Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhassyöpä on yleisin pahanlaatuinen kasvain miehillä. Esillä olevassa tutkimuksessa, LNCaP (androgeenistä herkkä ihmisen eturauhasen syöpäsolujen) ja PC-3-soluja (androgeenistä riippumaton ihmisen eturauhasen syöpäsolujen) käytettiin tutkimaan syövän ionisoivan säteilyn (IR) yhdistettynä arseenitrioksidi (ATO ) ja määrittämään taustalla olevien mekanismien

in vitro

ja

in vivo

. Olemme havainneet, että IR yhdistettynä ATO lisää terapeuttinen teho verrattuna yksittäisiin hoitoihin LNCaP-ja PC-3 ihmisen eturauhasen syöpäsoluja. Lisäksi, yhdistetty hoito osoitti parannettu reaktiivisen hapen (ROS) sukupolven verrattuna hoitoon ATO tai IR yksin PC-3-soluja. Yhdistetty hoito indusoi autophagy ja apoptoosin LNCaP, ja lähinnä aiheuttama autophagy PC-3-solut. Solukuolemaa, joka on saatu aikaan yhdistetty hoito oli pääasiassa seurausta inhibition Akt /mTOR signalointireittejä. Lisäksi olemme havainneet, että yhdistetty hoito solujen esikäsitelty 3-MA johti merkittävään muutokseen AO-positiivisten solujen ja sytotoksisuus. Eräässä

in vivo

tutkimuksessa yhdistelmähoito oli anti-kasvaimen kasvua vaikutuksia. Nämä uudet havainnot osoittavat, että yhdistetty hoito on mahdollinen terapeuttinen strategia ei ainoastaan ​​androgeeniriippuvaisissa eturauhassyöpä mutta myös androgeenista riippumaton eturauhassyöpä.

Citation: Chiu HW, Chen YA, Ho SY, Wang YJ (2012 ) Arseenitrioksidi Parantaa säteilyherkkyys androgeeniriippuvaisissa ja riippumattaman ihmisen syöpäsolujen. PLoS ONE 7 (2): e31579. doi: 10,1371 /journal.pone.0031579

Toimittaja: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 marraskuu 2011; Hyväksytty: 9. tammikuuta 2012 Julkaistu: 20 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Chiu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Science neuvosto, Taiwan (NSC 98-2314-B-006-034-My2) ja Sinlau Christian Hospital, Tainan, Taiwan. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on merkittävä terveysongelma miehille kaikkialla maailmassa. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että aktivointi androgeenireseptoreita (AR), jonka androgeenit tarvitaan kasvua ja selviytymistä eturauhasen syöpäsoluja. Lisäksi useimmat eturauhasen kasvaimet androgeeni-riippuvaisia ​​alussa [1]. Kuitenkin ajan myötä, kasvain toistuu androgeeni-tulenkestävä tavalla ja hetkellä aggressiivisemman ja metastaattisen fenotyypin, joka on vastustuskykyinen edelleen hormonaalista manipulointia [2]. Koska androgeenit tärkeitä rooleja kasvua ja elossa eturauhassyöpäsolujen, kasvava näyttö viittaa siihen merkittävä rooli Akt kehittämisessä hormonia riippumattoman eturauhassyövän hoitoon [3], [4], [5]. Inhibition Akt eturauhasen soluissa kumoaa HER-2 /neu-indusoidun AR signalointi- ja solujen eloonjäämistä /kasvun vaikutuksia puuttuessa tai läsnä ollessa androgeenireseptorin [4]. Lisäksi onnistunut eteneminen androgeenista riippumaton valtio tarvitsee ehjä PI3K signalointi [6]. Siten estyminen Akt-reitin on nousemassa houkuttelevana kliininen tavoite ehkäisemiseksi hormoneja tulenkestävien tauti.

Nyt on runsaasti todisteita hyödyistä suuren annoksen ulkoinen säde sädehoidon potilaalla on kliinisesti paikallinen eturauhassyöpä [7]. Kuitenkin suuren annoksen sädehoito aiheuttaa huomattavaa vahinkoja normaaliin solupopulaatioiden hoitoalueella [8]. Siten kemiallisten määritteet kuten säteilyherkistimet yhdessä pienen annoksen säteilytys saattaa lisätä yleistä terapeuttista tehoa. Arseeni on pitkään käytetty syöpälääke perinteisen kiinalaisen lääketieteen [9]. Äskettäin arseenitrioksidi (ATO) on onnistuneesti käytetty hoidossa tulenkestävien tai uusiutunutta akuutti promyelosyyttinen leukemia (APL), ja sen tehokkuus on vahvistettu myös potilailla resistenttejä tavanomaisille kemoterapiaa [10]. Aikaisemmat tutkimukset ovat myös osoittaneet, että yhdistelmä ATO ja ionisoiva säteily (IR) on todennäköisesti tehokkain strategia leukemiaa ja kiinteitä kasvaimia [11], [12], [13]. ATO voisi olla voimakas säteily herkistävä ja voi lisätä paranemisasteella pahanlaatuisia soluja. Kuitenkin vaikutukset ja tarkkaa mekanismia yhdistetyn hoitoon ATO ja IR eturauhassyöpää vastaan ​​ovat edelleen epäselviä.

