Krooninen sairaus

tiivistelmä

Anti-EGFR hoito on yleisesti käytetty hoitoon peräsuolen syöpä (CRC), vaikka vain potilasryhmässä hyötyvät hoidosta. Vaikka

KRAS

mutaatio ennustaa kuin reagointikykyä, positiivinen ennustearvo markkereita eivät kliinisessä työssä. Olemme aiemmin osoittaneet, että immunohistokemia (IHC) -Opastettu

EGFR

geenikopiomäärä (GCN) analyysi voi tunnistaa CRC potilaat hyötyvät anti-EGFR hoitoa. Tässä testasimme ennustearvo tällaisen analyysin chemorefractory metastaattisen CRC, selvitetty

EGFR

GCN heterogeenisuus sisällä kasvaimia, ja arvioi yhdistyksen välillä

EGFR

GCN,

KRAS

tila ja anti-EGFR-vasta-ainevasteen CRC solulinjoissa. Chemorefractory Potilas kohortti koostui 54

KRAS

villin tyypin (WT) metastaattinen CRC potilasta.

EGFR

GCN tila analysoitiin hopea

in situ

hybridisaatiolla käyttäen cut-off-arvo 4,0

EGFR

geenin kopiota /solu.

KRAS

WT ja

KRAS

mutantti CRC solulinjoissa erilaisilla

EGFR

GCN käytettiin

in vitro

tutkimuksissa. Chemorefractory CRC kasvaimista

EGFR

GCN lisäys (≥4.0) vastaamaan paremmin EGFR terapia kuin

EGFR

GCN ( 4,0) kasvaimet (kliinisen hyödyn,

P

= 0,0004, PFS, HR = 0,23, 95% CI ,12-+0,46).

EGFR

GCN laskettiin käyttäen EGFR IHC ohjaus oli huomattavasti suurempi kuin arvo satunnaisesti valitut alueet tarkastaa kasvaimensisäisenä

EGFR

GCN heterogeenisyys. CRC solulinjoissa,

EGFR

GCN korreloi EGFR. Paras anti-EGFR vaste nähtiin

KRAS

WT,

EGFR

GCN = 4 soluja ja köyhimpien vaste

KRAS

WT,

EGFR

GCN = 2-soluissa. Anti-EGFR vaste liittyi AKT ja ERK1 /2 fosforylaatio, joka tehokkaasti esti vain soluissa, joissa

KRAS

WT ja lisääntynyt

EGFR

GCN. Lopuksi IHC-ohjattu

EGFR

GCN on lupaava ennustaja EGFR hoidon tehoa chemorefractory CRC.

Citation: Ålgars A, Avoranta T, Österlund P, Lintunen M, Sundström J , Jokilehto T, et ai. (2014) heterogeeninen

EGFR

geenikopiomäärä lisäys on yleinen peräsuolen syövän ja Määrittelee vastaus Anti-EGFR Therapy. PLoS ONE 9 (6): e99590. doi: 10,1371 /journal.pone.0099590

Editor: Anthony W. I. Lo, Kiinan University of Hong Kong, Hongkong

vastaanotettu: 19 tammikuu 2014; Hyväksytty: 15 toukokuu 2014; Julkaistu: 18 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Ålgars et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Suomen Lääketieteen säätiö, The Suomi Cancer Foundation, National Graduate School of Clinical Investigations, TYKS EVO avustus, Suomen Akatemia, ja The Cancer Society of-Suomessa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: aa, ML, JS, RR ja OC ovat keksijät patenttiin liittyvät tähän työ: US 20110217296 A1 valintatapa potilaiden hoito EGFR estäjä. Kaikki jäljellä olevat kirjoittajat ovat ilmoittaneet lainkaan eturistiriitoja. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

kasvutekijän reseptorin (EGFR) signalointi on yleisesti käytössä kolorektaalisyövässä (CRC). EGFR-kohdistaminen monoklonaalisia vasta-aineita (mAb) on tullut vakio hoitovaihtoehto, erityisesti chemorefractory vaiheessa etäpesäkkeitä [1].

KRAS

molekyyliperheeseen myötävirtaan EGFR, on mutatoitunut noin 40% CRC [1] ja nämä aktivoivat mutaatiot välittää anti-EGFR hoito vastus [2]. Vuonna

KRAS

villin tyypin (WT) kasvaimet, tavoite vaste saavutetaan joka kolmas potilas osoittaa, että muut tekijät vaikuta lääkkeen tehoon [3]. Näin ollen on olemassa kiireellinen tarve uusille ennustavaa markkereita.

