Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

erittyvän proteiinin happamien ja runsaasti kysteiiniä (SPARC), kalsiumia sitovan Soluvälitilan glykoproteiini, on sekaantunut etenemistä moniin syöpiin. Tässä tutkimuksessa tutkimme ilmentymistä ja toimintaa SPARC munasarjasyövän.

Methods

cDNA microarray analyysi suoritettiin vertaamaan geeniekspressioprofiilien korkeasti invasiivisia ja alhainen invasiivisia alakloonit johdettu SKOV3 ihmisen munasarjasyövän solulinja. Immunohistokemiallinen (IHC) värjäys suoritettiin tutkimaan SPARC ilmentymisen yhteensä 140 munasarjojen kudosnäytteiden. Vuonna funktionaalisia määrityksiä vaikutukset SPARC Knockdown biologisesta käyttäytymisestä munasarjasyöpäsoluja tutkittiin. Mekanismit SPARC munasarjasyövän leviämisen, apoptoosin ja invaasio tutkittiin myös.

Tulokset

SPARC yliekspressoitiin erittäin invasiivisia jatkokloonin verrattuna alhainen invasiivisia jatkokloonin. Korkea SPARC ilmentyminen liittyy korkea vaiheessa alhainen eriyttäminen, imusolmuke etäpesäke ja huonon ennusteen munasarjasyöpä. Knockdown SPARC ilmaisun merkittävästi tukahdutti munasarjasyövän solujen lisääntymistä, indusoi apoptoosia ja esti solujen invaasiota ja etäpesäkkeiden.

Johtopäätös

SPARC yliekspressoituu erittäin invasiivisia jatkokloonin ja munasarjasyövän kudosten ja tärkeä rooli munasarjasyövän kasvua, apoptoosin ja etäpesäkkeitä.

Citation: Chen J, Wang M, Xi B, Xue J, hän D, Zhang J, et al. (2012) SPARC Onko avainsäätelijä leviämisen, Apoptosis ja Invasion Human munasarjasyöpä. PLoS ONE 7 (8): e42413. doi: 10,1371 /journal.pone.0042413

Editor: Irina Agoulnik, Florida International University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 05 heinäkuu 2012; Julkaistu: 03 elokuu 2012

Copyright: © Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat apurahan-in-tuki tieteelliseen tutkimukseen (2012TS088) Shandongin yliopistossa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Munasarjojen syöpä on toiseksi yleisin gynecologic syöpä ja yksi tärkeimmistä syistä syöpäkuolemista naisten [1]. Suuri prosenttiosuus munasarjasyöpää sairastavilla potilailla diagnosoidaan edennyt pitkälle. Vaikka huomattavaa edistystä onkin tapahtunut munasarjasyövän tutkimusta, jotta selviäisi ilmaantuvuussuhde on edelleen huono ja yleinen paranemisasteella edelleen hyvin alhainen [2]. Kasvaimen uusiutumisen ja etäpesäke pidetään tärkeimmistä syistä huono kliinisen tuloksen ja syöpäkuolemista [3]. Siksi tutkimalla kasvainten invaasio ja etäpesäkkeiden saadaan lisää oivalluksia kehittymistä ja etenemistä munasarjasyöpä.

SPARC (erittyvän proteiinin hapan ja runsaasti kysteiiniä), jota kutsutaan myös osteonektiini, BM-40, ja 43 K-proteiini, on kalsiumia sitova Soluvälitilan glykoproteiini, jonka tehtävänä on moduloida solu-matriisi vuorovaikutuksia ja solujen toimintaa ilman osallistuvat rakenteellisen telineen soluväliaineen [4]. Vaikka on yhä enemmän näyttöä varten tärkeä rooli SPARC erilaisia ​​syöpiä, ei ole yhdistävä malli, joka selittää kaikki osa-alueet sen toiminta ja panosta ja etenemiseen syövän [5]. SPARC ilmentyy differentiaalisesti kasvaimia ja sen ympärillä strooman erilaisissa syövissä verrattuna normaaliin kudokseen. Esimerkiksi korkeampia SPARC ilmaisun on raportoitu rintasyövän [6], [7], maksasyövän [8], [9], eturauhassyöpä [10], peräsuolen syöpä [11], [12], ja munasarjojen syöpä [13], [14]. Kuitenkin päinvastainen korrelaatio on myös osoitettu, viittaa siihen, että SPARC ehkä estää kasvaimien syntyyn tai syövän etenemisen rintasyövän [15], [16], maksasyövän [17], eturauhassyöpä [18], paksusuolen ja peräsuolen syövän [19] , [20], ja munasarjasyöpä [21]. Näin ollen, toiminto SPARC syövän ansaitsee lisätutkimuksia.

