Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ihmisen aiheuttama pluripotenttien kantasolujen (iPSCs) on ohjelmoitava uudelleen tilapäisesti ilmentämällä transkriptiotekijöiden somaattisissa soluissa. Noin 1% somaattisten solujen voidaan ohjelmoida osaksi iPSCs, kun taas jäljellä olevat somaattisten solujen differentiaalisesti ohjelmoida uudelleen. Täällä perustettu aiheuttama pluripotenttien syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja (iCSCs) kuin itseuudistuvien pluripotenttien solun klooneja. Vakaa ICSC linjat luotiin epävakaata aiheuttama epiteelin kantasolujen (iESC) linjojen läpi uudelleen pinnoitus seurasi embryonaalinen rykelmä muodostumista ja sarjasiirteillä. iCSCs jakoi ilmentymistä pluripotenttien markkerigeeni kanssa iPSCs, paitsi

REX1

ja

LIN28

, kun taas näytteillä ilmaus somaattisten markkerigeeni

EMP1

ja

PPAR

. iESCs ja iCSCs voisi tuottaa teratomas korkealla tehokkuudella istuttaa immuunivajaisiin hiiriin. Toinen iCSCs eristetty erottaa soluista teratoma ensimmäisen iCSCs oli stabiilisti yllä, osoittaa geeniekspressioprofiili samanlainen kuin ensimmäinen iCSCs. Ensimmäisen ja toisen iCSCs, siirtogeeni johdettu

Oct4

,

Sox2

,

Klf4

, ja

c-Myc

esitettiin. Vertaileva maailmanlaajuinen geenin ilmentymisen analyysit osoittivat, että ensimmäinen iCSCs olivat samanlaiset iESCs, ja poikkeaa selvästi ihmisen iPSCs ja somaattisissa soluissa. Vuonna iCSCs, geenien ilmentyminen kinetiikka ytimen pluripotenttisuuden tekijä ja Myc liittyvä tekijä olivat pluripotenttien tyyppi, kun taas Polycomb monimutkainen tekijä oli somaattisen tyyppi. Nämä havainnot osoittavat, että pluripotenttien tuumorigeenisyystesti voidaan siirrettävä somaattisten solujen avulla säätely ylöspäin ytimen pluripotenttisuus ja Myc liittyviä tekijöitä, ennen perustamista iPSC molekyylitason verkon koko uudelleenohjelmointi kautta alas-sääntely Polycomb monimutkainen tekijä.

Citation: Nagata S, Hirano K, Kanemori M, Sun LT, Tada T (2012) Self-Renewal ja pluripotenttisuus hankittu somaattinen Uudelleenohjelmointia Human Cancer Stem Cells. PLoS ONE 7 (11): e48699. doi: 10,1371 /journal.pone.0048699

Editor: Martin Pera, University of Melbourne, Australia

vastaanotettu: 18 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 28 syyskuu 2012; Julkaistu: 08 marraskuu 2012

Copyright: © 2012 Nagata et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukee JSP Kakenhi, lupanumeroon 23390067. rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, että mitään kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

Syöpä kantasolut (CSCS), jotka ovat alapopulaatiot kasvainsolujen, toiminto ylläpitämisessä syövät kautta aloittamista ja leviämistä pysyviksi kasvaimen kasvu [1]. CSCS arvellaan olevan päätavoitteisiin syövän hoitomuotoja, mutta tiedot niiden geneettisten ja epigeneettiset allekirjoitukset ovat epäselviä. Koska kultakantaan määritellä CSC ominaisuuksien tunnistamiseksi sarjasiirteillä määritys perustuu kykyyn itse uudistaa ja tuottaa kasvaimia on käytetty laajasti [2]. Ratkaiseva tapahtuma aloittamisen syövissä on aktivointi itseuudistumisen kone, joka on yleensä vain kantasoluja. Näin ollen on todennäköistä, että CSCS jakaa useiden geenien ilmentymisen allekirjoituksia havaittu pluripotenttien kantasolujen. Itse asiassa, pluripotenttien markkerigeeni,

Oct4

ja

Nanog

, ilmaistaan ​​joidenkin syöpien [3], [4], ja onkogeeni

Myc

osallistuu sukupolvi monien syöpien [5].

