Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Taiwanissa, suun syöpä on kausaalisesti liitetty ympäristön karsinogeenien. Hiilihappoanhydraasi 9 (CA9) on tiettävästi yli-ilmentyy useita erilaisia ​​karsinoomia ja pidetään yleisesti maligniteettimarkkerin. Nykyinen tutkimus selvitti yhdistetty vaikutus

CA9

geenipolymorfismien ja altistumista ympäristön syöpää aiheuttaville aineille herkkyydestä kehittää suun okasolusyöpä (OSCC) ja kliinis ominaisuudet kasvaimia.

Menetelmät ja Keskeiset havainnot

neljä yhden nukleotidin polymorfismien (SNP) ja

CA9

geenin 462 potilasta suun kautta syöpä ja 519 ei-syöpä valvonta analysoitiin reaaliaikaisen polymeraasiketjureaktion (PCR ). Vaikka tutkittu SNP (

CA9

rs2071676, rs3829078, rs1048638 ja +376 Del) eivät liittyneet alttiuteen suusyövän, GAA haplotyyppi 3

CA9

SNP (rs2071676, rs3829078, ja rs1048638) liittyi suurempi riski suun syöpä. Lisäksi neljä

CA9

SNP yhdistää betel mälli pureskelua ja /tai tupakan kulutus saattaa voimakkaasti nostaa alttiutta suusyövän. Lopuksi potilailla, joilla on suun kautta syöpä, joka oli vähintään yksi G alleelin

CA9

rs2071676 oli suurempi riski kehittää imusolmukkeiden etäpesäke (p

=

0.022), kuin potilailla, homotsygoottisia AA.

Johtopäätökset

Tuloksemme viittaavat siihen, että haplotyyppi rs2071676, rs3829078, ja rs1048638 yhdistetyt on potentiaalia ennustava merkitys suun syövän synnyn. Gene-ympäristö vuorovaikutukset

CA9

polymorfismien, tupakointi, ja betel-mälli pureskelu saattaa muuttaa suun syöpäalttiutta ja etäpesäkkeitä.

Citation: Chien MH, Yang JS, Chu YH, Lin CH, Wei LH, Yang SF, et ai. (2012) vaikutukset CA9 geenipolymorfismien ja ympäristötekijöiden vaikutusta Oral-Cancer herkkyys ja ennusteeseen viittaavia Ominaisuudet Taiwanissa. PLoS ONE 7 (12): e51051. doi: 10,1371 /journal.pone.0051051

Editor: Sevtap Savas, Memorial University of Newfoundland, Kanada

vastaanotettu: 27 elokuu 2012; Hyväksytty: 29 lokakuu 2012; Julkaistu: 04 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Chien et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustusta Taipei Medical University-Wan Fang Hospital (myönnä. 101swf03 Dr. Chien ja tohtori Yang). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

suun syövät voidaan peräisin jonkin kudoksen suun, mutta noin 90% on okasolusyöpää (SCC). Tällaisia ​​syöpiä ovat maailmanlaajuisesti tunnettuja niiden huono ennuste ja suuria onkologisiin ongelmia [1]. Herkkyyden yksilön suusyövän välittävät geneettisten tekijöiden ja karsinogeeni-altistus käyttäytymistä [2], [3]. Niistä geneettiset tekijät, yhden nukleotidin polymorfismien (SNP: t) ovat yleisin DNA-sekvenssin vaihtelu vaikuttavat esiintymiseen ja etenemiseen geenin liittyviin sairauksiin. SNP on muunnos DNA-sekvenssi, joka esiintyy, kun nukleotidin (A, T, C tai G) on muuttunut ainakin 1% tietyn populaation. Kun SNP kuuluu koodaava sekvenssi, se voi määrittää muuttaa aminohapon siihen liittyvän proteiinin sekvenssin. Tällainen SNP kutsutaan nonsynonymous. Mukaisesti degeneraation sääntöjen geneettisen koodin, joka on SNP voi myös tuottaa samaa aminohappoa, joka sitten kutsutaan synonyymi SNP. Huomattavaa on, että useat ryhmät ilmoittivat, että SNP on koodaamattomalle alue (3′-alueella; UTR) geenin voi myös vaikuttaa biologisiin prosesseihin [4].