Autophagy on yksi niistä mekanismeista, stressin sietokyky, joka ylläpitää solujen elinkelpoisuus ja voi johtaa kasvaimen lepotilan, etenemistä ja terapeuttinen vastus. Kuitenkin monet syöpälääkkeiden voisi myös aiheuttaa liiallista tai pitkittynyt autophagy joka laukaisee kasvain solukuolemaa. Tutkimukset ovat käynnissä määritellä optimaalinen strategioita moduloida autophagy syövän ennaltaehkäisyyn ja hoitoon sekä hyödyntää autophagy kuin kohteena syöpälääkettä löytö [14]. Useita yhteyksiä esiintyy ylävirtaan apoptoottisten ja autophagic koneet, joissa signalointipolkujen säätävät sekä prosesseja. Aktivointi PI3-kinaasi /AKT, tunnettu menetelmä apoptoosin inhiboi- miseksi, estää myös autophagy [15]. Akt on seriini /treoniini proteiinikinaasi, joka on keskeisessä asemassa tukahduttamaan apoptoosin säätämällä sen loppupään reittejä [16]. Akt myös fosforyloi nisäkkään rapamysiinin kohde (mTOR), joka on raportoitu estävän induktion autophagy [17]. Sekä apoptoosin ja autophagy voidaan indusoida tietyissä kasvainsoluissa alle hoitoon syöpälääkkeiden [18], [19].

Atorvastatiini indusoi autophagy on androgeenireseptorin negatiivinen eturauhassyöpä PC-3-solujen aktivoitumisen kautta of LC3 transkriptio [20]. Lisäksi viimeaikainen tutkimus on osoittanut myös, että luonnollinen BH3 jäljittelevää ((-) – Gossypolin) indusoi autophagy apoptoosin kestävä eturauhassyövän muuntamalla Bcl-2-Beclin1 vuorovaikutusta Endoplasmakalvosto [21]. Androgeenista riippumaton eturauhassyöpä solujen korkeampi Bcl-2 olivat resistenttejä (-) – Gossypolin aiheuttamaa apoptoosia. Kuitenkin (-) – Gossypolin indusoi samalla tasolla koko solukuoleman molemmissa androgeeniriippuvaisissa ja riippumattaman soluja; se tappoi androgeenireseptorin solut pääasiassa apoptoosin, mutta androgeeni-riippumaton soluja, tila solukuoleman ei ollut täysin ymmärretty [21]. Äskettäin on osoitettu, että ATO tai IR voi myös indusoi autophagy, mutta ei apoptoosin syöpäsoluissa [22], [23].

Esillä olevassa tutkimuksessa, LNCaP (androgeenistä herkkä ihmisen eturauhasen syöpäsolujen) ja PC -3-soluja (androgeenistä riippumaton ihmisen eturauhasen syöpäsolujen) käytettiin tutkimaan syövän vaikutukset IR yhdistettynä ATO. Tyypit indusoimaa solukuolemaa IR yhdistettynä ATO tutkittiin. Tutkimme myös mahdollisia mekanismeista apoptoosin tai autophagy LNCaP ja PC-3-solujen indusoiman IR- ja /tai ATO.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja lääkehoito

ihmisen eturauhasen syöpäsolulinjoissa LNCaP (ATCC CRL-1740) ja PC-3 (ATCC CRL-1435) saatiin the American Type Culture Collection (ATCC). Soluja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Gibco BRL, Grand Island, NY), joka oli täydennetty antibiooteilla, joka sisälsi 100 U /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä (Gibco BRL, Grand Island, NY), ja 10% naudan sikiön seerumia (HyClone, South Logan, UT, USA) .Cells inkuboitiin kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2 37 ° C: ssa. Eksponentiaalisesti kasvavat solut irrotettiin 0,05% trypsiini-EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY) RPMI 1640 -alustassa. Altistumista arseenitrioksidille (Sigma Chemical Co.), 1 mM tuoreet kantaliuokset valmistettiin ennen jokaista koetta ja steriloida suodattamalla käyttäen 0,2 um ruiskun suodattimen. Reagenssi lisättiin tiivistetyssä muodossa elatusaineeseen ja sekoitettiin varovasti. Viljelmiä viljeltiin sen jälkeen ajat merkitty kuvioihin.

