Krooninen sairaus

tiivistelmä

Epigeneettiset hiljentäminen on yksi niistä mekanismeista, jotka johtavat inaktivaatio kasvainsuppressorigeenin, joko DNA: n metylaatio tai histonimodifikaation vuonna promoottorin säätelyalueen. Mitogeenilla geenin, 6 (

MIG-6

), pääasiassa tunnettu negatiivista palautetta estäjä epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) perhe, on kasvainsuppressorigeenin, joka liittyy monien ihmisen syöpien. Sen määrittämiseksi,

MIG-6

inaktivoidaan epigeneettiset muutos tunnistimme ryhmä ihmisen keuhkosyövän ja Melanoomasolulinjojen jossa sen ilme on joko alhainen tai havaita ja tutkittu vaikutuksia metylaation ja histoni deasetylaatiolla on sen ilme. DNA metyylitransferaasi (DNMT) estäjä 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC) aiheuttama

MIG-6

ilmentymistä Melanoomasolulinjojen mutta vähän keuhkosyöpä linjat. Sitä vastoin histonideasetylaasi- (HDAC) estäjä trikostatiini A (TSA) aiheuttama

MIG-6

ilmentymistä keuhkosyövässä linjat mutta oli vähän vaikutusta melanooman linjat. Kuitenkin

MIG-6

promoottori itse ei näytä olevan suoraan vaikuttaa joko metylaatio tai histoni deasetylaatiolla, mikä osoittaa epäsuoran sääntelymekanismiin. Lusiferaasireporttiterilla analyysit paljastivat, että lyhyen segmentin eksonin 1

MIG-6

geeni on vastuussa TSA vasteen keuhkosyövän soluja; Näin,

MIG-6

geeni voidaan epigeneettiseltä vaientaa kautta välillisen mekanismin ilman fyysistä muutoksen sen promoottori. Lisäksi meidän tiedot viittaavat myös siihen, että

MIG-6

geeniekspressiota säädellään eri tavalla keuhkosyövässä ja melanooma.

Citation: Zhang YW, Staal B, Dykema KJ, Furge KA, Vande Woude GF (2012) Cancer-Type asetus

MIG-6

ilmentymisen estäjät metylointi ja histoni deasetylointi. PLoS ONE 7 (6): e38955. doi: 10,1371 /journal.pone.0038955

Toimittaja: Javier S. Castresana, Navarran yliopisto, Espanja

vastaanotettu: 27 helmikuu 2012; Hyväksytty: 15 toukokuu 2012; Julkaistu: 12 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Zhang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat rahoituksella Van Andelin Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja käsikirjoitus.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mitogeenillä geenin, 6 (

MIG-6

) (tunnetaan myös nimellä geeni 33,

ERRFI1

, tai

RALT

) on välitön varhainen vaste-geeni, joka ilmentyy erilaisissa kudoksissa, ja sillä on kriittinen rooli monissa patofysiologisia valtioissa [1]. Sen ilmentymistä voidaan indusoida laajan kirjon kasvutekijöitä, hormoneja tai stressin ärsykkeille, ja se liittyy erilaisia ​​kroonisia sairauksia [1], [2]. Tutkimukset hiirillä ovat osoittaneet, että

Mig-6

vaaditaan iho- morphogenesis ja keuhkojen kehitykseen ja että sillä on tärkeä rooli ylläpitää yhteistä tasapainotukseen [3], [4], [5].

sytoplasminen rakennustelineet sovitin, MIG-6 on useita tärkeitä proteiini-proteiini-vuorovaikutuksen motiiveja, jotka voivat välittää vuorovaikutusta molekyylejä alavirtaan reseptoria (RTK: t) [2]. Yksi merkittävimmistä rooleista MIG-6 säätelyssä signaalitransduktion tulee sen kyvystä suoraan vuorovaikutuksessa kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja muiden erbB-perheen jäseniä, estämällä niiden fosforylaation ja alavirran signalointia negatiivista palautetta tavalla [6], [7], [8], [9]. MIG-6 voidaan saada aikaan hepatosyyttikasvutekijän (HGF) ja toimii negatiivista palautetta säätelijä HGF-MET signalointi [10], [11], mikä osoittaa, että sillä on laaja rooli signaalina tarkistuspisteen moduloimiseksi aktivoitu RTK reiteistä ajoissa.

todisteet

MIG-6

on tuumorisuppressorigeeniä on vakuuttava. Se sijaitsee kromosomissa 1p36, kasvupaikalla, joka usein on Heterotsygotian menetys useissa ihmisen syövissä, mukaan lukien keuhkosyöpä [12], [13], [14], melanooma [15], ja rintasyövän [16]. Todellakin, alassäätöä tai menetys

MIG-6

ilme on raportoitu syöpiä ja liittyy usein huonoon ennusteeseen [3], [11], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23].

