Krooninen sairaus

tiivistelmä

Molecular täsmähoitoihin on osoittanut lupaus kuin kohtelu kehittynyt maksasyövän (HCC). Sorafenibi, multikinaasi estäjä, äskettäin saanut FDA edenneen HCC. Vaikka sorafenibi on hyvin siedetty, huoli niiden turvallisuus on ilmaistu. Selekoksibi (Celebrex®) on selektiivinen syklo-oksigenaasi-2 (COX-2) estäjä, jolla on kasvainten vastainen vaikutuksia ihmisen HCC-soluissa. Tässä tutkimuksessa tarkasteltiin vuorovaikutusta selekoksibia ja sorafenibi kahdessa ihmisen maksan kasvainsolulinjoja HepG2 ja Huh7. Tuloksemme osoittivat, että kukin inhibiittori yksinään vähensi solujen kasvua ja yhdistelmä selekoksibin ja sorafenibin synergistisesti inhiboi solujen kasvun ja apoptoosin. Jotta voitaisiin paremmin ymmärtää molekyylitason mekanismit synergistinen antituumorivaikutuksen yhdistelmän, tutkimme ilmentymisen profiili yhdistelmä-käsiteltyjen maksasyövän solulinjoja käyttäen microarray-analyysin. Yhdistelmähoito merkittävästi muuttunut ekspressiotasot 1986 ja 2483 transkriptien HepG2 ja Huh7 soluja, tässä järjestyksessä. Geenit toiminnallisesti mukana solukuoleman, signaalitransduktiota ja transkription säätely olivat pääasiassa säädelty, kun geenit aineenvaihduntaa, solusyklin ohjaus ja DNA: n replikaatio ja korjaus pääosin alassäädetty käsittelyllä. Kuitenkin yhdistelmä saaneista HCC solulinjoja näkyy spesifisyyden ilmaisussa ja toiminnan ratkaisevan tekijöitä hepatokarsinogeneesin. Muuttunut ilmentyminen Joidenkin näiden geenien vahvistettiin osittain ja kvantitatiivista RT-PCR: llä ja Western-blottauksella. Monet uusia geenejä ilmi meidän transcriptomic analyysejä, ja edelleen toiminnallisia analyysejä voi määrittää, ovatko nämä geenit voivat toimia mahdollisina molekyylikohteista tehokkaampaa anti-HCC strategioita.

Citation: Cervello M, Bachvarov D, Lampiasi N, Cusimano A, Azzolina A, McCubrey JA et ai. (2013) Novel yhdistelmä Sorafenibi ja Selekoksibi Tarjoaa Tehostemateriaalit antiproliferatiivisia ja proapoptoottisiin Effects in Human Liver Cancer Cells. PLoS ONE 8 (6): e65569. doi: 10,1371 /journal.pone.0065569

Editor: Manlio Vinciguerra, University College London, Iso-Britannia

vastaanotettu: 11 helmikuu 2013; Hyväksytty: 26 huhtikuu 2013; Julkaistu: 12 kesäkuu 2013

Copyright: © 2013 Cervello et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain avustuksilla Italian ”Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca (opetus-, yliopistot ja tutkimus) – MIUR FIRB427 MERIT n.RBNE08YYBM MC ja G.M .; D. B. on johtaja Core Genominen Facility CHUQ-Cancer Research Centre tukemana FRSQ-RR Cancer. Kaikki genomisen kokeiden ja tietojen analysointi suoritettiin tässä liikkeessä; M.C. on myös tukee osittain avustuksen, jonka CNR Italian talousministeriön ja Finance Project FaReBio di Qualità. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) edustaa viidenneksi yleisin syöpä ja kolmanneksi yleisin kuolinsyy syöpään [1], [2]. Vaikka kliininen diagnoosi ja hoito alkuvaiheen HCC on parantunut merkittävästi, HCC ennuste on edelleen erittäin huono. Lisäksi kehittynyt HCC on erittäin aggressiivinen kasvain, joilla on vähän tai ei lainkaan vastausta yhteistä hoitoja. Siksi tarvitaan uusia tehokkaita ja hyvin siedettyjä hoidon strategioita tarvitaan kiireellisesti.

Sorafenibi, multikinaasi estäjä, joka kohdistuu Raf-kinaasien sekä VEGFR-2 /-3, PDGFR-β, Flt-3 ja c-Kit , sai äskettäin FDA ja EMEA hyväksynnän hoitoon potilailla, joilla on kehittynyt HCC. Kuitenkin alhainen tuumorivaste hinnat ja sivuvaikutukset, jotka liittyvät tähän monoterapiana osoittavat tarpeen tutkia muita uusia terapeuttisia vaihtoehtoja HCC.

