Krooninen sairaus

tiivistelmä

JKA97, bentsylideeni- analogi harmiini, on havaittu olevan lupaava lääke-ehdokas ihmisen syövän hoidossa, vaikkakin taustalla oleva molekyylitason mekanismeja ei ole täysin osoitettu. Tässä tutkimuksessa arvioimme vaikutuksia JKA97 ihmisen rinta- syöpäsolujen

in vitro

ja

in vivo

. JKA97 esti kasvun ja lisääntymisen MCF7 (p53 villityypin), MCF7 (p53 pudotus) ja MDA-MB-468 (p53-mutantti) solujen annoksesta riippuvalla tavalla. Hoito JKA97 pidätettiin rintasyövän soluja G1 vaiheeseen ja indusoi apoptoosin. JKA97 myös merkittävästi tukahdutti kasvua MCF7 ja MDA-MB-468-ksenografti kasvaimia. Se säännelty ekspressiotasot G1 vaiheessa sääntelyviranomaisten, kuten p21, P27, sykliini, ja cylinD1. JKA97 aktivoitu p21 transkriptio, riippumaton p53, mutta oli vähän vaikutusta p21 proteiinin stabiilisuuteen /hajoamista. Yhteenvetona tulokset viittaavat siihen, että JKA97 estää ihmisen rinta- syöpäsolujen kasvua aktivoimalla p21, riippumaton p53, joka tarjoaa perustan kehittää tätä yhdistettä uutena lääkkeenä ihmisen rintasyövän hoidossa.

Citation: Yang X Wang W, Qin JJ, Wang MH, Sharma H, Buolamwini JK, et ai. (2012) JKA97, Novel bentsylideeni Analog of harmiini, Kiinnostavuus Anti-Cancer Effects indusoimalla G1 pidättäminen, Apoptosis, ja p53-riippumattoman Up-asetuksen p21. PLoS ONE 7 (4): e34303. doi: 10,1371 /journal.pone.0034303

Editor: Gen Sheng Wu, Wayne State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 19 tammikuu 2012; Hyväksytty: 28 helmikuu 2012; Julkaistu: 27 huhtikuu 2012

Copyright: © 2012 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: R.Z. tukivat NIH avustuksia R01 CA112029 ja R01 CA121211 ja avustusta Susan G. Komen varten Cure (BCTR070731). M.H.W. tukivat NIH avustuksen R01 CA91980. J.K.B. tukivat NIH avustuksen R15 CA100102. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Rintasyöpä on yksi yleisimmin diagnosoitu syöpien ja johtavia syitä syövän naisten yleisin kuolinsyy maailmassa. Mukaan tilastotietojen GLOBOCAN, noin 1,38 miljoonaa uutta potilasta oli diagnosoitu rintasyöpä ja noin 458400 maailmanlaajuisesti kuoli tautiin vuonna 2008 [1]. Viimeisten kahden vuosikymmenen aikana, kuolleisuus rintasyöpään ovat laskeneet vuoksi varhainen havaitseminen, lisääntynyt tietoisuus ja Parempien tai uusien hoitomuotojen. Kuitenkin tietyt rintasyövän ovat erityisen aggressiivisia ja esittää huono ennuste. Potilaat myöhäisvaiheen tai relapsoitunut rintasyöpä on usein vaatimaton vastaus kliinisesti olemassa oleviin hoitomuotoihin ja saattavat jopa resistenttejä tavanomaisille kemoterapia-aineiden [2] – [4]. Vähäisyys ja tehottomuus käytännössä terapeuttisten tekee onnistuneen hoidon rintasyövän haaste ja edellyttää löytö vaihtoehtoisten kemoterapeuttisten kanssa uusia syöpälääkkeen mekanismeja.

Natural tuotesuuntautuneesta synteettisiä johdannaisia ​​on ollut tärkeä rooli anti- syöpä lääkekehityksen [5], [6]. Useat laajasti käytetty kemoterapeuttisten aineiden kuten paklitakselin ja aktinomysiini C alun perin kehitetty luonnontuotteista. Harmiini, joka on β-karboliini alkaloidi saatu siemenistä myrkyllisten kasvien

pilviharmikki,

on käytetty lääketieteellisesti jonkin aikaa kuin verenpainelääkkeitä huumeiden; toimii palautuvasti estämällä monoamiinioksidaasi A. Tutkimukset viime vuosikymmenellä paljasti, että harmiini myös hallussaan voimakas antiproliferatiivisia ja sytotoksisia ominaisuuksia [7], [8].

