Krooninen sairaus

tiivistelmä

Rasvahappo nopaliinisyntaasin (FASN) lauseke on kohonnut useita syöpiä, ja tämän yli-ilmentyminen liittyy huonoon ennusteeseen. Inhibiittorit FASN, kuten orlistaatti, kuulemma näyttää antituumorivaikutukset syöpiä vastaan, jotka yli-express FASN, joten FASN lupaava terapeuttinen kohde. Kuitenkin suuret vaihtelut FASN ekspressiotasot yksittäisissä kasvaimia on havaittu, ja menetelmiä ennustaa FASN-täsmähoitoihin tulos ennen hoitoa tarvitaan, jotta vältetään tarpeeton hoito. Lisäksi miten FASN esto vaikuttaa syövän etenemiseen jää epäselväksi. Täällä osoitti menetelmä ennustaa FASN kohdistetun hoidon lopputulos käyttäen radioaktiivisesti asetaattia otto ja esitetty mekanismeja FASN inhibition ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, antaa hoidon strategia FASN-täsmähoitoihin. Olemme paljasti, että kasvain otto radioleimatun asetaatti kuvasti FASN ekspressiotasot ja herkkyys FASN-täsmähoitoihin Orlistaattihoito

in vitro

ja

in vivo

. FASN-täsmähoitoihin oli huomattavasti tehoaa kasvaimiin korkea FASN ilme, joka oli merkitty korkea asetaatti ottoa. Tutkia mekanismeja, loimme FASN pudotus syöpäsolujen transduktiolla lyhyen hiusneula-RNA vastaan ​​FASN ja tutki ominaisuuksia analyysein morfologiaan ja solujen käyttäytymistä ja microarray-pohjainen geeniekspressioprofilointi. FASN esto ei ainoastaan ​​tukahdutetaan solujen proliferaatiota mutta esti valejalka muodostumista ja tukahdutetaan soluadheesiota, muuttoliike, ja hyökkäystä. FASN inhibitio tukahdutti myös osallistuvien geenien tuotannon solunsisäisen toisiolähetin arakidonihapon ja androgen hormonit, jotka molemmat edistävät syövän etenemiseen. Yhdessä meidän tiedot osoittivat, että otto radioleimatun asetaatti on hyödyllinen ennustaja FASN-täsmähoitoihin lopputulokseen. Tämä viittaa siihen, että [1-

11C] asetaatti positroniemissiotomografia (PET) voisi olla tehokas keino saavuttaa yksilöllisiä FASN-täsmähoitoihin ei-invasiivisia visualisointi kasvain asetaattia oton ja valinta reagoiva kasvaimia. FASN kohdistetut hoito voisi olla tehokas hoito tukahduttaa useita vaiheita, jotka liittyvät syövän etenemisen eturauhasen syöpien valitaan [1-

11C] asetaatti PET.

Citation: Yoshii Y, Furukawa T, Oyama N, Hasegawa Y, Kiyono Y, Nishii R, et ai. (2013) rasvahapposyntaasikompleksin toimesta Onko avain Target Useita Essential Kasvain Functions of Eturauhassyöpä: otto Radioaktiivisuusmerkittyä Acetate ennustajana kohdistettua Therapy tulos. PLoS ONE 8 (5): e64570. doi: 10,1371 /journal.pone.0064570

Editor: Juri G. Gelovani, Wayne State University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 helmikuu 2013; Hyväksytty: 15 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 31, 2013

Copyright: © 2013 Yoshii et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Grants-in-Aid nuorten tutkijoiden (B) Japanin Society for Promotion of Science, Japani (JSPS) (YY). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

rasvahappo-syntaasi (FASN) on keskeinen entsyymi rasvahapon synteesiä asetyyli-CoA, joka ilmentyy korkeilla tasoilla maksassa ja rasvakudoksessa, mutta alhainen muissa kudoksissa ihmisellä [1]. FASN yli-ilmentyy useissa ihmisen syövissä, mukaan lukien eturauhas-, rinta-, keuhko-, munasarja-, virtsarakko-, maha-, suuontelon ja melanooma, ja yli-ilmentyminen liittyy huonoon ennusteeseen [2], [3]. FASN on osoitettu olevan tärkeä rooli syövän synnyssä suojaamalla soluja apoptoosin [2].

