Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Maailmanlaajuinen geeniekspressioprofiilien aikuisten ja sikiön hiiren eturauhasen kantasoluja määritettiin yhteiset ja ainutlaatuinen sääntelyviranomaisten joiden misexpression voisi olla rooli kehittämisessä eturauhassyövän .

Menetelmät /Principal havainnot

erottuva ydin transkription sääntelyviranomaisten yhteinen sekä sikiön ja aikuisten primitiivinen eturauhasen solut tunnistettiin sekä molekyylejä, jotka ovat yksinomaan kunkin populaation. Yhteiset elementit sikiön ja aikuisen eturauhasen kantasoluja ovat ilmentymisen profiilit Wnt, Shh ja muut reitit tunnistetaan kantasoluja muiden elinten, allekirjoitukset aryyli-hiilivety-reseptorin, ja ylös-säätely komponenttien aldehydidehydrogenaasin /retiinihapporeseptorin akselilla . On myös huomattava rasva-aineenvaihdunnan allekirjoitus, merkitty yli-ilmentyminen lipidi- metaboloivia entsyymejä ja läsnäolo sitova motiivi Srebp1. Sikiön kantasolujen populaatio, jolle on ominaista nopeampaa lisääntymistä ja itseuudistumisen ilmaisee sääntelyviranomaisten solusyklin, kuten E2F, Nfy, Tead2 ja Ap2, nopeana, kun taas aikuisen kantasolut näyttää allekirjoituksen, jossa TGF-β on näkyvä rooli. Lopuksi vertailu allekirjoitukset primitiivinen eturauhasen solujen aiemmin kuvattu profiilit ihmisen eturauhasen kasvaimia tunnistettu kantasolujen molekyylejä ja reitit säätelemättömään ilme eturauhastuumoreissa lukien kromatiinin määritteet ja onkogeeni, Erg.

Johtopäätökset /Merkitys

tiedot osoittavat, että aikuisen eturauhasen kantasolut tai esi voi hankkia ominaisuudet itseuudistuvien primitiivinen sikiön eturauhasen solujen kasvaimien synnyn aikana, ja viittaavat siihen, että poikkeava aktivaatio komponenttien eturauhasen kantasolun väyliä voi edistää eturauhasen kasvaimia.

Citation: Blum R, Gupta R, Burger PE, Ontiveros CS, Salm SN, Xiong X, et al. (2009) Molecular allekirjoitukset Eturauhasen Stem Cells paljastaa Novel signalointireittien ja toimittamaan tietoa eturauhassyöpä. PLoS ONE 4 (5): e5722. doi: 10,1371 /journal.pone.0005722

Editor: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 helmikuu 2009; Hyväksytty: 03 huhtikuu 2009; Julkaistu: toukokuu 29, 2009

Copyright: © 2009 Blum et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health, CA132641 (ELW), CA 90593 (DM), National Research Service Award (NRSA) National Institutes of Health, National Institute of Diabetes ja Ruuansulatusjärjestelmään ja munuaistautirekisterin, 5F32DK071468 (CSO), Amgen Inc. ja Helen L ja Martin S Kimmel Center for Stem Cell Biology NYU School of Medicine. Amgen tutkijat oli rooli tässä tutkimuksessa osallistumalla tietojen analysointi ja valmistelussa RNA käytetyn mircroarray kokeissa. Mikään muu rahoittajat ollut rooli tässä tutkimuksessa.

Kilpailevat edut: Muun tukea tätä työtä tukivat myös tutkimus avustus Amgen Inc. (ei numero tämän avustuksen). Monet meidän Amgen kollegat olivat myös yhteistyökumppaneita tässä projektissa. Nämä yhteistyökumppanit osallistui analyysi microarray tiedot ja valmistuksessa käytetty RNA mikrosirulla kokeissa. Erityinen merkitys kunkin tekijän on yksityiskohtainen asianmukaisessa varattu osa roolit kirjoittajien.

Johdanto

On todennäköistä, että poikkeava leviämisen eturauhasen kantasolujen (PSC) ja /tai niiden esiasteita edistää eturauhasen patologisia muutoksia. Selvitimme geeniekspression allekirjoitukset sikiön ja aikuisen PSC (FPSC ja APSC) saada tietoa signalointireittien jotka luonnehtivat nämä kaksi normaalia kantasolujen (SC) populaatiot ja verrataan näitä profiileja kuin eturauhasen syöpäsoluja. Rajata nämä säätelyreittejä voivat tarjota käsityksen järjestelmiä, jotka muuttavat lepotilassa aikuisten eturauhasen solujen osaksi lisääntyvissä osaston, joka synnyttää eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun ja syövän mikä sallii kohdentaminen erityisiä väyliä näiden sairauksien hoitoon.

