Krooninen sairaus

tiivistelmä

mTOR polku on poikkeuksellisesti stimuloidaan monissa syöpäsolut, mukaan lukien haiman adenokarsinooma (PDAC), ja näin ollen se on potentiaalinen kohde terapiassa. Kuitenkin mTORC1 /S6K akseli välittää myös negatiivista palautetta silmukoita, jotka vaimentavat signalointi kautta insuliinin /IGF-reseptoriin ja muut tyrosiinikinaasireseptorit. Tukahduttaminen näistä palautetta silmukoita vapauttaa yli-aktivointi ylävirran polkuja, jotka mahdollisesti tasapainottaa antiproliferatiivisia vaikutuksia mTOR-inhibiittorit. Tässä osoitamme, että hoito PANC-1 tai MiaPaca-2 haimasyöpäsoluissa joko rapamysiiniä tai aktiivisesta paikasta mTOR-inhibiittorit tukahdutetaan S6K ja S6 fosforylaatio aiheuttama insuliini ja GPCR agonistin neuro-. Rapamysiini aiheutti silmiinpistävää lisääntymistä Akt fosforylaation Pa

473, kun taas aktiivisen paikan estäjät mTOR (KU63794 ja PP242) kumosi kokonaan Akt fosforylaation tällä sivustolla. Toisaalta aktiivinen päällä estäjiä mTOR aiheuttaa selvän kasvun ERK aktivointi taas rapamysiini ei ole stimuloiva vaikutus ERK aktivointia. Tulokset osoittavat, että ensimmäisen ja toisen sukupolven mTOR-inhibiittorit edistää yli-aktivointi eri pro-onkogeenisen reittejä PDAC soluissa, mikä viittaa siihen, että tukahduttaminen palautetta silmukoita pitäisi olla tärkeä näkökohta käyttää näitä estäjiä PDAC hoitoa. Sen sijaan, metformiinin lakkautetaan mTORC1 aktivointi ilman yli stimuloiva Akt fosforylaatio Ser

473 ja esti mitogeenistimuloidut ERK aktivaation PDAC soluissa. Metformiini indusoi selvempää proliferaation esto kuin joko KU63794 tai rapamysiini, kun aktiivinen päällä mTOR-estäjä oli tehokkaampi kuin rapamysiinillä. Siten vaikutukset metformiinin Akt ja ERK aktivointi ovat silmiinpistävän erilainen allosteric tai aktiivinen-sivuston mTOR estäjien PDAC soluissa, vaikka kaikki nämä aineet esti voimakkaasti mTORC1 /S6K akselilla.

Citation: Soares HP, Ni Y, Kisfalvi K, Sinnettin-Smith J, Rozengurt E (2013) eri mallien Akt ja ERK palaute aktivointi vastauksena Rapamysiini, Active-Site mTOR estäjät ja metformiinin haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 8 (2): e57289. doi: 10,1371 /journal.pone.0057289

Editor: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 28 elokuu 2012; Hyväksytty: 20 tammikuu 2013; Julkaistu: 21 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Soares et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Institutes of Health Avustukset P30DK41301, P01CA163200 ja R01DK55003, Department of Veterans Affair Grant 1I01BX001473 ja varoja suotu Ronald S. Hirshberg puheenjohtaja haimasyövän Research kaikki ER. (https://www.nih.gov/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR) on erittäin kehityshistoriallisesti säilyneitä proteiinikinaasi, jolla on keskeinen rooli integraation kasvutekijä, ravinteiden ja energian tilan solujen [1]. mTOR toimii katalyyttisen alayksikön kahdessa eri Multiproteiinikompleksit, mTOR kompleksi 1 (mTORC1) ja mTORC2. mTORC1, tunnettu siitä, että säätelyalayksikön Raptor, ohjaa ainakin kaksi säätävät proteiinisynteesiä, ribosomaalisen 40S-proteiinin alayksikön S6-kinaasi (S6K) ja eukaryoottisia translaation aloi- tekijä 4E (EIF4E) sitoutuvilla proteiini 1, viitataan nimellä 4E-BP1 [1 ], [2]. Heterodimeerin kasvain vaimennin TSC2 (tuberiini) ja TSC1 (hamartin) tukahduttaa mTORC1 signalointi toimimalla kuten GTPaasia tioaktivaattoriproteiinille pienten G-proteiinin Rheb (Ras-homologia rikastunut aivoihin), joka on voimakas aktivaattori mTORC1 signaloinnin sen GTP- sitoutuneena [3], [4]. Fosforylaatio TSC2 mukaan Akt ja /tai ERK /p90RSK estää sen GTPaasi aktivoiva aktiivisuus Rheb, mikä mTORC1 aktivointi [5]. mTORC1 akuutisti ja allosterically estävät rapamysiini sitoutumalla FKBP12. mTORC2, tunnettu Rictor, ei inhiboi lyhytaikaiseen hoitoon tällä aineella ja fosforyloi useita AGC proteiinikinaasien, kuten Akt Ser

