Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Kasvain infiltroituneen CD8 + T-solut korreloivat pitkäaikainen progression- vapaa ja yleinen eloonjäämisen epiteelin munasarjasyöpä (EOC). Merkittävä osa EOC potilaiden mount autovasta vasteet eri kasvaimen antigeenejä, mutta suhde autovasta ja kasvaimen infiltroituneen T-soluja ei ole tutkittu EOC tai muuta ihmisen syövän. Oletimme, että autovasta-aine ja T-soluvasteita voidaan korreloida sisään EOC ja suunnattu kohti samoja antigeenejä.

Menetelmät ja tärkeimmät havainnot

saimme Hyväksytty seerumia ja kasvainkudoksen välillä 35 potilasta, joilla on korkea-asteen serous munasarjasyöpä. Seeruminäytteet arvioitiin ELISA autovasta-aineet yhteiseen tuumoriantigeeniin NY-ESO-1. Kasvainkudoksessa tutkittiin immunohistokemiallisesti ekspressioon NY-ESO-1, erilaisia ​​T-solun markkereita (CD3, CD4, CD8, CD25, FoxP3, TIA-1 ja grantsyymi B) ja muiden immunologisten merkkiaineita (CD20, MHC-luokan I ja MHC-luokan II). Lymfaattinen infiltraatiota vaihteli huomattavasti eri kasvaimia ja mukana positiivisten solujen CD3, CD8, TIA-1, CD25, FoxP3 ja CD4. Kaksikymmentä kuusi prosenttia (9/35) potilaista osoittivat seerumin IgG-autovasta-aineiden NY-ESO-1, joka oli positiivinen korrelaatio ilmaus NY-ESO-1-antigeenin kasvainsolujen (r = 0,57, p = 0,0004). Autovasta-aineita NY-ESO-1 liittyi lisääntynyt kasvaimeen infiltroituneen CD8 +, CD4 + ja FoxP3 + soluja. Yksilön HLA-A2 + potilaan autovasta-aineita NY-ESO-1, CD8 + T-solut oli eristetty kiinteä kasvain ja askites oli reaktiivinen NY-ESO-1: IFN-y-ELISPOT ja MHC-luokan I pentameeri värjäystä.

Päätelmät ja merkitys

osoittaa, että kasvain-erityisiä autovasta ja kasvaimen infiltroituneen T-solut korreloivat ihmisen syövän ja voidaan suunnattu samaan kohdeantigeeniä. Tämä tarkoittaa, että autovasta-aineet voivat tehdä yhteistyötä kasvainta infiltroituneen T-soluja vaikuttaa kliinisiä tuloksia in EOC. Lisäksi serologista menetelmät voivat osoittautua hyödylliseksi tunnistaa kliinisesti merkittäviä T-solujen antigeeneille immunoterapiassa.

Citation: Milne K, Barnes RO, Girardin A, Mawer MA, Nesslinger NJ, Ng A, et al. (2008) Tumor-infiltroivien T Cells korreloivan NY-ESO-1-spesifiset autovasta-aineet munasarjasyöpä. PLoS ONE 3 (10): e3409. doi: 10,1371 /journal.pone.0003409

Editor: Aric Gregson, University of California Los Angeles, Yhdysvallat

vastaanotettu: 6. kesäkuuta, 2008; Hyväksytty: 17 syyskuu 2008; Julkaistu: 15 lokakuu 2008

Copyright: © 2008 Milne et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Brittiläinen Kolumbia Cancer Foundation, Kanarian Foundation, Yhdysvaltain puolustusministeriön (OC000018). Mikään sponsoreita ollut rooli suunnittelussa ja tutkimuksen tekeminen, keräämiseen, analysointiin ja tietojen tulkinta, tai valmisteen, tarkastelun tai hyväksyntä käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, ettei kilpailevia etuja olemassa.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyöpä (EOC) on haastava sairaus, joka vaikuttaa yli 190000 naista maailmassa vuosittain (International Agency for Research Cancer) . Korkea kuolleisuus johtuu siitä, että useimmat potilaat diagnosoidaan laajalle levinneenä tautina, usein laajoja askites. Standardi käsittely sisältää sytoreduktiivisen leikkausta seuraa taxane- ja platinapohjaisen kemoterapian [1]. Yli 80% potilaista ovat erittäin herkkiä etulinjan hoito, mutta 60-70% kokemus tauti uusiutuu 2-5 vuotta lopulta periksi heidän sairautensa [2], [3].