Olemme osoittaneet että epiteelisolujen SC ominaisuuksia ovat keskittyneet proksimaalisen tiehyen alueen vieressä virtsaputken [1] – [3]. Näitä ominaisuuksia ovat liikkumattomuus, korkea proliferaatiopotentiaali ja kyky yksittäisten solujen aiheuttaa ductal rakenteita, jotka sisältävät sekä perus- ja onteloerityssolut [2] – [4]. Olemme aikaisemmin eristetty, joka perustuu ilmentymistä Sca-1 [2], kahden populaation soluja, jotka kykenevät regeneroimaan eturauhasen kudokseen

in vivo

eturauhasen saattamisen määrityksessä. Ensimmäinen populaatio, kantasoluja, on huomattava kasvupotentiaali, ei vaadi androgeenireseptorin eloonjäämisestä ilmentää korkeita Sca-1 ja asuu proksimaalisen alueen kanavat. Lähes kaikki Sca-1

Hi solut ilmentävät myös α6 integriiniä, antigeeni ilmentyy primitiivisiä eturauhasen soluissa [2] – [4]. Toinen väestö, kauttakulku vahvistavan soluja, on rajoitetumpi kasvupotentiaalia, ilmaisee alhaisempi Sca-1, vaatii androgeenireseptorin selviytymisen ja esiintyy kaikissa duktaalisessa alueilla [2], [3]. Kolmas väestöstä, sikiön eturauhasen kantasoluja, on olemassa urogenitaalisinuksesta josta eturauhasen kehittyy [5]. Sisäkerros epiteelisolujen hiiren urogenitaalisinuksesta alkaa tunkeutuvat ulkopinnan mesenkyymin muodostamiseksi kanavien eturauhanen jälkeen E16. Ennen tätä tapauksessa urogenitaalisinuksesta epiteelin (uge), joka sisältää primitiivisiä sikiön eturauhasen soluja voidaan eristää helposti läpi urogenitaalisinuksesta.

Jotta voitaisiin tunnistaa molekyylejä ja polkuja, jotka ovat aktiivisia primitiivisiä eturauhasen populaatioissa määritimme transkription profiilit neljä solujen populaatiot: (i) uge, rikastettu FPSC, (ii) Sca-1

Hi, soluja, jotka ilmentävät korkeita Sca-1, joka on rikastettu APSC [2], [6], (iii ) Sca-1

Lo, solut, jotka ilmentävät keskipitkällä alhainen Sca-1 ja rikastetaan kauttakulku vahvistavat solujen [2], ja (iv) Sca-1

Neg, solut ilman Sca-1 lauseke, joka edustaa kaikkein kypsä väestö ja ole juurikaan uusiutumispotentiaali [2]. Perehtyä sääntely kerroksiin transkription verkkojen aktiivinen primitiivinen eturauhasen soluissa, teimme laskennallinen näytön cis-sääntelyyn promoottori motiiveja [7] paljastaa ne, jotka ovat merkittävästi rikastettu joukossa PSC geenejä. Olemme myös toiminnallisia geeni luokissa, jotka on rikastettu primitiivinen soluissa.

Sikiön ja aikuisen SC populaatiot ilmaisseet lukuisia tunnettuja SC liittyviä geenejä. Meidän analyysi paljasti merkittävän rikastamisen useita transkriptiotekijän (TF) sitovan kohdan motiiveja promoottorit ilmaisi geenejä. Tulokset osoittavat, että FPSC ja APSC ovat ainutlaatuisia ja yhteisiä transkription ohjelmia ja tunnistaa useita keskeisiä piirteitä, jotka mahdollistavat huolto- ja itsensä uudistamiseen erilaistumattoman tilan. Useat kantasolujen liittyvien geenien tunnistamme voivat myös osallistua kehittämiseen eturauhasen kasvaimia, mikä osoittaa, että nämä molekyylit voivat rajata osajoukko kasvaimia, joissa on enemmän alkeellinen ja mahdollisesti aggressiivisemman fenotyypin.

Materiaalit ja menetelmät

Cell valmistelu, vasta-aineet ja FACS-analyysi

Ethics selvitys.

Kaikki eläinten hoitoon ja menettelyt suoritettiin noudattaen New York University Institutional Review board vaatimukset.

proksimaalinen alue eturauhasen kanavat (eli se osa kanavien lähimpään virtsaputkeen) on 6 viikkoa vanhoja C57BL /6-hiiriä hajotettiin ja solut tutkittiin antigeenin ilmentymisen (taulukko S1) [1], [2]. Sca-1-leimatut solut lajitellaan FACS käyttämällä DakoCyomation MoFlo lajittelija otetaan 3 populaatiot mukaan keskimääräisen fluoresenssi-intensiteetin (MFI) Sca-1 ilmentymisen [2]. Solut (10,000-50,000) ja suurin MFI (25%, Sca-1

Hi), keskimääräinen /alhainen rahalaitos (40%, Sca-1

Lo) ja niille, joilta puuttuvat Sca-1 ilmentymisen (25%; Sca-1

Neg) kerättiin TRIzolia (Invitrogen). Uge eristettiin urogenitaalisinuksesta 16 päivän ikäisten C57BL /6-hiiren alkioiden [8], ja lisättiin TRIzol. Ilmaisu ALDH määritettiin FACS-analyysillä värjäyksen jälkeen kanssa Aldefluor reagenssipakkausta (StemCell Technologies).