Viime vuosina inhibiittorit FASN tiettävästi osoittavat kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta [4]. Orlistaatti, selektiivinen estäjä FASN, on yksi niistä valmiina kliiniseen käyttöön, varsinkin koska orlistaattia jo käytetään itsehoitolääke lihavuutta Yhdysvalloissa ja EU. Orlistat on raportoitu aiheuttavan kasvaimia torjuvaa aktiivisuutta indusoimalla apoptoosin kasvainsoluissa [3], [5]. Siten FASN-täsmähoitoihin odotetaan tehoavan FASN ilmentäviä kasvaimia. Kuitenkin suuret vaihtelut FASN ekspressiotasot yksittäisten kasvainten on havaittu patologiset tutkimukset [2], [6]. Näin ollen, kun otetaan huomioon sovellettaessa FASN kohdistetun hoidon menetelmiä ennustaa hoitotulokseen yksittäisissä kasvaimissa ennen hoitoa tarvitaan vähentää turhaa hoitoon.

lähestyä tätä vaatimusta, olemme keskittyneet ottoa radioleimattujen asetaattia kasvainsoluissa. Olemme aiemmin raportoitu oton mekanismia radioleimattujen asetaatti kasvainsoluihin; sytosolinen asetyyli-CoA, joka muuntaa asetaatti asetyyli-CoA, on yli-ilmentynyt kasvainsoluissa ja tärkeä rooli radioleimattujen asetaattia ja asetaatti osaksi kasvainsolujen käytetään pääasiassa rasvahappojen synteesiä ennemmin kuin jakauma on CO

2 kautta trikarboksyylihapposyklin tai aminohapposynteesin [7], [8]. Lisäksi Yun et al. 2009 ovat myös osoittaneet, että asetyyli-CoA on tärkeää [1-

11C] asetaattia otto ja liittyy asetaatti riippuvan rasvahappojen synteesi [9]. Nämä todisteet tarkoita, että asetaatti otto välittämä asetyyli-CoA liittyy rasvahapposynteesissä kasvaimissa. Itse asiassa, on raportoitu, että estäjät FASN, kuten orlistaatti, voi vähentää radioaktiivisesti asetaatti sisällyttämistä rasvahappoja eturauhassyöpäsoluissa [5], [10]. Vāvere et ai. ovat osoittaneet, että radioleimattu asetaatti otto korreloi FASN ilme ja [1-

11C] asetaatti positroniemissiotomografia (PET), joka voi ei-invasiivisesti visualisoida oton asetaatti, on hyödyllinen väline tutkia FASN ekspressiotasot vierassiirrekokeissa of eturauhassyöpäsolulinjoissa [10]. Nämä tutkimukset osoittavat, että radioleimattu asetaatti otto on hyvä korvikemarkkerilta FASN ilmaisun kasvaimissa. Siksi radioleimattu asetaatti otto voi olla hyvä ennustaja FASN-täsmähoitoihin lopputulos; kuitenkin epäselvää tulos FASN-täsmähoitoihin voidaan ennustaa oton radioleimatun asetaattia. Tässä tutkimuksessa tutkimme onko radioleimattujen asetaatti ottoa voi ennustaa terapeuttista lopputulos FASN-täsmähoitoihin käyttäen ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa osoittaa sovellettavuus [1-

11C] asetaattia PET ennustajana FASN-täsmähoitoihin lopputulokseen. Toistaiseksi kliinisissä tutkimuksissa, [1-

11C] asetaatti PET on haettu arviointiin erilaisten pahanlaatuisten kasvainten [11] – [14]; joten jos suhde radioleimatun asetaatin otto ja FASN-täsmähoitoihin lopputulos on osoittautunut, [1-

11C] asetaatti PET voitaisiin välittömästi soveltaa ennustaa FASN-täsmähoitoihin tuloksen.

Lisäksi mekanismeja miten FASN esto vaikuttaa syövän etenemiseen ei ole vielä käsitelty riittävästi ja siksi selvittäminen mekanismeja tarvitaan ymmärtää merkityksen FASN eston ja kannustaa hyödyntäminen FASN-täsmähoitoihin. Tässä tutkimuksessa tutkia mekanismeja, loimme FASN Knockdown syöpäsolujen transduktiolla lyhyen hiusneula-RNA (shRNA) vastaan ​​FASN, mikä voi aiheuttaa geenispesifiseen hiljentämisen, ja tutki ominaisuuksia analyysein morfologiaan ja solujen käyttäytymistä ja microarray- perustuvat geenin ilmentymisen profilointi. Näiden tutkimusten keskustelimme uusi hoito strategia FASN-täsmähoitoihin eturauhassyövässä.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Viljely

Ihmisen eturauhassyöpäsolulinjoissa, LNCaP ( CRL-1740), PC3 (CRL-1435), 22Rv1 (CRL-2505), ja DU145 (HTB-81) saatiin American Type Culture Collection. Soluja inkuboitiin kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2 ilmassa 37 ° C: ssa. RPMI 1640-väliaineessa (Gibco, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia ja antibiootteja käytettiin kasvualustaa. Eksponentiaalisesti kasvavat solut käytettiin kokeita varten. Solut trypsinoitiin, ja elävien solujen lukumäärä laskettiin käyttämällä trypaanisinivärin syrjäytymistä menetelmällä.