Kohdennettu hoitomuodot ovat tulleet alan antineoplastisten hoito ja käytetään joko yksinään tai yhdistelmänä tavanomaisten kemoterapiaa huumeita. Molecular-täsmähoitoihin sisältyy lupaava HCC [3]. Kuten useimmissa syöpien, käyttö yhden molekyyli- kohdennettu aine olisi tuskin saavuttaa pitkäkestoinen remissio tai parannuskeinoa HCC, etenkin myöhäisvaiheen tauti. Yhdistelmähoito on näin ollen tarvitaan, ja on järkevää spekuloida, että yhdistelmä kahta tai useampaa ainetta on lopulta lisätä terapeuttisen hyödyn saamiseksi.

HCC on tavallisesti tulos jatkuvan vahingon ja krooninen tulehdus. Tärkeä välittäjä tulehdus on geenin, syklo-oksigenaasi-2 (COX-2). Se on vakiintunut, että COX-2 on tärkeä molekyylikohteena syöpähoitojen. COX-2 on kroonisesti yli-ilmentynyt moniin syöpiin, mukaan lukien HCC [4] – [8]. HCC, me ja muut tutkijat ovat osoittaneet, että COX-2-estäjät saattavat olla mahdollisia terapeuttisia vaikutuksia [9] – [13].

Perusteet yhdistämistä sorafenibille COX-2-estäjien HCC tulee julkaisemien tietojen muut kirjoittajat [14], mutta myös omasta julkaistuihin tietoihin [12]. Olemme osoittaneet, että ihmisten hoitoon HCC-soluissa, joilla on COX-2-estäjän liittyy aktivaatio ERK1 /2, ja että inhibitio MEK /ERK-signalointireitin, jonka MEK estäjä tehostaa antituumorivaikutuksen inhibiittorin. Kaiken kaikkiaan tulokset viittaavat siihen, että MEK /ERK-reitin ei välittävät sytotoksisuutta aiheuttama COX-2-estäjät, mutta voi suojata soluja kuolemalta, joka epäsuorasti tukee roolia MEK /ERK-reitin selviytymisen signalointi HCC-solujen [12].

Näin ollen näiden tulosten perusteella testasimme yhdistelmän vaikutuksia selektiivisen COX-2-estäjän selekoksibin ja sorafenibilla. Tehostemateriaalit antiproliferatiivisia ja proapoptoottisiin vaikutuksia saatiin käytettäessä yhdistelmää sorafenibin Selekoksibilla. Jotta voidaan paremmin ymmärtää yksityiskohtaisesti mekanismeja sytotoksisten vaikutusten selekoksibin ja sorafenibin, tutkimme myös ja verrattiin maailmanlaajuinen geenin ilmentymistä HCC-solujen käsitelty joko Selekoksibilla tai sorafenibia tai kahta lääkettä käytetään yhdessä.

materiaalit ja menetelmät

Reagenssit, Cell Culture, elinkykyyn, klonogeeninen ja lisääntymismääritykset

Selekoksibi (CLX) oli lahja Pfizer Corporation Inc. (New York, USA), sorafenibi (SOR) hankittiin Alexis Biochemical (Lausen, CH), ja molemmat lääkkeet liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO). Ihmisen maksasyövän solulinjoja HepG2 (ihmisen maksasyöpä solulinja, ATCC HB-8065) ​​ja Huh7 [15] (lahja prof Massimo Levrero, Sapienza University of Rome, Rooma, Italia) käytettiin tässä tutkimuksessa olivat alhaiset kapean käytävän numero ja ylläpidettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [16]. Kaikki solut pidettiin 5% CO

2 ja 37 ° C: ssa ja seulotaan rutiininomaisesti vastaan ​​mykoplasmakontaminaation. Solujen elinkelpoisuus-määritykset suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu [17]. Kertoimien Lääkeyhteisvaikutuksen (CDI) käytettiin analysoimaan vaikutuksia lääkkeen yhdistelmiä [18]. CDI lasketaan seuraavasti: CDI = AB /(A x B). Mukaan absorbanssi kunkin ryhmän, AB on suhde yhdistelmiä, valvoa ryhmä; A tai B on suhde monoterapiana ryhmä hallita ryhmään. Näin ollen, CDI-arvot olivat alle, yhtä suuri tai suurempi kuin 1 osoittaa, että lääkkeet ovat synergistisiä, lisäaineen tai antagonistisia, vastaavasti. CDI alle 0,7 tarkoittaa, että huumeet ovat huomattavasti synergistisiä. Lisäksi, tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Studentin t-testi (two-tailed). Kriteerit tilastollinen merkittävyys oli

p

0,05.

vaikutus eri inhibiittorikonsentraatioi- solujen elinkelpoisuus arvioitiin myös käyttäen klonogeeniset määritystä. Tätä analyysiä varten, 1,0-1,5 x 10

3-solut maljattiin kuuden kuoppalevyille kasvualustaan, ja sen jälkeen yön yli kiinnitys solut altistettiin joko CLX ja SOR yksin tai niiden yhdistelmät tai ajoneuvon 48 tuntia. Sitten solut pestiin lääkkeiden-elatusaineella ja sen annettiin kasvaa 14 päivää huumeiden-vapaa olosuhteissa. Pesäkkeet, joissa on enemmän kuin 50 solusta, laskettiin. Suhteellinen pesäkemuodostusta määritettiin suhde keskimäärin pesäkkeiden käsitellyissä soluissa keskimääräinen lukumäärä pesäkkeiden käsitellyissä soluissa liuottimella (DMSO). Kaikki kokeet suoritettiin kahtena kappaleena ja toistettiin kahdesti.

