Krooninen sairaus

tiivistelmä

DNA-sitovan proteiinin AT-Rich Interactive Domain 3B (ARID3B) on koholla munasarjasyövän ja lisää kasvaimen kasvua ksenograftimallia munasarjasyöpään . Kuitenkin suhteellisen vähän tiedetään ARID3B toimintaa. Tässä tutkimuksessa suorittaa ensimmäisen genomin laajakuvanäyttö ARID3B suoraan kohdegeenien ja ARID3B säännelty polkuja. Havaitsimme ja vahvistaneet lukuisat ARID3B tavoite geenien kromatiinin immunosaostuksella (chip) seuraa mikrosirujen ja kvantitatiivinen RT-PCR. Käyttäen motiivin löytää algoritmeja, me tunnettu sitoutumiskohdan ARID3B, joka on samanlainen kuin aiemmin tunnettu sivusto ARID3B paralogi ARID3A. Toiminnallisuus Tämän ennustetun sivuston osoitettiin Chip analyysi. Olemme ensi osoitti, että ARID3B indusoi ilmentymistä tavoitteensa munasarjasyövän solulinjoissa. Olemme vahvistettu, että ARID3B sitoutuu epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) edistäjän ja lisää mRNA: n ilmentymisen. ARID3B sitoutuu myös promoottorin Wnt5A n ja sen reseptorin FZD5. FZD5 ilmentyy erittäin munasarjasyövän solulinjoissa, ja on voimistuvan eksogeeninen ARID3B. Sekä ARID3B ja FZD5 ilmaisun kasvu adheesiota soluväliaineen (ECM) komponentteja kuten kollageeni IV, fibronektiini ja vitronektiiniä. ARID3B-nousi tarttumista kollageenien II ja IV vaativat FZD5. Tämä tutkimus osoittaa suoraan, että ARID3B sitoutuu kohdegeenien sekvenssi-spesifisellä tavalla, mikä lisää geeni-ilmentymisen. Lisäksi meidän tiedot osoittavat, että ARID3B sääntelyn suoraan kohde- geenien Wnt koulutusjakson edistää tarttumista munasarjasyöpäsoluja.

Citation: Bobbs A, Gellerman K, Hallas WM, Joseph S, Yang C, Kurkewich J, et al. (2015) ARID3B Suoraan Säätelee munasarjasyöpä edistäminen Genes. PLoS ONE 10 (6): e0131961. doi: 10,1371 /journal.pone.0131961

Editor: Jinsong Zhang, Saint Louis University School of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 06 helmikuu 2015; Hyväksytty: 8 kesäkuu 2015; Julkaistu: 29 kesäkuu 2015

Copyright: © 2015 Bobbs et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Institute of Health /National Cancer Institute R00CA133190, https://www.cancer.gov/(KDCD), Munasarjojen Cancer Research Fund, Liz Tilberis Scholar Award, https://www.ocrf.org/(KDCD), Eck Institute for Global Health, University of Notre Dame, Pilot apuraha Genomics Core, https://globalhealth.nd.edu/(KDCD ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Kun Yhdysvallat, munasarjasyöpä on 5

th yleisin syöpä naisilla ja kaikkein vaarallisin gynekologinen syöpä. Vuonna 2014, on odotettavissa, että on ollut 21980 uutta tapausta munasarjasyöpä, ja 14270 kuolemantapausta [1]. Olemme osoittaneet, että DNA: ta sitova proteiini ARID3B yliekspressoituu vakavien munasarjasyövän; ARID3B ilme tumassa korreloi taudin uusiutumisen [2, 3]. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli mekanistisesti tunnistaa suoraan kohdegeenien ARID3B jotka voivat edistää munasarjasyöpään etenemiseen.