Cell Uptake tutkimus [1-

14C] asetaatti

In vitro

Solun ottoa [1-

14C] asetaatti LNCaP, PC3, 22Rv1, ja DU145 solut tutkittiin. Soluja ympättiin 1 x 10

5 1 ml: aan kasvualustaa kuoppaa kohti 24-kuoppalevyille ja esi-inkuboitiin 24 tuntia ennen käyttöönottoa tutkimuksessa. Esi-inkuboinnin jälkeen, väliaine poistettiin ja 500 ui kasvualustaa, joka sisälsi 37 kBq [1-

14C] asetaattia (2,07 GBq /mmol) (GE Healthcare, Pollards, UK) lisättiin kuhunkin kuoppaan, ja soluja inkuboitiin 1 h 37 ° C: ssa. Sitten väliaine poistettiin ja solut pestiin kahdesti jääkylmällä PBS: llä. Saatu solut lyysattiin 500 ui 0,2 N NaOH: a 2 tunnin ajan huoneen lämpötilassa, ja radioaktiivisuus lysaatin ja nestetuikelaskurilla (ASCII-, GE Healthcare) seosta mitattiin Tri-Carb nestetuikelaskurilla (PerkinElmer Wallac, Turku, Suomi). Solut, joita käsiteltiin samalla tavalla, ennen kuin solun hajoaminen laskettiin käyttäen trypaanisinivärin syrjäytymistä menetelmällä.

Western blot -analyysi

FASN ilmentymistasot tutkittiin Western blot -analyysillä. Näytteet lyysattiin hajotuspuskuria, joka sisältää proteaasi-inhibiittoriseosta (Sigma, Saint Louis, MO, USA) ja proteiini pitoisuudet määritettiin Bio-Rad proteiinimäärityksellä kit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi suoritettiin 20 ug proteiinia kustakin näytteestä käyttäen 4% -15% mini-PROTEAN tgx esivalettuja geelejä (Bio-Rad). Kanin anti-FASN primaarinen vasta-aine (sc-20140; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), kanin anti-β-aktiini primaarinen vasta-aine (IMG-5142A, IMGENEX, San Diego, CA, USA), ja vuohi anti- kani-IgG sekundääristä vasta-ainetta (G21234, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) käytettiin. Vyöhykkeet havaittiin kanssa ECL Plus Western blotting Detection System (GE Healthcare) ja intensiteetti laskettiin densitometrialla Image J ohjelmisto (National Institutes of Health).

elinkykyyn jälkeen orlistaatti Treatment

Effect orlistaatin hoito

in vitro

tutkittiin LNCaP, PC3, 22Rv1, ja DU145 soluja. Soluja ympättiin 1 x 10

4 100 ul: ssa elatusainetta kuoppaa kohti 96-kuoppalevyillä. Sen jälkeen, kun esi-inkubaatio 24 tuntia, elatusaine korvattiin kasvatusliuoksella, joka sisälsi 0 uM, 12,5 uM, 25 uM, 50 uM, 250 uM tai 500 uM orlistaatti (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA). Pitoisuus orlistaatin päätettiin perustuu aikaisempiin tutkimuksiin [3], [5]. Orlistaatti liuotettiin etanoliin ja lisättiin kasvualustaan ​​sisältää vähemmän kuin 0,02% etanolia lopullisessa. 48 tunnin kuluttua inkuboinnin alustassa, joka sisältää orlistaatin, solujen elinkykyisyys analysoitiin CellTiter-Glo luminoiva solunelinkykyisyysmääritys (Promega, Fitchburg, WI, USA) valmistajan protokollan. CellTiter-Glo-reagenssia lisättiin suoraan viljelykuoppiin, ja inkuboitiin 10 minuutin ajan ravistellen. Luminenssi tallennettiin käyttäen levynlukijaa (SpectraMax M5, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Aikana 48-h inkuboitu orlistaatti, väliaine oli päivittyy 24 tunnin kuluttua hoidon aloittamisesta.