Solulisääntyminen määritetään arvioimalla määrä bromideoksiuridiinin (BrdU) sisällyttäminen DNA kolorimetrisellä immunomääritys (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Saksa). Lyhyesti, 5 x 10

3-soluja viljeltiin 96-kuoppalevyillä eri pitoisuuksia CLX ja SOR yksin tai niiden yhdistelmät tai ajoneuvon 24 tuntia. BrdU lisättiin sitten 10 uM lopullinen pitoisuus. Soluja inkuboitiin edelleen vielä 24 tuntia ja sen jälkeen kiinteän ja käsiteltiin anti-BrdU peroksidaasi mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Väri kehitettiin lisäämällä tetrametyylibentsidiiniä substraattina ja mitattiin 490 nm: ssä. Värin intensiteetti ja absorbanssiarvot suoraan korreloi määrän BrdU sisällytetty DNA. Tulokset ilmoitettiin eston prosenttiosuutena ja BrdU-kontrolliin nähden. Arvot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD kolmesta erillisestä kokeesta, joista kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

TUNEL määritykset

-soluja viljeltiin 8-kuoppaisilla kammion liukuu yli yön. Hoidon jälkeen 24 tunnin ajan eri pitoisuuksilla CLX ja SOR joko yksinään tai yhdistelmänä, solut pestiin kahdesti PBS: llä ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydissä, liuos 25 minuutin ajan huoneenlämpötilassa. Apoptoottisia soluja havaittiin terminaalista deoksinukleotidyylitransferaasilla välittämää dUTP nick end-merkintöjä (TUNEL) määritys käyttäen DeadEnd ™ Kolorimetrinen TUNEL System Kit Promega (Madison, WI), seuraten valmistajan ohjeita. Määrä apoptoottisten solujen määritettiin laskemalla prosenttiosuus ruskea väri positiivisia soluja. Vähintään 500 solua kahden eri solujen valmisteet laskettiin kullekin tilalle. Soluja visualisoitiin kanssa Axioskop mikroskoopilla (Zeiss, Saksa).

Western-blottaus Analyysit

Western blot -analyysiä varten, kokosolulysaateille saatiin käyttäen RIPA-puskuria (Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, MA) ja Western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [19], primaaristen vasta-aineiden surviviiniperäisiä ja TRIB3 /TRB3 (Abcam Limited, Cambridge, UK), DDIT3 /CHOP (Cell Signaling Technologies Inc., Danvers, MA), β- aktiini, YAP1 ja DKK1 (Sigma-Aldrich Srl, Milano, Italia).

geeniekspressioprofilointi ja tietojen analyysit

geeniekspressioanalyysissä suoritettiin käyttäen Agilent 44 K taustatietoa Ihmisen genomin oligonukleotidigeenisirumenetelmää ( sisältävät ~44,000 geenit), kuten aiemmin on kuvattu [20] – [23]. Kaikki microarray kokeet suoritettiin kahtena käyttäen väriaine-swap leimauksen aikana. GeneSpring ohjelmisto (Agilent, Palo Alto, CA) käytettiin luetteloiden valittujen geenien erilaisia ​​tilastollisia ja visualisointimenetelmät. Verkon ja reitin analyysit microarray data saatiin valmiiksi käyttäen Ingenuity Pathway Analysis (IPA) ohjelmisto (https://www.Ingenuity.com). Microarray data on talletettu GEO tietokantaan hakunumerolla GSE45340.

Semi-kvantitatiivinen RT-PCR (SQRT-PCR) Analyysit

Microarray data todensi valitulle ilmentyvät eri geenien sqRT- PCR kuten aiemmin on kuvattu [21], [23]. Β-aktiini-geenin käytettiin viite-geenin. Seuraavia sense- ja antisense-alukkeita käytettiin, vastaavasti, monistamaan ihmisen BIRC5 (5′-GCATGGGTGCCCCGACGTTG-3 ’ja 5′-GCTCCGGCCAGAGGCCTCAA-3′), DDIT3 (CHOP) (5’-ATGGCAGCTGAGTCATTGCC-3 ’ja 5’-TCATGCTTGGTGCAGATTC 3 ’), FABP1 (5′-CTCTATTGCCACCATGAGTTTC-3′ ja 5’-GCTGATTCTCTTGAAGACAAT-3 ’), HRK (5′-CTGTGTCCTTGGAGAAAGCTG-3′ ja 5’-GTGTTTCTACGATCGCTCCAG-3 ’), LARP6 (5’-GGAACAAGCTGGGATATGTGA- 3 ’ja 5′-GGTGGTCCTCATTCAACTCAA-3′), MT2A (5’-AAGAAAAGCTGCTGCTCCTG-3 ’ja 5′-TGGAAGTCGCGTTCTTTACAT-3′), YAP1 (5’-GGCAAAGACATCTTCTGGTCA-3 ’ja 5′-CATCATATTCTGCTGCACTGG-3′) ja β-aktiini (5’-CACCACACCTTCTACAATGAGC-3 ’ja 5′-AGTACAGCTACGAGCAGTTCTTGTT-3’). PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen seuraavia parametrejä: 95 ° C 5 min, 94 ° C 30 sekuntia, 62 ° C: ssa HRK, LARP6, 60 ° C: ssa BIRC5, β-aktiini, FABP1, MT2A, YAP1, 58 ° C ja DDIT3, ja 72 ° C: ssa 1 min, jota seurasi lopullinen jatkamisvaihe 72 ° C: ssa 8 min. Jaksojen määrä säädettiin sallia havaitsemisen lineaarisella alueella. Lopuksi PCR-tuotteet analysoitiin elektroforeesilla agaroosigeelissä, kuvannut ja kvantifioidaan densitometrinen skannaus.

Kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) analyysit

Expression valittujen geenien kvantitoitiin kvantitatiivinen Real Time PCR (qPCR) käyttäen SYBR Green fluoresenssi (Qiagen, Milano, Italia) on StepOnePlus (Applied Biosystem). QuantiTect Primer Määritykset CCND1 (QT00495285), DDIT3 (CHOP) (QT00082278), DKK1 (QT00009093), FGF19 (QT02452289), FNDC3B (QT01882748), KLB (QT02454977), TRIB3 (QT00088543), LARP6 (QT00221445) hankittiin QIAGEN (Milano, Italia) ja monistettiin suositellaan. Suhteellinen ilmentyminen laskettiin käyttäen vertailevaa C

t menetelmällä. Geenin ilmentyminen kohteisiin laskettiin kertainen induktio verrattuna ohjaus (DMSO) ja korjattiin määrällisten ilmentymistaso β-aktiini (QT00095431).

Tulokset

yhdistelmä Celecoxib kanssa sorafenibi vähentää synergistisesti elinkykyyn, Cell Proliferation ja Colony Formation ja indusoi apoptoosia HCC Solut

käyttäminen MTS määritystä ensin arvioitiin vaikutuksia sorafenibin (SOR) ja selekoksibi (CLX) elinkelpoisuudesta kahdesta ihmisen HCC solu linjat, HepG2 ja Huh7, joka näyttää eri ominaisuuksia kuten erilaistumista, biologisesta käyttäytymisestä ja geneettisiä vaurioita, COX-2 ekspressiotasot [21], sekä Raf /MEK /ERK-reitin toimintaa [23]. Kuten kuviossa 1 on esitetty, hoito CLX ja SOR 48 tuntia vähentää tehokkaasti elinkelpoisuus molemmissa solulinjoissa. 72 tunnin lääkkeen valotuksen, IC

50s CLX olivat 76 ± 9,9 ja 72,5 ± 0,7 uM HepG2 ja Huh7 soluja, tässä järjestyksessä; IC

50s SOR oli 10,3 ± 1,1 ja 10,1 ± 1,8 uM samoissa soluissa. Koska COX-2 mRNA: n ekspressio on havaittavissa HepG2-soluissa [10], [21], kasvua inhiboivaa aktiivisuutta CLX näyttäisi olevan suurelta osin COX-2 itsenäistä näissä soluissa [21]. Lisäksi, SOR-välitteistä kasvua estävä aktiivisuus näyttää olevan riippumaton MEK /ERK-reitin inaktivaatio HepG2-soluissa, koska kuten aiemmin on raportoitu, ilmentymisen fosfo-MEK ja fosfo-ERK1 /2 on tuskin havaittavissa tässä HCC solussa line [23].

Solun elinvoimaa arvioitiin MTS-määritys. HepG2 ja Huh7-soluja käsiteltiin 48 h: n konsentraatiot CLX ja SOR joko yksinään tai yhdistelmänä. Tiedot on ilmaistu prosentteina kontrollisolujen ja ovat keskiarvoja ± SD kolmesta erillisestä kokeesta, joista kukin suoritettiin kolmena rinnakkaisena. *

p

0,05; **

p

0,01 versus sorafenibia yksin, # p 0,05; ## P 0,01 verrattuna selekoksibin yksin.

tutkimme seuraavaksi sytotoksisia vaikutuksia SOR + CLX yhdistelmä sekä HCC-solulinjoissa käyttäen MTS määritykset (kuvio 1). SOR + CLX yhdistelmä näytetä merkittävästi lisääntynyt sytotoksisuus verrattuna yksittäisinä aineina. CDI käytettiin millainen välisen vuorovaikutuksen aineet (taulukko 1). Molemmissa solulinjoissa voimakas synergia tapahtui, kun CLX sovellettiin yhdessä SOR (taulukko 1).

sytotoksisia vaikutuksia yhdistelmähoidon varmistettiin vielä käyttäen klonogeenisten määritystä (kuvio 2). -Soluja käsiteltiin 2 päivää tai ilman yhdisteitä, väliaine aspiroitiin ja ne pestiin sitten estäjä-väliaineella. Solujen annettiin kasvaa vielä 14 päivää. Oli annoksesta riippuvaista lasku pesäkkeen muodostavien kyky johtuen yhdistetyn SOR + CLX hoitoja molemmissa solulinjoissa. Todellakin, SOR + CLX yhdistelmä kiinteällä annoksella suhde johti merkittävään kasvuun kasvainsolujen tappaminen mitattuna pesäkkeen muodostumisen määritykset verrattuna yksittäisillä aineilla (kuva 2).