ARID3B kuuluu perheeseen AT-Rich Interactive Domain (kuiva) proteiineja, jotka osallistuvat chromatin remodeling ja geenin ilmentymisen säätelyyn. Nämä proteiinit on tunnusomaista kuivilla DNA: ta sitovan domeenin, joka on erittäin konservoitunut sekvenssi ~ 100 aminohapon [4]. ARID3B on kuivilla verkkotunnuksen, joka jakaa 89,9% aminohappojen identtisyys sen paralogi ARID3A (B-soluaktivaattorin alkuperäiseltä nimeltään ”Kirkas”), joka on sitova konsensus sivusto ”AATTAA” [5-7]. Liikkuvuuden siirtymän määritykset ovat osoittaneet, että ARID3B voi sitoa Matrix Attachment Alueet, jotka sitovat myös ARID3A päässä IgH [8]. Äskettäin raportoitiin, että ARID3B sitoutuu Oct4 promoottori ja säätelee sen ilme kuitenkin puolueeton lähestymistapa tunnistaa suoraan ARID3B kohdegeenejä ei ole raportoitu [9].

kuivilla proteiinit ovat osallisena kehittämiseen ja kudoksille spesifisen geenin ilmentymisen, ja poikkeava ilmentyminen on tuumorigeneesiin liittyvistä [10].

Arid3b

on välttämätön geeni; null alkiot die puolivälissä raskauden, joilla vakavia puutteita kehitystä sydämen, hermokudoksen, kallon ja kasvojen rakenteet, raajasilmuissa ja muodostuminen apikaalisella endodermaalinen harjun [11-13]. ARID3B yliekspressoituu neuroblastooma, varsinkin vaihe IV kasvaimia, ja yhteistyössä MYCN lisäämiseksi onkogeeninen ja leviämisen [14, 15]. Vuonna vakavien munasarjasyöpä, ARID3B on kohonnut [2]. Nuclear ilmaus ARID3B korreloi taudin uusiutumisen [3]. Lisäksi yliekspressio ARID3B munasarjan syöpäsolujen kiihdyttää tuumorin kasvua ksenograftimallia munasarjasyöpään [3]. Tavoitteena geenit säätelevät ARID3B ja molekyylitason mekanismeja, joilla ARID3B vaikutukset tuumorigeneesiä munasarjasyövän ei tunneta.

Tässä tutkimuksessa tunnistettu suoraan geenikohteet of ARID3B vuonna munasarjasyöpäsoluja kautta Kromatiini Immunosaostaminen (chip) jonka jälkeen mikrosiru (chip Chip) tekniikkaa. Sitova alueet ARID3B leimasi laskennallisia bioinformatiikan analyysi ja tuottivat hyvin säilyneitä sitoutumiskohdan. Niistä kohdegeenien ARID3B kuuluvat EGFR, NOTCH, TNF, ja Wnt signalointireitteihin. Olimme erityisen kiinnostuneita ARID3B vaikutuksesta Wnt-signalointireitin koska ARID3B sitovia alueita neljässä Wnt-reitin geenit: WNT5A, FZD5, APC, ja MYC. WNT5A ja FZD5 ovat yli-ilmennetään munasarjasyöpä ja korreloi huonon ennusteen ja Wnt toiminta tiedetään säätelevän solujen lisääntymisen ja kuolema [16-19]. Säätelyä FZD5 ja ligandin WNT7A kasvua kasvaimen kasvun ja solujen adheesion [20]. Huomasimme, että ARID3B lisää ilmentymä FZD5, APC, ja MYC. Yliekspressio FZD5 tai ARID3B munasarjan syöpäsolujen lisää tarttumisen useita ECM-proteiinien, kuten fibronektiinin ja vitronektiinin, kun pudotus on FZD5 tai muokkaaminen ARID3B aiheuttaa tarttumisen menetyksestä tiettyihin ECM komponentteja. Lisäksi knockdovvn FZD5 soluissa, joissa ARID3B on yli-ilmentynyt johtaa vähentynyt tarttuvuus ja vähentynyt ARID3B aiheuttama tartunta kollageeni II kollageeni IV, ja tenaskiini. Nämä tulokset viittaavat siihen, että suora Wnt-signaloinnin ARID3B voivat edistää munasarjojen syövän etenemisessä.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