Syöpä on geeni-vika sairaus, ja SNP mahdollisesti ennustaa riskiä suusyövän [5]. Siksi strategiat genotyyppitestien liittyvien SNP ja analysoidaan niiden jakelun taajuuksia yhteisön käytetään usein ennustaa riskiä ja ennusteen syöpiä. Betel-mälli pureskelua, tupakointi, ja alkoholin kulutus ovat 3 yhteinen karsinogeeni-altistuksen käyttäytymistä. Näiden yhdistelmät ympäristön karsinogeenien ja tietyt geenipolymorfismien saattaisi lisätä henkilön alttiutta suusyövän [5]. Siten SNP tiettyjen geenien saattavat vaikuttaa yksi vastaus stimulaation kohti karsinogeneesi edistää ympäristötekijät.

Hypoksia on yleinen piirre ihmisen kiinteiden kasvainten [6]. Kasvain hypoksia aiheuttaa kasvainsolujen tehdään sopeutusten joiden avulla ne voivat selviytyä ja lisääntyä [7]. Hypoksinen kasvaimet liittyy aggressiiviseen kasvaimen kasvua, metastaasia, ja hoidon epäonnistuminen useita erilaisia ​​kiinteitä ihmisen kasvaimia [8]. Kehittäminen markkeri hypoksinen kasvaimia saattaa mahdollistaa arvioida biologinen aggressiivisuus yksittäisten kasvainten, joka voisi puolestaan ​​helpottaa yksilöllisesti räätälöityjä hoitoja.

Hiilihappoanhydraasi 9 (CA9), glykoproteiini, joka kuuluu perheeseen sinkkiä sisältäviä entsyymejä, ei ole ilmaistu useimmissa elimissä tai kudoksissa, mutta se on täysin ilmaistu lukuisissa syövissä ja on tutkittu endogeeninen merkki kasvaimen hypoksia [9], [10].

CA9

sijaitsee kromosomissa 9p12-13, joka käsittää 11 eksonia ja koodaa 459 aminohapon proteiinia, CA9. CA9 on kalvoon liittyvä proteiini, joka katalysoi palautuvan reaktion H

2O + CO

2↔H

++ HCO

3

-, mikä on tärkeää monenlaisia ​​prosesseja, mukaan lukien pH: n säätely [11]. Tämän toiminnan, CA9 auttaa ylläpitämään normaalia pH kasvainsoluja hypoksinen mikroympäristön, joka voi mahdollistaa kasvainsolujen proliferaatiota [12]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että CA9 ilmaisu edustaa biologinen kasvaimen aggressiivisuus ja liittyy huono kliinisiä tuloksia useissa kasvaimissa kuten pään ja kaulan, kohdunkaulan, munuais-, ja keuhkojen syövät [13] – [16]. Viime aikoina, poikkeava ekspressio CA9 in OSCC myös osoitettu korreloivan solmukohtien etäpesäkkeitä ja huonoon ennusteeseen [17] – [19]. Nämä erilaiset havainnot viittaavat siihen, että CA9 tärkeä rooli OSCC etenemiseen.

Ennen tutkimusta raportoitu, että polymorfiset vaihtelut eksonissa alueella

CA9

liittyivät eloonjäämiseen varten mRCC [11 ]. Sen lisäksi, että tutkimuksessa ei raportteja keskityttiin yhdistyksen välillä

CA9

polymorfismien ja kehittää kiinteitä kasvaimia. Nykyisessä tutkimuksessa tutkittiin suhteita SNP: iden välillä (rs2071676, rs3829078, ja 376del393) on eksonissa ja 3′-UTR (rs1048638) alueet

CA9

geenin ja riski suusyövän (kuvio 1). Vaikutteita Näiden SNP yhdistettynä betel-pähkinä ja tupakan kulutusta, joka johtaa alttiuteen suusyövän, arvioitiin. Tutkimme myös suhdetta geneettiset vaikutukset ja kliinis ominaisuudet suun syöpä. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus osoittaa merkittävää yhdistyksen välillä

CA9

polymorfismien ja suun syövän syntymistä Taiwanissa.

numerot timantit ovat pareittain

D ’

arvoja. Tämä juoni kertyi Haploview ohjelmasta.