hoito säteilytys ja solunelinkykyisyysmääritys

IR suoritettiin 6 MV röntgensäteiden avulla lineaarikiihdyttimellä (Digital M Mevatron Accelerator Siemens Medical Systems, CA, USA) annoksella nopeudella 5 Gy /min. Vielä 2 cm kudoksen yhtä bolus pantiin päälle muovinen kudosviljelypullossa varmistaa sähköisen tasapainon, ja 10 cm kudoksen yhtä materiaali asetetaan pulloon saada täyttä takaisinsirontailmiön. Käsiteltyjen solujen sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen 0,1 ml: aan PBS: ää. Kukin solususpensio (0,02 ml), sekoitettiin 0,02 ml: n trypaanisininen-liuosta (0,2% PBS: ssä). Sen jälkeen, kun 1 tai 2 min, kutakin liuosta pantiin hemosytometrillä, ja sinistyneen solut laskettiin ei-ehjä.

klonogeeninen määritys

Soluja säteilytettiin 2, 4 tai 6 Gy . ATO lisättiin soluihin pitoisuuksina 2 tai 5 uM. Solut trypsinoitiin ja laskettiin. Tunnettu lukumäärä soluja myöhemmin maljattiin uudelleen 6 cm: n viljelyastioihin ja palautettiin inkubaattoriin, jotta pesäkkeiden kehittämiseen. Seitsemän päivän kuluttua, pesäkkeitä (jotka sisältävät ≥50 solut) värjättiin 0,5% kristalliviolettiliuoksella 30 min. Plating tehokkuus (PE) on suhde pesäkkeiden lukumäärä ja solujen määrä kylvetään säteilyttämätön ryhmässä. Laskeminen hengissäsäilymisosuudet (SFS) suoritettiin käyttäen yhtälöä: SF = pesäkkeiden /(solujen ympätty × PE), ottaen huomioon yksittäisten PE.

määritys varhaisen apoptoosin

Apoptosis oli arvioi tarkkailemalla translokaatio fosfatidyyliseriinin solun pintaan, havaittuna anneksiini V apoptoosin havaitseminen pakki (Calbiochem, San Diego, CA, USA), mukaan edellisessä raportissa [13].

mittaaminen ROS

reaktiivisen hapen (ROS) tuotanto seurattiin virtaussytometrialla käyttämällä 2,7-dichlorodihydrofluorescein diasetaatti (DCFH-DA), kuten aiemmin on kuvattu [24]. Hoidon jälkeen IR ja /tai ATO, soluja inkuboitiin 20 uM DCFH-DA 30 min. Solut kerättiin, pestiin kerran ja suspendoitiin uudelleen PBS: ään. Fluoresenssia seurattiin käyttäen virtaussytometriä.

Supravital solujen värjäys akridiinioranssilla ja autophagy havaitsemiseksi

Soluvärjäys akridiinioranssilla (Sigma Chemical Co.) suoritettiin julkaistujen menetelmien mukaisesti [13]. Soluja, jotka on esikäsitelty autophagy estäjien 3-metyyliadeniini (3-MA) ​​(Sigma Chemical Co.), jonka lopullinen konsentraatio on 1 mM: ssa 1 h ennen IR-hoitoa.

elektronimikroskopialla

solut kiinnitettiin liuoksella, joka sisälsi 2,5% glutaraldehydiä ja 2% paraformaldehydiä 0,1 M kakodylaattipuskurissa, pH 7,3, 1 tunnin ajan. Kiinnityksen jälkeen näytteet jälkikiinnitettiin 1% OsO

4 samassa puskurissa 30 minuutin ajan. Ultra-ohuet leikkeet sittemmin tarkkailtiin lähetyksen (JEOL JEM-1200EX, Japani) 100 kV.

Western blot-analyysi

Yhteensä solun lysaatit valmistettiin keräämällä solut proteiinin uuttopuskuria 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa, kuten aiemmin on kuvattu [12]. Tiheydet kvantitoitiin tietokoneella densitometrillä (AlphaImager ™ 2200 System Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA). Ilmentyminen GAPDH käytettiin proteiinin lastaus ohjaus. Vasta-aineet havaitsemiseksi Akt, fosfo-Akt, fosfo-mTOR, fosfo-p70S6K, ERK, fosfo-ERK, fosfo-PDK1, PDK1, JNK, p38, fosfo-p38, Beclin 1, Bax ja Bcl-2 saatiin Cell Signaling Technology (Ipswich, MA, USA); anti-GAPDH saatiin Abcam (Cambridge, MA, USA); LC3, Atg5 ja Atg5-12 saatiin Abgent (San Diego, CA, USA); anti-P62 /SQSTM1 vasta-saatiin MBL (Nagoya, Japani); anti-poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP) vasta-aine saatiin Millipore (Bedford, MA, USA); mTOR, p70S6K, fosfo-JNK, kaspaasi-3 ja pilkottiin kaspaasi-3 saatiin Epitomics (Burlingame, CA, USA).

