Krooninen sairaus

tiivistelmä

Sen hypoteesin testaamiseksi, että samanaikainen kohdentaminen epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja transformoiva kasvutekijä-beeta (TGF-β) voi tarjota uusi terapeuttinen lähestymistapa haimasyövän, EGFR hiljentämiseltä RNA-interferenssi (shEGFR) yhdistettiin TGF-β sitominen liukoista TGF-β-reseptorin II (sTβRII). Vaikutukset pesäkkeiden muodostumista 3-ulotteinen kulttuuri, kasvainten muodostumista nude-hiirissä, ja loppupään signalointi seurattiin. Sekä ASPC-1 ja T3M4 soluja, joko shEGFR tai sTβRII inhiboi merkittävästi pesäkkeiden muodostumista. Kuitenkin ASPC-1-soluissa, jossa yhdistyvät shEGFR kanssa sTβRII pienentää pesäkkeiden muodostumisen tehokkaammin kuin kumpikaan lähestymistapa yksinään, kun taas T3M4 soluissa, shEGFR estoa pesäkemuodostuksen purettiin sTβRII. Vastaavasti,

in vivo

kasvua ASPC-1-johdettu kasvainten heikennetty joko shEGFR tai sTβRII, ja oli merkittävästi tukahdutti sekä vektorit. Sen sijaan T3M4 johdettu kasvaimia ei joko muodostaa tai olivat hyvin pieniä, kun EGFR yksin hiljennettiin, ja nämä vaikutukset palautettiin sTβRII lisääntyneen syöpäsolun lisääntymistä. Yhdistelmä shEGFR ja sTβRII laski fosfo-HER2, fosfo-HER3 phoshpo-ERK ja fosfo-src (Tyr416) ​​tasot ASPC-1-soluissa, mutta lisäsivät tasoja T3M4 soluissa. Lisäksi esto sekä EGFR ja HER2 mukaan lapatinibille tai src by SSKI-606, PP2, tai dasatinibi, esti sTβRII välittämää antagonismin pesäkkeenmuodostusta T3M4 soluissa. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että samanaikaisesti kohdistaminen EGFR, TGF-β, ja src voivat muodostaa uusia terapeuttisia lähestymistapaa PDAC joka estää haitallisia cross-talk välillä EGFR perheenjäsenten ja TGF-β-riippuvainen reittejä.

Citation: Deharvengt S, Marmarelis M, Korc M (2012) samanaikainen kohdentaminen EGF Receptor, TGF-beeta ja Src viittaa Novel terapeuttinen lähestymistapa on Haimasyöpä. PLoS ONE 7 (6): e39684. doi: 10,1371 /journal.pone.0039684

Editor: Hidayatullah G. Munshi, Northwestern University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 29 toukokuu 2012; Julkaistu: 27 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Deharvengt et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Cancer Institute (NCI) myöntää CA-R37-075059 (MK). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on neljänneksi suurin syy syöpään liittyvän kuolleisuuden Yhdysvalloissa, jossa on 5 vuoden pysyvyys 6% [1]. Nämä synkkä tilastot johtuvat, osittain pitkälle edennyt syöpä on esitys, alhainen resectability useita molekyyli- muutoksia, jotka edistävät haiman syöpäsolujen kasvua ja selviytymistä, merkitty chemoresistance, ja voimakas desmoplasia joka vaimentaa lääkeaineläpäisevyyden [2] – [5]. PDAC liittyy korkean taajuuden mutaatioiden K

ras

onkogeenin (95%), ja p16 (85%), p53: n (75%) ja Smad4 (55%) tuumorisuppressorigeeneille [4 ]. Lisäksi, kun p16-geeni ei ole mutatoitunut, on epigeneettiseltä vaimennettu [6]. On myös kohonnut ilmentyminen epidermaalisen kasvutekijän (EGF) reseptori (EGFR), muut tyrosiinikinaasin reseptorit ja niiden ligandit, ja transformoiva kasvutekijä beeta (TGF-β) isoformien [7]. EGFR välittää solu-autonominen mitogeenisesta ja motogenic signalointikaskadien aktivoimalla monipuolisia polkuja, mukaan lukien mitogeeni aktivoitua proteiinikinaasi (MAPK), p38 MAPK, ja kesäkuu kinaasin (JNK), kun taas TGF-β aktivoi Smad riippuvia ja riippumattaman signalointi ja uskotaan käyttää parakriinisiä vaikutuksia solujen kasvaimen mircroenvironment in PDAC [8] – [10].

Liiallinen EGFR aktivointi ja huonosti signaloinnin TGF-β-reseptorin (TβR) -riippuvaista reittejä, kuten havaittiin PDAC, luo useita poikkeava autokriinisiä ja parakriinisiä vuorovaikutukset syöpäsoluja ja kasvaimen mikroympäristössä, jotka edistävät kasvaimen desmoplasia ja jotka voivat leikkaavat tai toisella kymmenkunta signa-, jotka ovat osallisina useimpien PDACs [5], [11]. Ikävä kohdistaminen EGFR vain hieman pidentää selviytymisen sairastavien potilaiden PDAC, ja vasta kun sitä annetaan yhdessä gemsitabiinin [12], kun taas anti-TGF-β hoitoja PDAC parhaillaan kehitetään ja testataan prekliinisissä tutkimuksissa [13] – [15].