Tulokset

tilastollinen analyysi demografisten ominaisuuksien on esitetty taulukossa 1. Löysimme merkittävästi erilaiset jakaumat iän (

p

= 0,023), sukupuoli (

p

0,001), betel-mälli pureskelua (

p

0,001), alkoholin kulutus (

p

0,001 ), ja tupakointi (

p

0,001) välillä kontrolliosallistujaan ja OSCC potilaita. Vähentääksemme mahdollinen häiriöitä ympäristöön liittyvät tekijät, AORs 95% CI arvioitiin useita logistinen regressio mallien jälkeen ohjataan muille covariates kussakin verrattuna.

Kaikki analysoitu geenimerkkejä meidän kontrolliryhmässä olivat tilastollisesti todennettu ollessa HWE (

p

0,05). Taulukon 2 osoittavat, että sekä OSCC potilaiden ja verrokkien, alleeleja korkein Voitonjakotiheys olivat seuraavat: heterotsygoottista A /G: +201 (rs2071676) locus ja homotsygoottisia A /A, C /C, ja Ins /Ins vastaavasti varten +1081 (rs3829078), +1584 (rs1048638), ja +376 (376del393) loci on

CA9

geeni. Oikaisun jälkeen muuttujia, ei ollut merkittävää eroa ottaa suun syöpää yksilöiden rs2071676, rs3829078, rs1048638, ja 376del393 polymorfismit on

CA9

geeni verrattuna villin tyypin (WT) yksilöitä.

Vuorovaikutus vaikutusten välillä ympäristöön liittyvien riskitekijöiden ja geneettisten polymorfismien on

CA9

esitetään taulukoissa 3 ja 4. joukossa 598 tupakoitsijoita, potilailla, joilla on vähintään 1 G-alleelin rs2071676, 1 G alleelin rs3829078 1 A alleelin rs1048638, tai 1 Del alleeli

CA9

+376 ja betel-pähkinä pureskelua tapa oli vastaavat riskit 23.90- (95% CI: 8,84-64,61), 14.25- (95% CI: 5,18-39,17), 16.80- (95% CI: 5,82-48,46), ja 12,85-kertaisesti (95% CI: 6,19-26,68) ottaa suun syöpä. Yksilöiden joko vähintään 1 G-alleelin rs2071676, 1 G alleelin rs3829078 1 A alleelin rs1048638 tai yksi Del alleeli

CA9

+376 tai jotka pureskella pähkinä oli kunkin riskit 4.36- (95 % CI: 1,67-11,42), 15.18- (95% CI: 8,92-25,83), 10.65- (95% CI: 6,39-17,77), ja 11,30-kertaisesti (95% CI: 6,50-19,64) ottaa suun syöpä verrattuna yksilöiden WT homozygoottien jotka eivät pureskella pähkinä (taulukko 3).

Niistä 444 betel-pähkinä kuluttajille meidän kohortin tupakoinnin merkittävästi kohonnut suullisen syöpäriskin osallistujat Monimuotoinen varten rs2071676, rs1048638, ja 376del393 polymorfismit on

CA9

, verrattuna ihmiset WT geeniä, jotka eivät tupakoi savukkeita (taulukko 4). Lisäksi ihmiset, jotka olivat joko Monimuotoinen varten

CA9

4 loci (+201, +1081, +1584, ja +376) tai tupakoivat olivat klo 4.13~22.71-kertainen riski (

p

0,001) sairastua suun syöpä, verrattuna ihmiset WT geeniä, jotka eivät tupakoi (taulukko 4). Edellä esitetyt tulokset viittaavat siihen, että

CA9

geenipolymorfismien käyttää suuri vaikutus suun kautta-syöpäalttiutta joka pureskelee pähkinä ja /tai tupakoi.

lisäksi tutkineet haplotyyppien arvioimiseksi yhdistetyt vaikutukset 3 polymorfismien suullisia-syöpäalttiutta. Jakauma taajuudet

