasvuun. Vaikka kontrolliryhmässä (kuvio 3c ja 4), nopea kasvu kasvaimen koon havaittiin lähes kaikki eläimet (87,5%), NKp30-Ig-treatement johti huomattavaan vähenemiseen syövän etenemiseen; 50% hiiristä hoidettiin NKp30-Ig kasvain rajusti 20% tai palje alkuperäisestä koosta (pidettävä ”tehokasta hoitoa”), 25% osoitti osittaista vaikutusta taas 25% ei vastannut ja etenevää kasvaimia. Lisäksi niissä hiirissä, joissa tehokasta hoitoa on saatu, ei uusiutumisen havaittu jopa 3 kuukautta sen jälkeen, kun viimeinen NKp30-Ig annon. Tärkeää on, NKp30-Ig terapeuttinen vaikutus ei ollut riippuvainen alkuperäinen koko kasvain, kuten reagointikykyä tai reagoimattomuus ei korreloinut alkuperäisen signaalin havaittu kasvain, mitattuna ”alkupiste” (merkitty numeroin päällekkäin sarake) .

Male nude-hiiriin injektoitiin PC3 /

luc

kasvainsoluja (15 x 10

6) SC vasen kylki. Kolme viikkoa tuumorin implantaation jälkeen, hiiriin injektoitiin (ip) joka toinen päivä yli yhden kuukauden ajan 4 mg: lla /kg NKp30-Ig (

n

= 16) (a), NKp46D2-Ig (

n

= 9) (b) tai PBS: ää (

n

= 8) (c). Syövän etenemistä seurattiin mittaamalla valon emission kustakin yksittäisestä hiiren aloittamisen (alkupiste) ja lopulta (päätepiste) hoidon aikana. Y-akselit edustavat suhteellista (prosentteina) muutokset kasvaimen koon hoidon jälkeen, kun lasketaan integroidusta valon emissio mitataan kunakin ajankohtana (osoitettu suuremmat luvut sarakkeita). Kutistuminen kasvain 20% tai alle sen alkuperäinen koko kutsuttiin nimellä ”tehokas hoito”. Tämä luku on yhteenveto kahdesta kokeesta ja sisältää kaikki hiiret, jotka testattiin.

NKp30-Ig käsittely merkitsevästi kasvun estyminen sekä DU145 ja PC3 /

Luc

, mutta joiden näkyvämpi vaikutus PC3 /

Luc

(luvut 2-4). Tätä ei voida katsoa johtuvan eroista ligandin ilmentyminen (kuvio 1a) ja voisi heijastaa tehostetun asteittaisen kasvun DU145 verrattuna PC3 /

Luc

. Toisin kuin NKp30-Ig ja yhteisymmärryksessä edellä esitetyt tulokset (kuvio 2), NKp46D2-Ig käsittely oli vain vähäinen vaikutus (kuvio 3b ja 4); 66,6% hiiristä käsiteltiin NKp46D2-Ig osoitti progressiivista kasvaimen kasvua, kun taas 22,2% ja 11,1% oli osittain kovettunut tai hoitaa tehokkaasti, vastaavasti.

(a) visualisointi kasvaimen etenemisen ja jakelu

in vivo

. Kuviossa on esitetty kuvan visualisointi yksi edustaja eläimen kunkin käsittelyn. Asteikon oikealle kunkin kuvion kuvaa värikartta fotonin laskenta. Integroitu valoemissio ( ’I’) on tarkoitettu vasemman jokaisen kuvan. (B) yhteenveto hoidon vaikutus. Taulukossa kuvataan kokonaisvaikutus hoitoja, kuten on esitetty tiedot kuvassa 3.

Kuvassa 4a on kuva yhden edustajan hiiren kustakin hoitoryhmässä. Useimmissa tapauksissa ei ole etäpesäkkeitä havaittu. Kasvain mittaukset edellä kuvatulla tavalla (kuvio 3) edustaa koko kasvainmassan havaittiin kullekin eläimelle.

Nämä tulokset osoittavat selvästi terapeuttista potentiaalia NKp30-Ig-fuusioproteiinin ihmisen eturauhasen syövän hoitoon

in vivo

.

farmakokinetiikkaa NKp30-Ig ja NKp46D2-Ig

Yhteenvetona tuloksemme osoittavat, että NKp30-Ig, mutta ei NKp46D2-Ig, voidaan tukahduttaa kasvaimen kasvua

in vivo

. Tämä selektiivinen vaikutus oli yllättävä, koska sekä NKp30-Ig ja NKp46D2-Ig samalla sitoutuvat PC3 /

Luc

, DU145 (kuvio 1 a ja b) ja ihmisen eturauhassyövän yksilöitä

in vitro

(kuva 1c ). Siten erot: n terapeuttista potentiaalia NKp46D2-Ig ja NKp30-Ig on seurausta muiden ominaisuuksien proteiineja, jotka vaikuttavat tehokkuutta hoidon.