äskettäin perustetun 3-ulotteinen kulttuuri järjestelmä, jossa solut on upotettu Matrigel, joka koostuu 3%: kollageeni IV /laminiinilla rikastetun hyytelömäinen keskipitkällä ja sijoitettu yli jähmettynyt kerros pehmeää agaria [16] . Olemme todenneet, että samanaikainen hoito TGF-β1 ja EGF parannettu kasvua tällä 3-D malli järjestelmä suuremmassa määrin kuin joko kasvutekijän yksin, ja antoivat lisääntynyt chemoresistance sytotoksisille yhdisteiden [16]. Lisäksi farmakologinen esto TβRI kanssa SB431542 tai EGFR erlotinibin parannettu tehoa gemsitabiinin ja sisplatiinin ihmisen haimasyövän soluja ja primaarisissa soluviljelmissä perustetaan haimasta geenitekniikalla hiiri malleja PDAC [16], mikä korostaa hyödyllisyyttä 3 -D kulttuuri järjestelmä tehokkuuden testaamiseksi terapeuttisten aineiden kanssa.

Koska tärkeyden EGFR ja TGF-β in PDAC, pyrimme testaamaan hypoteesia, jonka kohteena sekä reitit voivat käyttää hyödyllisiä kasvua heikentävän vaikutuksia, ovat suurempia kuin tukahduttaa jommankumman reaktiosarjan yksin. Koska pienmolekyylisalpaajien jotka kohdistuvat EGFR ja TβRI voivat käyttää epäspesifisiä vaikutuksia ja /tai ne voivat kohdistaa läheisesti liittyvien kinaasien, käytimme tarkempi lähestymistapa koostuu vaiennettu strategia tukahduttaa EGFR ja liukoisen TβRII strategia sekvesteroimaan TGF-β ligandien . Nyt raportoivat, että samanaikaisesti tukahduttaminen molempien reittien heikennettyä pesäkkeiden muodostumista ASPC-1 ihmisen haimasyövän soluja kasvatettiin 3-D kulttuuri ja kasvaimen kasvu

in vivo

, mutta kohdistaminen TGF-β päinvastaiseksi kasvua estäviä vaikutuksia kohdistuu by EGFR hiljentämisen T3M4 ihmisen haimasyövän soluja, ja tämä kääntyminen tapahtui yhdessä src aktivoinnin kuten heijastuu kasvaneena src fosforylaatio tyrosiini 419.

tulokset

vaikutukset EGFR knockdown ja sTβRII Ilmaisu pesäkkeenmuodostus

Ihmisen haimasyövän solulinjoissa ilmaista transformoivan kasvutekijä alfan (TGF-α) ja muut kasvutekijät, jotka aktivoivat EGFR [17] – [19], samoin kuin kaikki kolme TGF-p: aa, [20]. Sen määrittämiseksi, onko kumotaan EGFR: n ja TGF-β signalointi moduloitua kasvua tällaisten solulinjojen, ASPC-1 ja T3M4 solut co-infektoitiin m.o.i. 10 kullekin virus shRNA-lentivirukselle kohdistaminen Luciferase (shLuc-LV pWPT-GFP), EGFR (shEGFR-LV pWPT-GFP), sTβRII (hLuc-LV pWPT-sTβRII), tai molempia EGFR ja sTβRII (shEGFR -LV kanssa pWPT-sTβRII). shEGFR-LV tehokkaasti tukahdutetaan EGFR tasoilla, kun taas pWPT-sTβRII ilmentyminen liittyi läsnäolo runsaita tasoja sTβRII proteiinin keskipitkällä kaikissa neljässä solulinjoissa (Fig. 1A).

(A) ASPC-1 ja T3M4 ihmisen haimasyövän soluja infektoitiin shLuc-LV (shLuc), shEGFR-LV (shEGFR), WPT-sTβRII (sTβRII), tai molemmat shEGFR ja sTβRII. Solulysaateista ja elatusainetta alistettiin sitten immunoblottauksella anti-EGFR ja anti-HA-tag-vasta-aineita, vastaavasti, jälkimmäinen palvelevat vahvistaa sTβRII vapautumista syöpäsolut. Anti-ERK-vasta tarjoillaan arvioida kaista lastaus. (B) seuraukset EGFR hiljentämiselle shEGFR ja TGF-β sitomista kanssa sTβRII arvioitiin seuraamalla pesäkkeiden muodostumista 3-D kulttuuri (B). Tiedot ovat keskiarvoja ± SE kolminkertaisten määritysten kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** p 0,01 verrattuna vastaaviin kontrolleihin.