EGFR

geenikopiomäärä (GCN) lisäys on liitetty anti-EGFR hoitovaste. Useimmat tutkimukset ovat osoittaneet yhteyden GCN tasolla ja kliinisen hyödyn, elinaika ilman taudin etenemistä (PFS), ja joissakin tapauksissa, joissa kokonaiselinaika (OS) [4] – [6]. Kuitenkin

EGFR

GCN ei tällä hetkellä käytössä kliinisessä yhteydessä, koska tekniset esteet ja huomattavia eroja pisteytysjärjestelmät [7]. Olemme äskettäin raportoitu uusi algoritmi, joka voi parantaa ennustearvo

EGFR

GCN. Ensin osoitti, että

EGFR

GCN analysoituna hopea

in situ

-hybridisaatio (SISH) korreloi positiivisesti immunohistokemia (IHC), jolloin arviointi suoritettiin kasvaimen alueet korkeimman värjäytymisen intensiteetti [ ,,,0],8]. Olemme lisäksi osoittaneet, että lisääntynyt

EGFR

GCN, käyttäen cut-off-arvo (≥4.0), korreloi positiivisesti vaste anti-EGFR-hoidon kaikkien kolmen parametrin analysoitiin: kliinisen hyödyn, PFS ja OS.

EGFR

GCN oli riippumaton

KRAS

tila, ja kun kaksi määritystä yhdistettiin, he ennustivat hoitovaste paremmin kuin kumpikaan koe yksin. Keskimääräinen

EGFR

GCN, koska tällä menetelmällä analysoidut oli 5,5, ja kopioluvun kasvu ≥4.0 havaittiin 64%: n kasvaimia. GCN kasvu oli tyypillisesti liittyvät Kromosomi 7 polysomy, kun taas korkean tason vahvistus nähtiin harvoin.

Syynä vaihteluun julkaistu

EGFR

GCN tulokset voivat olla kasvain heterogeenisyys, joka ei ole ollut käsitelty aikaisemmissa tutkimuksissa. On olemassa jonkin verran näyttöä siitä, että EGFR voidaan heterogeenisesti ilmaista yksittäisten Kolorektaalituumorien, sekä geenin ja proteiinin taso [5]. Heterogeenisyys voi vaikeuttaa analyysin EGFR-proteiinin ilmentymisen ja kopioluvun muutoksia ja johtaa huonoon testin toistettavuus [7], [9]. Tämä voi olla erityisen tärkeää FISH-analyysi, jossa GCN laskenta ei voida korreloida histologia [7]. Jos

EGFR

heterogeenisuus näyttelee biologinen rooli, sitten algoritmi, jossa proteiinin ilmentymisen (IHC) ohjaimet

EGFR

GCN arviointi voisi parantaa ennustearvo.

Tavoitteena tämän tutkimuksen tarkoituksena oli testata uusia

EGFR

GCN menetelmä riippumattomalla potilaalla kohortti ja arvioimaan

EGFR

GCN aseman tulokseen yhdistetyssä chemorefractory potilaan kohortissa. Molemmissa potilasaineistoihin

EGFR

lisäys (≥4.0) oli osoitettu liittyvän paremman kliinisen tuloksen, mukaan luettuna kliininen hyöty korko, PFS ja OS. Toissijainen tavoitteena oli valaista

EGFR

GCN heterogeenisuus sisällä kasvaimet ja testata, onko CRC solulinjat erilaisilla

EGFR

GCN, reagoivat eri EGFR mAbien. Saamiemme tulosten,

EGFR

GCN on heterogeeninen CRC ja saatavia arvoja IHC ohjausta valituilta kasvain alueet ovat korkeammat kuin saatu satunnaisessa. Tärkeää on vain

EGFR

GCN laskettiin EGFR IHC ohjausta pystyi ennustamaan vaste anti-EGFR hoitoa. Meidän

in vitro

tutkimukset tukevat kliiniset havainnot, koska paras vastaus EGFR hoito nähtiin

KRAS

WT,

EGFR

GCN = 4,0 soluja ja köyhimpien vastaus

KRAS

WT,

EGFR

GCN = 2 soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat

alkuperäinen TYKS löytö kohortti on raportoitu [8]. Validointi kohortti koostui 31

KRAS

WT saaneilla potilailla EGFR mAb toisesta kuudenteen rivi Helsingin yliopistollisessa sairaalassa metastasoineeseen CRC välillä kesäkuussa 2008 ja heinäkuun 2010 valintakriteerit tätä tutkimusta varten: (I ) kudosta oli saatavilla primaarikasvaimen diagnoosin ennen aloittaa mitään hoitoa, (II) kasvain oli

KRAS

WT, (III) potilaista sai toiseksi kuudenteen line setuksimabihoidon tai Panitumumabilla tai ilman kemoterapiaa, ja (IV) potilaista ei ollut muita syöpään niiden historiaa. Histologia Jokaisen validoinnin kohortin tapaus uudelleen arvioitiin asiantuntija GI-patologia (AR).