solulinjat kasvatettiin 37 ° C: ssa 5% CO

2. OVCA429 soluja (saatu tri Bast, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX ja kuvattu [21]) kasvatettiin Minimal Essential Medium (MEM). Saimme Skov3IP soluja Dr. Mills, MD Anderson Cancer Center, Houston, TX. Johtaminen Skov3IP solujen kuvataan Yu et al [22]. Skov3IP soluja kasvatettiin McCoys Media 5A. Media oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Atlas, Ft. Collins, CO), 0,1 mM L-glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia, 50 U /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä. OVCA429 ja Skov3IP soluja, jotka ilmentävät ARID3B, FZD5 (Plenti-C-mGFP, Origene, Rockville, MD), tai kontrollina Red fluoresoiva proteiini (RFP), luotiin, kuten edellä on kuvattu ja tasot ARID3B yliekspression oli samanlainen kuin saavutetaan meidän aiemmissa tutkimuksissa ( Kuva 1) [23]. Editointi ARID3B geenin OVCA429 soluissa suoritettiin käyttäen transfektoitiin sgRNA /Cas9 all-in-one-ekspressiovektoriin kohdistaminen ARID3B (p-CRISPR-CG01, Geneocopeia, Rockville, MD). Kontrollina CRISPR-muokattu solulinjat, OVCA429 solut transdusoitiin Cas9 nukleaasin ilmaisu klooni (CP-LvC9NU-01, Geneocopeia, Rockville, MD) ja salatun sgRNA kontrollivektorin (p-CRISPR-LvSG02, Geneocopeia, Rockville, MD). Sillä FZD5 transduktio, SKOV3–solut (ATCC, Manassas, VA, USA, # HTB-77) [24], käytettiin sijasta Skov3IP solujen koska meidän SKOV3IP solut ekspressoivat GFP: tä ja FZD5 ekspressiovektori ilmentää GFP (Plenti-C-mGFP) . FZD5 knock-down saatiin aikaan käyttämällä transdusoitujen shRNA vektorin (pGFP-C-shLenti, Origene, Rockville, MD). OVCAR3-soluja (ATCC, # HTB-161) [25] kasvatettiin RPMI-elatusaineessa, jossa on 20% FBS: ää ja 10 mg /ml insuliinia. Caov3 (ATCC, # HTB-75) [26] ja 293FT (Life Technologies, Carlsbad, CA, # R700-07) [27] soluja kasvatettiin Dubecco Modified Eagle Medium (DMEM), jossa oli 10% FBS: ää. IOSE398 solut (Dr. Stack, Harper Cancer Research Institute, Notre Dame, IN on kuvattu [28]), kasvatettiin 1: 1-seosta Media 199 ja MCDB105, jossa oli 5% FBS: ää ja 50 ug /ml gentamysiini. Kaikki soluviljelmäreagenssit paitsi FBS oli Invitrogen (Carlsbad, CA). Solulinjoja todennettu 1. lokakuuta 2013 kello ATCC mukaan STR profilointia.

ARID3B ilmentyminen arvioitiin vanhempien, RFP-ilmentävät, ja 6xHis-ARID3B OVCA429 (A) ja Skov3IP (B) solulinjoissa, käyttämällä sekä qRT-PCR: llä. (C) Immunoblotilla vanhempien ja ARID3B ilmentäviä solulinjoja vahvistaa tämän tuloksen.

Vieraslajisiirteen hiiri malleja munasarjasyövän

Kaikki tutkimukset hyväksyttiin yliopiston Notre Dame IACUC komitea (Protocol 14-060) ja tehtiin suuntaviivojen mukaisesti Yhdysvaltain Public Health Service Policy varten inhimillinen hoito ja käyttö Laboratory Animals. Kuusi viikkoa vanhat naaraspuoliset nude nu /nu-hiiriä (Charles River, Wilmington, MA) säilyivät Freimann Life Science Center (University of Notre Dame). Kokeilututkimusohjelmaan (4 hiirtä ryhmää kohti), 1×10

6 SKOV3IP-RFP tai SKOV3IP-ARID3B solujen 200 ul: ssa fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, ja 11,9 mM fosfaattipuskuri, pH 7,4 ) injektoitiin intraperitoneaalisesti (IP) nude-hiiriin. Hiiriä seurattiin viikoittain kasvaimen kasvua (jossa ventraali ja selkä kuva viikoittain). Kasvainten kasvua ja kuvantamisen on raportoitu Roy, L., et ai [3]. Koska IP kasvaimen kasvua tuloksia laajalle levinnyt kasvain levittäminen, on vaikea tarkasti kvantitoimiseksi kasvaimen useita kasvaimia

in vivo

. Hiiret lopetettiin, kun mukaan

in vivo

kuvantaminen havaittu useita suuria kasvaimia tai jos hiiret osoittivat merkkejä sairaudesta kuten laajentunut vatsa.