473 [6], [7]. MTORC1 polku on keskeinen rooli insuliinin /IGF-reseptori signalointi [8], [9] ja on poikkeuksellisesti aktivoitu monissa syövissä, mukaan lukien haiman adenokarsinooma (PDAC), yksi kaikkein vaarallisin ihmisen sairauksia. Niinpä PDAC solut ilmentävät insuliinin ja IGF-1-reseptoreihin ja yli-express IRS-1 ja IRS-2 [10] – [12] ja PDAC (mutta ei normaali) kudosta näyttö aktivoituu (fosforyloituu) IGF-1 R [13]. Gene vaihtelut IGF-1 merkinantojärjestelmä on liitetty sen elinajan potilailla, joilla PDAC [14]. Inaktivointi p53 katsottuna etenemisen aikana 50-70% PDAC, ajan säätelee insuliini /IGF-1 /mTORC1 reitin [15]. Ylikuuluminen insuliinipitoisuuden /IGF-1-reseptoreihin ja G-proteiiniin kytketty reseptori (GPCR) liikenneopastejärjestelmien voimakkaasti stimuloida mTORC1, DNA-synteesiä ja solujen lisääntymistä in paneeli PDAC solujen [16] – [20]. mTORC1 signalointi on keskeinen rooli lisääntymisessä ja selviytymistä PDAC solujen [21] ja se aktivoidaan haimasyövän kudoksissa [20], [22] – [24]. Niinpä mTORC1 on tullut houkutteleva terapeuttinen tavoite PDAC ja muiden yhteisten syöpäsairauksia.

Lisäksi kasvua edistäviä signalointi, mTORC1 /S6K välittää myös negatiivista palautetta silmukoita että hillitä signalointi kautta insuliinin /IGF-reseptoriin ja muut tyrosiini nikinaasireseptoreiden kautta fosforylaation ja transkription tukahduttaminen IRS-1 [25] – [30] ja fosforylaation Grb10 [31], [32]. Niinpä tukahduttaminen mTORC1 aktiivisuuden rapamysiini estää estävän IRS-1 fosforylaatioita ja hajoaminen, siten lisäten PI3K /Akt aktivointi useilla syöpäsolutyyppien [30], [33] – [35]. Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että mahdollinen syövänvastainen aktiivisuus rapamysiinin (tai analogeja) voidaan tasapainottaa vapautuminen palaute estämällä PI3K /Akt aktivointi [25], [30], [33] – [35]. Lisäksi rapamysiini epätäydellisesti estää 4E-BP-1-fosforylaation [36] – [40]. Näin ollen, kliininen antituumoriaktiivisuuden rapamysiinin ja sen analogit (rapalogs) on melko rajoitettu monissa syöpätyypeissä [41], [42], mukaan lukien PDAC [43], [44]. Yrittäessään kohdistaa mTOR koulutusjakson tehokkaammin, uudet inhibiittorit mTOR-, jotka toimivat tällä katalyyttisesti aktiiviseen kohtaan (aktiivi-site mTOR inhibiittorit) on tunnistettu, mukaan lukien PP242 [37], Torin [45], KU63794 [38] ja sen analoginen AZD8055 [46]. Nämä yhdisteet estävät 4E-BP-1 fosforylaation rapamysiini kestävä sivustoja (esim Thr

37/46) ja estää Akt fosforylaation Pa

473 estämällä mTORC2. Kuitenkin aktiivinen päällä mTOR estäjät myös poistaa takaisinkytkentäsilmukoiden että hillitä PI3K aktivointi [25], ja näin ollen niiden terapeuttista tehokkuutta voidaan myös vähentynyt aktivoimalla ylävirran polkuja, jotka vastustavat heidän antiproliferatiivisia vaikutuksia.

mTORC1 on myös säätelee negatiivisesti metformiinia, eniten käytetty huume hoidossa tyypin 2 diabeteksessa (tyypin 2 diabetekseen). Metformiini on nousemassa potentiaalinen uusi aine syövän kemopreventiossa. Viimeaikaiset epidemiologiset tutkimukset, jotka liittyvät hallinnon metformiinia vähentänyt, toistumisen ja kuolleisuus erilaisia ​​syöpiä Tyypin 2 diabeteksen potilailla [20], [47] – [56], mukaan lukien PDAC [54], [56]. Solutasolla, metformiini epäsuorasti stimuloi AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK) aktivointi [57], vaikka muita toimintamekanismeja on ehdotettu hyvin suurilla pitoisuuksilla tämän biguanidi. AMPK estää mTORC1 aktivointi stimuloimalla TSC2 toiminto [58] – [60], mikä johtaa kertyminen Rheb BKT (inaktiivisen muodon) ja suoralla fosforylaatio Raptor, joka häiritsee sen yhdessä mTOR, mikä dissosiaatiota mTORC1 monimutkainen [61]. Tarkka seurauksena tukahduttaminen negatiivista palautetta silmukoita välittämiä mTORC1 /S6K akseli vastauksena metformiinin edelleen heikosti määritelty ja erityisesti sitä ei tiedetä, rapamysiini, aktiivinen päällä mTOR-inhibiittorit ja metformiinin johtaa yli-aktivointi samanlaisia ​​ylävirtaan reittejä PDAC soluissa.