Real-Time PCR

Yksi ug kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin 52 ° C 1 tunnin ajan käyttäen Thermoscript RT-PCR-järjestelmä (Invitrogen). 20 ng saatua cDNA: ta käytettiin Q-PCR-reaktiossa käyttäen iCycler (Biorad) ja ennalta suunniteltu TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems). Cycle raja-arvot kolmesta eri RNA-näytteet otettiin keskiarvo; määriä kohde interpoloitu standardikäyristä ja normalisoidaan hy- poksantiiniguaniinifosforibosyylitransferaasi.

RNA: n eristys ja mikrosirujen hybridisaatio

perustettu transkription profiileja uge, Sca-1

Hi, Sca- 1

Lo, ja että Sca-1

Neg erilaistuneita soluja. Kolme rinnakkaisnäytettä uge (FPSC) ja Sca-1

Hi (APSC) näytteet ja neljä rinnakkaisnäytettä Sca-1

Lo ja Sca-1

Neg näytettä analysoitiin. RNA eristettiin standardimenetelmillä ja sen laatu arvioitiin käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). Näytteet, joiden RNA Integrity Number (RIN) 7,0 katsottiin soveltuvan merkintöjä ja 20 ng leimattiin käyttäen GeneChip- kaksiportaisen tavoite -leimauskittiä (Affymetrix). Kymmenen mikrogrammaa leimatun ja hajanainen cRNA sitten hybridisoitiin hiiren genomiin MOE430 2.0 array (Affymetrix), joka kuulustelee ~45,000 selostukset. Raw ilme data (CEL-tiedostot) luotiin käyttäen GCOS 1,4 (Affymetrix). Tiedot käsitellään tässä julkaisun on talletettu NCBI: n Gene Expression Omnibus ja pääsee läpi GEO Sarjan hakunumerolla GSE15580 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE15580) .

analyysi geenien ilmentyminen tietojen

Hyödyntämällä ArrayAssist (Stratagene), raaka Affymetrix CEL tiedostoja käsiteltiin soveltamalla MAS5 algoritmia, määrittää havaitsemisen puhelut (Present /Marginal /poissa) kunkin koetin set, jotka myöhemmin käytettiin alavirran datan suodatus. Normalisoidun ilmentymisen tasoja, käytimme PLIER (koetin logaritminen intensiteetti virhe) algoritmi, malli-pohjainen, monen array signaali arvioijan, joka tuottaa tarkemman koetin asetettu signaaliarvojen [9]. Näiden edellä mittarit käytettiin datan suodatus saada 33967 ”

voimassa geenit

”, joka edustaa selostukset (Geenikoettimia) signaaleilla 20 ja tunnistetaan läsnä vähintään yhdessä näytteessä. Saadakseen osajoukko vaihtelevan geenien, laskimme variaatiokerroin (CV) kunkin otteen ja tuotti joukon 5095 ”

aktiivinen geenit

” sisältävien transkriptien kanssa korkein (15% kokonaismäärästä) CV tulokset. Keskittyä geenejä, jotka muuttuivat tilastollisesti merkittävällä tavalla, näytteet ryhmiteltiin solutyypin (uge, Sca-1

Hi, Sca-1

Lo, Sca-1

Neg), voimakkuudet

aktiivinen geeni

transkriptit olivat log2-muunnetaan ja alistettiin edelleen tilastollisia analyysejä käyttämällä kahta eri testeissä: (a) yksisuuntainen ANOVA käyttäen Benjamini-Hochberg korjaus (

p

0,05) ja (b) merkitys analyysi mikrosiruja (SAM) menetelmä, jossa on väärä löytö nopeudella 5%. Tämä tuotti luettelo 3137 ”

merkittäviä geenejä

”, joka edustaa selostukset, joka vastasi kriteerit molempien tilastollisten testien. Periaate komponenttien analyysi (PCA) (keskiarvo keskitetty) laskettu ArrayAssist, osoitti asianmukaisen toistettavuus ja erottaminen sisällä eri tyyppisiä soluja (kuvio S1). Määritellä ominaispiirteitä uge, Sca-1

Hi ja Sca-1

Lo populaatiot, vertasimme geenien ilmentymisen intensiteetti lukee (ryhmitelty näytettä) kaikkien näiden populaatioiden kanssa kaikkein eriytetty aikuisten solujen (Sca-1

Neg) käyttäen paritonta t-testiä (Benjamini-Hochberg korjattu

p

0,05). Kolme geeniä osajoukot (uge, Sca-1

Hi ja Sca-1

Lo), jotka sisältävät transkriptien joiden ekspressio lisääntyi ( 1,75-kertainen) suhteessa niiden ilmentymistä Sca-1

Neg soluja syntyy .