seuraukset EGFR hiljentämisen ja TGF-β sitomista arvioitiin seuraavaksi tarkkailemalla pesäkkeen muodostumista 3-D dosviljelmämäärityksessä jossa Matrigel tarjoaa acellular rakennustelineet ja pehmeä agar tukee ankkurista riippumaton kasvu [16]. Päätimme käyttää tätä 3D-malli järjestelmä, sillä olemme aiemmin osoittaneet, että samanaikainen hoito TGF-β1 ja EGF tässä mallissa parannettu kasvun suuremmassa määrin kuin joko kasvutekijän yksinään [16], mikä pääpiirteittäin TGF-β: n kasvain edistävät vaikutukset aiemmin osoittanut vierassiirrekokeissa ja potilaalle tehdä hiiri malleja PDAC [13] – [14]. Pesäkkeenmuodostusta kanssa ASPC-1-soluissa tartunnan pWPT-sTβRII tai shEGFR-LV väheni 21% (p 0,05) ja 33% (p 0,01), tässä järjestyksessä, kun taas infektio sekä shEGFR-LV ja pWPT-sTβRII johti 56% (p 0,01) vähenee pesäkeluvussa verrattuna shLuc ilmentävien ASPC-1-solut (Fig. 1 B). Sen sijaan sen jälkeen, kun infektio shEGFR-LV, pesäkemuodostusta T3M4 solujen väheni 45% (p 0,05), kun taas pWPT-sTβRII heikennetty pesäkkeenmuodostusta T3M4 soluissa 27% (p 0,05). Kuitenkin pWPT-sTβRII täysin päinvastainen estävää toimia shEGFR-LV kolonioiden muodostumista (Kuva. 1 B). Siten ASPC-1-solut osoittivat synergistisiä inhiboivia vaikutuksia pesäkkeiden muodostumisen, kun tartunnan sekä shEGFR-LV ja pWPT-sTβRII, kun taas T3M4 soluissa oli paradoksaalista muuttumista pWPT-sTβRII estävä toimien shEGFR-LV.

Voit selvittää muita haimasyövän solun vuorattu joka käyttäytyy kuin T3M4 soluja, me seuraavaksi suoritetaan pesäkkeitä muodostava määrityksessä yksityiskohtaisesti COLO-357 ja PANC-1 haima- syöpäsoluja (Fig. S1). COLO-357-solut olivat vain kasvu estyy vastauksena samanaikaisen EGFR Knockdown ja sTβRII ilme. Sitä vastoin PANC-1-solut kasvua inhiboidaan EGFR pudotus, mutta esillä käänteinen tämän estävää vaikutusta, kun läsnä on sTβRII (Fig. S1).

In Vivo Effects of EGFR pudotus ja sTβRII Expression

vieressä tutkinut seurauksia EGFR hiljentämisen ja sTβRII ilmaisun ihonalaisen nude hiiren kasvain malli, onko paradoksaalinen kääntyminen EGFR hiljentämisen havaittiin 3-D

in vitro

mallissa ilmeni

in vivo

. Verrattuna kasvaimia tuottamat ASPC-1-soluissa tartunnan shLuc-LV, kasvainten 24. päivänä pieneni 36% (p 0,05) kanssa shEGFR-LV, 38% (p 0,05) kanssa pWPT-sTβRII, ja 85% (p 0,01) sekä vektoreita (Fig. 2A). Lisäksi 2 8 hiiriä, joihin injektoitiin pWPT-sTβRII ilmentävien ASPC-1-solut olivat kasvaimettomia. Dramaattisesti, 4 8 hiiriä, joihin injektoitiin ASPC-1-solut ilmensivät sekä pWPT-sTβRII ja shEGFR-LV oli kasvain-free päivänä 24, ja jäljellä oleva 4 kasvaimia vain tuli näkyviin 21 päivää injektion jälkeen syöpäsoluja. Kun kyseessä on T3M4 johdettu kasvainten, kokeet lopetettiin 16. päivänä, koska nopea kasvaimen kasvua kaksi neljästä ryhmästä. Tänä ajankohtana, kasvaimen tilavuus väheni 37% (p 0,05) infektoidut solut pWPT-sTβRII ja 97% (p 0,01) ja shEGFR-LV-infektoituneissa soluissa (kuvio. 2B). Sitä vastoin, T3M4 infektoidut solut sekä pWPT-sTβRII ja shEGFR-LV muodostettu suuria kasvaimia, joista jokainen osoitti alueet kuolion (Fig. 2B).

ASPC-1 (A) ja T3M4 soluissa (B) infektoitiin shLuc-LV (shLuc), shEGFR-LV (shEGFR), sTβRII tai molemmat EGFR-LV ja sTβRII, ja injektoidaan subkutaanisesti (yksi injektio per hiiri) kylkeen alueelle nude-hiirten. Kasvaintilavuudet seurattiin ilmoitettu päivien. Arvot ovat keskiarvoja ± SEM 8 hiirtä ryhmää kohden, ilmoitetaan nimittäjä oikealle kunkin käyrän. Useita kasvaimia, jotka on muodostettu kussakin ryhmässä on esitetty osoittajassa. * P 0,05, ja ** p 0,01 verrattuna vastaaviin kontrolleihin.