Tässä osoitamme, että hoito PANC-1 tai MiaPaca-2 haimasyövän soluja joko rapamysiinin tai aktiivisesta paikasta mTOR-inhibiittorit tukahdutetaan S6K ja S6 fosforylaatio aiheuttama insuliinin, yhdistelmästä insuliinin ja GPCR agonistin neuro- tai seerumista. Rapamysiini aiheutti silmiinpistävää lisäämisen Akt fosforylaation Pa

473, kun taas aktiivisesta paikasta mTOR-inhibiittorit KU63794 ja PP242 kumosi kokonaan Akt fosforylaation tällä sivustolla. Keskeisen piirre tässä esitetyt tulokset on, että aktiivinen päällä estäjiä mTOR, toisin kuin rapamysiinin, aiheuttaa huomattavasti enemmän ERK aktivaatio PDAC soluissa. Tulokset osoittavat, että ensimmäisen ja toisen sukupolven mTOR-inhibiittorit edistää yli-aktivointi eri pro-onkogeenisen reittejä PDAC soluissa, nimittäin Akt ja ERK. Metformin myös poistanut mTORC1 aktivointi mutta ilman yli stimuloiva Akt fosforylaatio Ser

473. Lisäksi metformiinin esti ERK aktivoinnin vastauksena rajat puhuminen agonisteja PDAC soluissa. Tuloksemme osoittavat, että vaikutukset metformiinin Akt ja ERK aktivointi ovat silmiinpistävän erilaisia ​​kuin aikaansaamat allosteric tai aktiivinen-sivuston mTOR-inhibiittorit, vaikka kaikki nämä aineet esti voimakkaasti mTORC1 /S6K akselilla.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

ihmisen haimasyövän solulinjoissa PANC-1 ja MiaPaca-2 saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Nämä solulinjat satama aktivoivia mutaatioita

KRAS

onkogeeni. Soluja kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle Medium (DMEM), jossa oli 2 mM glutamiinia, 1 mM Na-pyruvaattia, 100 yksikköä /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa kostutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 10% CO

2.

Western blot-analyysi

Konfluentteja viljelmiä PANC-1 tai MIA PaCa-2-soluja kasvatettiin 3 cm astiat pestiin ja inkuboitiin sitten 24 tuntia DMEM, joka sisälsi 5 mM glukoosia ja 1% FBS: ää. Solut pestiin kahdesti DMEM, joka sisälsi 5 mM glukoosia ja inkuboitiin seerumivapaassa väliaineessa 4 tunnin ajan ja käsiteltiin sitten, kuten on kuvattu yksittäisten kokeissa. Sitten viljelmät suoraan hajotettiin 2 x SDS-PAGE-näytepuskuria [200 mM Tris-HCI (pH 6,8), 2 mM EDTA, 0,1 M Na

3Vo

4, 6% SDS, 10% glyserolia, ja 4% 2-merkaptoetanolia] ja sen jälkeen SDS-PAGE: lla 10% geelit ja siirto Immobilon-P -kalvoille (Millipore, Billerica, MA). Western blotit suoritettiin sitten kalvoja inkuboitiin yön yli vasta-aineista fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS), joka sisälsi 0,1% Tween-20. Immunoreaktiivinen vyöhykkeet havaittiin ECL (tehostettu kemiluminesenssi) reagenssit (GE Healthcare Bio-Sciences Corp, Piscataway, NJ). Käytetyt vasta-aineet havaittiin fosforyloidun tilasta S6K at Thr

389, S6 Ser

235/236, 4E-BP1 at Thr

37/46 ja Thr

70, Akt Ser

473 ja Thr

308 ja ERK1 /2 klo Thr

202 ja Tyr

204 tai koko määriä näitä proteiineja.

Anchorage riippuvaa soluproliferaatiota.

PANC -1-soluja (10

5) maljattiin 35 mm: n kudosviljelymaljoille DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää. 24 tunnin inkuboinnin 37 ° C: ssa, ryhmät viljelmiä inkuboitiin neurotensiini ja insuliinin metformiinin kanssa tai ilman DMEM: ssä, joka sisälsi 0,25% FBS: ää tai rapamysiini, KU63794 tai metformiinin DMEM: ssä, joka sisälsi 2,5% FBS: ää. Viljelmiä inkuboitiin sitten 4 d, ja solujen kokonaismäärään määritettiin vähintään kuusi syvennystä per ehto käyttäen Coulter-laskimella sen jälkeen, kun solu kokkareita eriteltynä viemällä solususpensiota 10 kertaa läpi 19 gaugen, ja sen jälkeen, 21-gaugen neula.