Analyysi toimintakategorioihin

Hyödynsimme toiminnallinen merkinnät hiiren geenien antamat hiiren Genome Informatics, joka käyttää standardia sanastoa käyttöön otetun Gene ontologia (GO) konsortio. Rikastettu toimintakategorioihin (

p

≤0.01, korjauksen jälkeen useiden testaus) havaittiin kussakin kolmessa klustereiden (

uge vain

,

uge + Sca-1

Hei

,

Sca-1

Hi-only

) käyttäen EXPANDER, jossa hypergeometrisen laskelma käytetään määrittämään yliedustettuna GO toimintakategorioihin on asetettu suhteessa tausta asettaa (koko kokoelma otaksuttu hiiren geenien) [7]. Välttämiseksi harhat, geenejä edustaa useita koetinsarjojen laskettiin vain kerran.

Computational analyysi promoottorin cis-säätelyelementtejä

promoottori analyysiä haimme EXPANDER [7] havaitsemiseksi cis-sääntelyyn promoottori elementtejä, jotka kontrolloivat havaittu transkription muutokset geenin ilmentymisen klustereita. Koska tavoite ja tausta sarjaa promoottorien, EXPANDER tekee tilastolliset testit tunnistaa TF: ille, joiden sitova päällä allekirjoitukset ovat huomattavasti yliedustettuina on asetettu suhteessa taustan (TF rikastus on merkitty

p

-arvo) [7 ]. Molemmat osat kunkin promoottorin skannattiin luulotellun sitoutumiskohtien (ulottuen transkription aloituspaikan 1000 bp ylävirtaan 200 emäsparia alavirtaan). Rikastuksissa tunnistettu tässä tutkimuksessa olivat vankka, koska ne pysyivät vakaina laaja valikoima raja-arvoja.

tietojen vertailu tunnettuihin SC-profiilit

Entrez Gene tunnukset ja UniGene yksilölliset tunnisteet käytettiin vastaamaan geenejä edustettuna eri microarray alustoille. Me sijoitettiin määrä geenejä, jotka olivat yleisesti säädellään ylöspäin geeniekspressioprofiilien ja ainakin yhden muun SC profiili.

Tulokset ja keskustelu

Profilointi geenien ilmentymisen kolmessa eturauhasessa varsi /kantasolujen rikastetun populaatioiden

RNA eristettiin neljästä solupopulaatioiden kuvatulla tavalla (uge, Sca-1

Hi, Sca-1

Lo ja Sca-1

Neg), valmis hybridisaatio mikrosiruja ja analysoitiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kolme geeniä osajoukot (uge, Sca-1

Hi, Sca-1

Lo) tuotettiin koostuu transkriptien joiden ilmentyminen oli tilastollisesti kohonnut kussakin populaatioiden suhteessa niiden ilmaisun kaikkein eriytettyä Sca-1

Neg solupopulaatio (kuvio 1, taulukko S2). FPSC osajoukko on eniten muuttunut merkittävästi selostukset (1286 Geenikoettimia), koska voidaan odottaa verrattaessa sikiön SC eriytetyn aikuisen solupopulaation. APSC alaryhmä (Sca-1

Hi) on 641 ja kauttakulku-monistetaan osajoukko (Sca-1

Lo; enemmän kuin kuin APSC osa siitä) on vain 144 selostukset, jotka ilmentyvät eri. Sitten määritetään, onko voisimme erottaa yhteinen ekspressiokuvioiden näistä kolmesta kantaisä subsets ja kuvioita, jotka olivat ainutlaatuisia kustakin seikasta. Risteyksessä sääteli transkriptien kolmen subsets johti sukupolven neljän ryhmän (

uge vain

,

uge + Sca-1

Hi

,

Sca- 1

Hi-vasta

,

Sca-1

Hi

+

Sca-1

Lo

) keskenään tai yksinomaan ilmaista geenien (kuvio 1, taulukko S3). Selkeimmistä geeniekspressiomalli oli peräisin uge solupopulaation, ilmenee 1050 transkriptien jotka olivat yksinomaan yli-ilmentyy

uge vain

klusteri (FPSC klusteri). Toinen erottuva kuvio näkyi Sca-1

Hi osajoukko, jota edustaa yksinoikeudella säätely ylöspäin 296 transkriptien

Sca-1

Hi-only

klusteri (APSC klusteri). Mielenkiintoista, klusterin sisällä että päällekkäisyydet sikiön ja aikuisen osajoukot,

uge + Sca-1

Hi

klusteri, löysimme huomattava määrä selostukset (209), jotka olivat yleisesti sääteli, kun taas vähemmän yhteisiä (112 selostukset) havaittiin klusterin, joka limittyy (