yhteenlaskettu kohortti chemorefractory potilaista 54 potilasta, 25 alkuperäisestä Turun kohortti ja 29 Helsingin validointi sarja. Chemorefractory Potilaan ryhmä koostui potilasta hoidettiin anti-EGFR mAb kolmannella rivillä tai enemmän, joko yksittäisinä hoitona tai yhdistelmänä irinotekaanin +/- fluoripyrimidiinisyöpälääkkeen. Tärkeimmät ominaisuudet kaikkien kolmen kohortteja kuvataan taulukossa 1.

Vastaus EGFR hoito arvioitiin tietokonetomografia (CT) tai magneettikuvaus (MRI) mukaan Response arviointiperusteet kiinteitä kasvaimia (RECIST versio 1.1) [10]. Kliininen hyöty pidettiin osittaisen vasteen (PR) tai vähintään 3 kuukauden vakaa tauti (SD). Progression elinaika (PFS) laskettiin puhkeamista EGFR hoitoa taudin etenemiseen asti. Kokonaiselinaika (OS) laskettiin puhkeamista EGFR hoito kuolemaan saakka tahansa syystä.

Ethics lausunto

Tutkimus tehtiin noudattaen Helsingin julistuksen. Kliiniset tiedot haettiin ja histologisten näytteiden kerätään ja analysoidaan ja vahvisti kansallisen viranomaisen lääketieteellistek- lakiasiat sekä Institutional Review Board sairaanhoitopiirin Varsinais-Suomen ja Eettinen Review Board Helsingin yliopistollisessa sairaalassa. Kirjallinen tai suullinen suostumus ei saatu johtuen siitä, että suuri osa potilaista mukana tässä Potilasaineisto oli kuollut heidän sairautensa. Tarve tietoisen suostumuksen osallistujilta oli luopunut kansallisen viranomaisen lääketieteellistek- lakiasiat.

IHC ja SISH menettelyt

KRAS

mutaatio-analyysi suoritettiin DXS KRAS mutaatio kit (dxs Ltd, Manchester, UK). Yksityiskohtaiset menetelmät EGFR IHC ja

EGFR

GCN on kuvattu [8]. Lyhyesti, kolmen um leikkeet värjätään ensin EGFR (klooni 5B7) mAb (Ventana Medical Systems /Roche Diagnostics, Tucson AZ, USA). Värjäykset suoritettiin BenchMark XT (Ventana /Roche) käyttäen

ultra

VIEW Universal DAB Detection Kit (Ventana /Roche).

EGFR

geeni havaittu jälkeen viiden um: n osat, joissa

EGFR

DNA Probe (Ventana /Roche) ja

ultra

VIEW SISH Detection Kit (Ventana /Roche). Kunkin kasvaimen,

EGFR

GCN neljänkymmenen kasvainsolujen analysoitiin käyttäen 40x tavoitteen kaksi tarkkailijaa (ML, JS) alueilta korkeimman IHC reaktiivisuus. Tutkijat sokaisi kliinisen tiedon. Arvioidaan keskiarvo

EGFR

GCN kussakin kasvain viisi kasvaimen alueet mielivaltaisesti valittu. Jokaisesta näistä alueista,

EGFR

GCN 20 satunnaisesti valittua syöpäsolujen laskettiin kaksi tarkkailijaa (TA, JS). Tulokset ilmoitetaan keskiarvona ja valikoima Kullakin alueella.

Cell Lines, Western blotting ja sytotoksisuusmääritykset

C2BBe1, SK-CO-1 ja NCI-H747-solulinjoja ostettiin ATCC (Manassas, VA, USA) ja CW-2-solulinjan RIKEN Bioresource keskustasta (Tsukuba, Japani). NCI-H747 ja CW-2-soluja viljeltiin RPMI-1640, SK-CO-1-solut EMEM: issä ja C2BBe1 soluja DMEM: 0,01 mg /ml ihmisen transferriiniä (Sigma, Saint Louis, MO, USA). Kaikki alustat täydennettiin 10% FBS: ää, 2 mM glutamiinia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä.

signalointireitin analyysiä soluja kasvatettiin 6-kuoppalevyillä, ja annettiin kiinnittyä 12 tunnin ajan normaalissa väliaineessa. Sitten he muuttuivat väliaineessa 1% FBS ja annetaan 0-200 ug /ml setuksimabi (Erbituxia, Merck Serono) 24 tuntia. 25 mg /ml EGF: ää annettiin soluja viisi minuuttia ennen hajoamista.