Istuttaminen Ksenograftien hiiriin

Tutkimus toteutettiin tiukasti suositusten mukaisesti oppaasta Care ja käyttö Laboratory Animals of National Institute of säteilytieteet (Japani). Protokolla hyväksyttiin eläinten eettisen komitean National Institute of säteilytieteet (Japani) (Luvan numero: M40-01). NOD.CB17-Prkdc scid /J-uroshiiriä (4 viikon ikäisiä) hankittiin Charles River Laboratories (Yokohama, Japani). Ennen kokeita, hiiret olla rauhassa vähintään 1 viikko. Sillä

in vivo

tutkimuksissa käytimme kolme edustaja solulinjojen suhteen FASN ilmaisun; LNCaP (korkea FASN lauseke), PC3 (matala FASN lauseke), tai DU145 (erittäin matala FASN ilme). Saadakseen ksenograftimalleja, kasvainsolut 3 x 10

7 LNCaP ja 1 x 10

7 PC3 ja DU145 subkutaani- ruiskutettiin hiiren oikean olkapään kanssa matrigeelin (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ, USA).

in vivo

bioleviäminen

biologisen jakautumisen tutkimuksessa hiirille kanssa ksenograftikasvaimissa injisoitiin laskimonsisäisesti 37 kBq [1-

14C] asetaattia 100 ui suolaliuosta osaksi häntälaskimoon ja tapettiin 10 min tai 30 min injektion jälkeen (4 hiirtä ryhmää kohti). Elimet etua (kasvain, lihaksen, keuhkojen, maksan, pernan, haiman, munuaisen ja eturauhasen) ja veren kerättiin, ja paino kunkin toimielimen mitattiin. Elimet hajotettiin 1 ml: ssa Soluene 350 (PerkinElmer) 50 ° C: ssa 2 tuntia. Alikvootit vetyperoksidia (30% w /v), 2 x 100 ui, lisättiin peräkkäin näytteiden lipeää. Scintillation keskipitkän (Hionic-Fluor, PerkinElmer) lisättiin ennen laskemista radioaktiivisuus Tri-Carb nestetuikelaskin (PerkinElmer). Bioleviäminen tiedot laskettiin% ID /g (keskiarvoja ± SD).

Small-Animal PET Imaging [1-

11C] Asetaatti

Vahvista biojakaantumi- oton radioleimattujen asetaatti ksenograftimalleissa, pieni-eläin PET kuvantamisen [1-

11C] asetaatti suoritettiin. [1-

11C] asetaattia syntetisoitiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [15]. Radiokemiallinen puhtaus oli 99%. Dynaaminen PET 60 minuutin ajan (12 x 5 min) suoritettiin käyttäen pieni eläin PET-järjestelmä (Inveon, Siemens Medical Solutions, Malvern, PA, USA). Kukin hiiri ruiskutettiin laskimoon noin 18,5 MBq [1-

11C] asetaatti häntälaskimoon alle 1,5% isofluraanianestesiassa. Kehon lämpötila ylläpidettiin lampun ja lämpöpumpun tarkistuksen aikana. Kuvat otettiin rekonstruoitu käyttämällä 3D enintään jälkikäteen käyttämällä Inveon Acquisition Työpaikka ohjelmisto (Siemens Medical Solutions).

In vivo

orlistaatti hoito

terapeuttinen vaikutus orlistaattia myös tutkittu -tuumoriksenografti hiirillä. Hiiret vakiintuneiden kasvainten (0,6-0,9 cm pisin halkaisija) satunnaistettiin orlistaattia-käsitellyissä ja kontrolliryhmissä (5 eläintä /ryhmä). Orlistaatti (240 mg /kg /päivä) injektoitiin i.p. vuorokaudessa 2 viikon ajan. Hoito annos määritettiin perustuu aiempiin tutkimuksiin [3], [5]. Orlistaatti liuotettiin 33 ul: aan etanolia, ja laimennettiin 66 ui suolaliuosta juuri ennen injektiota. Kontrollina vastaava määrä ajoneuvon injektoitiin samalla tavalla. Hiiret punnittiin ja kasvaimen kokoa mitattiin käyttäen tarkkuus satulat 3 kertaa viikossa. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen yhtälöä: kasvaimen tilavuus = pituus x leveys

2 × π /6.

RNA Interference (RNAi) Kokeet

Tässä tutkimuksessa selvittää tarkkaa mekanismia miten FASN esto vaikuttaa syövän etenemiseen, otimme FASN pudotus LNCaP perustettu transduktio shRNA vastaan ​​FASN, joka voi tuoda jatkuvaa pitkän aikavälin geenispesifiseen hiljentäminen [16]. FASN pudotus LNCaP-solut perustettu transduktion Operaation lentiviruksen transduktiopartikkeleilla (SHCLNV-NM 00410, Sigma), jossa ekspressiokasetit koodaa shRNAs, jotka tuottavat pieniä häiritseviä RNA: ita vastaan ​​FASN mukaan valmistajan protokollaa. Viisi kloonia shRNAs vastaan ​​FASN (TRCN3125, 3126, 3127, 3128, ja 3129) käytettiin ja solulinjat transfektoitiin kunkin shRNA määritettiin (nimetty FASN-RNAi 3125, 3126, 3127, 3128. ja 3129-solut, vastaavasti). Ei-kohdistuksen shRNA (SHC002V, Sigma) käytettiin negatiivisena kontrollina (kontrolli-RNAi-solut). -Soluja (1 x 10