Sca-1

Hi

+

Sca-1

Lo

klusteri) välillä APSC osajoukon (Sca- 1

Hi) ja TA osajoukon (Sca-1

Lo) (kuvio 1, taulukko S2). Hyvin harvat selostukset (5) on leimallisesti yli-ilmentyy enemmän eriytetty väestöstä (

Sca-1

Lo vain

klusteri). Nämä tulokset kuvaavat näkyvä vaihe-erityisiä geenitranskriptien ilmaistiin kypsymisen eturauhasen solujen alkaen alkeellisin sikiön väestöstä (uge), ja etenemässä APSC väestöstä (Sca-1

Hi), ja sen jälkeläiset, kauttakulku -amplifying soluja (Sca-1

Lo) ja joka päättyy kaikkein eriytetty osajoukon (Sca-1

neg).

Venn-kaavio yksityiskohtaisesti määrä selostukset (geenikoettimia) ja yli-ilmentyy geenien yhteisten ja erillisten kesken uge, Sca-1

Hi ja Sca-1

Lo osajoukot. Määrä selostukset kussakin osajoukossa suluissa ulkopuolella Venn kaavio. Määrä selostukset kussakin klusterissa on merkitty kursiivilla sisällä siivuja Venn kaavio. Numerot selityksin geenien esiintyy jokaisessa neljässä klustereiden on annettu upotettavat taulukossa. Vastaava dendogram Kunkin klusterin esitetään.

. Expression SC merkkiaineiden eturauhasen varsi /kantaisä klustereita

profilointia analyysi osoittaa, että kaikki kolme varsi /kantaisä rikastetun subsets sisältävät merkittäviä määriä tunnettuja markkereita hiiren PSC eli

Trp63

,

CD200

,

Ctnnb1

,

Smo

,

Krt5

,

Krt14

,

Itga6 Twitter /

Cd49f

,

CD44

,

Kit

,

Bcl2

, ja

CD34

[10] (kuvio 2A, B, taulukko S4). Vertailu 11 tiedossa PSC markkereita, jotka olivat säädellään ylöspäin meidän alaryhmissä paneelin kanssa 15 yhteistä hiiren taloudenhoito geenejä, joiden ilmentyminen ei muuttunut, vahvistaa sen, että profiilit heijastavat tiettyä transkription allekirjoitus primitiivisen FPSC ja APSC (kuvio 2A, taulukko S4). Lisäksi transkriptien varten efriini reseptoriin,

Ephb3

, ja kaksi efriini ligandit,

Efna5

ja

Efnb2

, jotka toimivat koordinaattorit muuttoliikkeen ja leviämisen suoliston SC kapealla [11] ovat säädelty sekä FPSC ja APSC populaatioiden (kuvio 2B). FACS-analyysi Sca-1

Hi ja Sca-1

Lo solujen validoitu lisääntynyt ilmentyminen useiden kantasolun antigeenejä ennusti mikrosirulla (kuvio 3A) ja kantasolujen merkkiaineita α6 ja β4 -integrins [12], keratiini 5, Bcl-2, β-kateniinin [10], Sox2 [13] ja CD34 [14] (kuvio 3B). Tämä osoittaa, että muutokset mRNA tasoilla monien SC-markkereita heijastuvat muutokset niiden proteiinipitoisuuden.

. Expression profiilit molekyylejä kuvataan ilmaistaan ​​alkeellinen eturauhasen populaatiot, joita säädellään ylöspäin vähintään 2-kertainen (ylempi paneeli) on uge, Sca-1

Hi ja Sca-1

Lo solut on esitetty. Kukin pylväs edustaa yksittäisen näytteen, ja kukin rivi edustaa tiettyä geeniä. Red (korkea), vihreä (matala) suhteellinen ilmaisu; musta merkitsee yhtä suuri ilmaisun suhteen Sca-1

Neg soluja. Alempi paneeli esittää kasetin 15 yhteistä hiiren taloudenhoito geenit ilmenevät stabiili ilmentyminen kaikissa näytteissä. Log-suhde (LR) arvot on esitetty taulukossa S3. B. Expression profiilit tunnettujen SC markkereita (

Egon

ja

FatiGO

tutkimus), jotka oli säädelty vähintään 2-kertaisesti eturauhasen varsi /kantaisä rikastettu näytteitä. Viisi ilmaisua kuvioita voidaan erottaa. LR arvot on esitetty taulukossa S5.