Huolimatta näistä valitettavaa tilastot, 20-30% EOC potilaista kestävät viisi vuotta tai enemmän diagnoosin jälkeen. Myönteinen ennustetekijöiden kuuluvat alkuvaiheessa, ei-vakavien histologia, huono laatu, hyvä suorituskyky tila, ja optimaalinen kirurgiset debulking [4], [5]. Lisäksi, useat viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet korrelaation kasvaimen infiltroituneen CD3 + CD8 + T-solujen ja suotuisat tulokset [6], [7]. Zhang

et. al.

ensimmäinen raportoitu, että potilailla, joilla on CD3 + T soluinfiltraat- kasvain epiteelin nousseen etenemisestä vapaa ja eloonjäämiseen [8]. Tämä on vahvistettu kahdella muut tutkimukset [9], [10], ja kaksi ryhmää on laajennettu tästä havainnosta CD8 + T-solujen osajoukko erityisesti [11], [12]. Lisäksi, läsnä CD3 + CD56 + T-solujen askites on yhdistetty platinaa herkkyyteen [13]. Nämä havainnot ovat yhtäpitäviä aiempien tutkimusten osoittavat positiivinen korrelaatio selviytymisen ja ilme interferoni-γ (IFN-γ) [14], [15], IFN-γ reseptori [16], IL-18 [17], ja MHC-luokan I [18], [19], jotka kaikki ovat tyypillisiä CD8 + T-solujen vasteita. Sen sijaan läsnä kasvaimeen infiltroivien CD25 + FoxP3 + T-solujen EOC korreloi huonompi selviytymisen [11], [20] – [22]. Siten näyttää siltä, ​​että tasapaino CD8 + T-soluja ja CD25 + FoxP3 + säätelijä-T-solujen on tärkeä tekijä kliinisten tulosten EOC.

Lisäksi kasvaimeen infiltroivien T-solujen, monet EOC potilaat asentaa seerumin autovasta vasteita erilaisille kasvaimen antigeenejä, mukaan lukien NY-ESO-1, HOXA7, Ep-CAM, HSP-90, MUC-1 ja p53 [23] – [25]. Tyypin I diabeteksen ja muiden autoimmuunisairauksien olosuhteissa, kehitys autovasta-vastausten ennakoi kudoksen tunkeutumisen ja tuhoa autoreaktiivisten T-solujen [26]. Siksi arveltu, että EOC potilailla saattaa esiintyä samanlaista suhdetta kasvainspesifisiä autovasta vasteet ja kasvaimen tunkeutuvia lymfosyyttejä. Tämä hypoteesi testattiin kohortin 35 pitkälle, korkealaatuista serous EOC tapauksia varten, jotka vastasivat seerumi ja kasvain saatiin näyte. Käyttäen NY-ESO-1, kuten testi-antigeeni, osoitamme ensimmäistä kertaa korrelaatio kasvaimen-spesifiset autovasta ja kasvaimen läpäisevistä T-soluja. Meidän havainnot esiin mahdollisuuden, että autovasta-aineet voivat olla rooli aikaisemmin kirjattu suhdetta kasvainta infiltroituneen T-soluja ja kliinisiä tuloksia vuonna EOC.

Tulokset

Tutkimus kohortti

tutki suhdetta kasvainspesifisten autovasta ja kasvaimen tunkeutuvia lymfosyyttejä käyttämällä sovitetun kasvain ja seerumi näytteitä retrospektiivinen kohortin 35 potilailla, joilla on korkea-asteen vakavien EOC (taulukko 1). Me valittiin keskittyä yhteen histologinen alatyyppi, kun muut alaluokat EOC näytteille erillisiä biologisia ja kliiniset ominaisuudet, jotka ovat saattaneet sekoitti analyysi [27]. Kaikki verinäytteet kerättiin ennen leikkausta tai kemoterapiaa, ja kaikki kasvaimen näytteet saatiin aikaan ensisijaisen sytoreduktiivisen leikkaus ennen kemoterapiaa. Ohjaus verinäytteitä saatiin 60 samanikäisiin naiset, joilla ei ole tunnettua henkilökohtainen historia syöpä.

Analyysi kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä

Tumor-tunkeutuvia lymfosyyttejä arvioitiin immunohistokemiallisesti (IHC ) käyttämällä vasta-aineita erilaisia ​​immunologisia merkkiaineita (kuvio 1, taulukko 2). Kaikki raaka IHC tiedot löytyvät lisätaulukot S1 ja S2. Vain 23% (8/35) arviointikelpoisista kasvaimia osoitti merkittävää CD20 + B-solujen infiltraatit. Sitä vastoin 94% (33/35) kasvainten oli havaittavissa CD3 + T-solujen infiltraatio. Värjäys vasta CD4 ja CD8 paljasti, että 59% (20/34) ja 69% (24/35) arviointikelpoisista kasvaimia oli merkittävää CD4 + ja CD8 + solujen infiltraatit, vastaavasti. CD4 + ja CD8 + solut korreloivat voimakkaasti (r = 0,69, p 0,0001). Kaikki arvioitavissa kasvaimet (27/27) ilmaistuna MHC-luokan I jossain määrin, mikä osoittaa, ne voisivat teoriassa läsnä antigeenin tunkeutumisatmosfääri CD8 + T-soluja. Seitsemänkymmentä kaksi prosenttia (18/25) kasvainten ilmaistuna MHC-luokan II ja siten voi teoriassa esillä olevan antigeenin CD4 + T-soluja.