Pakko ilmentymisen yhdistelmä transkriptiotekijöitä, Oct4, Sox2, Klf4, ja c-Myc (OSKM), voi edistää suoraan kyseeseen ihmisen ja hiiren somaattisten solujen indusoidun pluripotenttien kantasolujen solut (iPSCs) [6], [7]. Suorassa uudelleenohjelmointi,

Oct4

ja

Sox2

, jotka ovat keskeisiä pluripotenttisuus tekijöitä, toimivat säätelijöinä kehitys- ja transkriptio liittyvä prosessien [8],

Myc

kohdistuu geenien pääasiassa mukana solujen aineenvaihduntaan, solusyklin ja proteiinisynteesiä reittejä [9]. Lisäksi

Myc

toimintoja lisäämään tehokkuutta säätelemällä p53-reitin [10]. Tämä näyttö osoittaa, että yhteinen reitit voidaan käyttää sekä hankinnan pluripotenttisuuden ja kasvaimen kehittymisen. Ihmisissä, CSC kaltaisia ​​soluja transformoitiin primäärisistä ihon fibroblastien vakaa ilmentyminen hTERT, H-RasV12, ja SV40 LT ja ST-antigeenit [11]. Hiirillä, CSCS luotiin hiiren indusoi pluripotenttien kantasolujen (iPSCs) viljelmässä, jossa väliaine syöpäsolulinjojen, joka oli jäljittelee karsinooma microenvironment [12]. Siten globaali muutos transkription allekirjoituksen suoraan uudelleenohjelmointi tai vaihtoehtoisten viljelyolosuhteet voitaisiin edistää siirtymistä CSCS. Tässä yhteydessä on mahdollista, että pakotettua ilmentymistä OSKM somaattisten solujen indusoi suoran uudelleenohjelmointi osaksi CSCS. Vastatakseen molekyylitason mekanismeja alkion kantasoluja (ES-solut) ja CSCS, kolme toiminnallisesti eri geenistä sarjaa, nimeltään Core (core pluripotenttisuus tekijät), Kiina (Polycomb tukahduttavaa monimutkaisista tekijöistä), ja Myc (Myc-liittyvät tekijät) moduulit, ehdotettu viimeksi käytettiin vertailevia analyysejä globaalin geenin toiminnan eri solutyyppejä [9].

Täällä jotta kysymyksiä siitä, onko ihmisen aiheuttama syöpä kantasolujen kaltaisia ​​soluja (iCSCs) voidaan muodostaa somaattiset uudelleenohjelmointi perinteisiä OSKM virusinduktion, ja miten ihmisen iCSCs, mutta ei iPSCs, syntyy ensimmäinen me eristetty iCSCs solu- populaatioita, jotka olivat saaneet kyvyn itse uusimisen jälkeen pakko ulkosyntyisen OSKM ihmisen somaattisten fibroblasteissa TIG1. iCSCs on omaisuutta pluripotenttisuuden mikä voidaan todeta teratoma muodostumisen sarjasiirteillä on immuunivajaisiin hiirillä. Huomattavaa on, että geenin ilmentyminen allekirjoitus osoitti, että iCSCs jatkuvat tietyt somaattisten solujen muistissa, vaikka säätely ylöspäin pluripotenttien markkerigeenejä kautta uudelleenohjelmoinnin. Meidän havainnot paljastivat, että säätely ylöspäin geenin sarjat Core ja Myc-moduulit on riittävän antamaan ominaisuuksia itseuudistumisen ja pluripotenttisuus, ja juokseva alas-säätely geenin sarjat Kiinan moduulin asentamiseen tarvitaan asianmukainen iPSC allekirjoituksen somaattisissa soluissa. Nämä havainnot osoittavat, että iCSCs ja iPSCs jakaa uudelleenohjelmointi väylä somaattisten ytimet osaksi pluripotenttien ja itsestään uusiutuvien ytimiä, ja sitten hajaantuvat iCSCs tai iPSCs.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

Kokeet hiiret suoritettiin institutionaalisten suuntaviivat Kyoto University, Japani. Meidän eläinkokeissa (W-3-6) tarkistetaan ja sallii eläimen tutkimus komitean Kyoto University, Japani.