MIG-6

alassäätö ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) liittyy lisääntynyt EGFR signalointi ja huonosti eriytetty syöpää [21], kun taas tappio sen ilmentymisen ErbB2-monistettiin rintasyöpä tekee syöpä solut kestävät paremmin Herceptin, neutraloiva vasta-aine ErbB2 [16]. Glioblastoma,

MIG-6

tunnistetaan yhden geenin sisällä yleisimmin poistettu alue on 1p36.23 locus, ja sen ilmentyminen säätyy alas 34% glioblastoma näytteistä [19]. Vaikka

MIG-6

alassäätöä raportoidaan suuri osa papillaarisen kilpirauhassyövän [22], korkea

MIG-6

ilmaisu korreloi elinajan pitenemiseen ja liittyy suotuisa kirurgisten lopputulokset niille potilaille, [24]. Vähentynyt MIG-6 ilmaisu on myös raportoitu ihosyöpä, kohdun limakalvon syöpä, ja hepatosellulaarikarsinoomien [3], [20], [23]. Lisäksi vaikka tällaiset tapahtumat ovat harvinaisia, kolme mutaatiot

MIG-6

geeni on tunnistettu ihmisen keuhkosyöpää ja yksi neuroblastoomakasvaimissa [11], [18]. Lisätodisteita tukeminen

MIG-6

kuin tuumorisuppressorigeeniä syntyi hiiri tutkimukset;

Mig-6

vajausta hiiret ovat alttiimpia epiteelin liikakasvu tai kasvainten elimet mukaan lukien keuhkojen, ihon, kohtu, sappirakon ja sappitiehyeiden [3], [11], [20].

Epigeneettiset muuttaminen, yksi tunnettuja mekanismeja, jotka johtavat inaktivaatio kasvainsuppressorigeenin [25], voi johtua DNA: n metylaatio tai histonin deasetylointi on geenin promoottori [25]. Koska alas-säätely

MIG-6

havaitaan usein monissa ihmisen syövissä, kysyimme, onko

MIG-6

ilmentyminen vaikutti DNA: n metylaation ja histonien deasetylaatiolla. Tässä osoitamme, että

MIG-6

promoottori itsessään ole hypermetyloitunut eikä vaikuta histoni deasetyloinnilla. Kuitenkin sen ilmentyminen indusoi DNA metyylitransferaasin (DNMT) estäjä 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC) in melanoomasolulinjat ja histonideasetylaasi (HDAC) estäjä trikostatiini A (TSA) keuhkosyövän linjat. Leikkaamalla sen promoottorin säätelyalueen avulla lusiferaasireport- määritystä tunnistimme minimaalinen TSA-vaste-elementti eksonissa 1.

MIG-6

, joka on välttämätön sen indusoitumisen TSA keuhkojen syöpäsoluja.

tulokset

MIG-6 ilmentymistä säädellään eri tavalla 5-atsa-dC melanoomasolulinjojen ja TSA keuhkosyövän solulinjoissa

Voit selvittää

MIG-6

ilmentyminen vaikuttivat epigeneettiset muutos, ensin tunnistettu ihmisen syövän solulinjoissa, jossa sen promoottori on todennäköisesti vaikuttavat metylointi tai histoni deasetylaatiolla. Kuten on esitetty kuviossa 1, löydettiin neljä ihmisen NSCLC-solulinjat (A427, H226, H522, ja H596), ja viiden melanoomasolulinjoja (M14, MALME-3M, SK-2, SK-MEL-28, ja UACC-257) jossa MIG-6-proteiini oli joko alhainen tai huomaamaton. Sitten käsiteltiin näistä solulinjoista kanssa tai ilman 5-atsa-dC, TSA, tai molempia estäjien.

kokosolulysaateille valmistettiin ilmoitetun solulinjat, ja MIG-6 määritettiin western blot analyysi käyttäen anti-Mig-6 polyklonaalista vasta-ainetta. Latauskontrollina, sama blot koetettiin anti- β-aktiini vasta-aine.

Meidän yllätys, huomasimme, että TSA hoito lisäsi merkittävästi määrää MIG-6 proteiinin keuhkosyöpäsolua linjat, mutta ei melanooman rivit (kuvio 2A). Sitä vastoin 5-atsa-dC hoito lisäsi merkittävästi MIG-6-proteiinin melanoomasolulinjoja, mutta ei-pienisoluisen keuhkosyövän keuhkosyöpä linjat (kuvio 2B). Sen määrittämiseksi, kasvua MIG-6-proteiinin säännelty transkription tasolla, suoritimme RT-PCR-analyysillä. Kuten kuviossa 3 on esitetty, ja yhdenmukaisia ​​proteiinin ekspression,

MIG-6

mRNA: n ekspressio lisääntyi TSA hoitoon vain neljä keuhkosyövän solulinjat, ja se kasvoi 5-atsa-dC hoitoon vain viidessä melanooma linjat. Nämä tiedot viittaavat vahvasti siihen, että induktio

MIG-6

ilmentymisen 5-atsa-dC tai TSA säädellään transkriptionaalisella tasolla, ja säädellään eri tavalla, että keuhkosyövän ja melanoomasoluja.

kokosolulysaateille uutettiin käsiteltyjen solujen kanssa tai ilman 5-atsa-dC (10 uM) ja /tai TSA (1 uM), ja western blot-analyysit suoritettiin havaitsemiseksi MIG-6-proteiinia. β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. (A) MIG-6-proteiini indusoitiin TSA mutta ei 5-atsa-dC on keuhkosyöpä linjat. (B) 5-atsa-dC, mutta ei TSA, indusoitu MIG-6 melanoomasolulinjoja.