JKA97, myös nimitystä metoksi-1-styryl- 9H-pyrido [3,4-b] indolia (MW: 286,35; Fig. 1A), on bentsylideeni analogi harmiini [9], [10]. Tuore raportti osoitti, että JKA97 voivat aiheuttaa apoptoosin paksusuolen ja maksan syöpäsoluja

in vitro

ja

in vivo

jonka Bax-riippuvaisen ja p53-riippumattoman mekanismin [10]. Kuitenkin syövän toimintaa JKA97 muiden syöpien ja tarkka molekyylitason mekanismeja yhdistettä ei ymmärretä hyvin. Tässä tutkimuksessa selvitimme anti-kasvain toimintaa JKA97 rinta- syöpäsolujen erilaisten geneettisten taustoja, ja yrittivät edelleen valaista mahdollinen toimintamekanismi, joka muodostaa pohjan tulevaa kehitystä tämän aineen ihmisen rintasyövän hoidossa.

(A) kemiallinen rakenne JKA97. (B) pitoisuudet JKA97 indusoimaan 50% kasvun esto (IC

50) rintasyöpäsoluissa, suhteessa vastaavaan valvonnan, joka perustuu MTT-määritystä. MCF7, MDA-MB-468, ja MCF7 p53KD solut altistettiin eri pitoisuuksia JKA97 72 tuntia. (C) Anti-proliferatiivinen vaikutus JKA97 rintasyövästä soluissa. Solut altistettiin eri pitoisuuksia JKA97 48 tunnin ajan, jonka jälkeen BrdUrd sisällyttämällä määrityksessä. Lisääntyminen indeksi laskettiin vastaan ​​käsittelemätön kontrolli soluja (* P 0,05). (D) Apoptoosin rintasyövän soluissa JKA97. Solut altistettiin eri pitoisuuksia JKA97 24 tuntia, minkä jälkeen mittaus apoptoosin anneksiini V-määrityksellä. Apoptoottiset indeksi laskettiin vastaan ​​käsittelemätön kontrolli soluja (* P 0,05). (E) vaikutukset JKA97 on solusyklin jakautumisen rintasyövän soluissa. Solut altistettiin eri pitoisuuksia JKA97 24 tuntia, minkä jälkeen mittaus DNA sisältö virtaussytometrialla. Solusyklin jakautumisen arvioitiin vertaamalla, että valvonta-soluja (* P 0,05). Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena. Tulokset olivat vähintään kolmea erillistä, toistuvat kokeet.

Tulokset

JKA97 pienenee rinta- syöpäsolujen kasvua

in vitro

JKA97 arvioitiin sen vaikutukset rintasyövän solujen elinkelpoisuuden

in vitro

käyttämällä MTT-määritystä. Kolme ihmisen rintasyövän solulinjoissa, jotka edustavat kolmea erilaista geneettisissä taustoissa (MCF7 /p53 villityypin, MCF7 /p53 pudotus, ja MDA-MB-468 /p53-mutantti) altistettiin eri pitoisuuksia koeyhdistettä (0, 1, 2,5, 5, 10, 25, ja 50 uM) 72 tunnin ajan, ja solujen selviytymisen prosentit määritettiin. Kuten nähdään Fig. 1B yhdiste osoitti IC

50-arvot alle 20 uM (6,6-19,0 ​​pM). MDA-MB-468 ja MCF7 p53KD solut näyttivät olevan herkempiä yhdiste kuin MCF7-soluja.

JKA97 estää rintasyöpäsolujen lisääntymistä

in vitro

Samanlainen vaikutukset solujen eloonjäämistä, JKA97 inhiboi solujen proliferaatiota annoksesta riippuvaisella tavalla (kuvio. 1C). Merkittävät antiproliferatiivisia vaikutuksia havaittiin kaikissa kolmessa solutyypeissä eri p53 taustoja. Konsentraatiossa 20 uM, JKA97 inhiboi proliferaatiota noin 35%, 35%, ja 45%, MCF7, MDA-MB-468, ja MCF7 p53KD soluja, vastaavasti.

JKA97 indusoi apoptoosia rintojen syöpäsolut

in vitro

lisäksi proliferaation, JKA97 myös indusoi apoptoosin rintasyövän soluissa. Kuten kuviossa. 1D, kaikki kolme tutkittiin rintasyövän solulinjat osoittivat merkittävän kasvun (P 0,05) apoptoosin altistumisen jälkeen 20 uM yhdisteen pitoisuus. Vuonna MCF7, MDA-MB-468, ja MCF7 p53KD soluja, 20 uM JKA97 kasvanut apoptoottisten indeksi 3,9-kertainen, 5-kertainen, ja 4,2-kertaisesti, vastaavasti, verrattuna, että kontrollisoluissa.