Yksi tärkeimmistä tekijöistä syövän hoidossa on t

1/2 terapeuttisen aineen. Jotta välittäjänä merkittävän antituumorivaikutuksen fuusioproteiinit on pystyttävä saavuttamaan seerumin ja pysyvän vakaana useita tunteja.

arvioida suhteellisen vakauden fuusioproteiinien

in vivo

hiirille annettiin yksi annos (5 mg /kg kehon painoa) joko NKp30-Ig tai NKp46D2-Ig ja sitten seurataan tietyn proteiinin tasoja seerumissa muutaman tunnin välein 14 päivän ajan. Maksimaalinen taso proteiinien mitattu seerumissa oli samanlainen sekä NKp46D2-Ig ja NKp30-Ig (kuva 5a ja b). Kuitenkin, selviä eroja ei havaittu kinetiikka ja stabiilisuus kaksi fuusioproteiinia; korkea NKp46D2-Ig havaittiin seerumissa 1 tunnin kuluttua injektiosta, vaikka laski nopeasti veren ja 2 tunnin kuluessa noin 50% proteiinista oli hajonnut. Lisäksi, 24 tunnin jälkeen, vain pieniä jälkiä NKp46D2-Ig havaittiin (kuva 5b). Sen sijaan, korkeimman NKp30-Ig havaittiin seerumin jo 30 minuuttia injektion jälkeen ja se säilyi lähes 2 päivää, laskee vain sen jälkeen, kun 120 tuntia (kuvio 1a). Nämä havainnot osoittavat suhteellinen vakaus NKp30-Ig

in vivo

ja saattaa selittää ainakin osittain, epäonnistuminen NKp46D2-Ig tuottaa terapeuttisen vaikutuksen.

Hiiret injektoitiin i.p. yhden annoksen (5 mg /kg) NKp30-Ig (a) tai NKp46D2-Ig (b). Seeruminäyte kerättiin (0, 0,5, 1, 2, 6, 25, 48, 120, 168, 264 ja 312 tuntia injektion jälkeen) ja tasot NKp30-Ig tai NKp46D2-Ig määritettiin standardissa ELISA-määrityksessä. Kuvassa on esitetty keskimääräinen määrä fuusioproteiinien havaittiin seerumissa kolmesta hiirestä, mitataan kunakin ajankohtana. Virhepalkit edustavat keskiarvo ± sd kolmen rinnakkaisen.

NKp30-Ig tehostaa makrofagien välittämää sytotoksisuutta tuumorisoluja

in vitro

Useita mekanismeja on ehdotettu kyky kasvaimen vasta välittäjänä niiden vaikutus

in vivo

. Yksi mahdollinen tapa, jolla tällaisia ​​vasta-aineet voivat inhiboida kasvaimen kasvua on sitoutumalla pinta-reseptorit, jotka osallistuvat solusyklin säätelyssä [25]. Siksi testattiin ensin, onko sitoutuminen NKp30-Ig sen tuntematon kasvain ligandit voivat indusoida suoraan apoptoosin tai kasvun pysähtymisen kasvainsolujen viljelmässä. PC3 /

luc

ja DU145-soluja inkuboitiin kasvavien pitoisuuksien kanssa NKp30-Ig, NKp46D2-Ig tai kontrolli Ig-fuusioproteiinia 48 tunnin ajan, kun läsnä on silloittuminen vasta-aine. Käsittelyn jälkeen prosenttiosuus apoptoottisten solujen määritettiin anneksiini V: n ja propidiumjodidin (PI) -värjäyksellä. Inkubointi joko PC3 /

luc

tai DU145 solujen eri fuusioproteiinien ollut vaikutusta apoptoosin hinnat (kuva 6a ja b) keskiarvona spontaani apoptoosin PC3 /

luc

ja DU145 solut (noin 25% ja 8%, vastaavasti) oli samanlainen ja ei vaikuttanut millään näistä käsittelyistä. Lisäksi, ei ole solusyklin pysähtymisen havaittiin, arvioituna tymidiinin määrityksissä (tuloksia ei ole esitetty). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin inkuboinnin jälkeen 24 h tai 72 h (tuloksia ei ole esitetty).

(a, b) NKp30-Ig ei indusoi apoptoosia kasvainsoluissa. PC3 /

luc

(a) tai DU145 (b) soluja inkuboitiin kasvavien pitoisuuksien kanssa NKp30-Ig, NKp46D2-Ig, hallita Ig tai PBS: n läsnä ollessa silloitusaineen vasta-aine. 48 tunnin jälkeen, prosenttiosuus apoptoottisten solujen määritettiin anneksiini V: n ja PI-värjäyksellä. Kuvassa näkyy yksi kolmesta kokeita. (C, d) NKp30-Ig voidaan välittää kasvaimen opsonisaation makrofagit. Radioaktiivisen leimatun PC3 /

Luc

(c) tai DU145 (d) soluja inkuboitiin LPS-aktivoitujen makrofagien osoitetussa E:T suhde. Spesifinen lyysi määritettiin 48 tunnin kuluttua. Virhe palkit edustavat keskiarvoa ± S.D kolmen rinnakkaisen. Kuva edustaa yhtä kolmesta kokeita. (E) tunkeutuminen makrofagien kasvaimen kudoksessa. Ihmisen eturauhasen kasvaimia (DU145) kasvatettu nude-hiirissä kiinnitettiin 10% puskuroituun formaliiniin. Parafinoidut osat värjättiin hematoksyliinillä ja eosiini. Nuolet osoittavat kasvaimen associated- makrofageja (X380). Tämä luku edustaa yhtä out of 5 kohdat testattu.

Koska kasvainsolut ei osoittanut mitään luontaista herkkyyttä NKp30-Ig

in vitro

, me seuraavaksi testattiin kapasiteettia NKp30- Ig indusoivan efektori-välitteisen kasvainsolujen tappamista. Makrofagien on aiemmin osallisina merkittäviä toimijoita vasta-aineista riippuvainen kasvain ohjaus

in vivo

[26], [27]. Arvioida kyky NKp30-Ig parantaa makrofagien lyysin kasvainsolujen, hiiret injektoitiin ensin (i.p.) tioglykolaattia, jotta saadaan aikaan paikallinen ei-patogeenista tulehdus ja rekrytoida suuria määriä makrofageja vatsakalvoon onteloon. Viisi päivää myöhemmin hiiret tapettiin ja makrofagit eristettiin.