Microarray Analysis ja bioinformatiikan

kolme RNA-näytteet kukin SKOV3IP-RFP ja SKOV3IP-ARID3B askitesneste /vatsakalvon pesuja valmistettiin [3]. Microarray suoritettiin Notre Dame Genomics Core Facility koskevasta Affymetrix Human Genome U133 Plus 2 GeneChip- (Affymetrix, Santa Clara, CA). Koetin asettaa ekspressiotasot normalisoituivat ja tiivistää käyttämällä GC vankka multi-array keskiarvo (GCRMA) algoritmi [29]. Ohjaus koetinsarjojen ja koetinsarjojen jotka olivat ”ei havaittavissa” erotettiin suodattamalla tarkempaan analyysiin. ”Ei havaittavissa” määriteltiin koetinsarjojen jotka ovat joko kutsutaan ”poissa” Affymetrixin Call Detection Algorithm (Manual otsikolla ”GeneChip- Expression Analysis Data Analysis Perusteet”, Affymetrix; www.affymetrix.com) kaikissa kuusi paneelit, tai joilla on kaikki sen ilmentymisen ilmoittama GCRMA alle 2,5. Merkitys analyysi mikrosirut (SAM, [30]) käytettiin havaitsemiseksi differentiaalisesti ilmentyvien geenien välillä ARID3B ja RFP valvontaa. Tuhat kaksitoista koetinsarjojen havaittiin merkittäväksi väärä löytö määrä (FDR) alle 10%. Näistä koetinsarjojen, 199 oli alas säätelee ARID3B. Toinen, tiukempia analyysi normalisoitunut raaka microarray tietojen RMA, ja edellytti FDR alle 5%. Pathway analyysi toteutettiin ristiviittauksia geenien niihin liittyvine Gene ontologia (GO) ehdot lueteltuja Ensembl tietokantaan.

Kromatiini immunosaostus ja sitä seuraava mikrosiru (chip Chip) B

hakkuri Chip menettely suoritettiin protokollan Tamimi et. Ai. [31]. Lyhyesti, Ni

2 + -NTA-magneettisia helmiä käytettiin eristämään murtunut kromatiinin sisältävät kompleksit (His) -6-ARID3B fuusioproteiinin lysaateista. Positiivinen kontrolli (100% tulo, ei Ni

2 + -NTA) ja negatiivinen kontrolli (H2O plus Ni

2 + -NTA lisätty näyte) on myös mukana. Microarray hybridisaatio suoritettiin käyttäen NimbleGen Human 2.1M Standard Promoottori Array valmistajan ohjeiden mukaisesti, kuten on kuvattu alla. Ehjinä kokeellisiin siru ja ohjaustulo näytteitä on todennettu Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA). Yksi ug kokeellisia ja kontrollinäytteiden leimattiin Cy3 ja Cy5-leimattu random nonameerejä, vastaavasti (Roche NimbleGen, Inc., Madison, WI). 34-ug: aan kutakin cy-väriaine leimattu tuote yhdistettiin ja hybridisoitiin microarray 42 ° C: ssa 16-20 tunnin ajan. Mikrosiruja pestiin, kuivattiin, ja sitten skannataan NimbleGen MS200 skanneri 2 um resoluutio. Microarray kuvia visualisoitiin ja analysoitiin NimbleScan ohjelmisto v2.5 (Roche NimbleGen, Inc.).