Materiaalit

DMEM saatiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Neurotensiini ja insuliini hankittiin Sigma Chemical (St. Louis, MO). Rapamysiini, KU63794 ja PP242 olivat R & D Systems, Inc. Minneapolis. Kaikki vasta-aineet ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-kani-IgG ja anti-hiiri-IgG oli GE Healthcare Bio-Sciences Corp (Piscataway, NJ). Kaikki muut reagenssit olivat korkein arvosana käytettävissä.

Tulokset

Tutkijoiden p70S6K ja S6 fosforylaation vastauksena insuliinia ja neuro- vuonna PDAC soluissa poistetaan kokonaan rapamysiinillä tai KU63794

Aluksi määritimme vaikutus rapamysiinin ja KU63794 on mTORC1 välittämän fosforylaation S6K in PDAC soluissa. Rapamysiini on allosteerinen estäjä mTORC1, joka toimii kautta FKBP-12 taas KU63794 on erittäin spesifinen ATP-kompetitiivinen inhibiittori mTOR, joka estää sekä mTORC1 ja mTORC2. Viljelmät PANC-1 (Fig. 1) tai MiaPaca-2 (Fig. 2) soluja inkuboitiin 2 h puuttuessa tai läsnä rapamysiinin (10 tai 100 nM) tai KU63794 (1 tai 5 gM). Sitten viljelmiä stimuloitiin yhdistelmä insuliinin (10 ng /ml), ja GPCR-agonistin neurotensiini (5 nM), 2 tuntia saamaan aikaan positiivisia ylikuulumisen [18], [20]. Fosforylaatio S6K on Thr

389, välitön tavoite mTORC1, ja fosforylaatiota S6 (Ser

235/236), substraatti S6K, seurattiin käyttäen spesifisiä vasta-aineita, jotka tunnistavat fosforyloidun tilaa, jotka jäämiä. Stimulointi joko PANC-1 tai MiaPaca-2 solujen insuliinin ja neuro- aiheuttamaa vankka fosforylaation S6K on Thr

389 ja S6 (kuviot. 1 ja 2). Altistuminen joko rapamysiinin tai KU63794 esti täysin fosforylaation lisääntymiseen näiden proteiinien vasteena stimulaatiolle insuliinin ja neuro- joko PANC-1 (Fig. 1) tai MiaPaca-2-solut (Fig. 2). Olemme varmistaneet, että koko tasot S6K ja S6 ei muuttunut vastauksena hoitoja. Tulokset osoittavat, että allosteerinen tai aktiivisesta paikasta estäjiä mTOR voimakkaasti estetty mTORC1 /S6K akselin käytetyt konsentraatiot PDAC soluissa.

viljelmät PANC-1-soluja inkuboitiin ilman (-) tai läsnä KU63794 (Ku) 1 uM tai 5 uM tai rapamysiini (RAP) 10 tai 100 nM: ssa 2 h DMEM: ssä, joka sisälsi 5 mM glukoosia, kuten on osoitettu. Sitten soluja stimuloitiin 2 h 5 nM neurotensiini (NT) ja 10 ng /ml insuliinia (Ins), ja hajotettiin 2 x SDS-PAGE-näytepuskuria. Näytteet analysoitiin SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus vasta-aineilla, jotka tunnistavat fosforyloidun tilan S6K at Thr

389, S6 Ser

235/236, 4E-BP1 at Thr

37/46 ja Thr

70, Akt Ser

473 ja Thr

308 ja ERK on Thr

202 ja Tyr

204. Immunoblottaus vasta-aineita, jotka tunnistavat yhteensä S6K, S6, 4E-BP1, Akt ja ERK käytettiin todentaa, että solu hoidot eivät muuta kokonaistaso näiden proteiinien ja vahvistaa yhtäläiset geelilatauspuskuria. Kertainen nousu ERK-fosforylaation kvantitoitiin käyttäen Multi Gauge V3.0 ja piirretään baareja. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin 3 itsenäisestä kokeesta.

viljelmät MiaPaca-2-soluja inkuboitiin ilman (-) tai läsnä ollessa KU63794 (Ku) 1 uM tai 5 uM tai rapamysiini ( Rap) 10 tai 100 nM: ssa 2 h DMEM: ssä, joka sisälsi 5 mM glukoosia, kuten on osoitettu. Sitten soluja stimuloitiin 2 h 5 nM neurotensiini (NT) ja 10 ng /ml insuliinia (Ins), ja hajotettiin 2 x SDS-PAGE-näytepuskuria. Näytteet analysoitiin SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus vasta-aineilla, jotka tunnistavat fosforyloidun tilan S6K at Thr

389 (pS6K), S6 Ser

235/236 (PS6), 4E-BP1 at Thr

37/46 ja Thr

70, Akt Ser

473 ja ERK on Thr

202 ja Tyr

204. Immunoblottaus vasta-aineita, jotka tunnistavat yhteensä S6K, S6, 4E-BP1, Akt ja ERK käytettiin todentaa, että solu hoidot eivät muuta kokonaistaso näiden proteiinien ja vahvistaa yhtäläiset geelilatauspuskuria. Kertainen nousu ERK-fosforylaation kvantitoitiin käyttäen Multi Gauge V3.0 ja piirretään baareja. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin 3 itsenäisestä kokeesta.