CA9

rs2071676, rs3829078, ja rs1048638 haplotyyppien meidän palvelukseen yksilöitä analysoitiin. Yleisin haplotyyppi kontrolliryhmässä oli AAC (46,6%), ja se valittiin sen vuoksi viittaus. Verrattuna viittaus, 1

CA9

haplotyyppi, GAA, merkittävästi (

p

0,001) lisäsivät riskejä OSCC by 5,27-kertaiseksi (95% CI: 1,13-24,55) (taulukko 5).

tutkia vaikutuksia polymorfisten genotyyppien

CA9

kliinisestä tilasta OSCC, me luokitellaan OSCC potilaita 2 alaryhmään. Ensimmäisessä alaryhmässä, potilailla oli homotsygoottinen WT alleelit; toisessa alaryhmä heillä oli vähintään 1 polymorfisen alleelin. Sillä genotyypin taajuudet SNP vain

CA9

rs2071676 osoitti merkittävää yhteyksiä kliinisiin patologinen muuttujat OSCC potilailla. Verrattuna WT genotyyppi (A /A), potilailla, joilla on vähintään 1 polymorfisen G-alleelin rs2071676 oli suurempi riski (1,69-kertainen, 95% CI: 1,00-2,84) imusolmukkeen etäpesäke (taulukko 6).

keskustelu

verrattuna kontrolliryhmään, suurempi osuus suun-syöpäpotilaiden käytetään betel quid, tupakan tai alkoholin (taulukko 1). Tämä havainto viittaa siihen, että nämä 3 ympäristön karsinogeenien saattaa liittyä riskejä suun syöpä. Betel-mälli ja tupakan kulutusta näytti erityisen voimakkaasti yhteydessä suusyövän, päätelmä on yhtenevä aiemman tutkimuksen [20]. Betel-mälli pureskelua havaittiin stimuloivan proteiinin tason matriisin (MMP) -9 syljen terveiden ihmisten [21]. Lime-piper betel mälli voivat myös lisätä proteiinin tasot c-fos ja c-jun esikasvaintekijät [22]. Tupakan kulutus voi merkittävästi indusoida ydin- hypoksian indusoituva tekijä (HIF) -1α, joka on epäsuotuisa ennustetekijä suusyövän [23]. Nämä tekijät osoittavat, että ympäristön karsinogeeni altistus on mukana muodostumista tai synnyssä suusyövän.

CA9 ilme on erittäin herkkä hypoksinen olosuhteet [24]. Poikkeavaan ilmentyminen CA9 havaittiin syöpäsolujen itse tai kasvaimeen liittyvää strooman kudosten OSCC potilaiden ja korreloi huonoon ennusteeseen ja solmukohtien etäpesäkkeitä [17], [18], [25]. CA9 katalysoi palautuvia nesteytystä hiilidioksidia hiilihapon. Tämä johtaa solunsisäisen alkaloosia ja solun asidoosi kasvaimen mikroympäristössä, jonka avulla kasvaimet hengissä hypoksisissa olosuhteissa. Lisäksi solunulkoiseen asidoosi voi edistää invasiivisuus ja huonon ennusteen korkean strooman CA9-ilmentävien kasvainten aktivoimalla solunulkoiset proteaasit ja häiritsevät adheesiomolekyyli-toiminto [26] – [28]. CA9 pienentää E-kadheriinin välittämiä solun tarttumista kilpailukykyinen vuorovaikutus beeta-kateniinin [28]; Tämä voi parantaa metastaattisen fenotyypin ja edistää yhdistyksen välillä korkea-strooman CA9 ilmaisun ja imusolmukkeiden etäpesäkkeitä. Siten CA9 ilmentyminen kasvaimissa voivat osoittaa hypoksisten solujen enemmän-aggressiivista käyttäytymistä ja hoito johtuvan vastuksen hypoksian aiheuttamaa solumuutoksia [29], [30].