Solun kasvua HepG2 ja Huh7 solujen määritettiin klonogeeniset määrityksessä hoidon jälkeen CLX ja SOR joko yksinään tai yhdistelmänä. Solut yli yön ja altistetaan CLX ja SOR yksin tai yhdistelmänä ilmoitettuina pitoisuuksina 48 tuntia. Käsittelyn jälkeen kukin kuoppa pestiin ja koe jatkettiin 14 päivää ilman lääkkeitä. Elossa pesäkkeet värjättiin (vasen paneeli) ja laskettiin (oikea paneeli). Tiedot ilmoitetaan prosentteina pesäkkeiden kontrollisoluissa ja ovat keskiarvoja ± SD kahdesta erillisestä kokeesta, joista kukin suoritettiin kahtena kappaleena. *

p

0,05; **

p

0,01 verrattuna kunkin aineen yksinään.

Koska anti-kasvuvaikutuksista yksilön tai yhdistetty hoitoja voisi olla lisääntyneen solukuoleman ja /tai vähentynyt solu leviämisen, me tutkittava erikseen lääkkeen vaikutuksista apoptoosin induktioon ja DNA-synteesiin. Mitä apoptoosin, hoitoon HepG2 ja Huh7 solut jopa 50 uM CLX oli vähäinen vaikutus apoptoosin arvioituna TUNEL määrityksessä (kuvio 3A). Käsittely 7,5 tai 10 uM SOR korotti apoptoottisten HepG2 soluista 3,4 ± 0,85% ja 5,5 ± 1,4%, tässä järjestyksessä. Kuitenkin SOR + CLX yhdistelmä huomattavasti apoptoosin HepG2-soluissa verrattuna hoitoon joko ainetta yksinään (

p

0,05), kun taas Huh7 soluissa mitään vaikutusta ei havaittu (kuvio 3B). BrdU-määritystä käytettiin vaikutusten tutkimiseen yhdistelmähoidon soluproliferaatioon. Kuten esitetään kuviossa 3C, SOR + CLX yhdistelmä oli voimakas synergistinen vaikutus solujen lisääntymistä molemmissa solulinjoissa, näytetään CDI-arvot olivat alle 0,5 ja 0,6 kaikissa SOR + CLX huumeiden yhdistelmien HepG2-soluissa ja Huh7 soluja, vastaavasti.

(A) havaitseminen apoptoosin TUNEL määrityksessä. Mikrovalokuvia HepG2-soluja käsiteltiin 24 h: n konsentraatiot CLX ja SOR joko yksinään tai yhdistelmänä. Apoptoottiset solut visualisoitiin TUNEL värjäys, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät osassa. (B) kvantitatiivinen analyysi TUNEL-positiivisten HepG2 ja Huh7 soluja. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD kahdesta erillisestä kokeesta. *

p

0,05, verrattuna kunkin aineen yksinään. (C) Solulisääntyminen arvioitiin BrdU määrityksessä. Soluja käsiteltiin 48 h: n konsentraatiot CLX ja SOR joko yksinään tai yhdistelmänä. Data on ilmaistu prosentteina kontrollisolujen ja ovat keskiarvoja ± SD kolmesta erillisestä kokeesta. *

p

0,05; **

p

0,01 verrattuna kunkin aineen yksinään.

Transcriptomic analyysi jakautuu Gene Expression muuttuu samat ja Ainutlaatuinen HepG2 ja Huh7 Solujen jälkeen yhdistelmähoito