Proteiinitasot analysoitiin Western-blottauksella soluja lyysattiin RIPA-puskuriin (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCI, 1% Nonidet P -40, 0,5% deoksikolaatti, 0,1% SDS, 1 mM ortovanadaatti, ja proteaasi-inhibiittorin seosta, pH 7,4). Proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin nitroselluloosamembraaneille. Yön yli inkuboinnin + 4C ° primaarista vasta-aine [anti-EGFR (D38B1, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), fosfo-EGFR (Tyr1173, 53A5, Cell Signaling Technology), ERK2 (K-23, Santa Cruz Biotechnology , Dallas, TX, USA), fosfo- ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, D13.14.4E, Cell signalointi Technology), fosfo-AKT (Ser 473), panAKT (C67E7, Cell signaling Technology)], kalvot inkuboitiin 1 tunnin huoneen lämpötilassa piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Dako, Glostrup, Tanska) ja signaalit detektoitiin SuperSignal West Pico kemiluminesenssisubstraatilla (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Anti-α-tubuliinin mAb (B-1-5-1-2, Sigma) tai HRP-konjugoitua anti-GAPDH-mAb (mAbcam 9484, Abcam, Cambridge, UK) käytettiin latauskontrollina.

solujen elinkelpoisuuden määritykset, 5000 solua /kuoppa maljattiin 96-kuoppaisille levyille. Yön yli inkuboinnin jälkeen, kun läsnä on 2% FBS: ää, solut altistettiin 0-200 ug /ml setuksimabi (Erbituxia, Merck Serono) tai panitumumabipitoisuus (Vectibix, Amgen) 72 tunnin ajan väliaineessa, jota oli täydennetty 1% FBS: ää. Kukin käsittely tehtiin kolmena kappaleena ja koe toistettiin neljä kertaa. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin kanssa CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation määritystä (Promega, Madison, WI, USA). Solun elinkelpoisuus annetaan prosentteina kontrollisolujen.

Tilastollinen analyysi

Tilastolliset analyysit suoritettiin SAS 9.2 ja Enterprise Guide 4.2 ohjelmia (SAS Institute Inc., Cary, NC). Taajuus taulukon tiedot analysoitiin χ2-testiä tai Fisherin testiä. Ero

EGFR

GCN saadut arvot eri arviointimenetelmiä (normaalisti jakautunut muuttujat) laskettiin kanssa Studentin t-testiä. Kaplan-Meier ja log-rank testejä sekä Coxin suhteellisen vaarat regressiomallin käytettiin yksiulotteista selviytymisen analyysiä. Kaikki tilastolliset testit olivat kaksipuolisia.

P

-arvot 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä. Tilastollinen merkitys solujen elinkelpoisuuden määritykset laskettiin Microsoft Excel 2011 ja StatPlus: mac LE (Version 2009 AnalystSoft Inc.). Merkityksen välillä eroja vasteet solulinjoissa määritettiin kaksisuuntainen ANOVA seurasi useita t-testejä.

Tulokset

EGFR

GCN Test Validation kanssa riippumattoman potilaan kohortti

validoida aiempaan tuloksia yhdistyksen välillä

EGFR

GCN ja anti-EGFR hoitovaste, tutkimme riippumaton potilaan kohortin käsitellään Helsingin yliopistollisessa sairaalassa. Menetelmät

EGFR

GCN havaitseminen ja cut-off-arvo GCN kasvuun olivat identtisiä löytö tutkimus [8]. Vuonna validointi kohortin 18 ulos 31 (58%) kasvaimet oli

EGFR

GCN yläpuolella cut-off-arvo (≥4.0), verrattuna 64% alkuperäisen löytö asetettu. Neljätoista (78%) ja korkea

EGFR

GCN (≥4.0)

KRAS-

WT potilailla havaittiin kliinistä hyötyä [osittainen vaste (PR) + stabiili tauti (SD)] anti-EGFR hoito, kun taas vain 4 (31%) alhaisen

EGFR

GCN ( 4,0) hyötyi käsittely (Chi-neliö testi,

P

= 0,009). Kohonnut

EGFR

GCN liittyy merkittävästi parantunut selviytymistä. Mediaani PFS aika

EGFR

GCN≥4.0 oli 25 viikkoa verrattuna vain 11 viikkoa

EGFR

GCN 4,0 potilasta (Log-Rank testi,

P

= 0.002; Cox testi,

P

= 0,003, HR = 0,28, 95% CI 0,12-0,65; kuva 1a). Lisäksi

EGFR

GCN≥4.0 liittyy merkittävästi parantunut OS (mediaani 12,1 vs. 8,2 kuukautta, log-rank testi,

P

= 0,004; Cox testi,

P

= 0,006, HR = 0,32, 95% CI 0,14-0,72; kuva 1b).