JKA97 aiheuttaa G1 vaiheen pysähtymisen rintasyöpäsoluissa

in vitro

Havaitsimme myös, että JKA97 esti solusyklin etenemistä, mikä pidättää G1 vaiheessa solusyklin annoksesta riippuvaisella tavalla kaikissa kolmessa solulinjoissa (Fig. 1 E). Sekä MCF7 ja MCF7 p53KD soluja, jopa 5 uM, JKA97 johti merkittävään (P 0,05) määrä kasvaa solujen G1 vaiheessa. Tällä 20 uM, suurin osa soluista pidätettiin G1 vaiheessa (P 0,05).

JKA97 pienenee ksenograftikasvaimissa kasvu

in vivo

Määritä onko yhdiste voidaan myös käyttää syövän vaikutukset

in vivo

, JKA97 annettiin kantavien nude-hiirten MCF7 tai MDA-MB-468-ksenografti kasvaimia. Vuonna MCF7 ksenograftimallissa, korkea annos JKA97 (25 mg /kg) esti tuumorin kasvua noin 60% (P 0,05) päivänä 18, ja pienen annoksen (5 mg /kg), myös johtavat merkittäviin kasvaimen kasvun estäminen (50%, p 0,05; Fig. 2A1).

in vivo

syövänvastainen aktiivisuus JKA97 tutkitaan edelleen MDA-MB-468 ksenograftimallissa. Tämä malli näytti olevan hieman vähemmän herkkä lääkkeen, jossa pienellä annoksella (5 mg /kg) ja suuren annoksen (10 mg /kg) vähentämällä kasvaimen kasvua noin 45% ja 52%, tässä järjestyksessä (P 0,05; Fig. 2B1). Lisäksi ei ollut merkittäviä eroja painon välillä valvonnan ja käsiteltyjen eläinten JKA97, tai brutto elin poikkeavuuksia ruumiinavauksessa kummassakaan ryhmässä (kuviot. 2A2 ja B2).

JKA97 annettiin i.p. injektiona kantavien nude-hiirten MCF7 (A1) tai MDA-MB-468 (B1) ksenograftikasvaimissa. Hiirillä, joissa MCF7-ksenografti kasvaimen, hoidon ryhmää sai JKA97 annoksina 5 mg /kg /päivä tai 25 mg /kg /päivä, 5 päivää /viikko, ja 6 viikkoa; ja hiirillä, joilla on MDA-MB-468-ksenografti kasvaimen, hoidon ryhmää sai annosta 5 mg /kg /päivä tai 10 mg /kg /päivä, 5 päivää /viikko, ja 18 päivää. Ohjaus ryhmät saivat ajoneuvon vain. Eläimiä seurattiin myös muutoksia kehon painoa korvikemarkkerina myrkyllisyyden, kun se annettiin kantavissa nude (A2) MCF7 tai (B2) MDA-MB-468 ksenograftikasvaimissa. Lopussa kokeiden, ksenograftikasvaimissa poistettiin ja otettiin valokuva (A3 ja B3).

JKA97 up-regulation p21 ilmentymistä p53-riippumattomalla tavalla

seuraavalle tutki mekanismi (t), ja JKA97 tutkimalla sen vaikutuksia ekspressiotasot eri proteiineja, jotka liittyvät solusyklin etenemisen. Kaikki kolme solulinjaa käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla JKA97 24 tuntia, Käsitellyt solut osoittivat lisääntynyttä p21 ilmentymisen annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi CyclinD1, sykliini, ja E2F1 pieneni, kun taas P27 nostettiin, todennäköisesti johtuu p21 aktivaation (Fig. 3A). Me käsitellään edelleen kaikki kolme solulinjaa 10 uM JKA97 vaihtelevia aikoja, kuten on esitetty kuviossa. 3B. P21-proteiinin tasot olivat lisääntyneet ajasta riippuvalla tavalla kaikissa soluissa testataan, riippumatta p53 status.

(A) MCF7, MDA-MB-468, ja MCF7 p53KD solut altistettiin eri pitoisuuksia JKA97 24 tuntia, ja p53: n ja p21-proteiineja määritettiin Western blot -analyysillä. (B) Soluja altistettiin 10 uM JKA97 varten osoitetun ajan, ja p53: n ja p21-proteiineja määritettiin Western blot -analyysillä. β-aktiini käytettiin tasa-latauskontrollina näytteiden.

JKA97 on vain vähän vaikutuksia vakauteen p21-proteiinin

Vaikutukset JKA97 on p21 sääntelyä määritettiin myös osoitteessa posttranskriptionaalisella tasolla. Kaikki kolme solulinjoja altistettiin 10 uM JKA97 tai liuotinta 24 tunnin ajan, minkä jälkeen lisättiin n proteiinisynteesi-inhibiittorin, sykloheksimidiä (CHX, 10 uM). Kuten on esitetty kuviossa. 4A, ei ollut merkittävää eroa p21-proteiinin stabiilisuuteen solujen välillä alttiina JKA97 ja altistuneet ainoastaan ​​liuotinta.