Määritellään uusia potentiaalisia mekanismien olisi yhdistetty selekoksibin ja sorafenibin niiden vaikutukset maailmanlaajuiseen geeniekspression molemmissa solulinjoissa tutkittiin ja verrattiin käyttäen DNA-siru teknologiaa. Agilent 44 K Human Whole Genome oligonukleotidigeenisirumenetelmää (sisältää ~44,000 geenejä) käytettiin tunnistamaan globaalin geeniekspression muutoksia HCC-solulinjat, samanaikaisen hoidon 50 uM CLX ja 7,5 uM SOR 48 tuntia. Nämä pitoisuudet olivat empiirisesti arvioitu maksimaalinen lääkeaineen pitoisuudet, jotka eivät aiheuta huomattavaa vähentämistä solujen elinkelpoisuus (alle 20-30%) ja /tai solujen morfologian muutoksiin hoidon aikana (tuloksia ei ole esitetty). Kaikki microarray kokeet suoritettiin kahtena soveltamisessa väriaine-swap välttämiseksi merkintöjä bias. Tätä lähestymistapaa käyttäen yhteensä 1986 differentiaalisesti ilmentyvien geenien ekspressiotasojen ≥2 kertaisesti todettiin HepG2-soluissa, ja 2483-geenit näytetään ≥2 kertainen ekspression Huh7-soluissa. Näistä 975 geenit tai 1382 geenejä säädellään ylöspäin ja 1011 tai 1111 geenit alassäädetty HepG2 ja Huh7 soluja, tässä järjestyksessä. On syytä korostaa, että molemmissa HCC solulinjoissa yhdistetyn SOR + CLX käsittely tuotti hallitseva vähenemistä geenejä, jotka liittyvät aineenvaihduntaan, solusyklin ohjaus ja DNA: n replikaatioon ja korjaukseen, lukuisia geenejä, jotka osallistuvat DNA: n replikaatioon ja korjaukseen olivat erityisen alassäädetty HepG2-soluissa (katso taulukko 2A ja 2C). Geenit toiminnallisesti liittyvät solukuolemaan, signaalitransduktiota ja transkription säätely olivat pääasiassa ajan säännelty kummassakin HepG2 ja Huh7 soluja (taulukko 2B ja 2D). Geenit osallisena solujen kasvua ja lisääntymistä ja liikenteen olivat suhteessa ylä- ja alas-moduloidaan HepG2-soluissa, kun he olivat pääosin indusoitiin Huh7 soluissa (taulukko 2). Taulukot S1 ja S2 näyttö täydelliset luettelot differentiaalisesti-ilmentyvien geenien (≥2-kertainen) SOR + CLX-käsiteltyjen HepG2 ja Huh7-soluissa, vastaavasti.

transcriptomic analyysit voimakkaasti vahvisti havaittu synergistinen vaikutukset yhdistetyn hoidon HCC-soluissa. Olemme aiemmin tutkineet molekyylitason mekanismeja (mukaan lukien geenin ilmentymisen profilointi) selekoksibia [21] ja sorafenibille [23] sytotoksisuutta HepG2 ja Huh7-soluissa. Venn-kaavio analyysi perustuu aiemmin julkaisemattomia ja edellä geeni luettelot olivat osoitus huomattavan määrän differentiaalisesti ilmentyvien geenien, jotka olivat yksinomaan moduloitu sekä HCC solulinjoissa vasta kun yhdistetyn SOR + CLX käsittely (kuvio 4A). Lisäksi suurin osa näistä ainutlaatuisesti moduloidun geenit näkyvissä ilmeistä HepG2 tai Huh7 soluspesifisyys upon SOR + CLX hoitoon (katso kuva 4B). Nämä tiedot ovat yhtäpitäviä aikaisempien havaintojemme tietoa eri molekyylitason mekanismeja sytotoksisen toiminnan Selekoksibin tai sorafenibin HepG2 ja Huh7 solujen [21], [23]. Edellä analyysit myös sai meidät arvioimaan, SOR + CLX-käsiteltyjen HepG2 ja Huh7 soluja voitaisiin erottaa perusteella niiden geeniekspressioprofiilien. Sen jälkeen suodatus 2-kertainen signaalin intensiteettiä, käytimme yksisuuntainen ANOVA parametrinen testi (Welch

t

-testi; ristiriitaisuutta ei oletetaan vastaavan) valitse syrjivä geenejä. Todellakin,

t

testi

p

-arvo sulku 0,005 valittujen 174 geeniä, jotka ilmentymisen erosivat HepG2 ja Huh7 soluja. Ryhmittely analyysi perustuu 174 geenit lista suoritettiin käyttäen standardia kunto Tree algoritmin annetaan GeneSpring paljastaen muodostumista kahden suuren klusterin ryhmiä, jotka selkeästi erottavat HepG2 ja Huh7 soluja käsiteltäessä (kuvio 4C). Yhdeksänkymmentäyhdeksän geenit 174-geenit lista oli säädellään ylöspäin HepG2-käsitellyissä soluissa verrattuna Huh7 soluihin. Suurimmat luokitukset näistä geeneistä sisältyvät solujen lisääntymisen, signaalitransduktion, aineenvaihduntaa ja liikenne. Geenit säädellään ylöspäin Huh7-käsitellyissä soluissa verrattuna HepG2-soluissa (75 geenit) ovat pääasiassa mukana aineenvaihdunnassa, signaalitransduktion, transkription säätely, immuunivasteen ja DNA: n replikaatio ja korjaus. 174 geenien luettelo on esitetty taulukossa S3.