Kasvaimet, jotka johtuvat joko ASPC-1 tai T3M4 solut osoittivat runsas Ki-67 immunoreaktiivisuus ja pesäkkeitä CD-31- positiivinen endoteelisolujen (Fig. 3A). In ASPC-1-johdettu kasvainten, ilmentyminen pWPT-sTβRII ei muuttanut proliferaatiota, kun taas ekspressio shEGFR-LV liittyi 60% (p 0,05) lasku sekä Ki-67 ja CD31 immunoreaktiivisuus, ja ilmaisun sekä vektorit aiheutti edelleen vähentynyt Ki-67 (72%, p 0,01) ja CD31 (76%, p 0,01) immunoreaktiivisuus (Fig. 3A). Vuonna T3M4 soluissa, ilmentyminen pWPT-sTβRII liittyi vähentynyt proliferaatio (40%, p 0,01) ja angiogeneesiä (77%, p 0,01), ilmentyminen shEGFR-LV ei merkittävästi muuttanut proliferaatiota mutta huomattavasti vähentynyt CD31 immunoreaktiivisuus (71 %, p 0,01), kun taas ilmaus molempien vektorien merkittävästi lisääntynyt syövän solujen lisääntymistä (196%, p 0,01) huolimatta jatkuvasti vähennys (85%, p 0,01) CD31 immunoreaktiivisuus (Fig. 3A).

. ASPC-1- ja T3M4 johdettu kasvaimia on kuvattu kuvassa 2, immunovärjättiin Ki67 arvioida leviämisen ja CD31 arvioida angiogeneesiä. B. Samat kasvaimia pisteytettiin TUNEL-poisitive solujen ja halkaistut PARP immunoreaktiivisuus arvioida apoptoosin. Tiedot ovat keskiarvo ± keskiarvon keskivirhe kolminkertaisten määritysten kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ja ** p 0,01 verrattuna vastaaviin kontrolleihin.

Koska läsnä alueiden nekroosin T3M4 ilmentävien kasvainten sekä pWPT-sTβRII ja shEGFR-LV, se oli tärkeää välttää vääriä tuloksia, jotka voi esiintyä alueilla, jotka valmistautuvat kuolion. Näin ollen sekä TUNEL-määritys ja pilkotaan PARP immunovärjäys suoritettiin seuraava arvioimiseksi apoptoosia, sekä menetelmiä saadaan yleisesti yhtäpitävät tulokset (Fig. 3B). Siten pWPT-sTβRII ei merkittävästi muuttanut solujen prosenttiosuutta apoptoosin joko ASPC-1 tai T3M4-drived kasvaimia, kun taas shEGFR-LV-ilmentyminen liittyy huomattavasti enemmän apoptoosia ASPC-1-soluja (p 0,01), mutta ei T3M4 soluissa. Lisäksi ASPC-1-johdettu kasvaimia, pWPT-sTβRII ei muuttanut shEGFR-LV-liittyvän apoptoosin, mutta T3M4 johdettu kasvaimia se liittyi parannettu apoptoosin (Fig. 3B).

Effects of EGFR knockdown ja sTβRII Ilmaisu fosforyloitumisaste EGFR perheenjäsenet

EGFR, HER2 ja HER3- ovat kaikki sekaantuneet patobiologian on PDAC [7], [21] – [23]. Koska EGFR muodostaa heterodimeerejä HER2 ja HER3 oli tärkeää selvittää sen hiljentäminen voi moduloida signalointi näiden EGFR perheenjäseniä. Näin ollen, ASPC-1 ja T3M4 solulysaatit altistettiin immunoblottaus arvioida tasot fosfo-HER2, ja fosfo-HER3- (Fig. 4A). Densitomet- tietojen analysointi kolmen kokeet osoittivat, että pWPT-sTβRII ilmentymisen ASPC-1-soluissa indusoi 17% ja 20% lasku fosfori-HER2 ja fosfo-HER3- tasoilla, vastaavasti (p 0,05), kun taas EGFR knockdown indusoi 61% vähennys fosfo-HER2 tasot (p 0,01) ja 30% lasku fosfo-HER3- (p 0,01) tasoja. ASPC-1-solut ilmensivät sekä shEGFR-LV ja pWPT-sTβRII osoitti samanlaista laskua fosfori-HER2 tasoa (52%, p 0,01), mutta hieman lausutaan lasku fosfo-HER3- tasoa (56%, p 0,01). Sen sijaan T3M4 soluissa, pWPT-sTβRII ei muuttanut fosfo-HER2 tai fosfo-HER3- tasoilla, kun taas EGFR knockdown liittyi kohonneeseen molempien fosfo-reseptorien (Fig. 4A). Kolmessa kokeessa, oli 60%: n nousu fosfo-HER2 ja fosfo-HER3- tasot T3M4 soluissa EGFR pudotus, ja 100% ja 80% nousu fosfo-HER2 ja fosfo-HER3- tasoilla, vastaavasti, soluissa, jotka ilmentävät sekä vektoreita .