(A1) MCF7, MDA-MB-468, ja MCF7 p53KD solut altistettiin eri pitoisuuksille ja JKA97 tai ajoneuvon 24 tuntia, minkä jälkeen altistus proteiinisynteesi-inhibiittorin sykloheksimidin (CHX, 10 ug /ml). p21-proteiinin ekspressio havaittiin Western-blottauksella eri aikoina altistuksen jälkeen CHX. (A2) Grafiikka osoittaa kvantifiointiin Western blotting tiedot. MCF7 (B1), MDA-MB-468 (B2) ja MCF7 p53KD (B3) Solut altistettiin eri pitoisuuksille JKA97 tai ajoneuvon 24 tunnin ajan, ja kokonais-RNA uutettiin seuraa käänteistranskriptio, ja havaitseminen mRNA-tasolla p21 by reaaliaikainen kvantifiointi PCR ja kvantifiointi RT-PCR, normalisoidaan mRNA tasolla GAPDH. (C) transfektoitiin p21-promoottorin lusiferaasireportteriplasmidi ja Renilla lusiferaasireportteri- yhdessä 12 tuntia, jota seuraa käsittely 10 uM JKA97 tai ajoneuvon vielä 24 tuntia. Toimittaja aktiivisuus normalisoitiin vastaavaksi Renilla lusiferaasireportterigeenin. Lusiferaasimääritys suoritettiin kolmena kappaleena. Tilastollinen merkittävyys määritettiin verrattiin kontrolli (* P 0,05).

JKA97 indusoi p21 transkriptio

Voit selvittää p21 säätelyä by JKA97 seurausta tuotannon mRNA transkriptiotasolla, kaikki kolme solulinjoja käsiteltiin erilaisilla pitoisuuksilla JKA97 24 tuntia, ja p21 mRNA: n ilmentymisen tasot määritettiin reaaliaikaisella PCR: llä. Muita semi-kvantifiointia RT-PCR käytettiin johdonmukaisuutta. Kuten kuviossa. 4B, ekspressio p21-mRNA: n määrä kasvoi JKA97 annoksesta riippuvalla tavalla.

havainnollistaa lisäksi, miten JKA97 vaikuttaa p21 transkription ihmisen täyspitkän p21-promoottori reportteri transfektoitiin kaikilla kolmella solulinjoissa, ja näitä soluja altistettiin sitten JKA97 (10 uM). Kuten on esitetty kuviossa. 4C lusiferaasiaktiivisuudet p21 reportteri oli merkittävä kasvoi 7,1-kertaiseksi, 13,4-kertaiseksi, ja 6,6-kertaisesti MCF7, MDA-MB-468, ja MCF7 p53KD soluja, tässä järjestyksessä.

Keskustelu

Aikaisemmat tutkimukset osoittavat, että JKA97 indusoiman apoptoosin paksusuolen ja maksasyövän soluissa p53-riippumatonta ja Bax-riippuvaisen reitin [10]. Muitakin mahdollisia mekanismeja ja yhdisteen mahdollisuudet hoitoon muiden syöpätyyppeihin ei ole vielä täysin selvitetty. Parhaan tietomme mukaan esillä oleva tutkimus on ensimmäinen, tutkia sekä

in vitro

ja

in vivo

antituumorivaikutuksia romaanin harmiini bentsylideeni analoginen ihmisen rintasyövän soluja. Tutkimuksessa tuodaan esiin useita tärkeitä seikkoja: 1) JKA97 merkittävästi estää rintasyövän solujen kasvua; 2) JKA97 indusoi solujen apoptoosia; 3) soluproliferaation inhibointi ja solusyklin etenemisen näyttävät olevan merkittäviä mekanismi, jonka avulla JKA97 kykenee sen syövän vaikutukset; 4) JKA97 ajan säätelee p21 ilmentymistä transkriptiotasolla sijasta posttranskriptionaalisella tasolla riippumaton p53; ja 5) JKA97 vähentää kasvua ihmisen rintasyövän ksenograftikasvaimissa hiirillä, annoksesta riippuvalla tavalla.