Koska monet kasvaimet oli tiheä CD8 + T-solujen infiltraatio, olemme analysoineet kudosten TIA-1 ja grantsyymi B, jotka molemmat ilmaistaan ​​CD8 + sytotoksisten T-solujen ja luonnollisten tappajasolujen [28] – [30]. Seitsemänkymmentä-kolme prosenttia (25/34) kasvaimia oli merkittävää TIA-1 + solujen infiltraatit, joka oli positiivinen korrelaatio CD8 + infiltraatit (r = 0,83, p 0,0001) (kuvio 2). Sitä vastoin vain 20% (7/35) kasvainten oli merkittävää grantsyymi B + solujen infiltraatio (tuloksia ei ole esitetty); kuten odotettua, 6 7 kasvaimia olivat myös positiivisia CD8 + solujen.

Kasvaimet analysoitiin myös solujen infiltraatio ilmentävät FoxP3, markkeri aktivoitujen T-solujen ja säätelijä-T-solujen [31]. Kuusikymmentä kuusi prosenttia (23/35) arvioitavissa kasvaimia oli merkittävää FoxP3 + infiltraatit (kuvio 2), jotka korreloivat voimakkaasti CD4 + soluihin (r = 0,73, p 0,0001). Olemme myös arvioitiin CD25-proteiinin ekspression, ylimääräinen markkeri aktivoituu ja säätelijä-T-solujen [32]. Viisikymmentä prosenttia (17/34) kasvainten oli merkittävästi CD25 + solujen infiltraatio (kuvio 2), jotka korreloivat voimakkaasti CD4 + -solujen (r = 0,58, p = 0,0003) ja FoxP3 + soluja (r = 0,75, p 0,0001).

edelleen kerrostunut T soluinfiltraat- niiden epiteeli- tai strooman sijainnista kasvain, kuten intraepiteliaalisten CD3 + /CD8 + T-solut erityisesti ovat korreloineet elonjäämisetua in EOC [8] – [12]. Tätä analyysiä varten, ensin mitattu kasvaimen koostumus on määritelty epithelial:stromal suhde kussakin kudoksessa ydin ja sitten lasketaan tiheys T-solujen kohden epiteelin tai strooman. Kuten esitetty taulukossa 3, tiheys CD3 + T-solujen kohden kasvaimen epiteelin vaihtelivat 0-17, jossa mediaani 4,6. Vertailun tiheys CD3 + T-solujen kohden kasvaimen stroomaa vaihteli 0-138, mediaani 16,3. Yleensä tiheys CD3 + T-solujen kasvaimen epiteelin ja strooman vasta korreloivat heikosti (r = 0,34, p = 0,048), ja oli monia esimerkkejä kasvaimista tiheä CD3 + suodattuu epiteelissä, mutta ei strooman, ja päinvastoin, stroomassa mutta ei epiteelin. Samanlainen kuin CD3 + solut, CD8 +, CD4 +, FoxP3 + ja TIA-1 + -soluissa olivat yleensä tiheämpi kasvaimen strooman kuin kasvaimen epiteelin (taulukko 3).

koostumus kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä jälkeen neoadjuvanttikemoterapian

TMA käytetään edellä analyysit sisältyi myös ylimääräinen kohortin 15 kasvainten naisista osana kliinistä tutkimusta, oli tehty neoadjuvant platina /taksaani kemoterapian ennen niiden ensisijainen leikkausta. Kuten 35-tapauksen kohortin nämä naiset olivat korkealaatuisesta vakavasta EOC. Kasvaimet olivat resektoitiin kolmen syklin karboplatiinia /taksoli-kemoterapiaan. Vaikka otoskoko oli pieni, tämä tarjosi ainutlaatuisen tilaisuuden arvioida vaikutuksia kemoterapiaa kasvainten tunkeutuvia lymfosyyttejä. Useimpien parametrit, lymfosyyttinen infiltraatit oli samanlainen käsiteltyjen ja käsittelemättömien kasvaimia. Kuitenkin käsitellyt tuumorit osoittivat yhdenmukaista lisääntymässä tunkeutumisen kaikki osajoukot T-solujen arvioitiin, ja tämä nousu oli huomattavasti suurempi CD3 + (mediaani 80 vs. 35, p = 0,02) ja CD8 + (mediaani 78 vs. 30, p = 0,013) solut (tuloksia ei ole esitetty).

Serum autovasta-vasteet NY-ESO-1

Vaikka munasarjasyöpä potilaat osoittavat autovasta-vasteita laajan valikoiman antigeenejä [23] – [25], olemme keskittyneet on yksi immunogeenisen antigeenejä, NY-ESO-1 [24], [33], [34]. Kuusikymmentä kontrolliseerumeita analysoitiin IgG-autovasta-aineiden rekombinantti NY-ESO-1, ja keskiarvo ja keskihajonta OD-arvot laskettiin (Supplementary taulukot S1 ja S2). Yksittäisistä seerumeista pisteytettiin positiivisiksi, jos niiden OD-arvo oli yhtä suuri tai suurempi kuin kaksi standardipoikkeamaa keskiarvosta ja verrokkien. Yhdenmukainen julkaistut tulokset, 26% (9/35) munasarjasyövän tapauksissa osoittaneet IgG autovasta-aineita NY-ESO-1, verrattuna vain 5% (3/60) valvonnan (kuvio 3A).