Soluviljely

Ihmisen sikiön keuhkojen fibroblasteja (TIG1) antamat JCRB Cell Bank viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) (Sigma-Aldrich, USA), joka sisälsi 10% FBS: ää, ja infektoitiin Oct4, Sox2, Klf4 ja c-Myc retrovirukset. Päivänä 4 infektion jälkeen, solut siirrostettiin uudelleen 10 cm: n viljelymaljaa on syöttösoluja. 5. päivänä infektion jälkeen, viljelyalusta vaihdettiin iPSC (DMEM /Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM /F12) (Sigma-Aldrich), jota oli täydennetty 20%: knockout seerumin vaihto (Invitrogen, USA), 10 ng /ml bFGF (Peprotech, USA), L-glutamiinia, ja ei-välttämättömiä aminohappoja ja 2-merkaptoetanoli). Pesäkkeet, jotka voisivat itse uudistaa ja laajentaa, poimittiin ja siirrostettiin uudelleen päälle syöttösoluja noin päivä 30. eristämiseksi ihmisen iPSCs ja aiheuttama epiteelin kantasolujen (iESCs), kukin pesäke poimittiin ylös ja siirrostettiin uudelleen Matrigel päällystetty ruokia hiiren alkion fibroblasti (MEF) -conditioned iPSC väliaine.

embryonaalinen rykelmä (EB) muodostumista, pieni iESC aineaggregaattien yön yli riippuva pisara kulttuurin MEF-conditioned iPSC väliaine. Aggregaatit kasvatettiin Bakteeriviljelmässä ruokia 5-7 päivää, ja sitten viljeltiin gelatiinipäällystetyille malja DMEM, joka sisälsi 10% FBS.

kasvainperäinen soluviljelmässä, kasvaimet leikattiin pieniksi paloiksi, liukenevat kollagenaasi, ja maljattiin gelatiinipäällystetyille ruokia 10% FBS sisältävän DMEM. Perustettu ICSC linjat pidettiin gelatiinipäällystetyille malja DMEM /F12 (Wako, Japani), jota oli täydennetty 15% FBS: ää, 1000 U /ml LIF (Chemicon, USA), L-glutamiinia, penisilliini-streptomysiiniä, natriumbikarbonaatti, natrium- pyruvaattia, ja 2-merkaptoetanolia läpikulun käyttämällä 0,25% trypsiiniä /EDTA.

RT-PCR

RT-PCR-analyysit, kokonais-RNA viljeltyjen solujen uutettiin TRIzol reagenssia (Invitrogen). cDNA syntetisoitiin 1 ug kokonais-RNA: ta Superscript III (Invitrogen) käyttäen sattumanvaraisia ​​heksameerejä seuraten valmistajan ohjeita. Kaikki PCR-kokeet suoritettiin hehkutus lämpötila 57 ° C. Alukesekvenssit käytettiin tässä tutkimuksessa on esitetty taulukossa S1.

Immunosytokemia

Viljellyt solut kiinnitettiin 4% PFA (paraformaldehydiä) /PBS: llä (fosfaattipuskuroitu suolaliuos), 10 minuuttia huoneenlämmössä , pestiin PBST (0,1% Triton X-100 PBS: ssä), sitten esikäsitelty blokkausliuoksella (3% BSA: ta ja 2% kuorittua maitoa (Difco, USA) PBST: ssä) 4 ° C: ssa yön yli. Soluja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla; anti-Oct4 (01:50; Santa Cruz Biotechnology, USA), anti-Sox2 (1:500; Abcam, UK) ja anti-Nanog (1:200; ReproCELL, Japani), anti-CDH1 (1:200; TaKaRa , Japani), anti-SSEA4 (1:500, Hybridoma Bank, USA), ja anti-TRA-1-60 (1:500; Millipore, USA) vasta-aineita, 4 ° C: ssa yön yli. Sitten ne inkuboitiin toissijaisen vasta-aineet; anti-kani-IgG: tä tai anti-hiiri-IgG: llä konjugoituna Alexa 488 (1:500; Molecular Probes, USA) estopuskurissa 1 tunti huoneenlämpötilassa. Solut vastavärjättiin DAPI (4,6-diamino-2-fenyyli), ja on asennettu kanssa SlowFade valoa mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää (Invitrogen).

Kasvaimen muodostuminen

solususpensiota, jossa oli 5,0 x 10

5 iESCs tai iCSCs 200 ui DMEM ihon alle ruiskutettiin imusolmukkeet alueen tai istutetaan munuaisten kapselit immunopuutoksesta SCID-hiirten (CLEA, Japani). Kasvaimia kirurgisesti leikattiin 5-7 viikkoa istutuksen jälkeen, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä ja upotettiin parafiiniin. Osiot 5 um paksu värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla.