Yhteensä-RNA: t eristettiin soluista käsiteltiin kanssa tai ilman 5-atsa-dC (10 uM ) ja /tai TSA (1 uM), ja

MIG-6

ilmentyminen määritettiin RT-PCR-analyysit.

GAPDH

ilmaisua käytettiin sisäisenä kontrollina. (A) TSA lisäsi

MIG-6

mRNA neljässä keuhkosyövän solulinjat. (B)

MIG-6

mRNA viiden Melanoomasolulinjojen nostettiin 5-atsa-dC.

MIG-6-promoottori ei ole hypermetyloitunut eikä vaikuttaa suoraan histoni deasetyloitumisen

Koska

MIG-6

indusoitiin 5-atsa-dC in melanooma linjat, kysyimme sen promoottorin hypermetyloitunut näissä soluissa. Poimimamme genomista DNA: ta sekä keuhkosyövän ja melanoomasolulinjat ja tutkitaan DNA: n metylaatio 596 bp

MIG-6

promoottorin säätelyalueen, joka sisältää runsaasti CpG sivustoja (kuvio 4). Yllätykseksemme keuhkosyöpä solulinjat (kuvio 4A) ja Melanoomasolulinjojen (kuva 4B) oli samankaltainen ottaa hyvin vähän metyloitu CpG sivustoja

MIG-6

promoottori säätelyalueen, mikä osoittaa, että induktio

MIG-6

5-atsa-dC in melanooma oli riippumaton DNA: n metylaation sen promoottori. Nämä tulokset vahvistettiin suoralla sekvensoinnilla PCR-tuotteiden monistettu ui bisulfiittikäsiteltyä DNA: t (tuloksia ei ole esitetty).

MIG-6

promoottori monistettiin bisulfiitti-muunnettu DNA ja kloonattiin TOPO TA-kloonausvektoriin. Tilan

MIG-6

promoottorin metylaation (A) keuhkosyöpä solulinjat ja (B) melanoomasolulinjoja arvioitiin sekvensoimalla 10 satunnaisesti poimittu pesäkettä kustakin linja metyloidut sytosiinit. Jokainen punainen palkki edustaa CpG sivusto. Avoin soikio osoittaa metyloimattoman CpG sivustoja ja kiinteä ovals osoittavat metyloituja sivustoja. EBC-1 solulinjaa käytettiin negatiivisena kontrollina näyttää pohjapinta metylaatiostatuksen MIG-6-promoottori.

Samoin kysyimme

MIG-6

promoottori vaikutti histonin deasetylointi. By kromatiinin immuunisaostustesti (ChIP), olemme havainneet, että TSA hoito ei lisätä sitoutumisen asetyyli-histoni H3

MIG-6

promoottorin keuhkosyöpä viivoja tai melanooman rivit (kuvio 5), mikä osoittaa, että

MIG-6

promoottori ei vaikuta suoraan histoni deasetyloinnilla joko.

soluja käsiteltiin tai ei TSA (1 uM) 24 tunnin ajan, ja chIP-määritys suoritettiin anti-asetyyli histoni H3 vasta-aine. Negatiivisena kontrollina, normaali kanin seerumi käytettiin immunosaostukseen. DNA-fragmentit silloitettuja ja yhteistyö immunosaostettiin asetyloitu histoni H3 puhdistettiin ja käytettiin monistamiseen PCR edistäjinä

MIG-6

ja

GAPDH

. EBC-1 solulinjaa käytettiin negatiivisena kontrollina näyttää pohjapinta histonien deasetylointi tilan MIG-6-promoottori.

MIG-6 transkriptio epäsuorasti säätelee kertoimella (t), jotka vaikuttavat metylaatio tai histonien deasetylaatiolla

Koska edellä tiedot viittaavat siihen, että

MIG-6

induktio ei ole suoraan säännellä, etsimme sekundaarinen mekanismi, jossa inhibiittorit asiakkuutta ilmentymistä transkriptiotekijä (t) tai kofaktori (t), joka puolestaan ​​säätelee

MIG-6

ilme. Niinpä selvitimme vasteet

MIG-6

promoottorisäätelyelementtiin alueen estäjien kautta lusiferaasireportterigeenin määritys.