tulokset osoittivat, että oli olemassa merkittäviä eroja solujen eloonjäänti sen jälkeen, kun JKA97 hoidon, määritettynä MTT määritys, MDA-MB-468-solut on kaikkein herkin (Fig. 1 B). MTT-analyysi edustaa koko solujen eloonjäämistä, jotka voivat vaikuttaa useat tekijät, jotka sisältävät ainakin soluproliferaation apoptoosin, ja solusyklin etenemisen. Näin ollen, olemme edelleen määritetään vaikutuksia JKA97 soluproliferaatioon, apoptoosia, ja solusyklin jakautuminen. Käytimme BrdU määrittämiseksi solujen lisääntymisen indeksi. Vaikka oli annoksesta riippuvia vaikutuksia soluproliferaatioon kussakin testatussa solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa ei ollut merkittäviä eroja MCF7 (p53 WT), ja MDA-MB-468 (p53 mutantti) solujen, mikä osoittaa, että JKA97 vaikutukset soluproliferaatioon ovat p53-riippumattomia. Mielenkiintoista on, että p53 KD MCF-7-solut olivat herkempiä kuin muut kaksi solulinjaa (Fig. 1 C). Kuitenkin, MDA-MB-468-solujen on osoitettu olevan herkempiä apoptoosia (Fig. 1 D) ja solukierron jakelu määrityksessä (Fig. 1 E). Esimerkiksi suurimmalla annoksella käytetty (20 uM), MCF7 ja MCF7 p53 KD-solujen määrä nousi apoptoosin vastaavasti mutta MDA-MB-468-soluja herkempiä. Yhdessä meidän tulokset osoittavat, että apoptoosin induktio ja solukierron pysähtymisen ovat todennäköisimmin liittyvät eroihin solujen eloonjäämistä määrityksessä yksi kolmesta solulinjat. Yksityiskohtaiset mekanismit on selvitettävä, että tulevissa tutkimuksissa.

Tässä tutkimuksessa olemme myös osoittaneet, että JKA97 ollut merkittävää

in vivo

antituumorivaikutuksen kahdessa rintasyövän ksenograftimalleissa. Tällä 5 mg /kg annostaso, olemme havainneet samanlaisia ​​vastauksia hoidon välillä kaksi mallia. Koska käytimme eri suuremmilla annoksilla MCF7 ja MDA-MB-468-mallit, on vaikea verrata vastekäyrät. Annos käytetty MDA-MB-468 malli (10 mg /kg) oli alle puolet annoksesta MCF7 malli (25 mg /kg), mutta syntyy samanlainen kasvaimen kasvun estäminen hinnat. Spekuloida, että MDA-MB-468-solut ovat herkempiä. Ottaen huomioon, että on olemassa muita tekijöitä, jotka vaikuttavat

in vivo

vastauksena JKA97 hoitoon, emme voi tehdä varmoja johtopäätöksenä ero kahden mallin. Lisätutkimuksia tarvitaan osoittamaan nämä erot ja taustalla olevien mekanismien.

tukkiminen solusyklin etenemisen syöpäsoluissa pidetään yhtenä tehokkaimmista valvontaa varten kasvaimen kasvua [11]. Siirtyminen lepotilassa lepotilassa vaiheessa (G0) ja aktiivisesti kasvava tila on edellytys tuloa solusykliä useimmissa soluissa ja ratkaiseva askel syöpäsoluja. Solusyklin etenemistä moduloi sääntelyviranomaisten tunnetaan sykliiniriippuvaisen kinaasin (CDK) estäjät. Ensimmäinen näistä proteiineista voidaan tunnistaa ja kloonata on p21 [12] – [14]. P21-proteiini, universaali solusyklin estäjä, sitoutuu sykliini-CDK-komplekseja ja lisääntyvissä solun tuma-antigeenin, aiheuttaen siten solu- pysähtymisen G1 ja estää solujen pääsyä S-vaiheeseen. Kun tämä otetaan huomioon, tarkistimme suhteita G1 pidätyksen ja solusyklin liittyviä sääteleviä proteiineja kuten p53, p21, ja p27, kun lääkehoitoa. Tuloksemme paljasti, että JKA97 välittämää G1 pidätys rintasyövän soluissa liittyy p21 riippumatta p53 status (villin tyypin, mutantti tai knockdown). Ylös-säätely p21 ja p27-proteiineja edistää muodostumista komplekseja G1-S CDK ja sykliinejä estäen siten niiden toimintaa [15] – [17]. Tämän uskotaan olevan ensimmäinen raportti osoittaa mekanismi p53-riippumattoman G1 solusyklin pysähtymiseen aiheuttama JKA97 rintasyöpäsoluissa. Tutkimuksemme osoittivat lisäksi, että säätely ylöspäin p21 aiheuttamien JKA97 oli pääasiallisesti riippuvainen transkription mekanismia sen sijaan translaation jälkeistä muutos. Tulevaisuuden tutkimuksia olisi tarkastella vallitsevia järjestelmiä, jotka koskevat kuinka JKA97 ajan säätelee p21 transkriptio ja vaikuttaa loppupään polkuja.