Esillä olevassa tutkimuksessa, teimme cDNA microarray-analyysi tutkimaan ero geeniekspression profiilin erittäin invasiivinen subklooni S1 ja alhaisen invasiivisia subkloonista S21, sekä jotka olivat peräisin SKOV3 ihmisen munasarjasyövän solulinja. Olemme havainneet, että monet geenit ilmentyvät differentiaalisesti näiden kahden alakloonit. Erityisesti SPARC havaittiin olevan huomattavasti yli-ilmentynyt erittäin invasiivisia jatkokloonin S1 verrattuna alhainen invasiivisia jatkokloonin S21. Täsmennetään suhdetta SPARC ja munasarjasyövän etenemisen, ilmaukset SPARC ihmisen munasarja- kudosnäytteiden mitattiin immunohistokemiallinen (IHC). Toiminto määrityksessä, jonka lentivirus-välitteisen RNA-interferenssi, me vähentynyt ilmentyminen SPARC erittäin invasiivisia alaklooni S1 ja HO8910PM vaikutuksen määrittämiseksi SPARC on munasarjasyövän solujen lisääntymistä, apoptoosin, invaasio ja metastaasi.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat

SKOV3, NIH3T3 ja HO8910PM (erittäin metastaattinen munasarjasyövän solulinja [22]) solulinjat saatiin Shanghai Institute for Biological Sciences, Kiinan tiedeakatemia. Erittäin invasiivinen aliklooni (S1) ja alhaisen invasiivisia aliklooni (S21) olivat peräisin SKOV3 ihmisen munasarjasyövän solulinja [23]. Soluja viljeltiin RPMI-1640 SKOV3- tai DMEM NIH3T3 ja HO8910PM täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja antibiootteja (Gibco BRL, Rockville, MD).

Microarray Analysis

Kokonais-RNA uutettiin erittäin invasiivinen aliklooni (S1) ja alhaisen invasiivisia aliklooni (S21) käyttäen RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA). RNA laatu arvioitiin spektrofotometrisesti ja denaturoivalla geelielektroforeesilla. RNA monistettiin ja leimattiin käyttäen Agilent Lyhyt Amp -leimauskittiä ja hybridisoitiin Agilent koko genomin oligo mikrosirun. Dioja skannattiin käyttäen Agilent DNA-siru skanneri. Tiedot käsiteltiin käyttäen Agilent Feature Extraction Software (versio 10.5.1.1) ja analysoitiin Agilent GeneSpring GX (versio 11.0). Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

kudosnäytteiden

Tissue näytteet, jotka on saatu kirjallinen lupa 80 naisten epiteelin munasarjasyöpä (29 vakavien kystadenokarsinooma, 25 mucinous kystadenokarsinooma ja 26 endomet- karsinooma ), 35 naisten hyvänlaatuinen munasarjojen kasvain, ja 25 normaalia ohjausta munasarjasta kudos laitoksella Gynecology and Obstetrics, Shandong sairaala vuosina 2005 ja 2007. Kaikki munasarjasyöpä potilaat kliinisesti lavastettu mukaan FIGO lavastus järjestelmä [kanssa 38 alhainen vaihe kasvaimet (FIGO vaiheet I ja II) ja 42 korkea vaiheessa kasvaimia (FIGO vaiheet III ja IV)]. Yksikään munasarjasyöpä potilaat saivat ennen leikkausta säteilyä tai kemoterapiaa. Tutkimuksen hyväksyi institutionaalisten Medical Ethics komitean Shandongin yliopistossa.