In vivo

kasvaimen kasvun määrityksiä käyttäen PC- 3 kasvain malli nude-hiirissä

Kaikki kokeet hiirillä suoritettiin ohjeiden mukaan meidän instituutti (oppaasta hoito ja käyttö Laboratory Animals, National Cheng Kung yliopisto). Eläinten käyttö protokollan alla on tarkistanut ja hyväksynyt Institutional Animal Care ja Käytä komitea (IACUC) (Hyväksyntä nro: 99138). Kuudesta kahdeksaan viikkoa vanhoja nude-hiirten (BALB /cAnN.Cg-Foxn1

nu /CrlNarl) hankittiin National Laboratory Animal Center (Taiwan). Eläimiä pidettiin viisi häkkiä kohti 24 ± 2 ° C: ssa ja 50% ± 10% suhteellinen kosteus ja altistettiin 12 tunnin valo /12 tunnin pimeä jakso. Eläimiä sopeutettiin 1 viikko ennen alkua kokeiluja ja syötetään Purina kuivamuonadieetillä ja vettä halun. Kasvaimet aiheuttama ihon alle (s.c.) injektio PC-3-solut (2 x 10

6 solua 0,1 ml: ssa PBS) yhdessä kohtaa oikeaan kylkeen. Kasvaimet (visualisoida pieniä kyhmyjä klo injektiopaikoilla) esiintyi noin 7 päivää injektion jälkeen, ja eläimet jaettiin satunnaisesti kuhunkin ryhmään. Hiiriä käsiteltiin: (1) ajoneuvon (PBS), (2) 6 mg /kg ATO kolme kertaa viikossa kahden viikon ajan (päivänä 0, 2, 4, 7, 9 ja 11), (3) yksittäisen annoksen 6 Gy IR, tai (4) yhdistelmä mittainen 6 mg /kg ATO kolme kertaa viikossa kahden viikon alkoi heti kerta-annoksen jälkeen 6 Gy IR. Hiiren ruumiinpainot mitattiin kerran viikossa ja käytettiin indikaattorina systeemisen toksisuuden hoidossa. Kasvaimen kasvu mitattiin joka toinen päivä, ja tuumorin tilavuus laskettiin alla olevan kaavan [25]: Tiedot on ilmaistu suhteellinen kasvaimen tilavuus verrattuna esikäsittely tilavuus mitattiin vuorokautena 0. kasvaimen nelinkertaistaa ajan (TVQT, päivinä) määritettiin parhaiten sopiva regressioanalyysiä. Kasvaimen kasvun viivästyminen (TGD) aika määritellään erotus TVQT käsitellyn kasvainten verrattiin käsittelemättömään kontrolliin kasvaimia. TVQT ja TGD aika laskettiin kunkin yksittäisen hiiren ja keskiarvo kullekin ryhmälle. Tuumorin kasvun inhibitio laskettiin seuraavasti: Esto (%) = (kasvaimen tilavuus käsittelemättömien kontrollihiirten kasvaimen tilavuus käsiteltyjen hiirten) /kasvaimen tilavuus käsittelemättömien kontrollihiirten x 100.

immunohistokemiallinen (IHC) värjäystä analyysi

parafinoidut kudosleikkeiden (4 pm) kuivattiin, poistettiin parafiini, ja nesteytyksestä. Sen jälkeen, kun mikroaaltouuni esikäsittelyn sitraattipuskurissa (pH 6,0; antigeeniin haku), levyt upotettiin 3% vetyperoksidia 20 min estää endogeenisen peroksidaasin. Intensiivisen PBS: llä pesun jälkeen levyt inkuboitiin yön yli 4 ° C: n LC3 (MBL, Japani), PCNA (ProteinTec Group, Inc., Chicago, USA) ja Atg5 (Abgent, San Diego, CA, USA) vasta-aineita. Leikkeitä inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja levyt kehitettiin Starr TREK Universal HRP detektioreagenssipakkaus (biocare lääketieteen, Concord, CA). Lopuksi objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä. Kukin dia skannattiin alhaisella teholla (x 200).

Tilastollinen

Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Tilastollinen merkittävyys määritettiin Studentin t-testi vertailu keinoja tai yksisuuntaisen varianssianalyysin kanssa post-hoc Dunnettin testi [26]. Erot katsottiin olevan merkittäviä, kun p 0,05.