MIG-6

promoottorireportterivektori konstruoitiin lisäämällä 1,383 kb genomista DNA-fragmentti (joka koostuu

MIG-6

promoottori, sen ylävirran säätelyalueen, ja loppupään eksonin 1 ja osa introni 1) edessä lusiferaasireportterigeeniin. Testaaminen toimittaja sekä keuhkosyövän ja Melanoomasolulinjojen, huomasimme, että TSA huomattavasti korkeampia

MIG-6

promoottorin aktiivisuutta keuhkosyöpäsoluissa mutta eivät osoittaneet tällaista vaikutusta melanooman soluissa (kuvio 6). Tämä data oli yhdenmukainen meidän etukäteen western blot ja RT-PCR-analyysejä. 5-atsa-dC, kuitenkin, ei vaikuttanut olevan vaikutusta reportterin aktiivisuutta joko melanooman tai keuhkosyöpä viivoja (kuvio 6). Nämä tiedot osoittavat, että vaikka TSA vastaava elementti on alueella 1,383 kb alueella

MIG-6

, 5-atsa-dC-reagoiva elementti on todennäköisesti tämän alueen ulkopuolella.

Lung syöpä ja melanoomasolulinjat transfektoitiin ohimenevästi lusiferaasireportteri- plasmideja, joko pGL3-Basic tai pGL3-P (-1076 /+ 307), jota seuraa käsittely tai ilman 5-atsa-dC tai TSA. PU6B-

Renillaa

toimittaja kotransfektoitiin normalisointia. Kukin määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Virhepalkit edustavat keskihajonta. Opiskelija t-testi

p

arvo osoittaa tilastollisesti merkittävää eroa valehoidettujen ja TSA-käsiteltyjen näytteiden.

Pieni segmentti eksonin 1 MIG-6 on olennaista TSA vasteen keuhkosyöpää

suoritettu useita poisto analyysien 1,383 kb

MIG-6

promoottori säätelyalueen määrittää minimaalinen alue induktioon tarvittava TSA keuhkosyövän solut. Poistamista 5′-terminuksesta proksimaalisen alueen

MIG-6

promoottori pienensi pohjapinta promoottorin aktiivisuutta, kun taas vaste TSA pääasiallisesti säilytetty (kuvio 7A). Poistetaan 3′-terminuksesta transkription aloituskohtaan ja

MIG-6

johti täydelliseen menetykseen vaste TSA (kuvio 7B), mikä osoittaa, että TSA vaste-elementti oli alavirtaan

MIG- 6.

promoottori. Lisädeleetio analyysit paljastivat pienen segmentin eksonin 1 alkaen transkription aloituskohdasta joka oli välttämätön TSA reagointikykyä (kuvio 7C). Kuten esitetty kuviossa 7D, minimaalinen TSA vaste-elementti on ensimmäisten 50 nukleotidin eksonin 1, jossa distaalinen 20 nukleotidin segmentti, jolla on suurin aktiivisuus.

(A-C) eri pituudet

MIG-6

promoottorin säätelyalueen insertoitiin pGL3 vektoriin. Lusiferaasireportterigeenin määritys suoritettiin A427 keuhkosyövän soluja transfektoitiin väliaikaisesti pGL3-Basic tai ilmoitettu toimittaja kuljettaa

MIG-6

promoottorielementti. Solut käsiteltiin sitten tai ilman 5-atsa-dC tai TSA. PU6B-

Renillaa

toimittaja kotransfektoitiin normalisointia. Kukin määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Virhepalkit edustavat keskihajonta. (D) Kaaviokuva TSA-vaste-elementti

MIG-6

promoottori säätelyalueen. Nuoli osoittaa transkriptio alkaa sivuston; punainen ruutu osoittaa eksonin 1. Varjostetut vihreä on 50-bp tekijä eksonissa 1, joka on todennäköisimmin vastuussa TSA vasteen keuhkosyöpää soluissa, jota nimitetään minimaalinen TSA-elementin.

spekuloivat, että on olemassa kriittinen transkriptiotekijän sitova motiivi minimaalinen TSA vaste-elementin. Suoritimme mutaatio analyysit 50 nukleotidin segmentti paikantaa mahdollisia transkriptiotekijän sitova motiivi (t) (kuvio 8A). Verrattuna villityypin P (-76 /+ 50) reportteri, mutaatio m4 ja m5 elementtejä johti merkittävään lasku reportteri toimintaa vastauksena TSA, kun taas mutaatio muiden osien oli pienempi vaikutus (kuvio 8B). Tämä tulos yhtyy poisto analyysit, kuten m4 ja m5 elementit ovat distaaliseen 20 nukleotidin segmentti, että kun poistettu, johti jyrkkä pudotus-off in TSA vastausta. Meillä syntyy toinen mutantti reportteri m11 jossa puolet sekvenssit sekä m4 ja m5 mutatoitiin (kuvio 8A). Olemme havainneet, että M11-mutantti oli paljon suurempi väheneminen TSA vastaus (kuvio 8C), mikä osoittaa, että nämä sekvenssit ovat välttämättömiä sitoutumisen vielä tunnistaa transkriptiotekijä, joka säätelee MIG-6-geenin ilmentyminen indusoitiin TSA keuhkosyöpä .