immunohistokemia (IHC) B

Mukaan vakio streptavidiini-biotiini-peroksidaasi monimutkaisia ​​menettelyjä, IHC suoritettiin formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin -Embedded kohdat (5 pm paksu) ja solujen liukuu kiinnitettiin 4% paraformaldehydi. Lyhyesti, sen jälkeen vahanpoisto, nesteytys, ja antigeenin haku, leikkeitä inkuboitiin anti-ihmisen SPARC-vasta-ainetta (AF941, R 0,05.

immunohistokemia (IHC) Analyysi

semikvantitatiivinen pisteytys, joka perustuu värjäytymisen intensiteetti ja jakelu-positiivisten solujen käytettiin arvioimaan SPARC ilmaisun [24]. Intensiteetti SPARC positiivista värjäytymistä vaihteli 0-3 (negatiivinen = 0, heikko = 1, kohtalainen = 2, tai voimakas = 3), ja prosenttiosuus positiivisesti värjäytyneiden solujen pisteytettiin 0 (0%), 1 (1-25 %), 2 (26-50%), 3 (51-75%), ja 4 (76-100%). Summa intensiteetin ja prosenttiluku käytettiin lopullisessa värjäyksen tulokset (0-7). Summa-indeksit (-), (+), (++), ja (+++) osoitti lopullinen värjäys pistemäärä 0, 1-3, 4-5, ja 6-7, vastaavasti. Tilastoanalyysiin sum-indeksit (-) ja (+) määriteltiin alhainen SPARC ilmaisu, kun taas summa-indeksit (++) ja (+++) määriteltiin korkea SPARC ilme. Jokainen osa oli itsenäisesti tekee kaksi patologia. Jos epäjohdonmukaisuus tapahtui, kolmas patologi kuultiin päästä yksimielisyyteen.

peptidiblokeerauskokeista Pitoisuus

testaamiseksi spesifisyyden anti-SPARC vasta-inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa rekombinantti ihmisen SPARC (941-SP, R negatiivinen kontrolli sekvenssi oli 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 ’. Erittäin invasiiviset jatkoklooni soluja (S1 ja HO8910PM) viljeltiin kuuden kuopan kudosviljelylevyille ja infektoitiin lentiviruksen on infektiokertoimella (MOI) 100 24 tuntia. Sitten väliaine korvattiin tuoreella täydellistä elatusainetta. 4 päivän jälkeen, soluja havaittiin alle fluoresenssimikroskopiaa vahvistaa, että yli 80% soluista oli GFP-positiivisia.

soluproliferaatiomääritykset

Solujen proliferaatio määritettiin käyttämällä MTT-määritystä ja ankkurointi itsenäinen pehmeä agar pesäkemuodostusta. MTT-määritys 20 ui MTT: tä (5 mg /ml PBS: ssä) lisättiin suoraan kuhunkin kuoppaan 96-kuoppaisella levyllä, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h. Sitten elatusaine poistettiin ja 200 ui DMSO: ta lisättiin liuottamiseksi formatsaanikiteet. Optinen tiheys 570 nm: ssä luettiin mikrolevylukijalla (Molecular Devices, Sunnyvale, CA).

pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys, 500 ui 2 x DMEM, jota oli täydennetty 20% FBS: ää sekoitettiin 500 ul: 1,2 % Sea Plague agar ja jähmettynyt kussakin kuopassa 24-kuoppaisen levyn muodostamiseksi base agarkerros. Huippu agarkerroksen, 25 ui soluja (5 x 10

3 /ml) sekoitettiin 500 ul 2 x DMEM ja 500 ui 0,7% Sea Plague agar ja lisätään päälle pohjan agarkerros. Sen jälkeen, kun kasvatettu 14 päivää, pesäkkeen muodostumista seurattiin mikroskopialla. Klusterin kymmentä solua tai enemmän määriteltiin pesäke.

anneksiini V-PI Analyysit Apoptosis

Solut kerättiin ja pestiin kahdesti PBS: llä, suspendoitiin 200 ui sitomispuskuria ja 10 ui anneksiini V-FITC: llä 20 minuutin ajan pimeässä, ja sen jälkeen 300 ui sidospuskuria ja 5 ui propidiumjodidia (PI) lisättiin kuhunkin näytteeseen. Apoptoottisten solujen määritettiin käyttäen virtaussytometrillä (Becton Dickinson) ja CellQuest (Becton Dickinson) -ohjelmisto.