Microarray ja tietojenkäsittely

microarray analyyseja, 1 ug kokonais-RNA leimattiin standardin Affymetrix protokollia ja hybridisoidaan Affymetrix ihmisen genomin U133 Plus 2.0 Array (näytteet ihmisperäisiä). Raakadataa normalisoitiin MAS 5.0 menetelmää käyttäen Bioconductor paketin R-ohjelma (https://www.r-project.org/). Lämpöä karttoja geeniekspressioprofiili kaikkien geenien kustakin solulinjasta visualisoitiin MeV ohjelman (https://www.tm4.org/mev/). Hierarkkinen klustereita laskettiin Pearsonin korrelaatiokerrointa (r) ja visualisoida pvclust paketin R ohjelmasta. Sillä parvikuvio analyysien raakadataa normalisoitiin Tukeva Multichip keskiarvo (RMA). Sirontakaavioissa visualisoitiin käyttäen Bioconductor paketin R ohjelmasta.

Tulokset ja keskustelu

eristäminen iESCs ja iCSCs

Ihmisen iPSCs poimittiin pesäkkeinä noin 30 päivän kuluttua retrovirus- transduktio Oct4, Sox2, Klf4 ja c-Myc osaksi somaattisen fibroblastien TIG1, solulinja eristettiin ihmisen sikiön keuhkojen (Fig. 1A). Tehokkuus iPSC sukupolven oli vähemmän kuin 1%, ja muiden solujen populaatiot olivat eri tavoin ohjelmoida uudelleen. Jotkut differentiaalisesti ohjelmoida somaattisten solujen osoitti omaisuutta itseuudistumisen muodostuu pesäkkeitä, jotka sisälsivät soluja (iESCs) ja epiteelisolujen morfologia MEF-conditioned iPSC väliaineessa (Fig. 1A). iESCs ylläpidettiin epiteelisolujen morfologia noin 10 kohtia, koska olivat alttiita eriyttää (Fig. S1A). Siksi analysoida erilaistumisen potentiaalin iESCs EB muodostuminen aiheutettiin jousitus kulttuuri (Fig. 1 B). Onnistuneesti muodostettu iESC EB esittää pluripotenttisuuden analysoituna RT-PCR: llä (Fig. 2A) on kiinnitetty pohjaan viljelymaljoihin eristämiseksi itseuudistumisen kantasoluja. Näin ollen ensimmäisenä (1.) ICSC linjat eristettiin poimimalla solu möhkäleitä laajeni EB kolmessa itsenäisessä kokeessa oli vakaasti jatkuvat pidempään kuin 20 kohtia, tai uudelleen pinnoitettu pakastetuista-varastoidaan soluissa (Kuva. 1 B). Todentaa, että ensimmäinen iCSCs, toinen (2.) iCSCs eristettiin kasvaimet syntyvät sarjasiirteillä kanssa ruiskuttamalla 1. iCSCs osaksi imusolmukkeet alueille immuunivajaisiin SCID kahdessa riippumattomassa kokeessa (Fig. 1 C). 2. iCSCs muistuttava 1. iCSCs oli stabiilisti yllä ominaisuuksia epiteelisolujen morfologia ja vahva solujen kasvua yli 20 kanavat (Fig. 1 C). Seuraavaksi tutkia pluripotenttisuuden iESCs, 1. iCSCs, ja 2. CSCS, solut istutetaan munuaisen kapseleita tai imusolmukkeet alueilla SCID hiirillä. Muodostuminen teratoomat sisältävät ecotoderm, Mesodermi, ja endodermistä johdannaisten havaittiin hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäys korkealla taajuudella kaikissa solutyypeissä (Fig. 2B), mikä osoittaa, että kolme solutyypit olivat kantasolujen hankkiminen pluripotenttisuus siitä huolimatta, että epiteelisolujen morfologia.

(A) tuottaminen iPSCs ja iESCs suoraan uudelleenohjelmointi ensisijaisen sikiön fibroblastien (TIG1). (B) Generation ensimmäisenä (1.) iCSCs poimimalla solu tallustella (keltainen ympyrä) kautta iESCs johdettuja embryonaalisia (iESC EB) muodostumista. (C) Generation toisen (2.) iCSCs poimimalla solu tallustella (keltainen ympyrä) kautta sarjasiirteillä on ensimmäinen iCSCs.