Tulokset

Optimaalinen annos ja aika valinta IR ja ATO hoitoon LNCaP ja PC-3-solujen

elinkelpoisuus LNCaP-ja PC-3-solujen havaittiin eri annoksilla IR (0-8 Gy) 6, 12, 18, 24 ja 48 tuntia (kuvio. 1A). Käsittely IR yksinään vähensi elinkelpoisuuden LNCaP-ja PC-3-solujen annoksesta riippuvalla tavalla. Lisäksi solujen elävyys havaittiin eri pitoisuuksilla ATO (0-15 uM) 12, 24, 36 ja 48 tuntia (Fig. 1 B). ATO yksinään vähensi elinkelpoisuuden solujen pitoisuudesta riippuvalla tavalla. Käsittelyn jälkeen 5 uM ATO 48 tunnin ajan, elinkelpoisuus LNCaP-ja PC-3-solut laskettiin 60% ja 73%, vastaavasti. Kuvio 1C esittää elinkelpoisuuden ATO ja IR käsitelty yksin tai yhdessä LNCaP-ja PC-3-solut. Merkittävästi lisääntynyt toksisuus todettiin yhdistelmähoitoa verrattuna ATO ja IR hoito yksinään LNCaP-ja PC-3-solut. Kuviot 1D esittää säteilyn annos-vaste eloonjäämiskäyriä LNCaP ja PC-3-solujen kanssa tai ilman ATO hoitoa. Eloonjäämiskäyrät dramaattisesti siirtynyt alaspäin. ATO (2 uM) lisäsi IR aiheuttama klonogeeniset solukuolemaa LNCaP ja PC-3-solut. ATO vähensi hengissäsäilymisosuus annoksesta riippuvaisella tavalla verrattuna IR yksin.

(A) aika-kurssi ja annosriippuvaisia ​​vaikutuksia IR elinkelpoisuudesta LNCaP ja PC-3-solut. Soluja käsiteltiin 2, 4, 6 tai 8 Gy IR 6, 12, 18, 24 ja 48 tuntia. (B) Aika-kurssi ja pitoisuudesta riippuva vaikutus ATO elinkelpoisuudesta LNCaP ja PC-3-solut. Soluja käsiteltiin 2, 5, 10 tai 15 uM ATO 12, 24, 36 ja 48 tuntia. (C) sytotoksiset vaikutukset soluissa, joita käsiteltiin IR (4 Gy) ja ATO (5 uM). (D) säteilyannos-vaste eloonjäämiskäyristä LNCaP ja PC-3-solujen kanssa tai ilman ATO. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Measurement apoptoosin LNCaP-ja PC-3-soluja käsiteltiin ATO ja IR yksinään tai yhdistelmänä

induktio apoptoottisen solukuoleman on merkittävä kasvainten solujen vaikutuksen alaisena radio- /kemoterapian [27]. Kuten on esitetty kuviossa 2A, alussa apoptoosin LNCaP-ja PC-3-soluissa mitattiin virtaussytometrialla kanssa anneksiini V apoptoosin havaitsemiseen kit. Kvantitatiiviset tulokset osoittivat, että yhdistelmä indusoi enemmän apoptoottisen solukuoleman kuin hoito yksin ATO tai infrapunasäteilyä LNCaP. Sitä vastoin, esiintyminen varhaisen apoptoosin PC-3-soluja käsiteltiin ATO ja /tai IR-oli alhainen (alle 10%). ROS sukupolvi tutkittiin lisäksi virtaussytometrialla. Noin 3,5-kertainen solunsisäisten peroksidipitoisuudet havaittiin, kun PC-3-solut altistettiin yhdistelmähoito 1 h (kuviot. 2B, 2C). Kuvio 2D esittää western blot -analyysiä poly (ADP-riboosi) polymeraasi (PARP), kaspaasi-3, ja Bcl-2. Pilkkominen PARP aktivoitu kaspaasi-3 tulokset muodostumista 85-kDa: n C-terminaalinen fragmentti. Tuloksemme osoittivat, että katkaisua PARP ja kaspaasi-3 voisi löytyä soluissa, joita käsiteltiin IR, ATO yksinään tai yhdistelmänä LNCaP-soluissa. Olemme myös analysoineet ilmentymistaso Bcl-2, joka on vaimennin ohjelmoidun solukuoleman, ja totesi, että Bcl-2-proteiinien väheni hoidetuilla IR yksinään ja yhdistelmä kohtelu sekä soluissa.

(A ) varhainen apoptoosin havaitsemisen mitattiin virtaussytometrialla anneksiini V apoptoosin havaitseminen pakki. Soluja käsiteltiin IR (4 Gy) ja ATO (5 uM) 48 tunnin ajan. #,

p

0,05, IR vs. yhdistetty hoito. *,

p

0,05, ATO vs. yhdistetty hoito. (B) (C) ROS sukupolven PC-3-soluja käsiteltiin 5 uM ATO tai 4 Gy IR yksinään tai yhdistelmänä 30, 60, 120 min ja DCFH-DA vielä 30 min. Fluoresenssin soluissa välittömästi määritettiin käyttämällä virtaussytometria. #,

p

0,05, IR vs. yhdistetty hoito. *,

p

0,05, ATO vs. yhdistetty hoito. (D) Western blottaus PARP, halkaistut-PARP, pro-kaspaasi 3, pilkotaan-kaspaasi 3ja Bcl-2. Taso yhteensä GAPDH-proteiinin käytettiin lastaus ohjaus. Soluja käsiteltiin IR (4 Gy) ja ATO (5 uM) 48 tunnin ajan. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta kolmesta itsenäisestä kokeesta.