Analyysi Cell Cycle Distribution

Solut kerättiin, pestiin jääkylmällä PBS: llä, ja värjättiin 50 ug /ml PI: n ja 250 ug /ml RNaasi 30 minuutin ajan. Solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa solusyklin määritettiin tietokoneella ohjelmoitu ModFit LT2.0 DNA-määritys (Becton Dickinson) käyttäen virtaussytometriä.

Cell Invasion määritys ja Migration määritys

Invasion määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [25]. Jokainen Transwell (BD Biosciences, Bedford, MA) päällystettiin 50 pl 1:03 laimennusta Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA). Solut (0,2 x 10

6) suspendoitiin uudelleen 200 ul seerumittomassa alustassa ja kylvetään saliin. Esikäsitelty väliaine NIH3T3 soluviljelmässä suodatettiin ja lisättiin alempaan kammioon kemotaktinen tekijä. 12 tunnin kuluttua, ei-tunkeutuvat soluihin jäljellä yläpinnalla poistettiin ja solut alemmalla pinnalla kiinnitettiin, värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla (H 0,05 verrokkiin nähden.

virtaussytometria-analyysi

Solut on log-vaiheessa kerättiin ja säädettiin tiheyteen väliltä 1-5 x 10

6 /ml PBS: llä ja värjättiin sitten 20 ui fluoreskeiini-isotiosyanaatti (FITC) konjugoitua monoklonaalista vasta-ainetta 30 minuutin ajan 25 ° C: ssa. Kaikki vasta-aineet, mukaan lukien anti-integriini β1, anti-integriini β3 ja anti-E-kadheriinin hankittiin BD Biosciences Pharmingen (San Jose, CA, USA). Lopuksi värjätyt solut analysoitiin virtaussytometrillä. Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen ohjelmaa WinMDI. Koe suoritettiin neljänä rinnakkaisena.

MMP-aktiivisuusanalyysi zymografialla

matriksin metalloproteinaasien aktiivisuuden määritys suoritettiin 10% SDS-PAGE-geeliä, joka sisälsi 0,1 mg /ml gelatiinia. 20 ug proteiinia näyte Jokaiseen uraan laitettiin SDS-PAGE-geelissä. Elektroforeesin jälkeen geeli pestiin kahdesti 2,5% Triton X-100: ssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa SDS: n poistamiseksi ja inkuboitiin 37 ° C: ssa yön yli reaktion puskuriin (50 mmo1 /L Tris-HCI, pH 7,4, 8,775 g NaCl: a ja 1.ll g CaCl

2). Värjäyksen jälkeen Coomassie brilliant blue, MMP aktiivisuus tunnistettiin selvät vyöhykkeet vasten sinistä taustaa.

Tilastollinen analyysi

IHC tiedot analysoitiin käyttäen chi-neliö testi. Tulokset solu- ja molekyylibiologian tiedot ilmaistiin keskiarvona ± SE. Vertailun keinoja kahden ryhmän välillä, kaksisuuntaista t-testiä käytettiin ja vertailun avulla joukossa kolme ryhmää, yksisuuntainen ANOVA käytettiin. Survival käyrä laskettiin käyttäen Kaplan-Meier menetelmällä ja log-rank-testi. Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS-ohjelmiston version 13.0. P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

ilmennetty eri geenien erittäin invasiivinen Subklooni S1 ja Low invasiivinen Subklooni S21