4) maljattiin 100 ui elatusainetta kuoppaa kohti 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin yön yli. Elatusaine vaihdettiin sitten sisältävään kasvualustaan ​​heksadimetriinibromidi (Sigma) lopulliseen konsentraatioon 8 ug /ml parantaa transduktion tehokkuutta. Lentivirus- partikkeleita (5-50 ui, 0,5-5 infektiokertoimella) lisättiin, ja levyjä inkuboitiin yön yli. Sen jälkeen valitsimme vakaa transduktanttien ilmaisemiseen shRNAs kanssa puromysiini. Ekspressiotasot FASN mRNA tutkittiin qRT-PCR tarkistaa tehokkuuden knockdown. Sillä qRT-PCR, solujen hajoamista, RNA: n eristys, käänteinen transkriptio ja reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen TaqMan Gene Expression Solut-to-CT-kittiä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) valmistajan protokollan mukaisesti. Geenien ilmentyminen analysoitiin käyttäen TaqMan Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) ja β-aktiini (Hs99999903) ja FASN (Hs00188012) ja StepOne Real-Time PCR Systems (Applied Biosystems). FASN mRNA kvantifioitiin vertaileva C

T-menetelmällä β-aktiini ekspressiota kuin endogeeninen kontrolli [17].

Cell Proliferation, morfologia, Migration, ja Invasion

Cell käyttäytymistä olivat tutkittiin FASN-RNAi 3128 ja 3129 ja valvonta-RNAi LNCaP. Solun proliferaatiomääritys,-solut ympättiin 96-kuoppalevyille 5 x 10

3 solua /100 ui kasvualustaa. Sen jälkeen ajan funktiona inkuboinnin soluproliferaatiota määritettiin CellTiter-Glo luminescent määrityksissä. Solujen morfologia havaittiin käyttämällä käännettyä mikroskooppia (MDI 4000B; Leica, Solms, Saksa). Time-lapse kuvia hankittiin välein 2 tuntia 10 x suurennuksella 5 päivää käyttäen moottoroitu käännettyä mikroskooppia (IX 81, Olympus, Tokio, Japani), jossa on vaiheen alkuun hautomo (Tokai Hit, Fujinomiya, Japani) ja tiedot analysoitiin Fluoview ohjelmistot (Olympus). Siirtolaisuuden ja invaasio määrityksissä, CytoSelect 96-solumigraation ja invaasiota määritykset (Cell Biolabs, San Diego, CA, USA) käytettiin mukaan valmistajan protokollaa. Solut 4 x 10

4 solua /100 ul seerumittomassa alustassa pantiin alkuun hyvin ja 150 ui elatusainetta, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia sijoitettu pohjalle hyvin, ja solujen annettiin siirtyä tai hyökätä 24 tuntia ennen analyysiä. Top (ei-muuttolintuja tai ei-hyökkääviä) solut poistettiin, pohja (muuttaa tai hyökkääviä) solut värjättiin väriliuoksella ja fluoresenssi tallennettiin käyttämällä levylukijalla 480 nm /520 nm.

DNA Microarray Analysis

geeniekspressioprofilointi tutkittiin DNA-siru analyysi FASN-RNAi 3128 ja valvonta-RNAi LNCaP. Yhteensä RNA: t eristettiin soluista Micro-to-Midi kokonais-RNA puhdistusjärjestelmän (Invitrogen). Integriteetti koko RNA: iden arvioitiin käyttämällä Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Low Input Nopea Amp Labeling Kit, yksivärisiä (Agilent Technologies) käytettiin valmistettaessa Cy3-leimatun kohde cRNA mukaan valmistajan ohjeiden. Merkityt cRNA hybridisoitiin SurePrint G3 Human GE 8 x 60K mikrosirut (Agilent Technologies). Kaksi erillistä hybridisaatiot suoritettiin kullekin näytteelle. Array kuvat otettiin käyttäen DNA Microarray Scanner (Agilent Technologies), ja tiedot analysoitiin käyttämällä Feature Extraction Software (Agilent Technologies) saada tausta-korjatun signaalin intensiteettiä. Tiedot analysoitiin edelleen kanssa GeneSpring GX Software (Version 11.0, Agilent Technologies). Kun tietoja suodatus, mRNA: t ilmentyvät eri kohdesoluissa vastaan ​​kontrollit arvioitiin Fisherin testiä, jota seurasi useita korjauksia käyttämällä Benjamini ja Hochberg väärien löytö määrä (FDR) menetelmällä. Gene sarjaa, jossa on FDR

q

-arvo 0,05 pidettiin merkittävänä. DNA-siru data löytyy Gene Expression Omnibus tietokannasta hakunumerolla (GSE39183).

Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD.

P

arvot laskettiin analysoimalla varianssianalyysillä (ANOVA) vertailun välillä useita hoitoryhmässä. Tilastollinen analyysi kasvainten suoritettiin toistettiin ANOVA, mitä seurasi post-hoc Tukeyn testi.

P

arvojen 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

In vitro

Studies

Tutkimme suhteita ottoa radioleimattujen asetaatti, FASN ilme, ja herkkyys orlistaattia hoito

in vitro

kanssa LNCaP, PC3, 22Rv1, ja DU145 solulinjat (Fig. 1). [1-

14C] asetaattia otto 1 tunnin kuluttua on esitetty kuviossa. 1A, ylempi. Korkea ottoa [1-

14C] asetaatti havaittiin LNCaP, kun taas PC3 ja 22Rv1 oli pienempi, ja että DU145 oli hyvin alhainen (

P

0,05). FASN ilmaisu osoitti suuntausta täydennetään, joka havaittiin ottoa [1-

14C] asetaattia (Fig. 1A, alempi): LNCaP-solut osoittivat korkeampia FASN ilmentymistä verrattuna muita solulinjoja (

P

0,05) (Fig. 1 C, ylempi).

(A) otto [1-

14C] asetaattia (ylempi) ja tasot FASN ilmaisun (alempi) LNCaP, PC3, 22Rv1, ja DU145 soluja. Ryhmät, joissa erilaiset aakkoset ovat merkittävästi erilaiset (

P

0,05). (B) Prosenttia solujen elinkelpoisuus jälkeen orlistaatti hoidon LNCaP, PC3, 22Rv1, ja DU145 soluja. Solujen elävyys ilmoitetaan prosentteina että 0 uM orlistaatti hoitoa. Tähdet osoittavat tilastollista merkittävyyttä versus hoito 0 uM kutakin solulinjaa (*

P

0,05). (C) suhde omaksumista [1-

14C] asetaattia ja FASN lauseke (ylempi), suhde% solujen elävyyttä jälkeen orlistaattia hoitoa 12,5 uM ja otto [1-

14C] asetaattia (keskellä), ja suhde% solujen elävyyttä jälkeen orlistaattia hoitoa 12,5 uM ja FASN lauseke (alempi). Arvot kuudesta itsenäisestä kokeesta on esitetty. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD.

Fig. 1B esittää% solujen elävyyttä jälkeen orlistaattia hoidon

in vitro

. Heikossa Orlistaattiannos hoidon 12,5 uM, LNCaP-solut, jotka olivat osoittaneet korkeimman ottoa [1-

14C] asetaattia ja FASN ilme, havaittiin merkittävä väheneminen% solujen elinkelpoisuuden (

P

0,05;

R

2

= 0,97,

P

0,05), matalan annoksen orlistaattia hoitoa 12,5 uM (Fig. 1 C, keskimmäinen ja alempi). Katsovat, ei ollut merkittävää korrelaatiota% solujen elinkelpoisuuden, ja otto [1-

14C] asetaattia ja FASN ilmaisun vastaavasti kovassa annoksen orlistaatti hoitoa. Nämä tiedot osoittivat suurempi herkkyys orlistaatille hoitoon soluissa korkeammat FASN ilme ja käyttöönottoa asetaatti.

bioleviäminen ja [1-

11C] Asetaatti PET Study on kasvain

sillä

in vivo

tutkimuksissa käytimme hiirillä LNCaP (korkea FASN lauseke), PC3 (matala FASN lauseke), tai DU145 (erittäin matala FASN ilmaus) kasvaimia. Tasot FASN ilmaisun kunkin -tuumoriksenografti vahvistettiin ennen koetta, joka osoitti samanlaista taipumusta

in vitro

tutkimuksessa (Kuva. S1). Ensinnäkin tutkia absoluuttinen ottoa radioleimattujen asetaattia näissä ksenograftikasvaimissa teimme biologiseen jakaantumiseen tutkimus. Bioleviäminen tiedot saatiin 10 min ja 30 min injektion jälkeen [1-

14C] asetaattia (Fig. 2A). Ajankohtina näytteenottoa päätettiin perustuu aikaisemmin tutkimuksen [10]. Biologisen jakautumisen veressä ja normaali elinten osoitti samanlaista mallia kuin aiemmissa raporteissa [18]. [1-