Monet tutkijat ovat ehdottaneet, että solusyklin pysähtymiseen ja apoptoosiin voi liittyä. Molekyylit toimivat soluja G1 vaiheessa yleensä ajatella vaikuttavan apoptoosin; CDK-inhibiittorit on ehdotettu olevan välillisesti mukana apoptoosin säätelyn kautta CDK. p21, suuri CDK-estäjä, indusoi sekä p53-riippuvaisten ja riippumattomien mekanismien kautta seuraavasti stressiä [18]. Lisäksi on raportoitu, että yli-ilmentyminen p21 johtaa induktion Bax ja edistää apoptoosia [19]. Ottaen huomioon, että

Luo et al.

[10] ovat osoittaneet, että JKA97 voivat aiheuttaa apoptoosin paksusuolen syöpäsoluissa Bax-riippuvaisen mutta p53-riippumattomalla tavalla, lisätyötä tarvitaan korreloivan suhdetta solukierron pysähtymisen ja apoptoosin reitit säätelevät yhdiste.

havaintoja tässä tutkimuksessa edellyttäen järkevä todisteita käytöstä JKA97 kuin syöpälääkkeen ihmisen rintasyövän hoidossa. Tuloksemme otettuna yhdessä aiemmin tulokset tätä yhdistettä, osoittavat, että syövän vastainen aktiivisuus JKA97 liittyy erottamattomasti modulaatio p21. Lisätutkimukset joissa p21 järjestelmien puutteista vaadittaisiin täysin kuinka laaja osallistuminen tähän tärkeään proteiinia. Tämä tutkimus yhdessä aikaisempien raportoitu havaintoja [10], varmasti parantaa ymmärrystämme toimintamekanismit JKA97, joka muodostaa pohjan edelleen prekliininen ja kliininen arviointi yhdisteen uutena syöpälääkkeen.

Materiaalit ja menetelmät

testiyhdiste, kemikaalit ja reagenssit

testiyhdiste JKA97, metoksi-1-styryyli-9H-pyrido [3,4-b] indoli, syntetisoitiin ja puhdistettu, kuten aiemmin on raportoitu [10], ja sen rakenne varmistettiin UV, IR, MS, ja NMR-spektroskopia [10]. Puhtaus määritettiin testiyhdisteiden olevan suurempi kuin 95% HPLC: llä ja MS-analyyseillä. Kaikki kemikaalit ja liuottimet käytettiin analyyttistä laatua tai korkein arvosana käytettävissä. Soluviljely tarvikkeita, kuten elatusaineet, fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), naudan sikiön seerumia (FBS), natriumpyruvaattia, ei-välttämättömiä aminohappoja, ja penisilliini-streptomysiiniä saatiin Invitrogen (Carlsbad, CA). Vasta-aineita ihmisen p21 (C-19), p27 (C-19), sykliini D1 (DCS-6), sykliini E (HE12), ja E2F1 (KH95) olivat Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA) . Anti-humaani-p53-vasta-ainetta (Ab-6) oli EMD Chemicals, Inc. (Gibbstown, NJ). Anti-ihmisen β-aktiini-vasta-aine (T5168) oli Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

Solulinjat ja kulttuurin

Ihmisen rintasyöpä MCF7 ja MDA-MB-468 -solut saatiin American Type Culture Collection (Rockville, MD). MCF7 ja MDA-MB-468-soluja kasvatettiin MEM väliainetta, joka sisälsi 1 mM ei-välttämättömiä aminohappoja ja Earle: n BSS, 1 mM natriumpyruvaattia ja 10 mg /l naudan insuliini, ja DMEM /F-12 Ham media (DMEM /F- 12 01:01 seos). MCF7 p53KD soluja on synnytetty käyttäen edellä kuvatun menetelmän [20], [21] ja kasvatettiin samassa median MCF7-soluissa, mutta täydennetty 0,5 ug /ml puromysiiniä (Sigma, St. Louis, MO). Kaikki soluviljelyaine sisälsi 10% FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä, ellei toisin mainita.