Differential asetuksen 4EBP1 fosforylaatiokohdat vasteena mitogeeniseen stimulaatioon, rapamysiinin ja KU63794 in PDAC soluissa

fosforylaatio 4EBP1 myös seurattiin käyttäen paikkasidonnainen 4E-BP1 aineita, jotka tunnistavat p-Thr

37/46 tai p-Thr

70 lysayes of PANC-1 (Fig. 1) tai MiaPaca-2 (Fig. 2) soluja. Nämä solut näytetään korkean pohjapinta taso 4E-BP1 fosforylaation Thr

37/46, joka ei entisestään stimuloimalla insuliinin ja neuro-. Kuitenkin solu stimulaatio vähensi liikkuvuutta 4E-BP1 SDS /PAGE vastaus viittaavia fosforylaatio lisääntyy muissa kohdissa. Todellakin, hoito PANC-1 tai MiaPaca-2 solujen neuro- ja insuliinin selvästi kannustanut 4E-BP1phosphorylation on Thr

70. Constituve fosforylaatio 4E-BP1 on Thr

37/46 kumottiin käsittelemällä KU63794 mutta ei vaikuttanut rapamysiini joko 10 tai 100 nM, kanssa raportteja, että rapamysiinin ja sen analogit eivät estä 4E-BP1 fosforylaation näillä paikoilla muissa solutyypeissä. Sen sijaan signaali vasteena fosforylaation 4E-BP1 on Thr

70 estettiin käsittelemällä joko KU63794 tai rapamysiini 100 nM. Olemme varmistaneet, että koko tasot 4E-BP1 ei muuttunut vastauksena treatments.These tulokset paljasti unappreciated sääntely 4E-BP1 fosforylaatiota eri jäämiä vastauksena ulkoisten signaalien ja osoittaa, että rapamysiini estää indusoituvia mutta ei konstitutiivinen 4E-BP1 fosforylaation PDAC soluissa, kun taas aktiivinen päällä mTOR estäjät tukahduttaa fosforylaation 4E-BP1 kaikissa toimipaikoissa.

Rapamysiinin ja KU63794 aiheuttaa yli-stimulaatio eri ylävirran koulutusjaksojen PDAC stimuloitu insuliinia ja neuro- tai pelkästään insuliinilla

sen määrittämiseksi, onko allosteric ja aktiivisesta paikasta mTOR estäjät poistaa takaisinkytkennät että hillitä aktiivisuus alkupään signalointireiteissä PDAC soluissa, tutkimme vaikutus näiden estäjien fosforylaatiota Akt vastauksena mitogeenisesta signalointia PANC -1 ja Mia PaCa-2-soluissa. Stimulointi näiden solujen insuliinin ja neuro- indusoi huomattavasti enemmän Akt fosforylaatio Ser

473 (kuviot. 1 ja Fig. 2). Hoito joko 10 nM tai 100 nM rapamysiini huojumaan-stimulaation Akt fosforylaatio Ser

473, sopusoinnussa tukahduttaminen mTORC1 /S6K akselin palaute silmukoita. Sen sijaan aiempi altistus vaikuttavalle päällä mTOR-estäjä KU63794, joka estää sekä mTORC1 ja mTORC2, estetty Akt fosforylaatio Pa

473 PANC-1 (Fig. 1) ja MiaPaca-2-solut (Fig. 2), sopusoinnussa ajatus, että mTORC2 on merkittävä proteiinikinaasi fosforyloi Akt on Ser

473 PDAC soluissa. KU63794 ei estä Akt fosforylaation Thr

308.

ERK /EK-reitin, joka on keskeinen rooli PDAC solujen lisääntymisen johtaa myös mTORC1 aktivointi [5], [62]. Rintasyövän ja virtsarakon syövän solujen inhibitio mTORC1 /S6K akselin rapamysiini indusoi palautetta aktivointi ERK [63]. Näin ollen tutkimme vaikutuksia rapamysiinin ja KU63794 siitä ERK aktivaatio PDAC soluissa. Yhteisymmärryksessä aiempien tutkimusten kanssa, [16], [64], [65], stimulaatio joko PANC-1 tai MiaPaca-2 solujen insuliinin ja neuro- selvästi aktivoitu ERK (ERK fosforyloitiin Thr