(A) vaikutukset reseptorin fosforylaation. ASPC-1 ja T3M4 solut infektoitiin kuten on osoitettu shLuc-LV (shLuc), shEGFR-LV (shEGFR), WPT-sTβRII (sTβRII), tai molempia shEGFR ja sTβRII. Solulysaatit altistettiin immunoblottaus vasta-aineita vastaan, osoitti reseptorit ja fosfo-reseptoreihin. (B) Soluja infektoitiin kuten A, ja solulysaatit altistettiin immunoblottaus vasta-aineita vastaan ​​suunnattuja merkitty proteiinit ja fosfo-proteiineja. Kukin paneeli esittää tietoja edustavasta ainakin kahden itsenäisen kokeen. Sekä paneelit A ja B, immnoblotting anti-ERK-vasta vahvistettu vastaava kaistaa lastaus, mutta eivät kaikki ERK blotit näkyvät.

Voit selvittää, HER2 ja HER3- fosforylaatio oli myös moduloitujen

vuonna vivo

in T3M4 soluissa, kasvaimissa, jotka ovat peräisin näistä soluista arvioitiin immunohistochemsitry (Fig. S2). Kohtalainen fosfo-HER2-immunoreaktiivisuus oli ilmeistä kasvaimissa infektoitujen solujen shLuc, ja shEGFR-LV, joka väheni tuumoreissa tartunnan pWPT-sTβRII, mutta kasvoi ilmentävien kasvainten sekä vektoreita. Sen sijaan, fosfo- HER3 immunoreaktiivisuus oli alhainen kasvaimia shLuc-tartunnan T3M4 soluissa, hieman lisääntynyt pWPT-sTβRII ilmentävien kasvainten, kohtalaisesti lisääntynyt shEGFR-LV-ilmentäviä kasvaimia, ja huomattavasti lisääntynyt ilmentävien kasvainten sekä vektorit (Fig. S2 ). Siten sekä HER2 ja HER3- ovat poikkeavasti aktivoidaan

in vivo

vuonna T3M4 soluissa, kun sekä EGFR ja TGF-β reittejä on suunnattu.

Vaikutukset EGFR Knockdown ja sTβRII Expression loppupään Signaling

ERK, src, ja AKT ovat mitogeenisesta ja pro-selviytymisen indikointimoduulien jotka ovat alavirtaan EGFR perheenjäseniä ja jotka edistävät PDAC etenemiseen [12], [24]. Siksi ASPC-1 ja T3M4 solulysaatit altistettiin immunoblottauksella vaikutusten arvioimiseksi EGFR Knockdown ja sTβRII ilme näistä reiteistä (Fig. 4B). In ASPC-1-solut, shEGFR-LV, pWPT-sTβRII, ja niiden yhdistelmä liittyi heikennettyjä fosfo-ERK tasolla, mutta vain yhdistelmän laski fosfo-AKT tasot mikään näistä transfektion olosuhteissa indusoi de-fosforylaatiota Src (Tyr527 ), joka olisi heijastaa src aktivointi (Fig. 4B). Sen sijaan T3M4 soluissa, shEGFR-LV yksin tai yhdessä pWPT-sTβRII lisännyt fosfori-ERK ja laski fosfo-src (Tyr527) tasot, eikä se edellytä muutoksia fosfo-AKT tasot (Fig. 4B).

vahvista, että yhdistelmä shEGFR-LV ja pWPT-sTβRII aktivoitu src in T3M4 soluissa, lysaatit myös alistettiin fosfo-kinaasi-vasta array. EGFR hiljentäminen johti estämällä fosforylaation src (Tyr419), Fyn, Hck, Lyn, Yes ja FGR, joka oli erityisen selvää suhteen src (Fig. 5). Sitä vastoin ilmaus sTβRII esti fosforylaatiota Lyn Kyllä, ja FGR muuttamatta src, Fyn tai Hck fosforylaatiota (kuvio. 5). Kuitenkin estäviä vaikutuksia shEGFR-LV kaikista 6 kinaasit täysin päinvastaiseksi sTβRII (Fig. 5), mikä osoittaa, että ilmentyminen sTβRII uudelleen src-perheen kinaaseja.

T3M4 solut infektoitiin shLuc-LV (shLuc ), shEGFR-LV (shEGFR), ja /tai WPT-sTβRII (sTβRII) kuten on osoitettu. Solulysaatit analysoitiin kanssa fosfo-kinaasi-vasta-aine array arvioida fosforylaation tilan ilmoitettu src perheenjäseniä. Tulokset määrällisesti Menetelmät kuvatulla tavalla. Tiedot ovat keskiarvo ± keskiarvon keskivirhe kolminkertaisten määritysten kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** p 0,01 ja *** p 0,001 verrokkiin verrattuna.