14C] asetaattia verestä 30 min, verrattuna 10 min (Fig. 2A, vasen). 30 min, LNCaP kasvaimet (0,27 ± 0,05% ID /g) osoitti 2,2-kertainen otto [1-

14C] asetaatti kuin PC3 kasvaimet (0,13 ± 0,01% ID /g;

P

0,01) ja 5,5-kertainen otto kuin DU145 kasvaimet (0,06 ± 0,01% ID /g;

P

0,001) (Kuva. 2A, oikealla). Kasvain-to-veri ja kasvain-to-lihas suhde 30 min olivat myös korkeampia LNCaP kasvaimissa verrattuna PC3 ja DU145 kasvaimet (Fig. S2). Seuraavaksi pieneläinten PET kanssa [1-

11C] asetaatti tehtiin vahvistaa ja täydentää tulokset biologisen jakautumisen tutkimuksen. Kuten kuvat osoittivat, [1-

11C] asetaattia osoitti selkeää kasvaimen kertymistä LNCaP ksenograftimallia, kun taas kohtalainen tai alhainen kertymisen [1-

11C] asetaatti havaittiin PC3 ja DU145 ksenograftimallissa (Fig. 2B ). Siksi biologista jakaantumista ja [1-

11C] asetaatti PET tutkimukset osoittivat, että otto radioleimattujen asetaatti heijastaa FASN ekspressiotasot ja pystyy erottamaan kasvaimet korkealla FASN ilme kasvaimista alhaisen FASN ilme.

(A) bioleviäminen 10 min ja 30 min elimissä (vasemmalla) ja kukin kasvain (oikealla). Data edustaa% ID /g ilmaistuna keskiarvoina ± SD. Ryhmät, joissa erilaiset aakkoset ovat merkittävästi erilaiset (

P

0,05). (B) Pienet-eläin PET kuvia [1-

11C] asetaattia 30 minuuttia injektion jälkeen. Keltainen nuolet osoittavat kasvaimia. S = vatsaa L = maksa.

FASN-täsmähoitoihin

In vivo

tutki vielä herkkyyden FASN-täsmähoitoihin Orlistaattihoito kussakin -tuumoriksenografti

vuonna vivo

(Fig. 3). Kuva. 3A esittää tuumorin tilavuuden mittauksen. Päivänä 14, kasvaimen tilavuus LNCaP käsitellyt kasvaimet orlistaatti oli vähentynyt merkittävästi; 22,0 ± 6,2% alkuperäisestä kasvaimen tilavuuden. Sen sijaan, PC3 ja DU145 kasvaimia käsiteltiin orlistaatin osoitti progressiivista nousua kasvaimen tilavuuden; 238,8 ± 46,6% ja 367,1 ± 99,5% alkuperäisestä kasvaimen tilavuus, vastaavasti. Kuva. 3B esittää kasvaimen tilavuus LNCaP, PC3 ja DU145 käsitellyt kasvaimet orlistaatti esitetty suhteellisena kasvaimen tilavuuden versus alkuperäisen kasvaimen koko normalisoitu vastakkain hoitamatta kasvaimen samanaikaisesti piste; oli merkittäviä eroja kasvaimen kasvun välillä LNCaP, PC3 ja DU145 kasvaimet (

P

0,05). Vaikutukset orlistaattia hoidon painokiloa kohti on esitetty kuvassa. 3C. Kehon paino putosi alle 5% päivänä 14. Ei ollut mitään ilmeistä muutosta fyysisessä kunnossa (ilman merkkejä suttuinen takki tai ripuli) yli koejakson. Nämä tiedot osoittivat, että otto radioleimattujen asetaatin kuvastaa herkkyyttä FASN-täsmähoitoihin Orlistaattihoito

in vivo

ja FASN kohdistetun hoidon orlistaatti on erittäin tehokas kasvainten korkea FASN ilme osoittaa korkea otto radioleimattujen asetaattia.

(A) kasvu kasvaimia käsiteltiin orlistaatin (240 mg /kg /päivä) tai vehikkeliä vain päivittäin 2 viikkoa (vasemmalla) in -tuumoriksenografti-hiirille. Data edustaa kasvaimen tilavuus (mm

3). Edustavat kuvat käsiteltyjen kasvainten päivänä 14 (oikealla). (B) Suhteellinen tuumorin tilavuus verrattuna alkuperäisen kasvaimen koko normalisoitu vastakkain käsittelemättömän kasvaimen samaan ajankohtana. Ryhmät, joissa erilaiset aakkoset ovat merkittävästi erilaiset (

P

0,05). (C) vaikutukset orlistaatti hoidon painon.