202 ja Tyr

204 ), kuten on esitetty kuvioissa. 1 ja 2. Toisin kuin saadut tulokset muissa solutyypeissä [63], käsittelemällä joko 10 tai 100 nM rapamysiini 2 h ei muuttanut pohjapinta tai stimuloitu tason ERK-fosforylaation PANC-1 ja MiaPaca-2-soluissa . Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun nämä PDAC soluja käsiteltiin rapamysiinin 4 tai 24 tunnin ajan (tuloksia ei esitetty). Sen sijaan altistuminen KU63794 (1-5 uM) lisäsi perustason ERK-fosforylaation ja silmiinpistävän tehostettu stimulaatio ERK-fosforylaation aiheuttama insuliini ja neuro- joko PANC-1 tai MiaPaca-2-soluissa. Kvantifiointi tuloksia ERK on kuvattu alapaneelit kuvioiden. 1 ja 2 (baaria). Nämä tulokset osoittavat, että rapamysiini, allosteerisessa estäjä mTORC1, ja KU63794, aktiivisesta paikasta estäjä mTOR johtaa yli-aktivointi eri ylävirran pro-onkogeenisen reittejä PDAC soluissa.

stimulointi PANC-1 soluja tai MiaPaca-2 pelkästään insuliinilla aiheuttamaa voimakkaaseen kasvuun PI3K /Akt /mTORC1 mutta ei indusoi merkittävää kasvua ERK fosforyloitiin Thr

202 ja Tyr

204 (Fig. 3). Näin ollen meillä selvitettävä, ero vaikutuksia rapamysiinin ja KU63794 kuvattu PDAC stimuloidaan yhdistelmä insuliinin ja neuro- (kuviot. 1 ja 2) voidaan valmistaa myös silloin, kun PANC-1 ja MiaPaca-2 solut altistettiin pelkästään insuliinilla. Näiden solujen viljelmiä inkuboitiin 2 h puuttuessa tai läsnä rapamysiiniä (10-100 nM) tai KU63794 (1-5 uM) ja stimuloitiin sitten insuliinia (10 ng /ml). Monitoroimme fosforylaatio S6K on Thr

389, S6 on Ser

235/236, Akt on Ser

473 ja Thr

308 ja ERK on Thr

202 ja Tyr

204. Aikaisempi altistus joko rapamysiinin tai KU63794 poistetaan kasvu fosforylaation S6K ja S6 vasteena insuliinille joko PANC-1 tai MiaPaca-2-solut (Fig. 3). Altistuminen rapamysiinin yliaktivoitu taas hoito KU63794 lakkautetaan Akt fosforylaatio Ser

473 vuonna insuliinistimuloidun PDAC soluissa. Rapamysiini ei tuottanut havaittavaa vaikutusta ERK-aktivaation un stimuloiman tai insuliinihoitoa saaneista soluista. Keskeisen piirre tulokset kuvassa. 3 on, että altistuminen KU63794 indusoi selvän kasvun fosforylaation ERK on Thr

202 ja Tyr

204. Nämä tulokset tukevat että allosteerinen estäjä mTORC1 ja aktiivisen paikan päällä estäjä mTOR edistää yli-aktivointi eri ylävirran koulutusjaksojen PDAC jotka altistettiin tai insuliinin ja neuro-, yhdistelmä, joka saa aikaan ylikuulumisen insuliini /IGF ja GPCR opastinjärjestelmät .

viljelmät PANC-1 (ylempi paneeli) ja MiaPaca-2 (alempi paneeli) inkuboitiin ilman (-) tai läsnä ollessa KU63794 (Ku) 1 uM tai 5 uM tai rapamysiini (RAP) 10 tai 100 nM: ssa 2 h DMEM: ssä, joka sisälsi 5 mM glukoosia, kuten on osoitettu. Sitten soluja stimuloitiin 2 h 10 ng /ml insuliinia ja hajotettiin 2 x SDS-PAGE-näytepuskuria. Näytteet analysoitiin SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus vasta-aineilla, jotka tunnistavat fosforyloidun tilan S6K at Thr

389, S6 Ser

235/236, Akt Ser

473 ja Thr

308 ja ERK at Thr

202 ja Tyr

204. Immunoblottaus yhteensä S6K, S6, Akt ja ERK käytettiin tarkistaa yhtä suuri geelilatauspuskuria. Kertainen nousu ERK-fosforylaation kvantitoitiin käyttäen Multi Gauge V3.0 ja piirretään baareja. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin 3 itsenäisestä kokeesta.