Vaikutukset HER2 hiljentäminen ja src estoa Colony Formation T3M4 Solut

Me vieressä pyrittiin arvioimaan, millainen HER2 välittämisessä vahingollisia vaikutuksia samanaikaisesti kohdistaminen EGFR ja TGF-β. Kuten odotettua, shEGFR-LV merkittävästi tukahdutti EGFR tasoja T3M4 soluissa, shHER2-LV merkittävästi tukahdutetaan HER2 tasoilla, kun taas infektio molemmilla vektoreilla tukkinut ilmentymistä sekä EGFR ja HER2 (Fig. S3). Lisäksi T3M4 solut, jotka ilmentävät joko shEGFR-LV tai shHER2-LV osoittivat merkittävää vähenemistä pesäkkeiden numerot 3-D-määritys (Fig. 6A). Kun kyseessä on shEGFR-LV, mutta ei shHER2-LV tai shEGFR-LV yhdessä shHER2-LV, tämä vaikutus purettiin pWPT-sTβRII (Fig. 6A). Siten samanaikainen infektio shEGFR-LV ja shHER2-LV merkittävästi esti pesäkekasvun (66%, p 0,01). Samoin lapatinibi (1 uM), dual tyrosiinikinaasiestäjä joka keskeyttää HER2 ja EGFR signalointireitteihin, vähennetään pesäkkeiden lukumäärä 47% (p 0,01) ja esti kääntyminen havaittu seuraavat koinfektointi shEGFR-LV ja pWPT-sTβRII ( kuva 6).

. HER2 hiljentäminen ja esto. T3M4 solut infektoitiin shLuc-LV (shLuc), shEGFR-LV (shEGFR), shHER2-LV (shHER2), tai molemmat shEGFR ja shHER2 puuttuessa tai läsnä WPT-sTβRII (sTβRII) tai 1 uM lapatinip. Colony muodostumista seurattiin 3-D kulttuuri. Tiedot ovat keskiarvo ± keskiarvon keskivirhe kolminkertaisten määritysten kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ja ** p 0,01, verrokkiin verrattuna. B. Vaikutukset c-Src esto. T3M4 Soluja inkuboitiin puuttuessa tai läsnä src estäjät SKI-606 (1 uM), PP2 (1 uM) ja dasatinib (100 nM), ja vaikutus pesäkkeen muodostumista 3-D-kulttuuri määritettiin. Tiedot ovat keskiarvoja ± SE kolminkertaisten määritysten kolmesta itsenäisestä kokeesta. * P 0,05, ** p 0,01 verrattuna vastaaviin kontrolleihin.

Koska ylössäätöä fosfo-src (Tyr419) ja defosforyloitumista Src (Tyr527), jonka yhdistelmä shEGFR-LV ja pWPT-sTβRII in T3M4 soluissa, pyrimme määrittämään, onko haitallisia vaikutuksia tämän yhdistelmän voisi välittää aktivoitua src. Siksi vaikutukset kolme erillistä src estäjien kolonioiden muodostumista 3-D kulttuuri tutkittiin seuraavaksi. Vain dasatinib (100 nM) esti merkitsevästi kasvua T3M4 infektoitujen solujen shLuc-LV (Fig. 6B). Kuitenkin SKI-606 (1 uM), PP2 (1 uM), ja dasatinibi (100 nM) esti täydellisesti pWPT-sTβRII-välitteisen käänteinen shEGFR-LV aiheuttama kasvun esto (Fig. 6B), mikä osoittaa, että tämä vaikutus oli riippuvainen src kinaasiaktiivisuutta.

keskustelu

jäsenet EGF-perheen, kuten TGF-α, hepariinia sitovat EGF: n kaltainen kasvutekijä (HB-EGF), beetaselluliinilla, ja amfireguliini, ovat ilmaisi korkeilla tasoilla PDAC ja toimimaan syöpäsolujen PDAC ja viereisen peruskudoselementeistä [7]. EGFR aktivoituminen näiden ligandien käynnistää useita signalointikaskadien, kuten Ras /Raf /MAPK ja Rac /JNK /MAPK-p38 [24]. EGFR hetero- muiden jäsenten kanssa EGFR-perheen johtaa aktivointi muiden signalointireittien, jotka sisältävät Src, Raf1, B-Raf, Crk, ja Nck, joka edistää kasvaimen etenemisen ja biologisten aggressiivisuus [25]. EGFR rajat puhua useita reittejä on parantaa tiheä Kras ja Smad4 mutaatioita, sekä runsaasti TGF-β joka muuttaa soluväliaineen tavalla, joka edistää syöpäsolujen kasvua, indusoi poikkeavaan epiteelin mesenkyymisoluyhteisviljelmissä vuorovaikutusta, tehostaa angiogeneesiä, ja edistää etäpesäkkeiden [4] – [7], [10], [13] – [14], [26] – [27]. Lisäksi TGF-β synergiassa EGF edistää proliferaatiota 3-D kulttuuri [16]. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että poikkeava EGFR ja TGF-β-riippuvaiset signalointireittien ovat keskeinen edistämisessä haimasyövän etenemiseen ja voi edustaa ratkaisevaa terapeuttisia kohteita PDAC.