mittaus autophagy LNCaP-ja PC-3-soluja käsiteltiin ATO ja IR yksinään tai yhdistelmänä

Autophagy on tunnettu siitä, että muodostumisen lukuisia happamia rakkulat, joita kutsutaan hapan vesicular organelles (Avós) [23]. Mikrovalokuvia Avós havaittiin kautta vihreä ja punainen fluoresenssi akridiinioranssia (AO) -stained solut fluoresenssimikroskoopilla (Fig. 3A). Yhdistetyt hoitoa paljasti merkittävän kasvun Avós verrattuna kontrolliryhmiin LNCaP-ja PC-3-soluja. Ultrastructures PC-3-solut kussakin testiryhmässä havaittiin EM mikrovalokuvausta (Fig. 3B). Yhdistetyt käsittely johti myös suuri määrä autophagic ontelot ja autolysosomes sytoplasmassa. Lisäksi, ei ole kromatiinin kondensoitumista tai ydin- pyknosis, jotka ovat tunnusomaisia ​​apoptoosin, missä tahansa käsiteltyjen solujen. Lisäksi AO värjäytyminen kvantitoitiin käyttäen virtaussytometrialla (kuviot. 3C, 3D). Merkittävä lisäys AO-positiivisten solujen havaittiin solujen vastaanottamiseksi yhdistelmähoito verrattuna IR: llä käsitellyt tai ATO yksin molemmissa soluissa. Havaitsemiseksi ilmentymisen autophagy liittyviä proteiineja, suoritimme western blotting kanssa lysaatit LNCaP-ja PC-3-solujen vastaanottamiseksi kustakin eri hoitoja (Fig. 3E, 3F). Ilmaisu tasot LC3-II, P62, Atg5 ja Atg5-12 proteiinien lisääntynyt yhdistelmähoito molemmissa soluissa. Yhdistetty hoito indusoi autophagy LNCaP ja PC-3-solut.

(A) mikrovalokuva Avós LNCaP ja PC-3-solut. Havaitseminen vihreä ja punainen fluoresenssi akridiinioranssia (AO) -stained soluihin suoritettiin käyttäen fluoresenssimikroskooppia.

valkoiset nuolet

kohta Avós. (B) EM mikrovalokuvia PC-3-soluja käsiteltiin IR (4 Gy) ja ATO (5 uM) 48 tunnin ajan.

valkoiset nuolet

valitse autophagic vacuoles ja autolysosomes. (C) kehittäminen Avós LNCaP ja PC-3-solut. Havaitseminen vihreä ja punainen fluoresenssi in AO-värjättyjen solujen avulla virtaussytometrialla. (D) kvantifiointi Avós AO-värjättyjen solujen käsiteltiin IR (4 Gy) tai ATO (5 uM) yksin tai yhdessä virtaussytometriaa käyttämällä. Tiedot esitetään keskiarvona ± keskihajonta kolmesta itsenäisestä kokeesta. #,

p

0,05, IR vs. yhdistetty hoito. *,

p

0,05, ATO vs. yhdistetty hoito. (E) (F) Western blottaus LC3-I, LC3-II, p62 /SQSTM1, Atg5 ja Atg5-12 ilmaisun LNCaP-ja PC-3-soluja. Soluja käsiteltiin IR (4 Gy) ja ATO (5 uM) 48 tunnin ajan.

PI3K /Akt-signalointireitin on mukana yhteisessä hoidossa aiheuttaman solukuoleman ja solujen tehdään sekä apoptoottisia ja autophagic solu kuolema altistuessaan IR- ja ATO LNCaP ja PC-3-solujen

tutkia, PI3K /Akt-signalointireitin oli mukana yhdistettiin hoidon aiheuttama solukuolema, suoritimme western blotting havaitsemiseksi proteiinin fosforyloitumisaste ( Kuviot. 4A, 4B). Fosforyloitua proteiineja, jotka liittyvät PI3K /Akt signalointireittejä tutkittiin myös. Tulokset osoittavat, että fosforylaation Akt, mTOR, p70S6K ja PDK1 laski käsitellyissä soluissa yhdistetyn hoidon kontrolliin verrattuna. Seuraavaksi tutkimme, onko esto autophagy voisi muuttaa elinkelpoisten solujen prosentuaalinen, jotka oli käsitelty ATO ja IR (Fig. 5). Tätä tarkoitusta varten käytimme 3-metyyliadeniini (3-MA) ​​(an autophagy estäjä). Anneksiini V: ja AO värjäytyminen kvantitoitiin käyttäen virtaussytometrialla. Yhdistetyt hoito LNCaP-ja PC-3-soluja esikäsiteltiin 3-MA ei osoittanut vaikutusta apoptoottisten solujen (Fig. 5C, 5F), ja merkittävä väheneminen AO-positiivisia soluja (kuvio. 5B, 5E) verrattuna yhdistetyn hoitoon. Lisäksi tutkimme, onko esto autophagy voisi muuttaa sytotoksisuus yhdistetyn hoidon (Fig. 5A, 5D). Löysimme merkittävä lasku sytotoksisuus verrattuna soluihin vastaanottaa yhdistetyn hoitoa ilman esikäsittelyä 3-MA. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ATO yhdistettynä IR voi aiheuttaa autophagic solukuoleman LNCaP ja PC-3-solut.