(A) sekvenssit P (-76 /+ 50), jotka sisältävät

MIG-6

promoottorin ja minimaalinen TSA-elementin näkyvät. Kunkin mutantin reportteri-konstrukti (m3-m11), alleviivattu sekvenssi on mutatoitu GAATTC. (B ja C) lusiferaasireport- Määritys suoritettiin A427 keuhkosyövän soluista ohimenevästi transfektoimalla ilmoitettu reportteriplasmidilla kanssa tai ilman TSA hoitoa. Virhepalkit edustavat keskihajonnan ja kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.

Muut geenejä säädellään eri tavalla 5-atsa-dC ja TSA keuhkosyövässä ja melanoomasoluja

Seuraava pyysi onko olemassa muita geenejä säädellään eri tavalla 5-atsa-dC ja TSA keuhkosyövässä ja melanoomasoluja. Suoritimme DNA-siru analyysejä näytteistä peräisin A427 keuhkosyövän ja M14 melanoomasoluja käsiteltiin 5-atsa-dC ja /tai TSA. Kuvio 9A esittää geenit näyttämällä ekspressiomalli on samanlainen kuin

MIG-6

(joka on merkitty

ERRFI1

lämpöä-map) vasteena joko 5-atsa-dC tai TSA käsittely (kuvio 9A). Toinen ryhmä geenejä näytti alassäädetty, vastakohta

MIG-6

ilmaisu (kuvio 9B).

Microarray analyysit suoritettiin RNA näytteitä A427 keuhkosyövän soluja ja M14 melanooma solut, joita käsiteltiin tai ei 5-atsa-dC (10 uM) ja /tai TSA (1 uM). Lämpö kartat osoittavat (A) geenit, joiden ilmentymistä malli oli samanlainen kuin

MIG-6

, ja (B) geenit, joiden ilmentymistä alassäädetty käsittelemällä, toisin kuin

MIG -6

ilme.

MIG-6

geeni on merkitty tähdellä ja näkyy vaihtoehtoinen symboli,

ERRFI1

.

joukossa ylös geenien olivat koodaus for transkriptiotekijöiden kuten EGR1 ja STAT1, MIG-6-geenin,

HBEGF

, ja geenit, jotka koodaavat histoniproteiineista (kuvio 9A). Vaikka nämä geenit ilmentyvät differentiaalisesti A427 ja M14-soluja (kuvio 9A), joka lisäksi analyysit paljastivat, että

EGR1

(mutta ei useita muita geenejä tutkimme) näytetään ekspressiokuviota samanlainen kuin

MIG- 6

kaikkien neljän keuhkosyövän solulinjat ja viiden melanooma riviä (kuvio 10). Siten

MIG-6

ollut ainoa geeni differentiaalisesti säännelty keuhkosyövän ja melanoomasoluja. Ehkä on olemassa kudosspesifiset tekijöitä (joko transkriptiotekijöiden tai transkriptiotekijä co-aktivaattorit /co-repressors), joka reagoivat eri 5-atsa-dC ja TSA, mikä johtaa erilaiseen induktioon

MIG-6

ja

EGR1

keuhkosyövän ja melanoomasoluja.

ilmentyminen

EGR1

määritettiin RT-PCR: llä. (A) TSA aiheuttama

EGR1

ilmentymistä NCI-H226, NCI-H522, NCI-H596, ja A427 keuhkosyövän solulinjat. (B) 5-atsa-dC indusoi

EGR1

ilmentymistä M14, MALME-3M, SK-2, SK-MEL-28, ja UACC-257 melanoomasolulinjoja.

GAPDH

ilmaisua käytettiin sisäisenä kontrollina (katso kuva 3).

Keskustelu

MIG-6

, kasvainsuppressorigeenin , on todettu alassäädetty monissa ihmisen syövissä. Sen määrittämiseksi, alas-säätely

MIG-6

ilmentyminen vaikutti epigeneettiset muutos sen promoottorin, käsittelimme keuhkosyöpä ja melanooma solulinjoja estäjiä metylaation ja histonien deasetylaatiolla ja sitten määritetään, kuinka nämä inhibiittorit vaikuttivat

MIG-6

ilme. Kiinnostavaa, olemme huomanneet, että DNMT inhibiittori 5-atsa-dC indusoi spesifisesti

MIG-6

ilmentymisen melanooman soluissa, mutta ei keuhkosyövän soluja, kun taas HDAC-inhibiittori TSA indusoidun käänteisen mallin (kuvio 2 ja 3). Vaikka molemmat inductions joita säännellään transkription tasolla, olimme hämmästyneitä, että

MIG-6

promoottori ei ollut hypermetyloitunut eikä vaikuta suoraan histoni deasetyloinnilla (kuva 4 ja 5), ​​mikä osoittaa, että epäsuora mekanismi, jonka tehtävänä erotusdiagnoosissa induktio. Itse asiassa, 5-atsa-dC on myös raportoitu indusoivan useiden muiden geenien, joiden promoottorit eivät vaikuta suoraan metylaation leukemiasoluissa [26], mikä viittaa siihen, että 5-atsa-dC voi olla laajempi vaikutus säätelevä geeni ilmaisun kautta metylointi-riippumattomalla tavalla.