Tässä tutkimuksessa osoitimme, että lentiviraalinen perustuva hiljentäminen EGFR tehokkaasti vaimennettu sen pro-mitogeenisestä toimia 3 4 haimasyövän solulinjoissa, ja että lentivirus- perustuva sitomisen TGF-β myös heikennettyjä lisääntymistä 3-D kulttuurin samat kolme solulinjat. Kuitenkin ASPC-1 ja COLO-357-solut, samanaikaisesti hiljentäminen EGFR ja metalleja sitovia TGF-β johti tehostetun kasvun hidastuminen, kun taas T3M4 ja PANC-1-soluissa oli lähes täydellinen käänteinen kasvua tukahduttava vaikutus EGFR alassäätöä . Tavanomaisissa kudosviljelyolosuhteissa, ASPC-1 ja T3M4 solut ovat resistenttejä TGF-β-välitteisen kasvun inhibitiota, kun taas COLO-357 ja PANC-1-solut ovat kasvua inhiboivat TGF-β [19], [28]. Siten havaittiin paradoksaalinen kääntyminen ei voida katsoa johtuvan eroista kasvua estävää reagointikykyä syöpäsoluja. Sen sijaan T3M4 soluissa, tämä kääntyminen johtuu osittain ylös-säätely fosfo-HER2 ja fosfo-HER3- aikaansaamaa EGFR downregulation ja parannettu läsnä ollessa sTβRII. Suostumuksella tämän päätelmän, kasvua estäviä vaikutuksia aiheuttama hiljentäminen HER2 tai molemmat EGFR ja HER2 ei kumota sTβRII. Samoin lapatinibi, mikä estää sekä EGFR ja HER2 kinaasiaktiivisuudet, esti myös kasvua T3M4 solujen ja tämä vaikutus oli resistentti sTβRII välittämää kääntyminen. ERK voidaan aktivoida useita ylävirtaan signaaleja, ja lisääntynyt HER2 /3 fosforylaation T3M4 soluissa liittyi tässä tutkimuksessa lisääntynyt ERK-fosforylaation, mikä osoittaa, että HER2 /3 alavirran signalointia myös silloin.

Useat riviä todisteet viittaavat siihen, että src aktivaatio välittämä TGF-β sitomiseen on erittäin tärkeää myös kääntyminen ilmiö. Ensinnäkin src esto EGFR hiljentäminen oli täysin päinvastaiseksi TGF-β sitomiseen. Toinen, EGFR Signaling tiedetään aktivoida src [29], ja src aktivointi tiedetään aiheuttavan vapauttamista esiasteiden EGF-kaltaisen ligandit [6] ja vaimentaa EGF sisäistämisen [29], [30]. Nämä mekanismit voivat edistää EGFR hetero- HER2 ja HER3 siten edistämään solusignaalivälitysteitä. Kolmanneksi sTβRII nostivat src fosforylaatio tyrosiinitähteellä 419 T3M4, ja fosforylaatio tällä sivustolla korreloi lisääntyneeseen src aktiivisuutta. Lisäksi sTβRII ei muuttanut fosforylaatiota Src (Tyr527) in ASPC-1-soluissa, mutta laski sen fosforylaation T3M4 soluissa puuttuessa ja läsnä shEGFR, jossa vahvistetaan, että src oltiin aktivoidaan T3M4 soluissa sTβRII. Neljänneksi, kolme src estäjät, SKI-606, PP2, ja dasatinibi esti TβRII-välitteistä käänteinen kasvun inhibition.

Olemme aikaisemmin todenneet, että lisäämällä puhdistettua sTβRII proteiinin väliaineen näiden solujen myös hiilinieluna TGF-β ja estää TGF-β toimia

in vitro

(julkaisemattomia havaintoja). TGF-β sitoutuu tyypin II TGF-β-reseptorin (TβRII) homodimeeri, joka sitten muodostaa hetero- kompleksin TβRI homodimeeri, joka johtaa aktivaatioon TβRI seriini-treoniinikinaasiaktiivisuutta [9]. Tämä aktivointi aloittaa signalointikaskadin, joka sisältää fosforylaatio reseptori-säännelty Smad: ien (R-Smad: ien), Smad2 ja Smad3, niiden C-terminaalisen SSXS aihe, niiden myöhempää oligomerointia yhteisen välittäjän Smad4, ja translokaation kompleksin tumaan jossa geenien transkription säätelystä suoritetaan sitten [9], [31]. TβRII voidaan myös fosforyloitiin tyrosiinitähde 284 johtaa aktivoinnin vaihtoehtoisia reittejä, kuten p38 MAPK [32]. Vaikka src aktivointi tapahtuu usein alavirtaan tyrosiinikinaasireseptorit, TGF-β voi myös lisätä src aktiivisuutta, mutta ohimenevä tavalla [33]. Kuitenkin, TGF-β toimii myös indusoida src hajoaminen [34]. On mahdollista, siksi, että TGF-β sitominen T3M4 solut voivat estää syöpäsolujen johdettu TGF-β kannustamasta src hajoaminen ja /tai inaktivaation.