. Transkriptio taso SC merkkiaineiden alkeellinen ja esisolujen eturauhasen soluja. Microarray data SC merkkiaineiden näistä primitiivinen solupopulaatioiden ilmaistaan ​​LR-arvot [keskiarvo ± SD] suhteessa kypsyä Sca-1

Neg näytteitä. B. Antigeenin ekspressio SC merkkiaineiden Sca-1

Hi ja Sca-1

Lo soluja. FACS-analyysi Sca-1

Hi ja Sca-1

Lo solujen määritetty ilmaisua SC merkkiaineiden (merkitty A) on näissä potilasryhmissä. Väkevöiminen arvot [keskiarvo ± SD] ilmaistaan ​​kertainen muutos antigeeniekspressiota suhteessa antigeeniekspressiota kypsän Sca-1

Neg solupopulaation.

Voit selvittää lisää SC liittyviä geenejä ilmaistiin eturauhasen varsi /kantaisä subsets, käytimme kaksi lähestymistapaa. Ensin käytettiin kaksi bioinformatiikan työkaluja (

Egon

ja

FatiGO

[15]) tunnistamiseksi geenien selityksin kuin kantasolu-geenit perustuvat aikaisempaan julkaisuissa. Tämä tutkimus osoittaa, että kaikki meidän varsi /kantaisä liittyvien subsets (uge, Sca-1

Hi, Sca-1

Lo) ilmaisevat useita kantasolujen merkkiaineiden (yhteensä 67 geenien) (kuvio 2B, taulukko S5 ). Toinen lähestymistapa määrittämiseksi primitiivinen luonne profiilien mukana järjestelmällisen vertailun profiilin viiden muun geeniekspressioprofiilien alkion (ESC), hematopoieettisen (HSC), neuronaalinen (NSC) [16], [17], iho [18 ] ja maksan [19] kantasoluja. Huomasimme, että huomattava osa mRNA: iden ilmaistu eturauhasen varsi /kantaisä klustereita myös säädellään ylöspäin ainakin yksi viidestä julkaistun SC profiileja (vaihtelee 40%

uge vain

mRNA: t 20% on

Sca-1

Hi + Sca-1

Lo

mRNA: t) (kuvio 2B, taulukot 1, S6). Siten rajoituksista huolimatta verrataan saatuja tietoja käyttämällä eri koeolosuhteissa ja vähemmän kattava microarray kuin käytetty Tutkimuksessamme havaitsimme korkea verran päällekkäisyyttä geenien yli-ilmentyy eturauhasessa varsi /kantaisä profiilit ja ne, jotka yliekspressoituvat muissa SC profiileja. Tämä tarkoittaa, että eturauhasen varsi /esisolujen jakaa lukuisia ominaisuuksia SC eristetty muista lähteistä. Kuitenkin eturauhasen varsi /esisolujen myös ilmaista geenejä ei ole tunnistettu missään näistä viidestä SC populaatioiden siitä, että jotkin näistä geeneistä voi olla ainutlaatuinen eturauhasen tai se voidaan jakaa muiden undescribed SC profiileja. On huomattava, että kaksi lähestymistapaa käytetään arvioimiseen SC-merkki rikastamiseen osoittavat, että vaikka on huomattava yliedustus SC liittyvien geenien aikuisten Sca-1

Hi soluja, on olemassa vieläkin suurempi edustus SC-merkkiaineiden uge soluissa. Mielenkiintoista, vertailu kaksi ”stemness allekirjoitus” tutkimukset [16], [17] osoittaa, että PTK profiili on suurempi päällekkäinen ESC tai NSC profiileja, kuin HSC. Esimerkiksi vertailu tietoihin Ramalho-Santos et al [17] osoittaa, että 14,4% ja 16,1%: n PSC-rikastettu mRNA: t päällekkäinen ESC- ja NSC-rikastettu mRNA: t vastaavasti, kun taas vähemmän mRNA: t (6,8%) päällekkäisyys HSC-rikastettu transkriptien (taulukko 1). Useat viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että geeniekspressioprofiilien talous- ja sosiaalineuvostojen ja NSCs päällekkäin suuremmassa määrin kuin HSC [17], [20]. Siten tulokset viittaavat siihen, että eturauhasen kantaisä linjaa voi muistuttaa hermosolujen tai alkion esisolujen suuremmassa määrin kuin hematopoieettisten esisolujen.

Läsnäolo huomattava määrä SC geenien meidän APSC ja FPSC viittaa siihen, että näiden kantojen ovat luonteeltaan eriytymättömiä progenitorisolujen. Me seuraavaksi määritettiin molekyyliprofiilien eristetyn PSC väestön tulkita mahdollisia signalointi polkuja, jotka ovat ilmaisseet nämä solut.