(A) Venn-kaavio analyysit geenien, differentiaalisesti ilmaistuna (≥2-kertaisesti) HepG2 ja Huh7 solulinjoissa, kun CLX (50 uM) käsittely, SOR (7,5 uM) käsittely, ja yhdistetyt SOR + CLX hoitoa. (B) Venn-kaavio vertailu yhteisiä ja erillisiä geenejä ainutlaatuisesti moduloitu (≥2-kertaisesti) HepG2 ja Huh7 solujen vasta yhdistettynä SOR + CLX hoitoa. (C) Hierarkkinen ryhmittely perustuu 174 geenit listan (2-kertainen ero geenien ilmentyminen;

p

-arvo sulku 0,05), joka erottelee HepG2 ja Huh7 solut mukaan niiden vaste yhdistettynä SOR + CLX hoitoa. Punainen merkitsee ylössäätöä ja vihreä merkitsee alassäätöä.

Pathway ja verkko analyysit syntyy käyttämällä Ingenuity Pathways Analysis (IPA) ohjelmisto vahvisti yhteisen ja erillisiä suuria toiminnallisesti liittyvän geenin ryhmiä, jotka havaittiin ilmentyä erilailla SOR + CLX-käsiteltyjen HepG2 ja Huh7-soluja (kuvio 5). Huomattavaa on, että ylhäältä toiminnallinen reitit alassäädetty molemmissa solulinjoissa olivat ne, jotka liittyvät solu- syklin, DNA: n kahdentuminen, rekombinaatio ja korjaus, rasva-aineenvaihduntaan ja pienimolekyylisiä biokemia (kuvio 5B ja 5D), kun taas reittejä liittyy solujen kehitystä ja geeniekspression havaittiin yleisesti indusoitua (kuvio 5A ja 5B). Keinot liittyvät solukuolemaan ja solujen kasvua ja lisääntymistä olivat molemmat aiheuttamaa ja tukahdutettiin kahdessa solulinjassa, vaikka odotetusti kussakin HCC solulinjassa solukuolemareittejä olivat voimakkaammin aiheuttama kuin tukahdutetaan (kuva 5A-5D). Kaksi HCC solulinjoja myös joiltain osin erilainen upon SOR + CLX hoito; Näin, reitit liittyvät anturilaitteistolla ja organisaatio olivat pääasiassa alassäädetty HepG2-soluissa (kuvio 5B), kun taas väyliä toiminnallisesti liittyvät vitamiini, mineraali- ja aminohappo aineenvaihduntaa käytti enimmäkseen säädellä vähentävästi Huh7 soluissa (kuvio 5D). Niinpä reitit liittyy solujen liikkumista, solujen morfologia, solujen toimintaa ja huoltoa sekä solukierron olivat voimakkaammin säädellään ylöspäin HepG2-soluissa (kuvio 5A), kun taas Huh7 soluilla erityisiä säätely ylöspäin polkuja liittyvien hiilihydraattiaineenvaihdunta molekyylinkuljetuksessa, pienimolekyylisiä biokemia ja DNA-replikaatioon, rekombinaatio ja korjaus (kuvio 5C).

verkostoanalyysi tunnistettu lukuisia erittäin merkittäviä verkostoja pisteet ≥3 jotka olivat alas- tai ylöspäin säädeltyjä HepG2 ja Huh7 solujen upon yhdistetty SOR + CLX hoitoa. Odotetusti sekä HCC solulinjoja viisi top-pisteytys sääteli verkot liittyneet lähinnä toimintoihin liittyvät solukuolemaan ja geenien ilmentyminen, kun taas top-pisteytys alassäädetty verkkojen käytti enimmäkseen liittyy solusyklin ja aineenvaihduntaa (taulukko S4 ). Tässäkin molempien HCC solulinjoista näkyy joitakin erityisiä myös verkon modulaatio: näin varten HepG2-soluissa, viisi top-pisteytys sääteli verkostoja käytti enimmäkseen liittyy proteiinien biosynteesiä ja molekyylitason liikenne (taulukko S4A), kun taas Huh7 soluja, top-pisteytys sääteli verkostoja lisäksi liittyy soluun kokoonpano ja organisaatio, solujen toimintaa ja huoltoa sekä solukierron (taulukko S4b). Toimivat verkostot kytketty DNA: n replikaatio, rekombinaatio ja korjaus oli nimenomaan tukahdutettiin HepG2-soluissa (taulukko S4C), kun taas Huh7 soluilla alas-säätely verkkojen liittyvien solujen toimintaa ja huoltoa, RNA transkription jälkeinen muutos, solu kokoonpano ja organisaatio, molekyylinkuljetuksessa ja immuunivasteen (taulukko S4d).