Progression elinaika (a) ja kokonaiseloonjääminen (b) testin validointi kohortti mukaan

EGFR

geenikopiomäärä. Progression elinaika (c) ja kokonaiseloonjääminen (d) yhdistetyn chemorefractory potilaan kohortin.

korrelaatio

EGFR

GCN ja hoitovaste Chemorefractory Potilaat

yhdistimme chemorefractory

KRAS

WT potilaita sekä kohortteja (

n

= 54) edelleen tilastollisia analyysejä. Kahdeksankymmentä prosenttia (28 out of 35) potilaista, joilla on korkea

EGFR

GCN (≥4.0) saavutettu kliinistä hyötyä. Sen sijaan kliininen hyöty oli vain 32% (6 out of 19) potilaille, joilla on alhainen

EGFR

GCN ( 4,0) (Chi-Square testi,

P

= 0,0004).

analysoinut erikseen 31 chemorefractory Setuksimabihoitoa saaneilla potilailla (57%) ja 21 Panitumumabilla (39%). Kaksi potilasta hoidettiin sekä anti-EGFR-vasta-aineita verrattuna ja siksi pois analyysistä. Kliinistä hyötyä verokannan Setuksimabihoitoa saaneilla potilailla +/- sytotoksista hoitoa suurella

EGFR

GCN heidän ensisijainen kasvaimia oli 86% (18/21) verrattuna 20% (2/10) vuonna potilasryhmässä, joiden

EGFR

GCN 4,0 (Fisherin tarkka testi,

P

= 0,0007). Vuonna hoidettujen potilaiden ryhmässä Panitumumabilla +/- sytotoksisen hoidon kliininen hyöty oli 67% (8/12) potilailla, joilla on korkea

EGFR

GCN ja 44% (4/9) potilailla, joilla on alhainen

EGFR

GCN. Tulokset on esitetty tarkemmin taulukossa S1.

Lisääntynyt

EGFR

GCN Associates ja parannettu PFS ja OS Chemorefractory Disease

mediaani PFS on chemorefractory potilaan kohortissa oli merkitsevästi pidempi

EGFR

GCN≥4.0 potilailla kuin

EGFR

GCN 4,0 potilasta; 29.5

vs.

10,8 viikkoa (Log-Rank testi,

P

0,0001; Cox testi,

P

0,0001, riskisuhde = 0,23, 95% CI 0.12 -0,46). Mediaani OS aikaa potilailla, joilla

EGFR

GCN≥4.0 kasvaimia oli 12,5 kuukautta verrattuna 7,2 kuukautta niille, joilla

EGFR

GCN alle cut-off-arvo (log-rank testi,

P

= 0,0002; Cox testi,

P

= 0,0003, riskisuhde = 0,32, 95% CI 0,17-0,59). Kaplan-Meier-eloonjäämiskäyrät on esitetty kuviossa 1 c-d.

PFS säilyi kauemmin potilailla, joilla on korkea

EGFR

GCN riippumatta siitä, missä anti-EGFR-mAb on käytetty. Vuonna Setuksimabihoitoa saaneilla potilailla +/- sytotoksisen hoidon mediaani OS aika oli tilastollisesti merkitsevästi pidempi kohortin potilailla, joilla on

EGFR

GCN≥4.0 verrattuna niihin, joiden

EGFR

GCN alle 4,0 (12,5

vs.

4,6 kuukautta, log-rank testi

P

= 0,0006; Cox testi

P

= 0,001, HR 0,25, 95% CI 0,10-0,58 ), kun taas tilastollisesti merkitsevää OS ero nähtiin hoidetuilla potilailla Panitumumabilla. Tulokset on esitetty taulukossa S1.

Eloonjääntitulokset alkuperäisen Löytyminen, riippumattoman validation-, ja yhdistetyt chemorefractory potilasaineistoihin verrataan kuviossa 2.

riskisuhteita ja luottamuksen välein alkuperäisen löytö, validointi, ja yhdistetty chemorefractory potilasaineistoihin näkyvät. Korkea

EGFR

GCN (IHC opastettu SISH) liittyy parannettu tautia tulos kaikissa kolmessa

KRAS

villityypin metastasoitunut kolorektaalisyöpä potilasaineistoihin hoidettu anti-EGFR hoitoa (kaksi itsenäistä kohortteja ja yksi yhdistetty kohortti chemorefractory potilasta).