Monet DNMT inhibiittorit ja HDAC-inhibiittorit ovat tällä hetkellä kliinisissä kokeissa niiden syövän ominaisuuksia [27], [28], [29]. Vaikka useimmat näistä epigeneettiset huumeet ovat vielä varhaisessa kehitysvaiheessa ja näkymiä niitä voidaan käyttää kliinisesti syövän hoidossa vielä arvioidaan, että arviointi riippuu ymmärrystämme miten ne toimivat ja mitä tuloksia voidaan odottaa. 5-atsa-dC ja TSA nähdään voimakkaita ja spesifisiä estäjiä metylaation ja histoni deasetylaatiolla vastaavasti [27], [28], [30], ja niitä on käytetty laajalti tutkimiseksi epigeneettisellä muuttamista monet tuumorisuppressorigeeneille. Nämä inhibiittorit tavallisesti aiheuttavat maailmanlaajuisia muutoksia geenien ilmentyminen remodeling chromatin kautta suoraan muuntaa metyloitua DNA metyloitumattoman DNA tai unacetylated histonien on asetyloitu tilaan, mikä mahdollistaa helpon pääsyn transkription koneiston geenien promoottorit. Kuitenkin jotkut estäjät voidaan tehdä enemmän, ja niiden anti-cancer ominaisuudet voisivat olla paljon monimutkaisempi. Esimerkiksi monet ei-histoni solun proteiinien kuten transkriptiotekijät ovat substraatteja HDAC, ja niiden transkription toiminta voi vaikuttaa HDAC estäjä TSA samoin [29].

Useimmat tuumorisuppressorigeeneille ovat epigeneettiseltä vaiennetaan joko DNA: n metylaatio ja /tai histoni deasetylaatiolla niiden promoottorien [25]. Tietääksemme ei ole olemassa raportti, joka osoittaa, että sellaisten geenien ekspression voidaan differentiaalisesti säädellä estäjiä metylaation tai histonin deasetylointi on syöpää erityinen muoti ilman epigeneettiset muutoksia promoottori. Sääntely

MIG-6

nämä inhibiittorit, kun osoitamme tässä, julkistaa uuden mekanismin, jolla tuumorisuppressorigeeniä voidaan epigeneettiseltä vaientaa epäsuoraan ja kudosspesifisiä tavalla. Meidän lusiferaasireportterista määrityksen tulokset osoittivat, että sääntely

MIG-6

ilmentymistä melanooman ja keuhkosyöpä oli todennäköisesti välittävät eri tekijät. Olemme tunnistaneet minimaalinen TSA elementin eksonissa 1.

MIG-6

proksimaalisesti sen promoottorin (kuvio 7 ja 8), kun taas sijainti 5-atsa-dC vaste-elementti on edelleen epävarma (kuva 6) .

spekuloida, että TSA vaste tekijä

MIG-6

geeni on todennäköisesti säätelee kertoimella, jonka ilmentyminen vaikuttaa histoni deasetyloinnilla sen promoottori tai joiden proteiini on suoraan säännelty asetylointi /deasetylaation (kuvio 11A). Tämä seikka olisi aktivoitava keuhkosyöpäsoluissa upon TSA hoitoa, mutta ei melanooman soluissa. Sisällä minimaalinen TSA-vaste-elementti, joka meillä on yksilöity

MIG-6

geenin eksonin 1 (kuvio 7), on oletetun DNA: ta sitovan sekvenssit transkriptiotekijän aktivaattoriproteiini-2 (TFAP2), jossa on viisi perhettä jäsenten ja sitoutuu konsensus-sekvenssin 5′-GCCNNNGGC-3 ’[31], [32]. Kun otaksuttu TFAP2 sitoutumiskohdat mutatoitiin, havaitsimme merkittävä lasku TSA-reagointia (kuvio 8), mikä osoittaa, että nämä sekvenssit ovat ratkaisevia TSA-säätelyyn. On mielenkiintoista nähdä, jos TFAP2 tai muu tekijä (t) sitoutuu kyseisten merkkien ja säätelee MIG-6-geenin ilmentymisen. Koska 5-atsa-dC, sen vaste-elementti on todennäköisesti ulkopuolella testattuja 1,383 kb

MIG-6

promoottori säätelyalueen (kuva 6); toisin sanoen se on joko suoraan vaikuttaa metylaation sen DNA-sekvenssejä tai epäsuorasti välittyy toisen transkription sääntelijä, jonka promoottori on muunnettu metylaation melanoomasoluissa (kuvio 11B). Laajat tutkimukset vaaditaan määrittämään, mitä nämä tekijät ovat ja miten he hallitsevat

MIG-6

ilme.