( A) Serum autovasta vastauksia NY-ESO-1 on 35-potilaan kohortissa. Autovasta vasteet ilmoitetaan lukumäärä standardipoikkeamat keskiarvosta 60 iän ja sukupuolen verrokkia, joilla ei tiedetä henkilökohtainen historia syöpä. (B, C) immunohistokemiallinen analyysi NY-ESO-1 ilmentymisen kaksi edustavaa serous munasarjakasvaimia korkea (B) ja negatiivinen (C) antigeenin ilmentymistä.

Voit selvittää autovasta vastaukset NY-ESO-1 korreloi ekspressiota vastaavan antigeenin, täsmäsi kasvaimen näytteet analysoitiin IHC ekspressioon NY-ESO-1. 34 arvioitavissa kasvaimia, 5 (14,7%) sai positiivisen NY-ESO-1-antigeenin (kuvio 3B). Kaikki viisi näistä tapauksista olivat positiivisia myös autovasta-aineita NY-ESO-1. Sitä vastoin 4 tapaukset olivat positiivisia NY-ESO-1-spesifisten autovasta-aineet, mutta negatiivinen NY-ESO-1-antigeenin ilmentymisen.

väliset korrelaatiot autovasta vastauksista ja lymfaattinen suodattuu

tutkimme seuraavaksi seerumin autovasta-aineita NY-ESO-1 korreloivat kasvaimeen tunkeutuvia lymfosyyttejä. Tätä analyysiä varten, me pidetään epiteelin ja strooman T-solujen suodattuu erikseen, kuten edellä on kuvattu. Olemme luokiteltu tapauksissa olevan positiivinen tai negatiivinen autovasta-aineet ja NY-ESO-1 käyttäen cut-pisteen kahden keskihajonnan päässä keskiarvosta kontrolliryhmän (lisätaulukot S1 ja S2). Mann Whitneyn t-testi, potilaalla on autovasta-aineita NY-ESO-1 oli merkitsevästi suurempi strooman tiheys CD8 + solujen (p = 0,011), FoxP3 + solut (p = 0,013), ja CD4 + solujen (p = 0,026). Näin ollen, autovasta-aineiden NY-ESO-1, osoittivat merkittävää korrelaatiota T-solujen infiltraatteja, erityisesti tuumorin stroomassa.

kirjaaminen NY-ESO-1: n autovasta-aineiden ja kasvaimen läpäisevistä CD8 + T-solut samasta potilaasta

korrelaatio autovasta-aineita NY-ESO-1 ja kasvaimen infiltroituneen T-soluja viittasi mahdollisuuteen, että kasvaimen infiltroituneen T-solut voivat tunnistaa NY-ESO-1 seropositiivisille potilaalla. Tämän kysymyksen, keräsimme verta, kasvain ja askites yksilöitä prospektiivinen kohortin 15 vastadiagnosoidun vakavasta EOC potilaille. Kaksi potilasta oli positiivinen seerumi autovasta-aineita NY-ESO-1. Näiden, yhdessä tapauksessa (IROC013) oli HLA-A2 +, jonka avulla T-solut voidaan luetella virtaussytometrialla HLA-A2-pentameerien ladattu tunnetulla CD8 + epitoopin NY-ESO-1 (kuvio 4A). NY-ESO-1-spesifisten CD8 + T-solut olivat harvinaisia ​​ääreisveren tämän potilaan (0,22% CD8 + -soluja), mutta rikastuneet vatsaonteloon sekä kiinteä kasvain (1,53% ja 6,64% CD8 + -soluja, vastaavasti). Lisäksi T-solut vatsaonteloon sekä kiinteä kasvain tuotetaan IFN-γ vastauksena NY-ESO-1-peptidin (kuvio 4B), mutta ei kontrolloida peptidejä, jotka ovat peräisin p53: n, HER-2 /

neu

tai WT-1 ( dataa ei esitetty). Todellakin, askites vastaus NY-ESO-1 oli lähes yhtä vahva kuin nähdään CEF virus- kontrolliin, peptidejä. Kiinnostavaa, kasvainkudoksen tämän potilaan osoitti tiheän CD3 + ja CD8 + T-solujen infiltraatio kasvaimen strooman, mutta ei epiteelin (kuvio 4C), joka on samanlainen kuvio yleisesti nähtävissä autovasta-positiivisten potilaiden retrospektiivinen kohortissa. Vaikka kiinnitys on vahva humoraalisen ja T-soluvasteen NY-ESO-1, kiinteä kasvain tämän potilaan värjättiin negatiivisia ekspression NY-ESO-1-antigeenin; kuitenkin, askites tämän potilaan sisälsi NY-ESO-1-positiivisia soluja (kuvio 4C).