EGFR

GCN heterogeenisuus sisällä Kasvaimet

EGFR

GCN oli satunnaisesti arvioitiin ilman IHC ohjausta, kaikkien 31 validointi kohortissa kasvaimia. Keskimääräinen

EGFR

GCN arvoja satunnaisesti valitut alueet olivat merkittävästi alhaisemmat verrattuna menetelmään, jossa

EGFR

GCN arvioitiin selektiivisesti alueilla korkein EGFR-proteiinin ilmentymistä (

P

0,0001). Mediaani

EGFR

GCN näiden 31 ensisijaisen CRC kasvaimia oli 4,3, kun IHC ohjausta käytettiin ja 3.3, kun analyysi tehtiin satunnaisella tavalla. Heterogeenisuus

EGFR

GCN kuluessa CRC kasvain näyte osoitetaan kuviossa 3.

EGFR IHC osoittaa heterogeenistä värjäytymistä intensiivinen kalvomainen reaktiivisuus keskellä (a).

EGFR

SISH päässä intensiivisesti värjätään alue osoittaa geeniryppäät (b).

EGFR

SISH lähialueiden kanssa heikko tai negatiivinen EGFR IHC värjäytyminen osoittaa hieman koholla tai normaali geeni kopioida numeroita (c-d).

Kun satunnaisesti valitun

EGFR

GCN arvoja käytettiin hengissä analyysejä (

EGFR

GCN≥4.0

vs. EGFR

GCN 4,0) tilastollisesti merkitsevää eroa ei havaittu ryhmien välillä (PFS:

P

= 0,07, HR 0,40, 95% CI 0,15-1,08; OS:

P

= 0,22, HR = 0,58, 95% CI 0,25-1,38). Ei ole merkittävää eroa anti-EGFR hoidon tehokkuutta (kliinistä hyötyä

vs.

Etenevä tauti) havaittiin joko (Fisherin tarkka testi,

P

= 0,19).

EGFR

GCN ja vastaus Anti-EGFR Abs In vitro

Haimme Sanger Centerin syöpäsolun online-tietokannan (https://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/genetics/CGP /cghviewer/CghHome.cgi) ja

EGFR

GCN muutoksia. Alhainen

EGFR

GCN lisäys (4-15 kopiota /solu), tyypillisesti johtuen kromosomi 7 polysomy, nähtiin 18 ulos 39 (46%) solulinjat. Korreloida

EGFR

GCN ja

KRAS

tila anti-EGFR mAb vastaus, valitsimme neljä riviä analysoitavaksi. CW-2 ja C2BBe1 solulinjat ovat

KRAS

WT ja kaksi ja neljä kopiota

EGFR,

vastaavasti. NCI-H747 ja SK-CO-1 ovat molemmat

KRAS

mutantti ja on enemmän kuin neljä kappaletta (6-7) on

EGFR

.

EGFR

GCN varmistettiin SISH (kuva 4a).

EGFR

GCN heijastui välittömästi EGFR-proteiinin ilmentymisen kuten Western blot -analyysillä (kuva 4b). Solujen elinkelpoisuus määrityksissä,

KRAS

WT solulinjan

EGFR

GCN 4 (C2BBe1) oli kaikkein herkkiä sekä setuksimabi ja panitumumabipitoisuus käsittely (kuvio 4c). Ero oli erittäin merkittävä verrattuna tahansa muita solulinjoja (Studentin t-testi,

P

0,001). Mielenkiintoista,

EGFR

disomic, WT

KRAS

solulinja (CW-2) oli eniten resistentti mAb hoitoon. Solulinjat kanssa mutantti

KRAS

ja

EGFR

GCN 4 osoitti väli- herkkyyttä, erityisesti panitumumabista hoitoon. Tulokset ovat siis yhtä mieltä meidän kliiniset tiedot osoittavat, että sekä

EGFR

GCN ja

KRAS

asema määrittää kasvaimen soluvasteen anti-EGFR-mAb: t.

(a)

EGFR

GCN SISH analyysi eri solulinjoissa. (B) Western blot kuva, jossa tasot EGFR-proteiinin eri solulinjoissa. α-tubuliinin käytettiin kontrollina yhdenvertaista lastaus. Solujen elinkelpoisuutta eri solulinjoista vaihtelevia konsentraatioita (c) setuksimabi ja (d) Panitumumabilla. Tulokset on annettu elävien solujen prosenttimäärän verrattuna ei-käsiteltyjen solujen (keskiarvo ± SE viisi koetta). (E) Western-blotit osoittavat EGFR-reitin signalointi molekyylejä eri solulinjoissa. Solut esikäsiteltiin osoitetuilla määrillä setuksimabin 24 tunnin ajan väliaineessa, joka sisälsi 1% FBS: ää ja annetaan EGF: ää (25 ug /ml) 5 minuutin ajan, ennen kuin hajoamista. Ilmoitettu molekyylejä analysoitiin western-blottauksella. GAPDH käytettiin kontrollina yhtäläistä lastaus.