(A) In keuhko- syöpäsoluja, TSA voisi epäsuorasti säädellä

MIG-6

kahteen mekanismiin. Ensimmäinen voisi olla, että TSA estää histoni deasetylointia että promoottori geenin

X

, mikä lisäisi tuotantoa X-proteiinia, joka parantaa

MIG-6

geeniekspressiota liittämällä TSA-elementin aktiivisuutta eksonin 1. toinen voisi olla, että suora asetylaatio proteiinin X vaikutteita TSA johtaa lisääntyneeseen transkription

MIG-6

. (B) In melanoomasoluja, sääntely

MIG-6

ilmentymisen 5-atsa-dC saattaa olla suoraa tai epäsuoraa. 5-atsa-dC saattaisi estää DNA metylaatio promoottori geenin

Y

, mikä ylössäätöä sen tuotteen ja siten epäsuorasti parantamalla

MIG-6

ilmaisu; tai se voi suoraan estää DNA: n metylaatio ulkopuolella testattuja 1,383 kb

MIG-6

promoottori säätelyalueen, joka mahdollistaa helpon pääsyn Transkriptionaalisen koaktivaattoria parantaa

MIG-6

ilme. ”P” tarkoittaa promoottoria kunkin geenin; ”E1” osoittaa eksonin 1

MIG-6

geeni.

Syöpä-tyyppinen säätely geenin ilmentymisen estäjiä metylaation ja histoni deasetylaatiolla ei ole ainutlaatuinen

MIG -6

. Muita geenejä, kuten

EGR1

[33] ovat myös säädellään eri tavalla keuhkosyöpää ja melanoomasoluihin ne inhibiittorit (katso kuviot 9 ja 10). Vielä on selvitettävä,-, kuten

MIG-6

promoottori-

EGR1

promoottori ei ole hypermetyloitunut eikä vaikuta histoni deasetyloinnilla näissä soluissa. Jos nämä ominaisuudet ovat samat molemmissa promoottorit, on mielenkiintoista nähdä, jos ne säätelevät samalla kertoimella (t) kautta tai eri mekanismeja.

Tässä raportoidaan, että

MIG-6

ilmentymiseen eri säätelee inhibiittorit metylaation ja histoni deasetylaatiolla keuhkosyövässä ja melanoomasoluja ilman fyysistä epigeneettiset muutoksia sen promoottori.

MIG-6

(ja mahdollisesti

EGR1

) voivat toimia arvokkaana biomarkkereita määrittämiseksi herkkyys /soveltuvuutta syövän tyyppiä hoidon DNMT ja /tai HDAC-inhibiittorit klinikalla.

Materiaalit ja menetelmät

ihmissolulinjoilla

ihmisen keuhkosyöpä solulinjat A427, NCI-H292, NCI-H2122, NCI-H596, ja SK-MES-1 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). EBC-1 oli peräisin Health Science Research Resources Bank (Tokio, Japani). NCI-H226 ja NCI-H522 saatiin NCI-60 solulinjaa (NCI-Frederick). Ne viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 1% penisilliini /streptomysiiniä. Ihmisen melanoomasolulinjat A375, C8161R, MALME-3M, M14, SK-2, SK-MEL-28, SK-MEL-103, SK-MEL-147, UACC-62, ja UACC-257 ystävällisesti toimitti Dr. . Matthew VanBrocklin (Nevada Cancer Institute, Las Vegas, NV) [34] ja ylläpidettiin RPMI täydennetty 5% FBS: ää ja 1% penisilliini /streptomysiiniä.

Plasmidit

sarja DNA-fragmentteja johdettu

MIG-6

promoottorisäätelyelementtiin alueella työnnettiin

Bgl

II ja

Kpnl

I sivustoja promoottori-vähemmän lusiferaasireportterista pGL3-Basic (Promega, Madison , WI) luo plasmidien pGL3-P(−1076/+307),–P(−533/+307),–P(−106/+307),–P(−76/+307),–P(−76/+255),–P(−76/+245),–P(−76/+177),–P(−76/+139),–P(−76/+50),–P(−76/+31),–P(−76/+20),–P(−76/+10), ja-P (-76 /-1). Kaikki Lisätään fragmentit monistettiin polymeraasiketjureaktiolla (PCR) käyttäen

Pfu

turbo-DNA-polymeraasia (Stratagene, La Jolla, CA), ja tuloksena plasmidit sekvensoitiin tarkkuutta lisää.