Cell eloonläämismääritys

vaikutukset JKA97 ihmisen rinta- syöpäsolujen kasvua määritettiin käyttäen MTT- määritys ja ilmaistaan ​​prosentteina ohjaus solujen eloonjäämistä [22] – [25]. Soluja kasvatettiin 96-kuoppalevyillä, kylvö tiheydellä 4-5 x 10

3 solua per kuoppa, ja altistettiin eri pitoisuuksia koeyhdistettä (0-50 Im) 72 tuntia. 10 ui 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) liuosta (5 mg /ml; Sigma, St. Louis, MO) lisättiin sitten. Absorbanssi 570 nm: ssä rekisteröitiin käyttämällä Synergia Mx mikrolevylukijalla (BioTek, Winooski, VT). Solujen eloonjäämisprosentti (%) laskettiin jakamalla keskimääräinen OD yhdisteen sisältävien kaivojen, että Verrokkikuoppien.

proliferaatiomääritystä

vaikutukset JKA97 soluproliferaatioon määritettiin BrdUrd sisällyttäminen määrityksessä (Oncogene, La Jolla, CA), seuraten valmistajan protokollaa. Solut siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille (8 x 10

3-1,2 x 10

4 solua kuoppaa kohti) ja inkuboitiin eri pitoisuuksia JKA97 (0, 5, 10 ja 20, IM) 48 tunnin ajan. BrdUrd lisättiin elatusaineeseen 10 tuntia ennen kokeiden päättyessä. BrdUrd sisällytetään soluihin määritettiin anti-BrdUrd-vasta-aineen, ja absorbanssi mitattiin kahdella aallonpituudella ja 450/540 nm Synergia Mx mikrolevylukijalla (BioTek, Winooski, VT).

Detection of Apoptosis

Solut alussa ja loppuvaiheissa apoptoosin havaittiin käyttämällä anneksiini V-FITC apoptoosin havaitseminen pakki BioVision (Mountain View, CA). Lyhyesti, 4-5 x 10

5 solua kuoppaa kohti altistettiin koeyhdistettä (0, 5, 10 ja 20 uM) ja inkuboitiin 24 tuntia ennen analysointia. Solut kerättiin ja pestiin seerumittomassa alustassa, sitten suspendoitiin uudelleen 500 ul: aan anneksiini V: n sitoutumisen puskuria, minkä jälkeen lisättiin 5 ui anneksiini V-FITC ja 5 ui propidiumjodidia (PI). Näytteitä inkuboitiin pimeässä 5 minuuttia huoneen lämpötilassa ja analysoitiin FACSCaliber -virtaussytometriä (BD Biosciences, San Jose, CA).

Cell Cycle Mittaukset

vaikutusten määrittämiseksi JKA97 solusyklin jakautuminen, 4-5 x 10

5 solua kuoppaa kohti altistettiin yhdisteen (0, 5, 10, ja 20 im) ja inkuboitiin 24 tuntia ennen analysointia. Solut kerättiin ja kiinnitettiin 75% etanolilla 4 ° C: ssa yön yli, jonka jälkeen inkuboitiin RNaasi ja propidiumjodidilla (Sigma). DNA-pitoisuus määritettiin virtaussytometrialla kuten edellä.

Hiiri Vieraslajisiirteen Model of Human Breast Cancer

Eläinten käyttö ja hoito protokolla hyväksyi Institutional Animal käytön ja hoidon komitea Texas Tech University Health Sciences Center (IACUC # 10032, PHS Assurance # 3056-01, USDA rekisteröinti # 74-R-0050, REF # 039461). Naaras kateenkorvattomiin patogeenivapaita nude-hiiriin (nu /nu, 4-6 viikkoa) hankittiin Charies River Laboratories International, Inc. (Wilmington, MA). Perustaa MCF7 ihmisen rintasyöpään ksenografti kasvain malli, kukin naisten nude-hiirten ensin istutettiin 60 päivän ihonalainen hidas vapautuminen estrogeenia pelletti (SE-121, 1,7 mg 17β-estradiolia /pelletti) saatu Innovative Research of America (Sarasota , FL). Seuraavana päivänä, MCF-7-solut kerättiin yksikerrosviljelmiä pestiin kahdesti seerumittomalla alustalla, suspendoitiin uudelleen väliaineen, ja sitten injektoitiin s.c. (5 x 10

6 solua, kokonaistilavuus 0,2 ml) vasempaan imusolmukkeet alue hiirillä. Jotta MDA-MB-468 ksenograftimallissa, käytimme samaa menetelmää kuin yllä, mutta ilman estrogeenin pelletti. Kaikkia eläimiä tarkkailtiin toimintaa, fyysinen kunto, paino, ja kasvaimen kasvua. Kasvaimen koko määritettiin joka toinen päivä mittaharpilla kahden kohtisuoran halkaisijan implantin. Kasvaimen massa (g) laskettiin kaavalla, 1/2

×

b

2 jossa ”

” on pitkä halkaisija ja ”

b

”on lyhyt halkaisija (cm).

in vivo

kemoterapian kanssa JKA97

eläimiä, joilla on ihmisen syövän ksenograftikasvaimissa jaettiin satunnaisesti erilaisiksi hoitoryhmissä ja kontrolliryhmä (7-10 hiirtä /ryhmä). Ohjaus ryhmät molemmissa malleissa sai ajoneuvon vain. Sillä MCF7 ksenograftimallissa, JKA97 liuotettiin ajoneuvon, PEG400: etanoli: suolaliuos (57.1:14.3:28.6, v /v /v), ja annettiin i.p. injektio annoksina 5 ja 25 mg /kg /d, 5 päivää /viikko noin 3 viikkoa. Jotta MDA-MB-468 ksenograftimallissa, JKA97 annettiin i.p. injektio annoksina 5 ja 10 mg /kg /d, 5 päivää /viikko ja 6 viikkoa. Lopussa kokeiden, ksenograftikasvaimissa poistettiin, punnittiin, ja valokuvattiin kirjaa.