lisäksi tutkittiin vaikutuksia anti-EGFR mAb käsittely solunsisäinen signalointi näissä solulinjoissa. Vuonna

KRAS

mutantti solulinjat on enemmän kuin neljä

EGFR

geenin kopioita, fosforylaatio EGFR oli ilmeinen ja tehokkaasti estää anti-EGFR-mAbin (kuva 4e). Anti-EGFR esto osittain pelkistetty pERK1 /2 tasossa, kun taas taso Pakt ei vaikuttanut. In

KRAS

WT-solulinjoissa 2-4

EGFR

geenin kopioita EGFR fosforylaatio oli alle toteamisrajan (ei esitetty). Kuitenkin polku oli ilmeisesti toiminnalliset kuten osoitetaan vastaukset alavirran signalointia.

EGFR

disomic linja CW-2, anti-EGFR-mAb pienensi pERK1 /2 tasoa, mutta ei vaikuttanut AKT fosforylaatiota (kuvio 4e). Vain

EGFR

polysomic ja villin tyypin

KRAS

C2BBe1 soluja, tehokas tukos sekä ERK1 /2 ja AKT signalointi, havaittiin (kuvio 4e). Nämä tulokset näin viittaavat siihen, että sekä

EGFR

GCN ja

KRAS

mutaatiostatus vaikutuksen määrittämiseksi anti-EGFR-mAb on EGFR loppupään signalointi ja peräsuolen syövän solujen eloonjäämistä.

Keskustelu

tässä tutkimuksessa osoitamme, että heterogeeninen

EGFR

GCN kasvu on vahva ennustaja EGFR hoidon hyöty metastaattisessa CRC. Tulokset laajentaa aiempia havaintoja yhden instituutin potilas kohortti riippumattomalle validointi kohortin. Lisäksi ne osoittavat ennustearvo

EGFR

GCN anti-EGFR-hoidon tehoa chemorefractory CRC potilailla, tärkein potilasryhmässä oikeutettuja tähän hoitoon. Tulokset osoittavat lisäksi, että sisäinen kasvaimen

EGFR

GCN heterogeenisuus on yleinen CRC. Oletamme, että tämä aikaisemmin kateissa

EGFR

heterogeenisuus on syy raportoitu huono korrelaatio

EGFR

GCN analyysi ja tehoa anti-EGFR-hoidon, ja ehdottaa parannettua menetelmää ennustavan

EGFR

GCN testaus.

potilas materiaali meidän tutkimuksessa oli mukana potilaita hoidettiin anti-EGFR hoito sekä varhainen ja chemorefractory vaihe metastaattisen CRC hoidon. Kontrolloida vaikuttavat sekoittavat kemoterapia herkkyys yhdistettynä anti-EGFR-mAb: iden meidän tuloksiin, ennustearvo

EGFR

GCN anti-EGFR hoitovaste arvioitiin erikseen potilaiden alaryhmässä käsitellään chemorefractory vaihe (kolmas rivi tai enemmän). Saadut tulokset on chemorefractory alaryhmä olivat samanlaisia ​​tuloksia koko potilaan kohortin, mikä tukee tulkintaa, että korkean

EGFR

GCN on todellakin ennustaja suotuisa anti-EGFR hoitovastetta.

sekä setuksimabi ja panitumumabin että chemorefractory potilaan alaryhmä osoittanut parannettu PFS in

EGFR

GCN≥4.0 potilaille. Kokonaiselossaoloaika ja tautien torjunta oli tilastollisesti parantuneet setuksimabi kohortin ja numeerisesti mutta ei tilastollisesti pienessä panitumumabipitoisuus kohortin. Kaksi terapeuttinen Ab ovat eri tyyppiä, panitumumabi kohteena on täysin ihmisen mAb, kun taas setuksimabi on hiiri-ihminen-kimeeran.

In vitro

määrityksessä osoitti samanlaista sytotoksisuutta varten testattujen CRC linjat, mutta

in vivo

, muita mekanismeja, kuten vasta-aineesta riippuvaista sytotoksisuutta (ADCC) voivat olla toiminnallisia. Tässä suhteessa setuksimabi ja panitumumabi voi olla erilainen ja siksi lisääntynyt