(A) MHC-luokan I-pentameeri analyysin osoittamalla rikastuminen NY-ESO-1-spesifisten CD8 + T-solujen askitesta ja kiinteä kasvain verrattuna ääreisverenkierron. Boxed sekä vastaavat luvut edustavat prosentteina pentameeria-positiivisten solujen suhteessa koko CD8 + soluja. (B) ELISPOT-analyysi IFN-γ tuotantoa T-solujen stimulaation jälkeen HLA-A2-sitoutuvan peptidin NY-ESO-1. Aineisto esitetään useissa IFN-γ-tuottavia soluja per 1 x 10

6 irtotavarana soluja ilmoitetusta kudoslokeron. (C) immunohistokemiallinen analyysi kasvainta infiltroivien CD3 + ja CD8 + T-solujen kasvaimen stroomassa, ja ilmentyminen NY-ESO-1-antigeeniä. Vaikka kiinteä kasvain oli negatiivinen ekspression NY-ESO-1, joka on murto-osa soluista askites olivat positiivisia. Solufraktiosta askites sisälsi myös sytokeratiini-positiivisia epiteelisolujen, oletettavasti kasvaimen alkuperän (tuloksia ei ole esitetty).

Keskustelu

käyttäminen täsmäsi seerumia ja kasvaimen näytteitä 35 potilasta, joilla on korkea -laadun vakavien EOC, olemme osoittaneet korrelaation kasvaimen infiltroivien T-solujen ja kasvaimen spesifiset autovasta. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus tunnistaa tällainen korrelaatio missään ihmisen syövän. Erityisesti, kun läsnä on NY-ESO-1-spesifisten IgG-autovasta-aineet seerumissa korreloivat infiltraatio kasvaimen strooman ilmentävien solujen CD8, CD4 ja FoxP3. Lisäksi yksittäisen potilaan kanssa autovasta-aineita NY-ESO-1, joka vastaa vatsaonteloon sekä kiinteä kasvain näytteet osoitettiin olevan rikastettu NY-ESO-1-reaktiivinen CD8 + T-solujen, joka arvioidaan MHC-luokan I pentameeriä värjäystä ja IFN-γ ELISPOT. Nämä havainnot esiin mahdollisuuden, että autovasta-vasteet voivat tehdä yhteistyötä kasvainta infiltroituneen T-soluja vaikuttaa kliinisiä tuloksia vuonna EOC.

Lisäksi NY-ESO-1-spesifisten autovasta, useat tekijät ilmaistaan ​​munasarjakasvaimia ovat osoittaneet positiivinen korrelaatio kasvainta infiltroituneen T-soluja, mukaan lukien kemokiinit CXCL9, CCL21, CCL22 [8], CCL2 ja CCL5- [35]; p53 mutaatioita [36]; ja MHC luokan I [37]. Sitä vastoin kasvain infiltroituneen T-soluja on negatiivinen korrelaatio VEGF [8], B7-H1 /PD-L1 [12], CD68 + makrofageissa [38] ja endoteliini B-reseptori [39]. Näin ollen, useita tekijöitä vaikuttaa koostumuksen kasvaimeen infiltroivien T-solujen EOC.

Vaikka tässä tutkimuksessa keskityttiin yhden, yleisesti tunnustettu tuumoriantigeeni, NY-ESO-1, suuri määrä muita autovasta kohdeantigeenejä ovat havaittu EOC, mukaan lukien HOXA7, Ep-CAM, HSP-90, MUC-1 ja p53 [23] – [25]. Todellakin, kasvain-spesifisen autovasta-vasteet ovat yleisiä EOC potilailla. Esimerkiksi Stone et al. havaitsivat, että 44% vastadiagnosoidun EOC potilaalla oli autovasta vaste vähintään 1 paneelin 12 tuumoriantigeenien [24]. Tulevaisuuden työ, onko autovasta-vasteet muiden tuumoriantigeenien korreloi myös läsnä kasvainta infiltroivia T-soluja.

Toisin kuin serologisen vasteen, vähemmän tiedetään kohdeantigeeneja kasvaimeen infiltroivien T-solujen EOC . T-solureseptorin (TCR) spectratyping tutkimukset ovat osoittaneet, että kasvainta infiltroivia T-solujen EOC edustavat oligoclonal populaatioita, joka on johdonmukainen antigeenin indusoima kloonilaajenemisen [40] – [44]. Monet tutkimukset ovat osoittaneet tunnustamista autologisten kasvainsolujen kasvainta infiltroivia T-soluja [45] – [50]. Lisäksi edellinen työ on tunnistettu spesifisten T-solujen HER2 /

neu

[44], [51] – [53], p53 [54] ja folaattia sitovan proteiinin [55], [56] joukossa kasvain- soluttautuminen tai kasvaimeen liittyvien T-soluja. Tietääksemme nykyinen tutkimus on ensimmäinen, joka osoittaa tunnustamista NY-ESO-1 kasvain-tunkeutuva ja kasvaimeen liittyvä (so askites johdetut) T-soluja, mistä on osoituksena tulokset potilaalle IROC013. Kiehtovan, T-solu vasteita NY-ESO-1 olivat havaittavissa ääreisveren tästä potilas, joka osoittaa vahvaa rikastaminen tämän T-solujen alaryhmän kasvain ja askites. Itse asiassa IFN-y-ELISPOT-vaste NY-ESO-1-oli samaa suuruusluokkaa kuin nähdään CEF kontrolli peptidejä. Kuitenkin, NY-ESO-1-spesifisten alaryhmän osuus oli vain 6,6% kaikista kasvainta infiltroivien CD8 + T-solut tästä aiheesta, mikä osoittaa, on todennäköisesti monia muita tunnistamia antigeenejä infiltroivia T-soluja. Erityisesti, yli 80% munasarjasyövistä osoittavat menetys BRCA1 ja /tai BRCA2-toiminto, mikä vaarantaa DNA korjaukseen [57], [58]. Voidaan spekuloida, että tuloksena geneettinen epävakaus johtaa ilmaisun epänormaalien proteiinien, jotka voivat toimia neoantigeenien isännän immuunijärjestelmälle.