Voit löytää uusia biomarkkereita invasiivisia munasarjasyöpä, suoritimme mikrosiruanalyysi tunnistaa ero geeniekspressioprofiili on erittäin invasiivinen jatkokloonin S1 ja alhainen invasiivisia subklooni S21. Nämä kaksi jatkokloonit peräisin vanhempien SKOV3 ihmisen munasarjasyövän solulinjassa ja samankaltaiset geneettiset taustat; siksi, ne soveltuvat vertaileva analyysi. Microarray data analysoitiin käyttämällä osoitettu cut-off ilmentymisen suhde 1,5 kertainen muutos ja

P

-arvot ≤0.05. Analyysit tunnistettu 1596 ilmentyvät eri geenit (taulukko S1 ja kuvio 1A). Näistä geeneistä, SPARC oli selvästi säädellään ylöspäin erittäin invasiivisia jatkokloonin verrattuna alhainen invasiivisia jatkokloonin (13,8-kertaisesti,

P

= 0,023). Reaaliaikainen q-RT-PCR, Western blot ja IHC tulokset vahvistivat yli-ilmentyminen SPARC on erittäin invasiivisia jatkokloonin (kuvio 1BCD).

(A) Solulisääntyminen tutkittuna MTT: llä. (B) Anchorage riippumaton kasvu mitattuna pehmeä agar pesäkemuodostusta. (C) Cell-syklin jakaumat mitattuna virtaussytometrialla. (D) Cell apoptoosin mitattuna anneksiini V-PI määrityksissä. (E) Cell maahanmuutto ja invaasiomääritys käyttämällä Boyden kammioita. * P 0,05 verrokkiin nähden.

ilmaisujen SPARC Human Munasarjojen kudokset

molemmin kaksi anti-SPARC-vasta normaaleissa munasarjan kudoksissa, SPARC ilmaisuja olivat alhaiset ja lähinnä ympäri vasculatures stroomassa (kuva 2A ja 2F), ja hyvänlaatuisia munasarjan kasvaimissa, SPARC ilme oli myös alhainen ja pääasiallisesti keskittynyt paitsi strooman mutta myös kasvaimen sytoplasmassa (kuvio 2B ja 2G), lopuksi useimmissa munasarjojen karsinoomat, immunoreaktiivisuus oli korkea, ja korkea SPARC ekspressio havaittiin paitsi strooman vaan myös sytoplasmassa munasarjasyöpä soluja (kuvio 2CDE ja 2HIJ). Lisäksi korkea SPARC ilmentyminen liittyy alhainen erilaistumiseen, korkea vaiheessa ja positiivinen imusolmuke tilan munasarjojen karsinoomien (taulukko 2 ja 3). Tulokset peptidiblokeerauskokeista kokeet osoittivat spesifisyyttä ensisijaisen vasta-aineen (kuvio 3ABCDE). Arvioidaan ennusteen arvioinnissa SPARC munasarjasyövän, suoritimme selviytyminen analyysi käyttämällä Kaplan-Meier-analyysi. Tulos osoitti, että potilailla, joilla on korkea SPARC ilme oli paljon huonompi ennuste kuin ne, joilla on alhainen SPARC ilme (log rank,

p

= 0,004; Kuva 3F).

(A) valokuva ksenografteista leikattiin nude-hiirissä sen jälkeen, kun 3 kuukautta ihon alle inokulaation (n = 5). (B) knockdovvn SPARC esti kasvaimen kasvua in vivo. (C) SPARC ilmentyminen kasvaimen muodostama SPARC shRNA tartunnan soluja mitattuna IHC värjäytymistä (suurennus x 200). (D) SPARC ilmentyminen kasvaimen muodostama ohjaus shRNA tartunnan soluja mitattuna IHC värjäytymistä (suurennus x 200). (E) valokuva keuhkometastaasitestissä mikroskoopilla sen jälkeen, kun 3 kuukautta inokulaation kautta häntälaskimoon (n = 10). * P 0,05 verrokkiin nähden.