Soluja käsiteltiin IR (4 Gy) ja ATO (5 uM) 48 tunnin ajan.

(A) (D) Effects of 3-MA sytotoksisuuteen aiheuttama kombinaatio. (B) (E) Early apoptoosin mitattiin virtaussytometrialla anneksiini V (C) (F) kvantifiointi Avós AO virtaussytometriaa käyttämällä. *,

p

0,05, ATO + IR versus ATO + IR + 3-MA.

Kasvaimen kasvu nude-hiirissä tukahdutettiin IR ja ATO

seuraavaksi seuraava arvioitiin anti-kasvaimen kasvun vaikutus IR ja ATO

in vivo

. Kasvaimia indusoitiin s.c. injektio PC-3-soluja nude-hiiriin. Mittasimme painon hiirten joka viikko, ja tuumorin tilavuus kahden päivän välein. Tulokset Tämän tutkimuksen tulokset osoittivat, että yksikään hoito-yhtään painon menetys, joka voi olla merkki myrkyllisyys (Fig. 6A). Yhdistetty hoito tukahdutti kasvaimen tilavuus ja tuumorin paino nude-hiirissä verrattuna ATO tai IR hoitoja yksin (kuviot. 6B, 6C, 6D). Kuten taulukossa 1 on esitetty, tuumorin tilavuus nelinkertaistaa aikaa (TVQT) kontrolliryhmän mitattiin päivänä 18 (17,9 ± 2,2). Kasvaimen kasvun viivästyminen (TGD) aika 18 päivää kestävä hoito ATO yksinään oli 11 päivää, mikä ei ollut merkitsevästi erilainen kuin kontrolliryhmän (

p

= 0,11). IR yksinään tuotti TGD aikaan 8,9 ± 5,1 päivää (

p

= 0,17 verrattuna kontrolliryhmään). Yhdistelmä hoito johti TGD aikaan 39,5 ± 8,3 päivää (

p

0,05 verrattuna IR yksinään tai ATO yksin). Yhdistelmähoito IR ja ATO johti kasvaimen kasvun inhibition 74% päivänä 18. Näin ollen, yhdistelmä hoidon jolla on anti-kasvaimen kasvun vaikutus

in vivo

. Seuraava, PCNA, LC3 ja Atg5 ekspressiota PC-3-tuumorien tutkittiin IHC värjäytymistä (kuvio. 6E). PCNA ilmentyminen väheni ja LC3 ja Atg5 korotettiin yhdistetyssä hoidossa verrattuna ATO tai IR hoito yksinään.

(A) mittaamiseksi painon nude-hiirissä kerran viikossa. (B) mittaus tuumorin tilavuus nude-hiirissä, joka toinen päivä. Data esitetään suhteellinen kasvaimen tilavuus (keskiarvo ± keskivirhe) normalisoitu alkuperäiseen kasvaimen tilavuus mitattiin vuorokautena 0. (C) Suora havaintoja hiirten kasvaimia. Kokeiden jälkeen, hiiret tapettiin, ja tuumorit poistettiin. (D) Mittaus kasvaimen painoa nude-hiirten lopettamisen jälkeen. (E) immunohistokemiallinen (IHC) värjäys PC-3 hiiren Ksenograftikudoksista. IHC määrittämiseen käytettiin ilmaisua tasot PCNA, LC3 ja Atg5 (× 200 tavoite suurennus).

Keskustelu

Tällä hetkellä etenemisen eturauhassyöpä tilaan of androgeeniriippumattomuuteen edelleen ensisijainen este parantaa potilaan selviytymistä. Siten uusi hoito strategiat, jotka ovat hyödyllisiä androgeenista riippumattoman tauti on tunnistettava [28]. Esillä olevassa tutkimuksessa yhdistelmän IR ja ATO osoitti potentiaalia terapeuttisen strategian eturauhassyövän hoitoon (androgeeniriippuvaisten ja riippumaton) (Fig. 1). Lian et ai. raportoitu, että luonnollinen BH3 jäljittelevää (-) – Gossypolin edullisesti indusoi autophagy androgeeni-riippumaton eturauhassyöpä solut, jotka ovat resistenttejä apoptoosin, kun taas apoptoosi on edullisesti indusoi androgeeni-riippuvaisten solujen [29]. Tämä tutkimus osoittaa, että IR yhdistettynä ATO on lisääntynyt terapeuttinen teho LNCaP ja PC-3 ihmisen eturauhasen syöpäsolujen. Erityisesti, yhdistetyn indusoi autophagy ja apoptoosin LNCaP-soluissa, ja pääasiassa indusoidun autophagy PC-3-solut (kuviot. 1, 2, 3). Edellä