PP242, kuten KU63794, parantaa ERK-aktivaation PANC-1-solut stimuloitiin insuliinilla ja neuro-

Myöhemmin me selvitettävä, silmiinpistävää yli -activation ERK: n aktiivisen paikan mTOR-estäjä KU63794 voidaan valmistaa myös rakenteellisesti jotka eivät liity aktiiviseen päällä mTOR-estäjä. Viljelmät PANC-1 inkuboitiin 2 h puuttuessa tai läsnä PP242 (1-5 uM), äskettäin tunnistettu aktiivisen päällä mTOR-estäjä [37], ja stimuloitiin 2 h insuliinin ja neurotensiini. Monitoroimme fosforylaatio S6K on Thr

389, S6 on Ser

235/236, 4EBP1 on Thr

37/46, Akt on Ser

473 ja ERK on Thr

202 ja Tyr

204. Kuten on esitetty kuviossa. 4 A, ennen altistumista PP242 poisti fosforylaatiota S6K, S6, 4EBP1 ja Akt in PANC-1-soluissa. Keskeistä tuloksista on, että PP242, kuten KU63794, indusoi selvästi lisääntynyt fosforylaation ERK on Thr

202 ja Tyr

204 (Fig. 4A ja kvantifiointiin Fig. 4B). Koska PP242 on vähemmän selektiivinen mTOR-estäjä [66], me määrittää, ovatko pitoisuudet PP242 että edistetään ERK aktivointi vastaa muiden estävien mTORC1 aktiivisuutta. Kuten on esitetty kuviossa. 4C, PP242 parannettu ERK aktivointi ja esti S6 fosforylaation lähes identtiset pitoisuuksina.

, viljelmät PANC-1-soluja inkuboitiin ilman (-) tai läsnä ollessa PP242 at 1 uM tai 5 uM 2 h DMEM: ssä, joka sisälsi 5 mM glukoosia, kuten on osoitettu. Sitten soluja stimuloitiin 2 h 5 nM neurotensiini (NT) ja 10 ng /ml insuliinia (Ins), ja hajotettiin 2 x SDS-PAGE-näytepuskuria. Näytteet analysoitiin SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus vasta-aineilla, jotka tunnistavat fosforyloidun tilan S6K at Thr

389, S6 Ser

235/236, 4E-BP1 at Thr

37/46, Akt at Ser

473 ja ERK on Thr

202 ja Tyr

204. Immunoblottaus vasta-aineita, jotka tunnistavat yhteensä S6K, S6, 4E-BP1, Akt ja ERK käytettiin todentaa, että solu hoidot eivät muuta kokonaistaso näiden proteiinien ja vahvistaa yhtäläiset geelilatauspuskuria. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin 3 itsenäisestä kokeesta.

B

, Pylväät edustavat kasvua ERK-fosforylaation aiheuttama insuliini (Ins) ja neuro- (NT) soluissa ilman tai ennen altistumista PP242. Kvantifiointi suoritettiin käyttämällä Multi Gauge V3.0

C,

Cultures of PANC-1-soluja inkuboitiin kuten paneelissa A, mutta kun läsnä on kasvavia konsentraatioita PP242. Näytteet analysoitiin havaitsemiseksi fosforyloidun tila S6 on Ser

235/236 ja ERK on Thr

202 ja Tyr

204. Immunoblottauksella kokonaan ERK ja S6 (ei kuvassa) käytettiin tarkistaa yhtä suuri geelilatauspuskuria. Kvantifiointi suoritettiin käyttämällä Multi mittari V3.0.

D

, viljelmät PANC-1-soluja inkuboitiin ilman (-) tai läsnä ollessa joko KU63794 (Ku) tai PP242 5 uM: ssa 2 tuntia. Sitten soluja stimuloitiin 2 h 5 nM neurotensiini (NT) ja 10 ng /ml insuliinia (Ins), ja hajotettiin 2 x SDS-PAGE-näytepuskuria. Näytteet analysoitiin SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus vasta-aineilla, jotka tunnistavat fosforyloidun tilan ERK at Thr

202 ja Tyr

204, Akt Ser

473 ja Thr

308. Immunoblottauksella kokonaan Akt ja ERK käytettiin tarkistaa yhtä suuri geelilatauspuskuria.

todentaa, että aktiivisesta paikasta mTOR-inhibiittorit KU63794 ja PP242 pitoisuuksina että tehosti merkittävästi ERK aktivointi ja estivät Akt fosforylaatio Ser

473 ei estä Akt fosforylaation Thr

308 PDAC soluissa (Kuva. 4D). Itse asiassa erityisiä mTOR-estäjä KU63794 hieman parannettu Akt fosforylaation Thr

308, sopusoinnussa tukahduttaminen takaisinkytkentäsilmukoiden että hillitä PI3K (Fig. 4D). PP242 ollut yhtä tehokas kuin KU63794 parantamisessa Akt fosforylaation Thr

308, todennäköisesti heijastuvat-tavoite esto PI3K [66]. Siten tietyn aktiivisen paikan päällä mTOR-inhibiittorit KU63794 ja PP242 tukahdutetaan Akt fosforylaatio Ser