(A) Expression of eksogeenisten, pluripotenttien merkki, ja sukua merkki geenejä embryonaalisia (EB) muodostettu iESCs ja iPSCs RT-PCR-analyysit. (B) Parafiinisektioista of teratoomat, joista kertyi iESCs, ensimmäinen iCSCs, ja toinen iCSCs istutusta, värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla. NE, neuroepithelium (Ektodermi); CA, rusto (Ektodermi); MU, lihas (Mesodermi); RE, hengitysteiden epiteelin (Endodermi).

Geenien ilmentyminen profiilin iESCs ja iCSCs

Jotta voidaan tutkia geenin ilmentymistä iESCs ja iCSCs, globaali geeniekspressioprofiilien havaita geenin ilmentymistä microarray analyyseja verrattiin. Niistä TIG1, iESCs, 1. iCSCs, ja iPSCs, iESCs ja iCSCs muistuttavat läheisesti toisiaan. Mielenkiintoista on, iESCs ja iCSCs olivat samanlaisia ​​kuin somaattisten solujen ja TIG1 sijaan ihmisen pluripotenttien solujen (iPSCs ja ES-solujen), vaikka yhdenmukainen korkea ilmentyminen eksogeenisen

Oct4

,

Sox2

Klf4

, ja

c-Myc

(Fig. S2 ja Fig. 3A ja 3B). Tämän mukaisesti tiedot lämpökartalla analyysien osoitti, että iESCs ylläpitänyt välitilaa somaattisten fibroblasteja TIG1 ja pluripotentteihin iPSCs (Fig. 3A). Yksityiskohtaisemmin parvikuvio analyysit osoittivat, että iESCs, ilmentyminen somaattisten markkerigeeni

MAB21L1

ja

NR2F2

oli korkea iPSCs, kun taas ilmaus pluripotenttien markkerigeeni T

DGF1, Nanog, ZIC2,

ja

TPD52

samanlainen iPSCs (Fig. 3A). Samanlaisia ​​iESCs, ensimmäinen iCSCs leimasi kuvaamaan joitakin somaattisen markkerigeeni. RT-PCR-analyysit varmistanut, että endogeenistä pluripotenttien markkerigeenejä,

Oct4

,

Sox2

,

Nanog

,

REX1

,

LIN28

oli ilmeisesti alhainen, kun taas somaattinen markkerigeeni,

EMP1

,

PPARy

,

FOXF2

, ja

NR2F2

olivat erittäin ilmaistaan 1. ja 2. iCSCs (Fig. 3A ja 3B), mikä osoittaa, että epigeneettiset uudelleenohjelmointi meni puoliksi pyyhkimällä somaattiset muisti ja luoda pluripotentteihin transkriptio verkkoon. Alhainen ilmentyminen Nanog havaittiin immunosolukemiallisella 1. ja 2. iCSCs, kun taas korkea endogeenistä Oct4 /eksogeenisen Oct4 ja endogeeninen Sox2 /eksogeeninen Sox2 havaittiin (Fig. 3C). Immunosolukemialliset analyysit osoittivat, että pluripotenttien markkereita CDH1 ja SSEA4 oli heikosti ilmaistu iESCs ja iCSCs, kun taas kova iPSCs. Lisäksi ilmaus TRA-1-60 havaittiin iPSCs, mutta ei iESCs ja iCSCs (Fig. S3). Yhdessä iESCs ja iCSCs säilytti solujen tila välillä TIG1 ja iPSCs.

(A) Geenien ilmentyminen mikrosiruanalyysi keskuudessa TIG1, iESCs, iCSCs, ja iPSCs. Heat kartta (ylempi kuva) esittää differentiaalisesti ilmentyvien geenien somaattisten ja pluripotenttien geenejä. Sirontakaavioissa (alempi paneeli) osoittaa vertailu globaalin geeniekspressioprofiilien. Keltainen; geenien Ydinmoduuli, sininen; geenien Kiinan moduuli, ja punainen; geeni Myc moduulissa. (B) ekspressio analyysi pluripotenttien markkerigeenejä, somaattisten solujen markkerigeeni, ja eksogeenisten geenien TIG1, iPSCs, iESCs, 1. iCSCs, ja 2. iCSCs RT-PCR-analyysit. (C) Expression pluripotenttisten markkeriproteiinien (vihreä) in iESCs, ensimmäinen iCSCs, ja toinen iCSCs immunosolukemiallisella. Soluytimet vastavärjätään sininen DAPI (Blue). Ekso-, eksogeeninen; Endo-, endogeeninen.