B. Tunnistaminen yliedustettuina toiminnallisten luokkien ja TF-sitova promoottori motiivien sisällä klustereita geenejä, jotka yliekspressoituvat varren /esisolujen

tunnistamaan tärkeimmät biologiset prosessit ja transkription verkostoja kolmen SC sisältäviä klustereita (

uge vain

,

uge + Sca-1

Hi

,

Sca-1

Hi-vasta

; kuvio 1) sovelsimme EXPANDER paketti toiminnallinen ja promoottori analyysi. Useita toiminnallisia luokkia ja TF-sitoutumisen promoottori motiivit merkittävästi rikastettu näissä klustereissa (taulukot 2, S7).

a) Self-uusiminen allekirjoitettavaksi FPSC

uge vain

klusteri on hyvin rikastettu solujen lisääntymisen geenejä, kuten voidaan odottaa laajentuvan sikiön väestöstä (taulukot 3, S7,8). Up-regulation

Mki67

(12-kertainen) yksinomaan uge osajoukko todistaa, että nämä solut yleistyvät. Lisääntymistä ja solukierron liittyviä reittejä ovat koholla itseuudistumisen normaalin SC [21]. PTEN poisto, joka laajentaa allas itseuudistuvien NSC [21], paljastaa SC-itseuudistumisen allekirjoituksen (231 geenit) näille soluille. Erityisesti noin 64% näistä geeneistä ovat myös säädellään ylöspäin

uge vain

klusteri, mikä osoittaa huomattavaa samankaltaisuutta geenien ilmentyminen näiden kahden itseuudistuvien populaatioiden (taulukko S9). Komponentit, sekä kohdegeenien, Wnt /β-kateniinin polku, joka edistää itseuudistumisen monenlaisissa SC [22] ovat vahvasti edustettuina FPSC ja APSC (taulukot 3, S10). Poikkeavaan aktivaatio tämän reitin eturauhastuumoreissa [23] ja sen rikastumisen PSC on yhdenmukainen sen havainnon kanssa, että eturauhassyövän voi syntyä primitiivinen osastoon. qPCR-analyysi vahvisti geenin ilmentymisen profiilit, mikä osoittaa, että ilmentyminen

Wnt4

on kohonnut FPSC (5-kertainen) ja APSC (8-kertainen) verrattuna kypsä soluja (Sca-1

Neg). Lisäksi,

Wnt6

on kohonnut FPSC (22-kertainen), ja Fzd6 on kohonnut FPSC (5-kertainen) ja APSC (3-kertainen) verrattuna kypsä soluja (taulukko S11). Komponentit sonic hedgehog (Shh) reitin, jota myös osallisena itseuudistumisen primitiivisen solujen [24] ja tukahduttaminen eriyttäminen, ovat ilmeisiä vuonna FPSC ja APSC (taulukot 3, S12). Runsaus Shh-sääntelyviranomaisten ja kohde- geenejä, jotka ajan säännelty FPSC ja APSC osoittaa, että autokriinisella hedgehog-signalointia voi olla tärkeä rooli eturauhassyövän esisolujen /kantasolujen biologiassa. qPCR analyysi validoi geeniekspression data ja osoittavat, että

Shh

ja

Gli3

ilmaisua ovat lisääntyneet sikiön (35-kertaiseksi ja 4-kertaiseksi) ja aikuisten (6-kertainen ja 3-kertainen vastaavasti) SC suhteessa kypsiä soluja (taulukko S11). Hedgehog signalointi on tärkeää normaalissa eturauhasessa kasvua ja kasvaa aikana eturauhasen kasvainten synnyssä yhteistuumin kasvuun esisolujen merkkiaineiden [25], mikä jälleen, että primitiivinen soluja voidaan laajentaa aikana kasvaimen kehittymisen.

TF-sitoutumiskohta analyysi promoottoreita geeneistä, jotka olivat sääteli sisällä FPSC (

uge vain

cluster) yksilöidään kaksi transkription säätelijöinä solusyklin eli E2F ja Nfy (taulukot 2, S13), sopusoinnussa yli- edustus itseuudistumisen geenit (taulukot 3, S7) [20]. Tärkeää on, kasvaa tasot mRNA koodaa neljä jäsentä E2F perheen havaitaan sekä lukuisia geenejä, jotka ovat erityisiä tavoitteita E2f3 (taulukko 3). Analyysi qPCR vahvistaa, että

E2f3

(3-kertainen) ja sen edustaja kohdegeenin,

Cdc2a

(12-kertainen), ovat ajan säännellään uge soluissa verrattuna kypsät solut (taulukko S11). Mielenkiintoista, E2f3 ilmentyminen liittyy itseuudistumisen Hiiren trophoblast SC [26], laajennus SC on columella ja sivusuunnassa juuren korkit Arabidopsis [27], ja huono ennuste eturauhasen syöpä [28]. Sitoutuminen-motiivi allekirjoituksen Nfy on myös hyvin edustettuna edistäjiä FPSC geenien ja on mukaisesti lisääntynyt transkriptio Nfya ja Nfyb alayksiköt ja havainto, että Nfya indusoi HSC itseuudistumisen [29].