Yleinen verkot, syntyy yhdistämällä neljä top-pisteytys verkot, jotka sisälsivät sekä alas- ja ylöspäin geenien (≤2 kertainen), kirjattiin joitakin funktionaalisesti liittyvä geeni solmujen varta moduloitu kaksi HCC-solulinjoissa, kun SOR + CLX hoitoa (kuvio 6 ja 7). Erityisesti HepG2-soluissa useissa geenin solmujen osallisena solusyklin ohjaus ja DNA-replikaatioon, rekombinaation ja korjauksen (mukaan lukien ErbB2-EPO, CCNE1, CDC25A, CCNB1, BIRC5, NDC80, BUB1, PXN, KPNB1, KITLG, CDCA5, CDCA8 , TCF3, CDH1, CDKN3) olivat alassäädetty, kun taas geeni solmut liittyvät solukuolemaan (mukaan lukien ASNS, SOX4, EPAS1, S100P, IRS2, LCN2, IGFBP1, TRIB3, PHLDA2, AURKB) olivat enimmäkseen indusoitiin, kanssa lukuun ottamatta AURKB geenin solmu (kuvio 6). Gene solmut erityisesti säädellä vähentävästi Huh7 soluissa sisältyi useita solusykliä ja transkription sääntelyviranomaisten (CCND1, CCNE1, TCF3, FANCA, CENPF, FGFR3, ID1, ID2, ID3, MSX1 ja jäsenet NF-KB kompleksi), samoin kuten geenien RNA transkription jälkeinen muutos (CDKN2A, SREK, SRSF1), kun taas säädelty solmut (mukaan lukien SP1, ATF3, SRSF1, BMP4, MSX1, Klf4 JMJD6) käytti enimmäkseen liittyvät valvontaan solukuoleman (kuva 7) .

neljä top-pisteytys verkkoja on yhdistetty ja näytetään graafisesti solmut (geenit /geenituotteet) ja reunojen (biologinen suhteet solmujen). Intensiteetti solmun väri kertoo asteen ylä- (punainen) tai alas (vihreä) -regulation. Solmut näytetään käyttäen erilaisia ​​muotoja, jotka edustavat toiminnallinen luokka geenituotteen (neliö = sytokiini; pystysuora soikea = transmembraanireseptoriproteiinia; suorakulmion = tumareseptorin; timantti = entsyymi; vinoneliösilmäisellä = kuljettaja; kuusikulmio = kääntäminen tekijä; horisontaalinen soikea = transkriptiotekijä; ympyrä = muut). Reunat näkyvät eri merkkejä, jotka kuvaavat luonnetta suhde solmujen: –

sitova vain

, →

toimii

. Pituus reunan heijastaa todisteita, että solmusta-solmuun suhteeseen ja reunat tukevat artikkeleita kirjallisuudesta ovat lyhyempiä. Pilkullinen reunoja edustaa epäsuoraa vuorovaikutusta.

neljä top-pisteytys verkkoja on yhdistetty ja näytetään graafisesti solmut (geenit /geenituotteet) ja reunojen (biologinen suhteet solmujen). Kuvioiden selitykset ovat kuten kuvattu kuvassa 6.

validointi Microarray Havainnot Semi-kvantitatiivinen RT-PCR (SQRT-PCR) ja kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR) B

vahvistamaan meidän microarray tuloksia, me mielivaltaisesti valittu 13 differentiaalisesti ilmentyvien geenien seuraavan yhdistelmän hoidon. Jotkut näistä geeneistä oli aiemmin raportoitu vaikuttavan sorafenibia ja selekoksibi ja ovat mukana apoptoosin säätelyyn, ER stressin vastaus, DNA-vaurioita vastaus, solujen lisääntymisen ja invaasiota. Nämä geenit sisältyvät BIRC5 (surviviinin), sykliini D1 (CCND1), harakireineen (HRK), DNA-vaurion indusoituva transkription tekijä 3 (DDIT3, joka tunnetaan myös nimellä GADD153 tai CHOP), Tribbles liittyvä proteiini 3 (TRIB3, joka tunnetaan myös nimellä TRB3 ), metallotioneiini 2A (MT2A), La ribonukleoproteiini verkkotunnuksen perheenjäsen 6 (LARP6), Kyllä-liittyvä proteiini 1 (YAP1), rasvahappo-sitova proteiini 1 (FABP1, joka tunnetaan myös maksan-tyypin rasvahappoja sitova proteiini, L- FABP), ja Dickkopf 1 (DKK1). Lisäksi, ekspression joidenkin muiden geenien raportoitiin äskettäin olevan osallisena hepatokarsinogeneesin, kuten Klotho-beeta (KLB), fibroblastikasvutekijä 19 (FGF19), fibronektiinin tyypin III domeenin sisältävää 3B (FNDC3B), analysoitiin myös. Geenien ilmentyminen kvantifioitiin sqrt-PCR ja joissakin tapauksissa qRT-PCR-ohjaus ja käsitellyissä soluissa. sqrt-PCR ja qRT-PCR-analyysit suoritettiin näytteistä aiemmin käytetty microarray kokeet toistettiin käyttämällä RNA: ta kahden muun eri kokeissa. Taulukossa 3 esitetään geeni-ilmentymisen mittaukset aikana vahvistettujen geenit.

validointi Microarray Ensimmäisen Länsi-blottaus

Microarray data osoitti, että geeni, joka koodaa Surviviinia (BIRC5) oli laskenut merkittävästi -regulated HepG2-soluissa käsittelemällä yhdistelmällä verrattuna monoterapiana.