Acquisision pluripotenttisuuden ennen perustamista iPSC identiteetin

Tässä prosessissa ohjelmoida uudelleen somaattisten solujen iPSCs, soluihin progressiivisesti muuttaa ilmaisun kuvioita ja morfologia. Näin ollen verrata geeniekspressioprofiilit erilaisia ​​ohjelmoida uudelleen soluja, integroitu analyysi järjestelmä ekspression profiileja, suhteen kinetiikka-moduulit, vaaditaan. Kolme ES cell moduulit, Core, Kiinasta, ja Myc (CPM), jotka ovat toiminnallisesti erotettavissa, on määritelty [9]. Core moduuli sisältää tunnettuja tekijöitä ydin sääntelyn piirit, kuten

Nanog, Oct4, Sox2, TCF3

, ja

REX1

. VRK moduuli sisältää geenin yleensä tukahdutettu ES-soluissa, kuten

HOX

klusteri geenejä. Myc-moduuli koostuu geeneistä, jotka ovat yhteisiä tavoitteita seitsemän tekijän, MYC, MAX, NMYC, DMAP1, E2F1, E2F4, ja ZFX. Lisäksi ES-solujen kaltaisia ​​moduuli määritellään erottamaan toisistaan ​​ES-soluja, aikuisen kudoksen kantasolujen ja ihmisen syövissä [13]. Tässä osoitamme tietoja CPM moduulit, koska analyysi datan ES kennomainen moduuli verrattavissa data Ydinmoduuli CPM moduuleja, johon kuului pluripotentteihin markkerigeeni.

ohjelmoida TIG1 osaksi iESCs, ylössäätöä Core ja Myc moduulit tarvittiin (Fig. 4 ja Fig. S4). iESCs ja iCSCs leimasi suuri aktiivisuus Kiinan ja Myc-moduulit, kun Ydinmoduuli oli korkea iESCs ja alhainen iCSCs. Oli tärkeää asettaa esteen poistaminen somaattisten muistin että Kiinasta moduuli säilytti korkean aktiivisuuden kaikissa TIG1, iESCs, ja iCSCs mikä näkyy

FOXF2

ja

NR2F2

(Fig. 3A). Jotta täysin ohjelmoida osaksi iPSCs alkaen TIG1, induktio alas-säätely Kiinan moduulin oli tarpeen (Fig. 4 ja Fig. S4), mikä osoittaa, että loppuun perustamisen iPSC transkription verkko liittyy alas-säätely Kiinan moduuli.

Properties itseuudistumisen ja pluripotenttisuus ovat sidoksissa ohimeneviä tai jatkuva säätely ylöspäin Core ja Myc-moduulit, mutta ei PRC moduulia. C, Ydinmoduuli; P, PRC-moduuli; M, Myc-moduuli.

Stable solulinjat, TIG1, ICSC, ja iPSC, leimasi vastavuoroista aktiivisuutta Core ja Kiinasta moduulit, vaikka epävakaa iESCs osoitti samanaikaisesti säätely ylöspäin kahden moduulin , mikä viittaa siihen, että geenit luokitella kahden moduulin toimivat kilpailukykyisesti uudelleenohjelmointi. Erityisesti hankinta itseuudistumisen ja pluripotenttisuus oli yhdistetty säätely ylöspäin Core ja Myc, mutta ei Kiinasta, moduulit (Fig. 4). Nämä tulokset osoittivat, että omaisuutta itseuudistumisen ja pluripotenttisuus voitaisiin siirrettävä somaattisten ydinten ennen täyttä uudelleenohjelmointi osaksi iPSCs. Havainto, että tietty solupopulaation iESCs oli ohjelmoida uudelleen osaksi iPSCs spontaanisti tukenut tätä käsitettä (Fig. S1B). Kriteerit itseuudistumisen ja pluripotenttisuus käytetään laajalti määrittelyssä ihmisen iPSCs. Kuitenkin omaisuutta itseuudistumisen ja pluripotenttisuus voidaan siirrettävä erilaisia ​​solutyyppejä avulla uudelleenohjelmointi enemmän kuin odotimme, ja tarvitaan, mutta ne eivät riitä, määrittelylle iPSC identiteetin.