EGFR

GCN voisi paremmin osoittaa herkkyyttä Setuksimabihoitoa [11]. Mukaan prekliinisiä ja kliinisiä tietoja tiettyjen sytotoksisten hoitojen +/- immuunimuuntajat, kuten esim. gilf (gemsitabiini, irinotekaani, levofolinic, ja 5-fluorourasiili), GILFI (gemsitabiini, irinotekaani, levofolinic happo, fluorourasiili, aldesleukiini), ja GOLFIG (gemsitabiini, oksaliplatiini, levofolinate, 5-fluoriurasiili, GM-CSF, aldesleukiini) hoito, on kyky tehokkaasti säätää ylös EGFR paksusuolen syöpäsoluissa, mikä parantaa herkkyyttä koolonkarsinoomasoluissa setuksimabista käynnistää ADCC [12] – [14]. Tutkimuksessamme panitumumabi käytettiin yhtä hoitoa useammin kuin setuksimabi, 42,9

vs

6,5%: lla, mikä ainakin osittain voi selittää eron havaittu tehon tulokset kahden vasta-aineita. Molemmat vasta-aineet, kun ei antaa kerta-annoksena, yhdistettiin irinotekaania solunsalpaajahoitojen. Tutkimuksessamme, oksaliplatiini tai yhden kapesitabiini ei ole yhdistetty anti-EGFR terapiassa chemorefractory taudin vaiheessa. Kaksi potilasta sai setuksimabia ja panitumumabin peräkkäin ja siksi jätettiin pois tästä tutkimuksesta. Tämän vuoksi sen enempää yhdistelmä sytotoksinen lääke eikä samanaikaisesta vasta peräkkäin, selittää eron saatujen tulosten kanssa eri anti-EGFR-vasta-aineita. Vaihtoehtoisesti tuloksemme voi kertoa eroa saaneilla potilailla. Setuksimabia yleisemmin käytetty löytö kohortin, mikä on määritelty testin cut-off-arvon, ja panitumumabia validointi kohortin vain chemorefractory potilaita. Koska molemmat ikäluokat olivat retrospektiivinen, emme voi sulkea pois eroja potilasryhmissä, jotka voisivat selittää erot hoitotuloksen.

Kasvain heterogeenisuus on ehdotettu vaikuttavan vaikeuksista validointiin onkologian biomarkkereiden [15] . Tässä työssä, keskimääräinen

EGFR

GCN-arvot olivat merkittävästi alhaisemmat, kun analysoitu satunnaisella tavalla verrattuna arvoihin, jotka saatiin valitsemalla solut, joilla on korkein GCN. Ainoastaan ​​viimeksi mainittu menetelmä pystyi erottamaan potilaat mukaan niiden anti-EGFR hoitovaste. Tämä tukee käsitystä, että terapeuttinen päätöksenteko perustuu teki hallitseva fenotyyppi voi olla harhaanjohtavia [15]. Pienikin prosenttiosuus Mutanttialleelit ja geeniekspressioprofiilien voi olla ratkaiseva hoitovasteen [16].

EGFR

GCN heterogeenisuus on vakiintunut ilmiö glioomis- [17]. Vaikka

EGFR

GCN heterogeenisyys CRC ehkä on tunnistettu aiemmin, tämä havainto on yleensä oteta huomioon, eikä käyttää parametrina diagnostisissa analyyseissä. Joissakin suhteissa, yhdistyksen välillä

EGFR

GCN ja hoitovasteen muistuttaa havainnot toisen EGFR perheenjäsenen,

Her2,

mahasyövän.

Her2

monistetaan tai yliekspressoituu 7-34% mahasyövistä [18]. Toisin kuin rintasyöpä, Her2 ilmentyminen mahasyövässä näyttelyissä merkitty sisäisen kasvaimen heterogeenisyys, ja siksi diagnostinen testi tulkinta poikkeaa rintasyövän [19]. Nykyinen ennustava diagnostiikka trastutsumabi hoitoon mahasyövän perustuu yhdistelmään Her2 IHC ja

Her2

GCN analyysin alueilla korkein IHC värjäystä. Biopsioissa tällaiset alueet voivat kattaa vain 5% kasvain [19]. Vaikka yhtäläisyyksiä, Her2-mahasyövän algoritmi eroaa

EGFR

GCN CRC. Mahasyövän, cut-off-arvo perustuu geenin kromosomissa suhde ≥2.0, vaikka viimeisin suositusten mukaan

Her2

GCN 6,0 voidaan pitää positiivisina. CRC,

EGFR

GCN kasvu on tyypillisesti seurausta kromosomissa 7 polysomy ja siksi geenin kromosomiin suhde ei ole informatiivinen. Toisaalta kromosomi 17 on harvoin polyploideja mahasyövän, joka osoittaa erilaisia ​​biologisia mekanismi

EGFR

ja

Her2

kasvua.

Kasvain heterogeenisuus on ehdotettu taustalla resistenssin kohdennettuja syöpähoitojen [15]. Tältä osin havainto, että pieni populaatio

EGFR

GCN korkea solujen määrittelee hoitovastetta on odottamaton.