Vaikka kasvainta infiltroivia T-solut liittyy pitkittynyt etenemisestä vapaa ja yleinen eloonjäämisen EOC, on epäselvää, onko tämä heijastaa aktiivinen tai passiivinen rooli T-solujen. Toisin sanoen, älä T-solut aktiivisesti vastustaa kasvaimen kasvua vai ovatko ne yksinkertaisesti markkereita jonkin muun ominaisuuden kasvain, joka ajaa tuloksia? On olemassa useita rivejä tukevia seikkoja ensimmäiseen mahdollisuuteen. Ensinnäkin, ei kaikki T-solualaryhmiä liittyvät ennusteeseen; pikemminkin, suotuisia liittyvät CD8 + osajoukko ja huono tuloksia CD25 + FoxP3 + osajoukko [11], [12], [20], [21]. Toiseksi useat tekijät, jotka liittyvät aktiivisen CD8 + sytolyyttisten vasteet liittyvät myös suotuisat tulokset, mukaan lukien ekspressio IFN-γ [14], [15], IFN-γ-reseptorin [16], ja IL-18 [17]. MHC-luokan I on myös yhdistetty lisääntyneeseen eloonjäämiseen munasarjasyöpä [18], [19]. Esillä olevassa tutkimuksessa, joka keskittyy yksinomaan vakavien alatyyppi, kaikki arvioitavissa kasvaimet ilmaisivat MHC luokan I Samanlaisia ​​tuloksia on raportoitu muiden varten serous EOC [59], mikä viittaa siihen, valtaosa vakavien kasvaimet ovat MHC-luokan I positiivisia ja on kyky esitellä antigeeniä kasvaimeen infiltroivien CD8 + T-soluja. Kolmanneksi kasvain infiltroituneen T-solut osoittavat merkittävää sytotoksisuutta munasarjakasvaimia

in vitro

[43], [45], [47], [60], [61]. On kuitenkin huomionarvoista, että vain pieni osa kasvaimista tässä ja toisessa tutkimuksessa [59] oli merkittävä Granzyme B-positiivisia immuuni infiltraatit, mikä viittaa siihen, että sytotoksiset toiminto saattaa vaimentaa

in vivo

. Ja lopuksi, kuten edellä on esitetty, kasvaimeen infiltroivien T-solujen merkkejä kloonilaajenemisen [40] – [44] ja tunnustamista spesifisiä antigeenejä [44], [51] – [56], kuten tässä esitetty NY-ESO-1 (kuvio 4). Siten näyttöä kertyy hyväksi käsitteen, että kasvaimen infiltroituneen T-solut toimimaan aktiivisesti edistää suotuisia kliinisiä tuloksia in EOC. Samoin kolorektaalisyövässä, toiminnallinen merkkiaineita, jotka liittyvät aktiivisen Th1-kaltainen sytolyyttinen T-soluvasteita liittyvät suotuisat hoitotuloksia [62]. Tämä viittaa siihen, että immuunijärjestelmän modulatorisen strategioita, jotka parantavat näiden luonnossa esiintyvien T-soluvasteita voidaan parantaa kliinisiä tuloksia edelleen.

Toisin T-solujen infiltraatio, suhde kasvaimen-spesifiset autovasta ja kliinisiä tuloksia on vähemmän selvä. Tämä ongelma on tutkittu laajimmin varten kasvaimen antigeeni p53, joka saa aikaan autovasta vasteita 20-25% EOC potilaista. Goodell et. al. raportoitu positiivinen korrelaatio autovasta-aineita p53 ja kasvanut eloonjäämisen EOC [63]. Kuitenkin muut tutkimukset ovat osoittaneet negatiivinen korrelaatio [64], [65] tai ei lainkaan vastaavuutta [66], [67]. Kuten NY-ESO-1, löysimme suuntaus huono tuloksia potilailla, joilla autovasta-aineita NY-ESO-1 on 35-tapauksen kohortin tutkittu tässä (tuloksia ei esitetty), mutta tämä suuntaus ei havaittu riippumatonta kohortin 35 potilasta on aiemmin tutkimuksessa [24], (tietoja ei ole esitetty). Kuten edellä on esitetty, immuunivastetta EOC liittyy useita antigeenejä, näin ollen uskomme, että prognostista merkitystä autovasta-aineiden on parasta käsitellä käyttäen laajennettua paneelia kasvaimen antigeenejä ja suurempi potilasaineistoihin.