ohjelmoida somaattisia soluja iCSCs, up-sääntely Myc moduuli on keskeinen tapahtuma. Promoottorialueille sitoo MYC linkitetään histoni H3 lysin4 trimethylation (H3K3me3), joka korreloi positiivisesti muodostumista avoimen kromatiinin, ja geeniaktivaatioon kuin epigenetic allekirjoitus [9]. Lisäksi MYC vuorovaikutuksessa histoni ase- tyylitransferaaseja, jotka liittyvät transkription aktivaatio komplekseja [14]. Myc-moduuli mahdollistaa solujen aineenvaihduntaa aktivoimalla yleisen geenejä. Geenien Ydinmoduuli ovat myös ajan säännellä somaattisia uudelleenohjelmoinnin sen iCSCs.

Oct4

,

Sox2

, ja

Nanog

, jotka ovat keskeisiä Ydinmoduuli pelaajia, tukahduttavat kehityksellisesti tärkeitä homeodomain proteiinit yhteistyön avulla ammattia kohdegeenien, kun taas edistää itse- uusiminen ja pluripotenttisuus positiivinen säätely geenejä, jotka koodaavat osia keskeisten signalointireittien [15]. Kun nämä otetaan huomioon, Core ja Myc moduulit rooli annetaan ominaisuudet itseuudistumisen ja pluripotenttisuus somaattiseen ydinten, kun taas jatkuvasti korkea aktiivisuus Kiinasta moduuli TIG1, iESCs ja iCSCs vaikeuttaa palautuksen somaattisen muistin joissakin kehityksellisesti tärkeitä homeodomain proteiineja (Fig. 4). Polycomb tukahduttavaa komplekseja, erityisesti Polycomb tukahduttavaa kompleksi 2 sisältävien Ezh2, Eed, ja Suz12, ovat ratkaisevia repressors geenien yhdessä H3K27me3 [16]. Jotta nollata somaattisten muisti geenien kanssa homeodomeenin in iESCs ja iCSCs ja yli-kirjoittaa ES kennomainen epigeneettiset allekirjoitus ohjelmoida uudelleen ytimet iESCs aktiivisuus Kiinan moduulin tulee pienentää jatkuvasti tai tilapäisesti. Suhteellisen alhaisempaa Kiinan moduuli voi olla keskeinen tapahtuma uudelleenohjelmointia somaattisten solujen iPSCs. On arveltu, että puute H3K27me3 on merkittäviä rooleja edistämisessä uudelleenohjelmointi edeltävästä iPSCs jotta iPSCs myöhään vaiheessa uudelleenohjelmointi [17]. Kohtalo somaattisten solujen, ne ovat uudelleen iCSCs tai iPSCs voitaisiin määrittää aktiivisuus Kiinan moduulin, hankittuaan valmiutta itseuudistumisen ja pluripotenttisuuden (Fig. 4).

tukeminen tiedot

Kuva S1.

Spontaani erilaistuminen iESCs ja muuntaminen iPSCs. (A) eriyttäminen iESCs jälkeen pitkän aikavälin kulttuuri. (B) Perinteinen iPSCs (oikea paneeli) muodostettiin pieni pesäke (keltainen ympyrä vasemmassa paneelissa) esiintyvät iESC kulttuuri suurella solutiheys.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0048699.s001

(TIF )

Kuva S2.

Global geeniekspressioanalyysiä iESCs ja iCSCs. Vertaileva analyysi globaalin geeniekspressioprofiili vuonna iPSC, ihmisalkion kantasoluja (ES) solu, iESC, ensimmäinen ICSC, ja TIG1 riviä geeniekspressiota mikrosirujen määrityksessä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0048699.s002

( TIF)

Kuva S3.

ilmentäminen pluripotenttien merkki proteiinien iESCs ja iCSCs. Expression Merkittyjen solupintaproteiinien, CDH1, SSEA4 ja TRA-1-60 havaittiin kuin vihreän fluoresenssin, kun taas solutumissa olivat sinisiä DAPI.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0048699.s003

( TIF)

Kuva S4.

Keskimääräiset geenien ilmentyminen arvot (log2) CPM moduuleista somaattisten solujen ja pluripotenttien kantasolujen.

doi: 10,1371 /journal.pone.0048699.s004

(TIF) B Taulukko S1.

Alukkeet RT-PCR-analyysit.

doi: 10,1371 /journal.pone.0048699.s005

(DOC) B