Lisääntyvä näyttö osoittaa, että genomista muuttuu vähitellen muuttaa solujen fenotyyppi ja saattaa johtaa solujen edetään preneoplastista vaiheessa syöväksi helpommin [31]. Kerrottiin, että suun limakalvon yksilöiden

hiiren kaksinkertainen minuutti 2 (MDM2) B SNP 309 GG-genotyyppi on alttiimpi ympäristön karsinogeeni altistumista ja johtaa aikaisempaan alkamiseen kasvaimen muodostumisen [32]. Pidempi alleeliset polymorfismi GT dinukleotidi

hemioksigenaasi (HO) -1

promoottori ja toiminnallinen polymorfismi

tumatekijä kappa B1 (NFKB1) B promoottori ovat molemmat liittyvät riskit betel-quid- tai tupakointiin liittyvät OSCC [5], [33]. Polymorfismit useiden geenien havaittiin olevan liittyy riskejä suusyövän [34], [35]. On selvää, että geneettiset tekijät pelata keskeisiä rooleja karsinogeneesissä. Tutkimuksessamme

CA9

geenin SNP (rs2071676, rs3829078, rs1048638, ja 376del393) yksinään ei vaikuttanut suun kautta syövän alttius (taulukko 2). Synergiavaikutuksesta ympäristön tekijä (betelpähkinät mälli ja tupakointi) ja

CA9

geenipolymorfismien riskistä suusyövän (taulukot 3 ja 4) ovat hyvin osoitettu. Betel-mälli ja tupakka karsinogeenien saattaisi vahvistaa HIF-1α ilmaisua, ja sitten muuttaa

CA9

promoottorin aktiivisuutta ja ylössäätää CA9 ilme. Näin ollen voi säädellä lisäävästi solunulkoisia proteaaseja tai downregulate E-kadheriinin kehityksen edistämiseksi suusyövän.

Kerrottiin, että korkea ilmentyminen CA9 oli yleisempää kanssa imusolmukkeiden etäpesäke monenlaisia ​​kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien suun syöpä [25], [36], [37]. Esillä olevassa tutkimuksessa, joka on huomattavasti korkeampi jakelu taajuus imusolmukkeiden etäpesäkkeiden oli esillä OSCC potilailla, joilla on vähintään 1 polymorfisen G-alleelin

CA9

+201 verrattuna WT-genotyyppi (taulukko 6). +201 A /G-polymorfismi tiedetään aiheuttavan nonsynonymous korvaaminen (valiini ja metioniini), mutta ilmentymistä ja toimintaa CA9 joutuville tämän SNP vielä vahvistamaton. Vaikka tutkimuksessa de Martino et al. osoittivat, että tämä nonsynonymous SNP ei ollut merkittävää vaikutusta CA9 proteiinin ilmentymiseen [11], uskomme että otoskoko de Martino tutkimuksessa (

n

= 54) oli liian pieni onko

CA9

+201 SNP oli merkittävä vaikutus CA9 ilmaisua tulee varmistaa suuremmissa tulevaisuudentutkimusta.

erilaisia ​​SNP voi olla hiljaa, toisin sanoen, jolla ei ole suoraa vaikutusta geenituotteita. Kuitenkin nojalla kytkentäepätasapainossa (LD), joka on olemassa koko ihmisen genomin, niitä voidaan edelleen käyttää geneettisiä markkereita paikantaa viereiseen toiminnallisia variantteja, jotka edistävät taudin. Kun jokainen SNP rakennettaessa haplotypes on todellinen panos alttius sairauden, vaikka unapparent, haplotyyppi analyysit voi parantaa tilastollinen voima ja ovat joskus edullisia yli analyysi yksittäisten SNP havaitsemiseen yhdistyksen välillä alleelien ja sairautena [38]. Analysoimme osuudet eri haplotyypin yhdistelmiä 3

CA9

SNP (rs2071676, rs3829078, ja rs1048638) riskiin suun syöpää ja lopulta totesi, että

GAA

haplotyyppi oli korkea riski OSCC (Taulukko 5). On mahdollista, että

GAA

haplotyyppi

CA9

on LD muiden toiminnallisten polymorfismien jotka ovat vastuussa alttius OSCC.