knockdovvn SPARC Expression by lentivirustartunnat välittämä RNA-interferenssi

roolin tutkimiseksi SPARC munasarjasyövän, rakensimme lentivirus vektorin SPARC shRNA ja tartunnan erittäin invasiivisia jatkokloonin soluja (S1 ja HO8910PM). Samanlainen tiedot saavutettiin S1 ja HO8910PM soluissa SPARC shRNA virustartunnat. Virusinfektion jälkeen, on yli 80% soluista oli GFP-positiivisia, mikä osoittaa korkea hyötysuhde shRNA toimitus. Reaaliaikainen q-RT-PCR, Western Blot ja IHC vahvisti alas-säätely SPARC ilmaisuja sen shRNA sekä mRNA ja proteiini tasoilla, kuten kuvassa 4.

(A) Alavirran kohdegeenien SPARC mitattuna q-RT-PCR. (B) P53, P21, sykliini D1, PCNA, Bcl-2: n ja Bax-proteiinin ilmentymistä lentivirusta infektoimissa soluissa mitattuna Western blot. (C) E-cardherin proteiinin ilmentymistä lentivirusta infektoimissa soluissa mitattuna IHC värjäytymistä (suurennus x 200). (D) MMP toimintaa mitattiin zymografian. * P 0,05 verrokkiin nähden.

knockdovvn SPARC Expression Tukahdetut munasarjasyöpäsoluja leviämisen

Seuraavaksi tutkimme vaikutus SPARC Knockdown proliferaatioon erittäin invasiivisen jatkokloonin soluja ( S1 ja HO8910PM). MTT tulokset osoittivat, että SPARC pudotus vähensi merkittävästi solujen proliferaatiota S1 ja HO8910PM soluja (kuvio 5A). Pehmeässä agarissa pesäkkeiden muodostumisen määritys, S1 ja HO8910PM infektoimia soluja SPARC shRNA virus oli merkittävä väheneminen pesäkkeiden muodostumiseen (kuvio 5B). Ei havaittu merkittävää eroa välillä ohjaus shRNA viruksen tartunnan soluihin ja ei-tartunnan saaneiden solujen.

knockdovvn SPARC Expression aiheuttama solukierron pysähtymisen klo G1 /G0 Phase

Ymmärtää mekanismia, jolla leviämisen munasarjasyöpäsoluja estyi knockdovvn SPARC ilmaisun, käytimme virtaussytometria tunnistamaan yksittäisten vaiheiden solusyklin. Kuten kuviossa 5C esitetään, S1 ja HO8910PM infektoimia soluja SPARC shRNA sisälsi 20~30% enemmän soluja G1 tai G0 (G1 /G0) vaiheen (

P

0,05) verrattuna kontrolliin shRNA tartunnan solut. Nämä tulokset osoittivat, että knockdovvn SPARC ilmaisun inhiboivat munasarjasyöpäsoluja estämällä niiden etenemistä G1 /G0 vaiheesta S-vaiheeseen solusyklin aikana.

knockdovvn SPARC Expression aiheuttama munasarjasyöpä Cell Apoptosis

Kuten kuviossa 5D, prosenttiosuus apoptoottisten solujen tartunnan SPARC shRNA oli paljon korkeampi kuin kontrolli shRNA ryhmässä (P 0,05). Ei havaittu merkittävää eroa vertailuryhmän välillä shRNA viruksen infektoimissa soluissa ja ei-infektoidut solut. Nämä tulokset osoittivat, että knockdovvn SPARC ilmaisun aiheuttama munasarjasyöpäsolu apoptoosin.

knockdovvn SPARC Expression Inhibioitu munasarjasyöpäsoluja Migration and Invasion

lisäksi tutkittiin, mikä vaikutus SPARC Knockdown maahanmuutto- ja invaasio on erittäin invasiivinen jatkokloonin soluja (S1 ja HO8910PM). Kuten kuviossa 5E, knockdovvn SPARC esti munasarjasyöpäsoluja hyökkäyksen ja muuttoliike. Samanlainen tiedot saavutettiin S1 ja HO8910PM soluissa SPARC shRNA virustartunnat. Keskimääräinen tunkeutuvat tai vaeltavat solumäärän SPARC shRNA infektoitujen solujen oli paljon pienempi kuin kontrolli shRNA infektoituneita soluja. Ei havaittu merkittävää eroa vertailuryhmän välillä shRNA infektoituneet solut ja ei-infektoituja soluja.