473, ei laskenut Akt fosfory- on Thr

308 ja kannustanut yli-aktivointi ERK fosforylaation Thr

202 ja Tyr

204 PDAC soluissa.

mekanismi, jolla aktiivinen päällä inhibiittorit parantavat ERK aktivointia ei ole hyvin ymmärretty. Tuloksemme eivät tue olemassaoloa PDAC soluissa oletetun mTORC1 /S6K /PI3K /ERK silmukka, ehdotetaan muihin solutyyppeihin [63], koska voimakas inhibitio mTORC1 /S6K akselin joko rapamysiinin tai everolimuusille ei tuottanut overstimulation ERK: in PDAC soluissa. Väitteensä johtopäätös, PANC-1-soluja käsiteltiin KU63794 tai PP242 ja stimuloidaan insuliinin ja neuro- puuttuessa tai läsnä A66 [67], joka on selektiivinen 110α katalyyttisen alayksikön PI3K. Kuten on esitetty kuviossa. 4D, altistuminen A66 ei estä parantamiseksi ERK aktivoitumisen vasteena altistumiselle joko KU63794 tai PP242. Olemme vahvistaneet, että A66, käytetyn pitoisuuden, esti voimakkaasti PI3K sisällä PANC-1-soluissa, koska se esti insuliinin aiheuttamaa Akt fosforylaation Thr

308, avain jäännöksen Akt aktivointi silmukka fosforyloituu PI3K-riippuvainen PDK1.

jotta saataisiin tarkempi käsitys mekanismin, jolla käsittely KU63794 indusoi yli-aktivointi ERK myös määritti tämän aktiivisen paikan mTOR-estäjä aktivoinnista MEK, ylävirran kinaasi fosforyloi ERK. MEK aktivoituminen pisteytettiin arvioimalla fosforylaatio Ser

217 ja Ser

221 sen aktivoinnin silmukka. Kuten on esitetty kuviossa. S1, hoito PANC-1 tai MiaPaca-2-solujen KU63794 tehosti merkittävästi MEK fosforylaation aiheuttama insuliini ja neuro-. Yhdessä tulokset osoittavat, että aktiivinen päällä mTOR-inhibiittorit johti MEK /ERK hyper-aktivointi kautta PI3K /S6K riippumaton takaisinkytkentäsilmukan PDAC soluissa.

Differential malleja Akt ja ERK aktivoinnin vastauksena rapamysiini, everolimuusia, KU63794 ja PP242 in PANC-1-solut stimuloidaan seerumin

Edellä olevat tulokset saatiin PDAC stimuloitu määritelty mitogeenien jotka toimivat spesifisten reseptorien kautta. Laajentamisesta nämä löydökset testasimme myös ero kuvioita Akt ja ERK-aktivaation syntyy, kun solut stimuloidaan naudan sikiön seerumia. Viljelmät PANC-1-soluja inkuboitiin 2 h puuttuessa tai läsnä rapamysiiniä (100 nM), everolimuusille (100 nM), KU63794 (1 uM) tai PP242 (1 uM) ja stimuloitiin elatusaineella, joka sisälsi naudan sikiön seerumia. Monitoroimme fosforylaatio S6 on Ser

235/236, Akt on Ser

473 ja ERK on Thr

202 ja Tyr

204. Aikaisempi altistus rapamysiini, everolimuusia, KU63794 tai PP242 poistettiin fosforylaation lisääntymiseen ja S6 vastauksena seerumissa (Fig. 5). Altistuminen rapamysiinin tai everolimuusille yliaktivoitu taas hoito KU63794 tai PP242 poistettava Akt fosforylaatio Ser

473 seerumissa stimuloiman PDAC soluissa. Rapamysiini tai everolimuusi ei tuottanut mitään havaittavaa vaikutusta ERK aktivointi taas altistuminen KU63794 tai PP242 indusoi selvästi lisääntynyt fosforylaation ERK on Thr

202 ja Tyr

204 seerumissa käsiteltyjä soluja (Fig. 5). Nämä tulokset vahvistivat, että allosteric ja aktiivisen paikan päällä estäjät mTOR edistää yli-aktivointi eri ylävirran koulutusjaksojen PDAC soluissa erilaisissa koeolosuhteissa, mukaan lukien solut altistettiin insuliinia, insuliinin sekä GPCR agonistin neuro- tai tuoretta naudan sikiön seerumia.

viljelmiä inkuboitiin ilman (-) tai läsnä oli 5 uM KU63794 (Ku), 5 uM PP242, 100 nM rapamysiini (Rap) tai 100 nM everolimuusille 2 h DMEM: ssä, joka sisälsi 5 mM glukoosi, kuten on osoitettu. Sitten soluja stimuloitiin 2 h naudan sikiön lopullisessa laimennoksena 2% (seerumi) ja hajotettiin 2 x SDS-PAGE-näytepuskuria. Näytteet analysoitiin SDS-PAGE: lla ja immunoblottaus vasta-aineilla, jotka tunnistavat fosforyloidun tilan Akt Ser

473, S6 Ser

235/236, ja ERK on Thr

202 ja Tyr

204 . Kuten on esitetty kuviossa. Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM. Tulokset esitetään keskiarvona ± SEM.