Kaikki pGL3-P (-76 /+ 50) mutantti toimittajille luotiin käyttäen Quikchange mutageneesi Kit (Stratagene) mutatoimalla kunkin kuuden alkuperäisen nukleotidin osaksi

EcoRI

I -restriktioentsyymikohdan (GAATTC ), joka vahvistettiin sekvensoimalla. Käytetyt alukkeet luomiseen kunkin mutantin toimittaja ovat seuraavat: ja pGL3-P (-76 /+ 50) m3, 5′-TAGCGGGAGCGCGAGAATTCAAGAGGCGCCTGCG-3 ’(sense) ja 5′-CGCAGGCGCCTCTTGAATTCTCGCGCTCCCGCTA-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) m4, 5’-GAGCGCGAGCCAGCAGAATTCGCCTGCGCAGATCT-3 ’(sense) ja 5′-AGATCTGCGCAGGCGAATTCTGCTGGCTCGCGCTC-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) m5, 5’-AGCCAGCAAGAGGCGAATTCGCAGATCTGCGATCT-3 ’(sense) ja 5′-AGATCGCAGATCTGCGAATTCGCCTCTTGCTGGCT-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) m6, 5’-GCGGCGACGGCGGTCGAATTCGAGGCAGAGTGCTA-3 ’(sense) ja 5′-TAGCACTCTGCCTCGAATTCGACCGCCGTCGCCGC-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) M7, 5’-CGGCGGTCCGGTGCGAATTCGAGTGCTAGCGGGAG-3 ’(sense) ja 5′-CTCCCGCTAGCACTCGAATTCGCACCGGACCGCCG-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) m8, 5’-CCGGTGCGAGGCAGAATTCTAGCGGGAGCGCGA-3 ’(sense) ja 5′-TCGCGCTCCCGCTAGAATTCTGCCTCGCACCGG-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) M9, 5’-GAGGCAGAGTGCTAGAATTCGCGCGAGCCAGCAAG-3 ’(sense) ja 5′-CTTGCTGGCTCGCGCGAATTCTAGCACTCTGCCTC-3′ (antisense); for-P (-76 /+ 50) m10, 5’-GAGTGCTAGCGGGAGAATTCGCCAGCAAGAGGCGC-3 ’(sense) ja 5′-GCGCCTCTTGCTGGCGAATTCTCCCGCTAGCACTC-3′ (antisense); ja-P (-76 /+ 50) m11, 5’-GCGAGCCAGCAAGAGAATTCTGCGCAGATCTGCG-3 ’(sense) ja 5′-CGCAGATCTGCGCAGAATTCTCTTGCTGGCTCGC-3’ (antisense). Alleviivaus ilmaisee

EcoRI

I -kohta jokaisen mutantin.

Western Blot analyysi

valmistamiseksi proteiinilysaattien, solut käsiteltiin tai ilman 5-atsa-dC (10 uM) 3 d tai TSA (1 uM) 1 d täydellisessä kasvualustassa. Jotta näiden kahden yhdistelmä, soluja käsiteltiin 5-atsa-dC 2 d, jonka jälkeen TSA hoito 1 d. Kokosolulysaateille uutettiin RIPA-puskurissa (20 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP 40, 0,5% deoksikolaattia, 0,1% SDS, 1 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM natriumortovanadaattia, ja täydellinen proteinaasi Inhibitor Cocktail tabletit), kvantitoitiin käyttäen DC Protein Assay Kit (Bio-Rad, Hercules, CA), ja säätää yhtä suuri tilavuus 2 x Laemmli-näytepuskuria (Sigma, Saint Louis, MO). Proteiini ajettiin 10% Tris-glysiini-geeliä (Invitrogen, Grand Island, NY), siirrettiin PVDF-kalvolle ja tutkittiin anti-MIG-6 [11] tai anti-β-aktiini-vasta-aine (Sigma).

RNA valmistus ja RT-PCR-analyysi

käyttäminen TRIzol-reagenssia (Invitrogen), kokonais-RNA eristettiin kustakin solulinjasta, käsiteltiin 5-atsa-dC ja /tai TSA ja valvontaa, kuten yksityiskohtainen edellä. Käänteistranskriptioon (RT) -PCR, ensimmäisen juosteen cDNA syntetisoitiin ensimmäisen kerran 1 ug: RNA: sta käyttäen SuperScript II käänteiskopioijaentsyymiä (Invitrogen), jota seurasi PCR-monistus käyttämällä 5%: n cDNA kunkin reaktion. Seuraavat ovat amplifikaatioon käytetyt alukkeet kunkin geenin, sillä

MIG-6

, 5′-ATGTCAATAGCAGGAGTTGCTG-3 ’(sense) ja 5′-GTCTAAGGAGAAACCACATAGG-3’ (antisense); ja

GAPDH

, 5′-AACGGATTTGGTCGTATTGGGC-3 ’(sense) ja 5′-GCTTCACCACCTTCTTGATGTC-3’ (antisense);