FASN esto RNAi

Seuraavaksi tutkimaan mekanismeja miten FASN esto vaikuttaa syövän etenemiseen, otimme FASN pudotus LNCaP saatiin by shRNA transduktio. Tässä tutkimuksessa olemme perustettu viisi FASN-RNAi solulinjoissa, FASN-RNAi 3125, 3126, 3127, 3128, ja 3129-solut, ja qRT-PCR osoitti vähentyneen merkittävästi FASN mRNA: n ekspression FASN-RNAi 3128 solut ja kohtuullinen vähennys in FASN-RNAi 3129 soluihin, verrattuna kontrolli-RNAi-soluissa (kuvio. S3). Western blot-analyysi osoitti saman suuntauksen FASN-RNAi 3128 ja 3129 solujen FASN ilmaisu, vastaavasti (kuvio. 4A, vasemmalla). Knockdovvn FASN RNAi LNCaP-soluissa johti vähennetään vastaava asetaatti sisällyttäminen (Fig. 4A, oikealla).

FASN-RNAi 3128 ja 3129 solut ja valvonta-RNAi soluja käytettiin. (A) Suhteellinen ilmentymä FASN, analysoitiin Western blotting-analyysi (vasemmalla) ja omaksumista [1-

14C] asetaattia (oikealla). (B) Solujen lisääntyminen yli 7 päivää (ylempi, vasen). Valomikroskoopilla kuvia (ylempi, oikealla). Kulkeutuminen suhteessa ja invaasion potentiaalia FASN-RNAi soluihin, verrattuna kontrolli-RNAi soluja (alhaalla, vasemmalla ja oikealla, vastaavasti). Arvot kuudesta itsenäisestä kokeesta on esitetty. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SD. Ryhmät, joissa erilaiset aakkoset ovat merkittävästi erilaiset (

P

0,05).

Mielenkiintoista, knockdovvn FASN aiheuttaa havaittavia muutoksia biologisia ominaisuuksia LNCaP (Fig. 4B ). Knockdovvn FASN inhiboi solujen proliferaatiota, joka vastaa laskua FASN ilmentymisen (Fig. 4B, ylhäällä vasemmalla); oli merkittäviä eroja soluproliferaation FASN-RNAi 3128 ja 3129 soluihin, verrattuna ohjata-RNAi-solut (

P

0,05). Lisäksi mikroskooppinen tarkkailu osoitti, että valvonta-RNAi soluja kara-muotoinen valejalka viljelymaljoille, kun taas FASN-RNAi 3128 solut kierroksen puutteellinen muodostumista valejalka ja FASN-RNAi 3129 solut osoittivat väli- morfologia (Fig. 4B, ylhäällä oikealla) . Liike solujen viljelymaljoille edelleen havaittiin käyttäen nopeutus mikroskopialla (kuvio. 5, video S1, Video S2). Ohjaus- ja RNAi-solut on kiinnitetty levyn pohjaan muodostettu valejalka, tuli kara-muotoinen, ja aktiivisesti kulkeutuivat solun jakautumista ja venymä niiden valejalka. Vaikka FASN-RNAi 3128 solut osoittivat puutteellinen valejalka muodostumista, tuli pyöreä, ja solut jakautuvat, mutta osoitti vähemmän muuttoliikkeen verrattuna kontrolli-RNAi-soluissa. FASN-RNAi 3129-solut osoittivat väli- käyttäytymistä (tuloksia ei ole esitetty).

Tiedot osoittavat, kuvia valvonta-RNAi-solujen (A) ja FASN-RNAi 3128-soluja (B). Kuvat on otettu 6 tunnin välein 5 päivän ajan. Valkoinen arrowheads osoittavat esimerkki muodostumisen valejalka, kara-muotoinen morfologia, ja aktiivinen soluvaelluksen kontrolli-RNAi-soluissa. Musta arrowheads osoittavat esimerkki puutteellinen muodostumista valejalka, pyöreä morfologia, ja alhainen aktiivisuus solumigraation että FASN-RNAi 3128 soluissa.

Näiden havaintojen perusteella oletamme, että FASN esto vaikuttaa muuttoliike ja invaasion soluja. Tämän testaamiseksi suoritimme solujen vaeltamiseen ja invaasio määrityksissä kanssa FASN-RNAi ja valvonta-RNAi LNCaP. Huomasimme, että FASN-RNAi-solut osoittivat vähemmän muuttoliikettä ja invaasio vastaavat pienenee ilmaus FASN (Fig. 4B, alempi vasen ja oikea). Nämä havainnot viittaavat siihen, että FASN esto ei ainoastaan ​​tukahdutetaan solujen proliferaatiota, vaan myös alentunut soluadheesiota, muuttoliike, ja hyökkäystä.

geeniekspressioprofiili in FASN Knockdown Solut

edelleen ymmärtää vaikutuksia FASN eston,