in vitro

tulokset tueksi

in vivo

kokeita, palveluksessa hiiri malleja, joissa ksenograftikasvaimissa PC-3-solut. Yhdistetty hoito tukahdutti kasvaimen tilavuus ja tuumorin paino nude-hiirissä verrattuna ATO tai IR hoito yksinään (Fig. 6B). Lisäksi yhdistelmähoito IR ja ATO johti kasvaimen kasvun inhibition 74% (taulukko 1). Lisäksi kasvaimen kudokset LC3 ja Atg5 ilmentymistä lisättiin yhdistettyyn hoitoon verrattuna ATO tai IR-hoito yksinään (Fig. 6E).

Shen et ai. osoitti, että ATO hoito on suurelta osin turvallinen ja harvat potilaat vaativat hoidon lopettamisen haittavaikutusten vuoksi [30]. Plasman arseenin kliinisessä hoidossa akuutti promyelosyyttinen leukemia yleensä saavuttaa 5,5-7,3 uM [30]. On raportoitu, että huippupitoisuus plasmassa arseenin taso oli 10,6 uM jälkeen intraperitoneaalisesti 0,2 mg (10 mg /kg) ATO hiirissä [31]. Käytetty annos nykyisissä tutkimuksessa oli 6 mg /kg ATO hiirillä kokoaa plasman arseenin tasolle 6,4 uM, joka on kliinisesti merkittävä. Lisäksi tuloksemme vierassiirrekokeissa hiirimallissa todettiin, että ei ollut merkittävää kehon painon menetys hiirillä yhdistetyn hoidon verrattuna kontrolliryhmään (Fig. 6A), ja näin ollen yhdistetyt hoitotoimenpide (6 mg /kg ATO kolme kertaa viikossa kahden viikon ajan ja yksi annos 6 Gy IR) oli hyvin siedetty.

rooli autophagy syövän hoitomuotoja on yhä kiistanalainen. Autophagy on todettu olevan rooli soluksi selviytymismekanismi jonka avulla solut tyhjentää vaurioituneet soluliman proteiineja ja soluelimiin kautta lysosomaalisen hajoamisen ja hengissä metabolisen stressin [32]. Toisaalta, autophagy on havaittu edistää tyypin II ohjelmoitua solukuolemaa vasteena hypoksia, kemoterapeuttiset aineet, virusinfektio, ja toksiinit, [33]. Tuloksemme viittaavat siihen, että havaittu lisääntynyt merkittävästi autophagy voivat selittää ainakin osittain, sytotoksista vaikutusta yhdistetyn hoidon, koska esikäsittelyä 3-MA, joka on autophagy estäjä, oli suojaava vaikutus yhdistettynä hoidon indusoiman solukuoleman LNCaP ja PC-3-solut (kuviot. 3, 5). Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että Akt /mTOR-reitin keskeinen rooli sääntelyn sekä apoptoosin ja autophagy [34]. Ser473 on tärkeää tunnustamista ja fosforylaatiota Akt mukaan PDK1 [35]. Lisäksi antituumorivaikutukset OSU-03012, joka on selekoksibi johdannainen, arveltiin olevan pääasiassa välittyvät inhibition PDK1 [36]. Häiriöitä PI3K /Akt-reitin, joka päättyy esto Akt, on havaittu olevan yhteydessä autophagy aiheuttama eri antineoplastisten aineiden syöpäsoluissa [34]. Yhdistelmä indol-3-karbinolin ja genisteiiniä synergistisesti indusoi apoptoosia ja autophagy ihmisen paksusuolen syövän HT-29-soluissa inhiboimalla Akt-fosforylaation [37]. Friedrichs et ai. osoittivat, että monityydyttymättömät rasvahapot voivat estää etenemisen eturauhasen syöpäsolujen hormoni riippumattomuutta muuttamalla signaalintransduktioreitteihin kuten Akt /mTOR-reitin [28]. Ehjä PI3K /Akt-reitin tarvitaan LNCaP edetä hormoni-tulenkestävien tilassa, ja Akt aktiivisuus kasvaa, kun solut muunnos hormoniriippuvaiset hormoni-riippumaton [6]. Esillä oleva tutkimus osoittaa, että ilmentymisen p-Akt, p-mTOR, p-p70S6K ja p-PDK1 proteiinien vähentynyt soluissa, joita käsiteltiin IR yhdistettynä ATO verrattuna hoitoon ATO tai IR yksinään (Fig. 4A).