tulkinnat tämän tutkimuksen on rajallinen, koska tietoa tietyistä suun syövän riskitekijöitä, kuten marihuana (kannabis) tupakointi, lääkkeiden nikotiinin käyttöä, perinnöllisyys, ja familiaalinen riskit eivät olleet käytettävissä palvelukseen yksilöitä, ja tämä rajoitus voi rajoittaa säätö näiden mahdollisesti sekoittavia tekijöitä. Tässä tutkimuksessa kuitenkin tärkeimmät riskitekijät suusyöpää, alkoholin ja tupakan kulutusta ja betel-mälli pureskelua, oikaistiin, jotta voitaisiin arvioida vaikutuksia geenipolymorfismien on kliinis kehittämiseen OSCC. Epäsuorasti säädöt, kuten ikä, sukupuoli, ja maantieteellinen alue, käytettiin myös vaikutusten arvioimiseksi geenipolymorfismien suun syövän välillä terveiden verrokkien ja OSCC potilaita vähentämään mahdollisuutta vääriä positiivisia tuloksia. Tulevassa tutkimuksessa lisäämällä näyte (veri ja kasvainkudoksen) numero ja ottaen enemmän OSCC riskitekijöitä huomioon analyysissä voisi tarkasti vahvistaa näitä havaintoja.

Yhteenvetona tulokset viittaavat siihen, että geeni-ympäristö vuorovaikutukset

CA9

polymorfismien ja betel-mälli pureskelu kanssa tupakointi voi muuttaa alttius suullinen syövän kehitystä.

GAA

haplotyyppi 3

CA-9

SNP (rs2071676, rs3829078, ja rs1048638) yhdistettiin osoitti myös suuri riski yhdessä OSCC. Oral-syöpäpotilaiden

CA9

+201 A /G-polymorfismi on suurempi riski saada kaulan imusolmukkeiden etäpesäke kuin tehdä WT harjoittajille.

Materiaalit ja menetelmät

Aiheet ja Näytteenotto

rekrytoitiin 462 potilasta (444 miestä ja 18 naista, joiden keski-ikä oli 54,4 ± 11,4 vuotta) Chung Shan Medical University Hospital Taichung, ja Changhua Christian sairaala ja Näytä Chwan Memorial Hospital Changhua, Taiwan. Potilaita oli case ryhmän vuosina 2007-2010. Niistä 462 tapauksissa kasvaimia sijaitsee suun limakalvolta (n = 189), kielen (n = 148), ikenen (n = 48), kitalaen (n = 30), suun pohjan (n = 21), ja toiset (n = 26). Samalla valvonta otettiin pois lääkärintarkastus näiden kolmen sairaalat, jotka ovat myös palveluista tapaukset kerättiin. Lopussa rekrytointi, yhteensä 519 osallistujaa (425 miestä ja 94 naista, joiden keski-ikä oli 52,4 ± 14,7 vuotta), joka ei ollut itse ilmoitettu historia syövän mitään kohdetta sisällytettiin. Lisäksi potilailla, joilla on suun kautta precancerous sairaus kuten suun kautta submukoottinen fibroosia, leukoplakia, erytroplakia, verrukoosinen liikakasvu jne jätettiin kontrolliryhmään. Ennen aloittamista tämän tutkimuksen hyväksyntä saatiin Institutional Review Board of Show Chwan Memorial Hospital, ja tietoisen kirjallisen suostumuksensa osallistua tutkimukseen saatiin jokaiselle henkilölle.

molemmissa tapauksissa ja valvontaa, käytimme kyselylomakkeen saada tietoa potilaan altistumisesta betel-mälli pureskelua, tupakointi ja alkoholinkäyttö. Lääketieteellistä tietoa tapauksista saatiin niiden potilastiedot, ja mukana TNM kliininen lavastus, primäärikasvain koko, imusolmuke osallistuminen, ja histologinen. Oral-syöpäpotilasta oli kliinisesti järjestetään aikaan diagnoosin mukaan TNM lavastus järjestelmä American sekakomitean Cancer (AJCC) Välivarastointi Manual (seitsemäs painos) [39]. Kasvaimet luokitellaan vaiheessa I ja II vaiheen (n = 213) ja vaiheen III + vaihe IV (n = 249). Etäpesäke imusolmukkeisiin havaittiin 164 tapauksessa (35,5%). Kokoveriarvot kerätyt näytteet valvontaa ja OSCC potilasta sijoitettiin putkiin, jotka sisälsivät etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA), sentrifugoitiin välittömästi ja säilytettiin -80 ° C: ssa.