pudotus SPARC Expression inhiboi kasvaimen kasvua ja Lung metastaasin nude-hiirissä

Kasvaimen muodostuminen suoritettiin S1 subklooni tartunnan SPARC shRNA virus nude-hiirissä. Solut inokuloitiin subkutaanisesti nude-hiiriin, ja kasvaimen kasvua mitattiin sen jälkeen, kun 3 kuukautta. Kuten kuviossa 6A ja B, pudotus SPARC väheni kasvainten koon verrata sen ohjaus vastine. Ei ollut merkittävää eroa ohjaus shRNA infektoituneet solut ja ei-infektoituneiden solujen kasvaimen muodostumisen nude-hiirissä. Kasvaimet leikeltiin, vahvistetaan formaliinilla ja jotka on upotettu parafiiniin, sitten IHC tehty kokeita, kasvain muodostuu SPARC shRNA infektoituneet solut osoittivat alempi SPARC ilmentymistä (kuvio 6C), kun taas kasvain on muodostettu ohjaus shRNA infektoituneet solut osoittivat korkeampia SPARC ilmentymistä ( kuvio 6D). Lisäksi, kuvio 6E esittää keuhkometastaasitestissä mikroskoopilla injektion jälkeen ohjaus shRNA infektoituneiden solujen ja ei-infektoituja soluja kautta häntälaskimoiden nude-hiirten. Noin 50% keuhkometastaasitestissä todettiin 3 kuukauden kuluttua, että nude-hiirissä injektoitiin kontrolli shRNA tartunnan saaneiden solujen ja ei-tartunnan saaneiden solujen, kun taas mitään keuhkometastaasitestissä jälkeen havaittiin injektion SPARC shRNA tartunnan saaneiden solujen nude-hiirissä.

Euroopan alavirtaan kohdegeenien SPARC in vaikuttavat munasarjasyöpäsolu Proliferation, apoptoosi ja Invasion