autovasta-vaste NY-ESO -1 korreloi T-solujen tunkeutuminen kasvain stroman vastakohtana kasvain epiteelin. Tämä saattaa heijastaa tilastollista kysymys, koska absoluuttinen määrä T-solujen oli suurempi kasvaimen strooman verrattuna epiteelin, jolloin strooman arvojen saavuttamiseksi tilastollista merkittävyyttä. Todellakin, Spearmanin analyysi osoitti positiivinen suhde autovasta-aineita NY-ESO-1 ja tunkeutuminen kasvain epiteelin CD3 + ja CD8 + solut, mutta tämä ei ollut tilastollisesti merkitsevä (tuloksia ei ole esitetty). Vaihtoehtoisesti, voi olla biologinen selitys. Vuonna Th1 /Th2 paradigma, immuunivasteet arvellaan polarisoituvan kohti humoraalinen tai sytolyyttinen efektorimekanismeja [68]. Sovellettuna tuloksemme, tämä viittaisi siihen, että potilailla, joilla on vahvat autovasta vastausten olisi heikko sytolyyttinen vasteet, mikä saattaa johtaa epätäydellinen (ts stromal) tunkeutuminen kasvainkudoksen T-solujen. Toinen mahdollisuus on ehdottanut hiiren malleja, joissa autovasta vasteita on yhdistetty heikko CD8 + sytolyyttisen T-soluvasteiden [69]. Tällöin ehdotettiin, että autovasta-aineet helpottavat käyttöönottoa ja esittäminen kasvainantigeenien B-solujen kustannuksella dendriittisolujen. Koska B-solut ovat vähemmän tehokkaita antigeeniä esitteleviä soluja kuin dendriittisolut, nettotulos on huonompi T-solujen kasvainta vastaan ​​[69]. Viimeinen näkökohta on se, että esillä olevassa tutkimuksessa, autovasta-vasteet NY-ESO-1 korreloivat tunkeutumista kasvaimen ei vain CD8 + T-soluja, vaan myös CD4 + ja FoxP3 + T-soluja. Jälkimmäinen solut voivat edustaa säätelijä-T-soluja, jotka voivat inhiboida T -solujen vasteet ja laajuuden rajoittamiseksi kasvaimen tunkeutumisen [32]. Olemme nykyään perivät sovitettu veri ja kasvain yksilöitä suurempi, mahdollinen kohortin EOC potilaita paremmin ymmärtää suhde kasvainspesifistä autovasta, kasvaimen infiltroituneen T-soluja ja kliinisiä tuloksia.

Vaikka ei päätarkoitus tässä artikkelissa, meillä oli mahdollisuus arvioida vaikutusta neoadjuvanttikemoterapian kasvaimen infiltroituneen T-solut 15 potilaalla. Yleensä käsitellyt tuumorit osoittivat lisääntynyttä tunkeutumisen kaikki osajoukot T-solujen, ja tämä saavutti tilastollisen merkittävyyden CD3 + ja CD8 + solut. Tämä muistuttaa tutkimuksissa rintasyövän joka oli kohonnut T-solujen tunkeutuminen kemoterapian jälkeen taksaanien [70] ja muut aineet [71] ja yhdistyksen suotuisat kliiniset vasteet. Taksaanit voi myös edistää kasvainimmuniteetin parantamalla T- ja NK-solujen toimintaa [72] – [75] ja antigeenin esittelyä [76]. Samoin, platinaa aineita voidaan lisätä sytokiinien synteesiä ihmisen T-solujen [77], kumoaa estäjä-T-solun toimintaa [78] ja herkistää EOC solujen Fas-välitteisen apoptoosin [79]. Siten platina /taksaani kemoterapian voi olla suotuisia vaikutuksia isännän immuniteettia EOC, hypoteesi parhaillaan tutkivat prospektiivisessa potilaan kohortin.

Useat ryhmät ovat yrittäneet adoptiiviseen immuunihoitoon munasarjasyövän käyttäen T-soluja laajentunut kasvainta infiltroivia T-soluja [50], [80] – [89]. Vaikka lupaavia empiirisiä vastauksia on raportoitu, nämä pyrkimykset ovat yleensä onnistuneet vain rajoitetusti. On huomionarvoista, että kiinteän kasvainkudoksen potilaasta IROC013 oli suurelta osin negatiivinen ekspression NY-ESO-1, huolimatta NY-ESO-1-spesifisten T-solujen kasvaimen ja askites. Jos tämä tilanne on tyypillinen muiden EOC potilailla, se viittaa siihen, että monet kasvainta infiltroivia T-soluja voidaan tunnistaa antigeenejä, jotka ovat huonosti ilmaistaan ​​kasvainkudoksen, mahdollisesti johtuen immuunijärjestelmän valinnan aikana kasvainten kehittymiseen. Jos haluamme toteuttaa lupauksen immunoterapiaa varten EOC, on pakottava tarve tunnistaa kohdeantigeeneja jotka ovat välttämättömiä kasvulle ja selviytymiselle toistuvia, kemoterapia-resistenttejä kasvaimia. Tuloksemme viittaavat siihen, että autovasta-aine vasteita pitää käytännön hyötyä antigeenin tunnistus- ja takaa lisätutkimuksia suhteessa niiden roolia isännän kasvainimmuniteetin ja kliinisiä tuloksia.