Western blot -analyysi

proteiinin tasot solulysaateista arvioitiin käyttäen Western blotting kuten aikaisemmin on kuvattu [20 ], [21]. Lyhyesti, solut altistettiin eri pitoisuuksia JKA97 24 tunnin ajan ja solu- lysaatit fraktioitiin identtiset määrät proteiinia SDS-PAGE. Proteiinit siirrettiin Bio-Rad trans-Blot nitroselluloosakalvoille (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), jotka inkuboitiin sitten estopuskuriin (Tris-puskuroitu suolaliuos, joka sisälsi 0,1% Tween 20 ja 5% rasvatonta maitoa) 1 tunnin ajan huonelämpötila. Sitten membraaneja inkuboitiin sopivan primaarisen vasta-aineita yli yön 4 ° C: ssa tai 2 tuntia huoneen lämpötilassa, samalla varovasti ravistellen. Membraanit pestiin huuhtelupuskurilla (Tris-puskuroitu suolaliuos, joka sisälsi 0,1% Tween 20), kolme kertaa 15 minuutin ajan ja sitten inkuboitiin vuohen anti-hiiri /-rabbit IgG-piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vasta-ainetta (Bio-Rad) 1 tunnin ajan huonelämpötila. Pesun jälkeen kolmesti, proteiinit kiinnostava havaittiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin reagenssit PerkinElmer LAS, Inc (Boston, MA).

RNA, ja semikvantitatiivinen ja reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin käyttämällä Trizol-reagenssia Invitrogen (Carlsbad, CA). Ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin 1 ug kokonais-RNA-uutetta käyttäen iScript cDNA-synteesin kit (Bio-Rad, Hercules, CA). Aluke sekvenssejä, joita käytetään geenien monistaminen olivat seuraavat: p21 eteenpäin, 5′-AGC AGC GGA ACA AGG AGT-3 ’, kääntää, 5′-TGG AGA AAC GGG AAC CAG-3′; GAPDH eteenpäin, 5’-GGA GTC CAC TGG CGT CTT CAC-3 ’, kääntää, 5′- GAG GCA TTG CTG ATG ATC TTG AGG-3’. Semikvantitatiivinen RT-PCR suoritettiin seoksella cDNA tuotteen, alukkeet, dNTP ja Taq DNA-polymeraasia (Invitrogen) käyttäen sykliä 95 ° C 30 s, 57 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 30 s, seurasi lopullinen pidentäminen 72 ° C: ssa 5 min. Reaaliaikainen PCR suoritettiin 40 sykliä, jotka koostuivat 95 ° C: ssa 20 s, 57 ° C: ssa 20 s ja 72 ° C: ssa 20 s käyttäen iQ5 laitteen (Bio-Rad, USA). Kaikki näytteet analysoitiin vertaileva kynnyssykli (C

T) menetelmällä ja normalisoitiin GAPDH mRNA ohjaus.

lusiferaasimäärityssysteamiä

Solut kotransfektoitiin täyspitkä ihmisen p21-promoottori vektorit jossa

Renilla

lusiferaasireportterista (sisäinen kontrolli, Promega, Madison, WI) 24 tunnin ajan, jonka jälkeen inkuboitiin JKA97 24 tuntia. Lusiferaasin aktiivisuus p21-promoottorin toimittaja määritettiin Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. P21 reportteriaktiivisuutta normalisoitiin vastaaviin

Renilla

lusiferaasireportterilla aktiivisuutta.

Tilastollinen analyysi

Tiedot eri hoitoryhmään esitetään keskiarvoina ± keskivirhe. Yksisuuntainen ANOVA seuraa S-N-K post hoc testiä käytettiin määrittämään merkitystä eroja hoitoryhmien ja valvontaa. Tulokset katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun P 0,05.

Kiitokset

Kiitämme Drs. X. Zhang, H. Xu, X. Zhang, L. Ao, E. Rayburn, ja D. Chen erinomaisen teknisen tuen ja pohdinnan auttamiseksi, ja herra S. Voruganti ja Ms S. Nag lukemiseen käsikirjoituksen.