ymmärtää mekanismia SPARC munasarjasyövän leviämisen, apoptoosin ja invaasio, reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR: ää käytettiin havaitsemaan eri ilmaisuja E-kadheriinin, β-kateniinin, alfa-kateniini, integriini-β3, integriini-β1, ILK, FAK, P53, P21, sykliini-D1, PCNA, Bcl-2, Bax, u-PA, uPAR, PAI-1, MMP2, MMP-9, TIMP1 ja TIMP2 välillä SPARC shRNA tartunnan S1 jatkokloonin soluissa ja ohjaus shRNA tartunnan S1 subklooni soluissa. Kuten kuviossa 7A, sykliini D1, PCNA, Bcl-2, MMP2 ja MMP-9 olivat merkittävästi säädellä vähentävästi SPARC shRNA infektoituneita soluja. Lisäksi korkeammat ekspressiotasot E-kadheriinin, P53, P21: n ja Bax havaittiin SPARC shRNA infektoiduissa soluissa. Ei ollut merkittäviä eroja ilmauksia β-kateniinin, α-kateniinin, integriini β3, integriini β1, ILK, FAK, u-PA, PAI-1, uPAR, TIMP1 ja TIMP2 välillä SPARC shRNA infektoituneita soluja ja ohjaus shRNA tartunnan saaneiden solujen . Tulokset virtaussytometria-analyysi (taulukko 4) ja western blot (kuvio 7B) vahvisti, että E-kadheriinin P53, P21: n ja Bax oli säädelty ja sykliini D1, PCNA ja Bcl-2 oli säädellä vähentävästi SPARC shRNA infektoituneita soluja. IHC kokeet osoittivat, että ilmentyminen E-kadheriinin kasvoi cytomembrane SPARC shRNA infektoituneita soluja (kuvio 7C). Zymografia tulokset osoittivat, että MMP toiminta vähensi merkittävästi SPARC shRNA infektoituneita soluja (kuvio 7D).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa käyttämällä genomin laajuinen transkription profilointi tunnistimme, että SPARC yliekspressoitui että erittäin invasiivisia SKOV3 aliklooni verrattuna alhainen invasiivisia jatkokloonin. Lisäanalyysi SPARC ilmentymisen 140 ihmisen munasarjan kudosten osoitti, että SPARC yliekspressoitui pahanlaatuiset munasarjojen kasvaimet ja yhteydessä huonoon viittaavia tekijöitä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että SPARC voi olla tärkeä rooli kehitettäessä munasarjasyövän. Kun vasta-aine AON-5031, samanlaiset tulokset havaittiin 8 normaalin munasarjan kudosten ja 24 ihmisen invasiivisen munasarjasyöpiä [13], ja 14 normaali munasarjojen kudoksiin ja 48 munasarjasyöpäpotilaiden [14]. He kaikki havaitsivat, että SPARC oli säädellään ylöspäin reaktiivinen strooman liittyy invasiivisen munasarjasyövän. Meidän tutkimuksessa, jossa vasta-aineen AF941 ja bs-1133R, huomasimme, että immunoreaktiivisuus SPARC pahensi paitsi strooman vaan myös sytoplasmassa munasarjasyöpä soluja. Sitä vastoin vasta-aineen kanssa LF-54, toinen tutkimus osoitti, että SPARC ilmentyminen säätyy alas munasarjasyövän; eksogeeninen SPARC esti proliferaatiota ja indusoi apoptoosia munasarjasyöpäsoluja [21]. Mutta tutkimuksessamme, jonka lentivirus välittämä RNA-interferenssi, huomasimme, että knockdovvn SPARC ilmaisun tukahdutetaan solujen lisääntymistä, indusoi apoptoosia, ja esti solujen invaasiota ja etäpesäkkeiden munasarjasyöpäsoluja. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin myös havaittu, mahalaukun syövän soluihin [26], gliooma solujen [27] ja melanoomasoluja [28], jonka RNA-interferenssi. Tutkimuksessamme havaitsimme, että SPARC ollut ainoastaan ​​erittämät strooman vaan myös erittävät munasarjasyöpäsoluja ja voinut käyttää tärkeitä solunsisäisiä vaikutuksia, kun näitä soluja. Knockdown SPARC voi estää munasarjasyövän solujen kasvua ja invaasiota. Huomasimme, että SPARC diffundoitunut strooman syöpään verkkotunnuksia. Tässä prosessissa, SPARC voi olla rooli edistämisessä hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden munasarjasyöpä. Epäjohdonmukainen tuloksia noin SPARC ilmaus munasarjakudoksessa voi johtua erilaisista SPARC vasta käytetään näissä tutkimuksiin. Lopuksi toiminnot SPARC munasarjasyövän tarvitsevat lisätutkimuksia.

Tässä tutkimuksessa käyttämällä MTT-määritystä ja pehmeä agar pesäkemuodostusta, totesimme, että knockdovvn SPARC tukahdutetaan munasarjasyövän solujen lisääntymistä. Virtaussytometria osoitti, että knockdovvn SPARC vähensi solujen S-vaiheen, kun taas lisäsi solujen G1 /G0 vaiheen, mikä osoittaa G1 /G0 pidätykseen. Ymmärtää mekanismia SPARC munasarjasyövän leviämisen, me havainneet eri ilmentymiä sykliini D1, PCNA, P53 ja P21 välillä SPARC shRNA infektoituneita soluja ja ohjaus shRNA infektoituneita soluja.

sykliini D1, jäsen G1 Sykliinien , ja PCNA (proliferoivan solun tuma-antigeeni), käytetään yleisesti arvioimaan kasvainsolujen proliferaatiota [29], [30]. P53, kasvainsuppressorigeenin, ja P21 (sykliiniriippuvainen kinaasi-inhibiittori), joka on keskeinen välittäjäaine p53, voi aiheuttaa solusyklin pysähtymisen G1-S-tarkastuspiste [31], [32].