Materiaalit ja menetelmät

Tutkittavat

Kaikki yksilöt ja kliiniset tiedot saatiin tietoon perustuvan suostumuksen nojalla protokollien hyväksymien tutkimuseettiseltä BC Cancer Agency ja University of British Columbia. Retrospektiivinen tapaus kohortti koostui 35 naista, joilla on korkea-asteen serous munasarjasyöpään keneltä Hyväksytty seerumista ja kasvainkudoksen oli saatavilla (OvCaRe Munasarjojen Kasvain Bank, Vancouver, BC, Kanada). Kasvainkudoksessa saatiin aikaan ensisijaisen leikkaus ennen mitään muuta hoitoa. Taulukossa 1 on esitetty yleinen kliininen ominaisuudet 35-tapauksen kohortin. Retrospektiivinen kohortti myös kudosta vielä 15 naista, jotka saivat neoadjuvanttikemoterapian ennen ensisijainen leikkausta; Näitä tapauksia käsitellään erikseen tulokset. Blood, askites ja kasvain näytteet kerättiin myös mahdolliselle kohortin 15 potilasta kautta BC Cancer viraston Kasvainten Tissue Repository. Ohjaus seeruminäytteet saatiin 60 naista, joilla ei ole tunnettujen henkilökohtainen historia munasarjasyövän tai muita syöpiä. Kaikki verrokeilla itse ilmoittanut saaneensa negatiivisen mammografinen tulos viimeisen vuoden aikana. Ikäjakauma valvonnan kohortin (keskiarvo 62,0 vuotta, keskihajonta 12,3 vuotta, vaihteluväli 45,9-88,9 vuosi) oli samankaltainen kuin tapauksessa kohortin.

Kasvain ja seeruminäytteet

Retrospective kohortti .

Tuumorikudos saatiin aikana ensisijainen sytoreduktiivisen leikkauksen. Tissue oli iskemia aika on alle 30 minuuttia ja käyttänyt alle 48 tuntia formaliinilla ennen käsitellään parafiiniin. Kudos mikrosiru (TMA) rakennettiin ottamalla kahtena 0,6 mm porausnäytteistä kasvainkudospalasta tarkistuksen jälkeen hematoxylin- ja eosiini leikkeitä patologi. Ytimet valittiin alueilta kasvaimen sisältävän edustavan osuudet epiteelin ja strooman, välttäen erittäin nekroottisen alueilla. TMA koottiin käyttäen Pathology Devices kudoksen ryhmittäjällä (Westminster, MD). Seeruminäytteistä tapausta kerättiin ennen leikkausta tai kemoterapiaa. Verinäytteet käsiteltiin tavanomaisilla laboratoriomenettelyt.

Prospective kohortissa.

Verta kerättiin ennen leikkausta heparanized Vacutainer putket, ja ääreisverenkierron mononukleaariset solut (PBMC) eristettiin Ficoll-tiheyssentrifugaatiolla. HLA-A2-asema määritettiin virtaussytometrialla FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) sen jälkeen, kun pinta-värjäyksen PBMC: anti-HLA-A2-vasta-aineen (klooni BB7.2, BD Pharmingen, San Diego, CA). Askites kerättiin leikkauksen aikana sentrifugoitiin (1200 rpm, 10 min), ja punasolujen (RBC) poistettiin käsittelemällä ACK lyysipuskuria (Sigma, St. Louis, MO). Kiinteä kasvain poistettiin kirurgian aikana pilkottiin scalpels noin 2 mm

2 ja pilkottiin sitten yön yli 4 ° C: ssa RPMI 1640: ssä (Invitrogen, Carlsbad, CA), joka sisälsi kollagenaasia tyypin I ja IV (kukin 0,05 mg /ml) 0,025 mg /ml hyaluronidaasia ja 0,01 mg /ml DNAse I: a (kaikki Sigmalta, St. Louis, MO). Digestion jälkeen, materiaali johdettiin 100 um: steriiliä solun siivilä poistaa möhkäleitä, ja tuloksena yhden solususpensiota pelletoitiin kuten edellä on kuvattu.

Immunohistokemia ja immunosytokemia

TMA leikeltiin 5 pm päälle Superfrost plus dioja (Fisher Scientific, Ottawa, oN) ja inkuboitiin yön yli 37 ° C: ssa. Sen jälkeen deparaffinization, levyt laitettiin Ventana Discovery XT Autostaineriin (Ventana, Tucson, AZ) immunohistokemiallista värjäystä. Ventana vakio CC1 protokollaa käytettiin antigeenin haku. Primaaristen vasta-aineiden on lueteltu taulukossa 2.

TMA inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla 60 minuuttia, ja sopiva rajat adsorboitu, biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen (Jackson Immuno- research, West Grove, PA) levitettiin 32 minuuttia.