Muita promoottorin allekirjoituksia, jotka on rikastettu

uge vain

klusterin ovat ne Ap2 ja alkion TEA domeenin sisältävä tekijä (ETF), joka tunnetaan myös nimellä Tead2 (taulukot 2, S13). Vuonna FPSC ilmaus

ETF Twitter /

Tead2

ja sen koaktivaattorikompleksien,

Yap1

, lisättiin 4- ja 2-kertaiseksi. Lisääntynyt ilmentyminen

Tead2

(4-kertaisesti) FPSC suhteessa kypsyä soluihin varmistettiin qPCR (taulukko S11). Tead2 indusoi geenejä, jotka edistävät itse uusimisen kantasolujen hajuepiteeli [30] ja on olennaista, hiiren alkionkehityksen [31]. Ap2 selostukset ovat koholla 3-kertaiseksi ja useita sen kohdegeenien on lisääntynyt (taulukko 3). Ap2 edistää lisääntymistä yli erilaistumista ja on markkeri SC ja pluripotenttisuuden [32]. Siten E2F, Nfy, Tead2 ja Ap2 todennäköisesti mukana itseuudistumisen ja laajentaminen primitiivinen eturauhasen väestöstä.

b) TGF-ß signalointi allekirjoitettavaksi APSC

Vastakohtana runsauden leviämisen geenien läsnä laajenevan uge väestölle APSC (Sca-1

Hi osa siitä) huomaamme, että TGF-β kohdegeenien on voimistunut osoittaa, että TGF-β signalointi on näkyvä piirre APSC. Olemme aiemmin dokumentoitu, että ylläpito lepotilan APSC on riippuvainen TGF-β /Smad2 /3-signalointireitin [33]. On merkittävää, meidän cis-elementin promoottori analyysi identifioi rikastettu sitovat-sivustoja Smad ja Smad3

Sca-1

Hi-vasta

klusteri, kun taas samanlainen sivustot olivat poissa

uge vain

klusteri (taulukko 2), mikä osoittaa, että TGF-β /Smad signalointi voi olla hallitseva rooli APSC.

ilmentymisen taso

Itgb6

, integriini, joka sitoutuu ja aktivoi TGF β [34] on säädelty 3-kertaisesti APSC (taulukko 3). Lisäksi ekspression lisääntymisen tasot

IGFBP3

(14-kertaisesti), joka fosforyloi Smad3 [35], on havaittu yksinomaan Sca-1

Hi osajoukko. Validointi qPCR (3-kertainen, taulukko S11) ja FACS-analyysi (3-kertainen, kuvio 3B) vahvistaa, että TGF-β kohdegeenin klusteriini (Clu) on säädellään ylöspäin APSC. Meidän promoottori analyysi tunnistaa myös yliedustus on Smad3 motiivin promoottorit geenit uge + Sca-1

Hi klusteri (taulukko 2), mikä osoittaa, että TGF-β voi myös välittää signaloinnin FPSC. Toisena lähestymistapa määrittämiseksi mahdollinen osallistuminen TGF-β signalointi primitiivinen eturauhasen soluissa, vertasimme geenit kolmen SC-rikastettu klusterit (

uge vain

,

uge + Sca-1

Hi

ja

Sca-1

Hi-vain

) kanssa TGF-β-ajettu allekirjoituksensa keratinosyyttien [36]. Nämä vertailut osoittavat, että noin 14%: n geenien jokaisessa näistä kolmesta testattu klusterit saattavat olla TGF-β tavoitteet (

uge vain

112/823;

uge + Sca-1

Hi

19/130;

Sca-1

Hi-vasta

23/172 geenejä) (taulukko S14), joka tukee osuus TGF-β signalointi FPSC lisäksi sen näkyvä rooli APSC (Taulukko 3). Tältä osin on tärkeää huomata, että

Smad2

ja

Smad3

, kaksi tärkeintä transkription välittäjiä TGF-β, ovat yksinomaan ajan säädellään uge (taulukko 3). Näkyvä edustus Smad sitovan päällä motiivi promoottorit geenien up-säännellään APSC (Sca-1

Hi-only cluster) osoittaa, että TGF-β signalointireitistä on erittäin tärkeitä transkription ohjelma näiden solujen ja tukee havainto, että TGF-β ylläpitää liikkumattomuus on APSC [33].