arvioimiseksi biologista merkitystä näiden

in vitro

havaintojen käytimme ihonalaisen nude-hiirimallissa, joka mahdollistaa toistettavan arvioinnin

in vivo

biologista merkitystä signalointi polkuja, jotka ovat muuttuneet

in vitro

. Täten suhteen ASPC-1-soluissa, joko EGFR alassäätö tai TGF-β sitomisen aiheutti merkittäviä (36 38%) pienenee kasvaimen tilavuus, jossa vielä laskua 85%, kun molempia lähestymistapoja yhdistettiin. Näyttävästi, kasvaimet eivät muodostua 2 8 injektoidut hiiret ASPC-1 soluja, jotka ilmentävät pWPT-sTβRII ja 4 8 hiirestä ilmensivät sekä pWPT-sTβRII ja shEGFR-LV. Lisäksi oli selvästi viive ulkonäön 4 kasvaimia, jotka johtuvat soluista, jotka ilmentävät sekä pWPT-sTβRII ja shEGFR-LV, jotka kaikki osoittivat suuresti vähentynyt proliferaatio ja angiogeneesi, ja lisääntynyttä apoptoosia. Nämä havainnot tukevat strategioita, TGF-β in PDAC [13], [14], [35], ja ovat yhdenmukaisia ​​havaintoon, että on olemassa vahva EGFR

in situ

hybridisaatiosignaaliin kasvaimen verisuonistossa PDAC ihmisellä [36] ja ehdotetun rooleihin EGFR kasvaimen angiogeneesiä. Kohdistetussa TGF-p ligandivaihdolla sitominen tai TβRI kinaasin eston vaimentaa haiman kasvainten kasvua ja etäpesäkkeiden hiirimalleissa [13] – [15], meidän havainnot osoittavat, että tietyissä tapauksissa, kohteena sekä EGFR ja TGF-β-riippuvainen reittejä voi käyttää synergistisiä inhiboivia vaikutuksia PDAC leviämisen ja angiogeneesiin.

T3M4 johdettu kasvaimia, TGF-β sitomiseen johti 37%: n lasku kasvaimen tilavuuden ja vähentynyt proliferaatio ja angiogeneesi, kun taas EGFR alassäätöä johti joko jättäminen muodostaa kasvaimia tai muodostumista erittäin pieniä kasvaimia ja vaimensi merkittävästi angiogeneesiä. Siten T3M4 solut ovat erittäin riippuvaisia ​​EGFR kasvaimen aloittamista, etenemistä ja angiogeneesi

in vivo

, ja tämä hieno riippuvuus EGFR on sopusoinnussa EGFR välittämää mitogeneesi sekä sen roolia angiogeneesistä riippuvaisten onkogeeni riippuvuus [37], [38]. Nämä dramaattiset vaikutukset palautettiin sTβRII joka palauttaa proliferaatiota mutta eivät muuttaneet angiogeneesiä tai apoptoosin, joten suuria kasvaimia, jotka osoittivat pesäkkeitä kuolion. Siten, vaikka

in vitro

ja

in vivo

kasvua estävä vaikutus EGFR hiljentäminen palautettiin TGF-β sitomisen, paracrine antiangiogeeniset vaikutukset EGFR hiljentämisen ja vaikutukset apoptoosiin jatkui, mikä korostaa pro-mitogeenisesta vaikutukset src aktivointia. Lisäksi on äskettäin osoitettu, että angiogeneesi on tärkeää, kun Kras perustuva geneettisesti hiirimallissa PDAC [39] ja että variantti 161R muodossa interleukiini-17F (IL-17F: ksi), joka on luonnollinen antagonisti anti-angiogeeninen vaikutukset villityypin 161H IL-17F, liittyy huonompi ennusteeseen PDAC [40], joka tarjoaa epäsuoria todisteita, että angiogeneesiä voi olla tärkeä rooli sen metastaaseja. Näiden havaintojen, nykyinen havainnot viittaavat siihen, että kohdentaminen EGFR ja TGF-β voi olla tärkeää normalisoida kasvaimen angiogeneesin primaarikasvaimen ja tukahduttaa angiogeneesiä etäpesäkeleesioita vuonna PDAC.

ASPC-1 ja T3M4 solujen satama mutatoitunut KRAS ja p53-geenien ja express korkea EGFR tasolla [5], [41]. Nämä solut tuottavat myös suuria määriä TGF-β, TGF-α ja amfireguliini [19], [42], jotka ovat auto-indusoitavissa, TGF-β-indusoituva, ja angiogeneesiä. Lisäksi ASPC-1-soluissa satama mutatoitunut Smad4 geeni [43], kun taas T3M4 solut ovat villityypin Smad4 [44]. Sinänsä ASPC-1 ja T3M4 soluilla muutoksia, jotka ovat erittäin edustava spektrin tyypilliset molekyylitason muutoksia nähdään PDAC.