Valinta CA9 polymorfismit

dbSNP tietokannan, yli 30 SNP: t on dokumentoitu 11 eksonit alueella

CA9

-geenin, mukaan lukien kolme SNP: sijaitsee koodaavat sekvenssit geenin (eksonit 1, 7 ja 11). Saada riittävää tehoa arvioitaessa mahdollisia yhteyksiä, tutkimme rs2071676 (G201A eksonissa 1), rs3829078 (A1018G eksonissa 7) ja rs1048638 (C1584A in 3’UTR), joilla on pieniä alleelifrekvenssit ≥5%. Lisäksi toinen SNP on

CA9

geeni (18 emäsparin deleetio /insertio; +376 Del) valittiin tässä tutkimuksessa, koska tämä SNP löydettiin syöpäpotilailla [11].

Perimän DNA Extraction

genominen DNA uutettiin käyttämällä QIAamp DNA veren mini sarjat (Qiagen, Valencia, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Olemme liuotetaan DNA TE-puskuriin (10 mM Tris ja 1 mM EDTA; pH 7,8) ja kvantitoitiin sitten se mittaamalla OD260. Lopullinen valmiste oli varastoitu -20 ° C: ssa ja sitä käytettiin toimimaan malleja polymeraasiketjureaktiota (PCR).

Reaaliaikainen PCR

Allelic erottelukyky

CA9

+201 (rs2071676), +1081 (rs3829078) ja +1584 (rs1048638) alleelinen polymorfismit arvioitiin ABI StepOne ™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), ja analysoitiin SDS vers. 3.0 ohjelmisto (Applied Biosystems) käyttäen TaqMan määritystä. Lisäksi 376del393 alleelinen polymorfismien arvioitiin PCR. Tuotteet erotettiin 3% agaroosigeelillä ja värjättiin sitten etidiumbromidilla. Alukkeen sekvenssit ja koettimia analyysi

CA9

geenipolymorfismien on kuvattu taulukossa 7. Lopullinen tilavuus kustakin reaktiosta oli 5 ui, joka sisälsi 2,5 ui TaqMan-genotyypin Master Mix, 0,125 ui TaqMan-koettimella on sekoitus, ja 10 ng genomista DNA: ta. Meidän alustavassa tutkimuksessa, kuten reaktioseosta (5 ui) on todettu tarjoavan samanlaisiin tuloksiin kuin kanssa lopputilavuudessa 20 ui suositellaan valmistajan ohjeen. Real-time PCR sisältyy ensimmäinen denaturaatiovaiheen 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s ja sitten 60 ° C: ssa 1 min. Validoimiseksi tulokset reaaliajassa PCR: llä ja PCR: llä, noin 10% määritykset toistettiin ja useissa tapauksissa kunkin genotyypin varmistettiin DNA-sekvenssianalyysillä.

Tilastollinen analyysi

Erot 2 ryhmien pidettiin merkittävinä, jos

p

arvot olivat 0,05. Hardy-Weinberg tasapaino (HWE) arvioitiin käyttäen hyvyys fit

Χ

2

-testi varten kaksialleelisten markkerien. Mann-Whitney

U

-testin ja Fisherin testiä käytettiin vertaamaan erojen jakaumat potilaan demografisia ominaisuuksia välillä syöpä-vapaa (ohjaus) ja suun syöpää ryhmiä. Oikaistu kertoimet suhdeluvut (AORs) ja 95%: n luottamusvälit (CI) yhdistyksen välillä genotyypin taajuuksien ja riski sekä kliinis ominaisuudet arvioitiin käyttämällä useita logistista regressiota malleja, kun ohjataan muille covariates. Analysoimme kaikki data tilastollisin Analyyttinen System (SAS Institute, Cary, NC, USA) ohjelmiston (vers. 9.1, 2005) for Windows.