laskeminen ARID3B sitoutumiskohdan suoritettiin käyttäen molempia MEME (University of Queensland, Brisbane, Australia [32, 33] ja ALLEGRO (Tel Avivin yliopisto, Tel Aviv, Israel) [34, 35]. Jaksotiedot of ARID3B sitoutumisalueiden määritettynä meidän chip Chip kokeet uutetaan käyttäen erikoisvalmisteinen PerlScript. top 50 ARID3B sitoutumiskohta sekvenssit skannataan yhteisten motiivien avulla MEME. Rinnakkaisessa analyysia kaikki merkittävät ARID3B sitoutumiskohdan sekvenssejä verrattiin taustalla genomin käyttäen ALLEGRO.

kromatiini Immunosaostaminen (chip)

Sheared chromatin valmistettiin 90% konfluentteja munasarjasyöpäsoluja käyttämällä Pierce Agarose ChIP Kit (Rockford, IL) ja julkaistu protokollan Cold Spring Harbor [36]. DNA leikkaus suoritettiin käyttämällä EpiShear Probe Sonicator (Active Motif, Carlsbad, CA), jossa on sarja 10 20 sekunnin pulsseja 25% amplitudi. Viisikymmentä ug pilkottua kromatiinin käytettiin kunkin immunosaostuksella (IP). IP suoritettiin käyttäen anti-ARID3B-vasta-ainetta (Bethyl Laboratories, A302-564A, Montgomery, TX) tai IgG: tä (Pierce, Rockford, IL) ja proteiini A-agaroosi-magneettisiin helmiin. Näyte ”Input DNA” kerättiin ennen IP normalisointia. ChIP näytteet käänteisfaasi-silloitettu kuumentamalla 65 ° C: ssa 4 tunnin ajan, kun läsnä oli 20 ug proteinaasi K ja 250 mM NaCl: a, ja puhdistaa käyttämällä standardia uutetaan fenoli /kloroformilla ja sen jälkeen etanolisaostuksella.

ChIP DNA-näytteet analysoitiin määrällisiä polymeraasiketjureaktio (qPCR), käyttäen SSO Fast EvaGreen Supermixiä (Bio-Rad, Hercules, CA). Jokainen ChIP DNA-näyte verrattiin asianmukainen Input DNA-näyte. Alukkeet hankittiin Integrated DNA Technologies (Coralville, IA) ja suunniteltu kylki ehdotettujen ARID3B sitoutumiskohtia:

EGFR F: CTCAAGTGTCTCATACTACC /R: GTCATTGGGCAAACCACTG

BTC F: GTCTCAGCCTCCCAAGTAGC /R: CTAACAGGTATAATGTCACAG

WNT5A F: AGTGATTCTCCTGCCTCAGC /R: TGGAAGGGATGAATTTGGTC

MYC F: GGAGGCCAGATGCATGAG /R: TAC CTA TGG CTG TTA GAA TC

FZD5 F: GCACAATGGCTCATGCTTG /R: CGCAATCTTGGCTCACTGC

APC F: CTCCTGACCTCAAGTGATCC /R: CAGTCACTGCTTATAGAATC

RIPK1 F: GTCTTGAACTCCTGACCTCG /

R: ACAGAAACTCCATGCAAACC

NOTCH2 F: GTCAGGAGTTTGAGACC /R: ACTGCAATCTCTGCCTCC

NUSAP1 F: TTCACATGCCTCATTAAGAG /R: TCCCGAGTAGCTGGGATTCC

CASP1 F: ACTCAAGCAATTCACTCACG /R: CATTCTGAGTCCAGAGCCTG

LPAR1F: TGAAGAGTTGCGTATTAAC /R: AGTTTCATGGGTGCTATACC

CENPN F: ATCTACTGTATGTCAGACAC /R: CAGGCACCCGATACCACG

CEP55: F: GCAGGAGTTCGTGATCAGAG /R: CCAGCTAATTCTGGGATCG

Gene Expression

RNA OVCA429 ja Skov3IP solut eristettiin käyttäen TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA), mukaan valmistajan ohjeita. Komplementaarisen DNA: n (cDNA) valmistettiin 500 ng RNA: ta käyttäen High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Waltham, MA), kuten on suunnattu. Reaktiot suoritettiin joko iTaq Universal Probes Supermixiä (Bio-Rad) tai SSO Fast EvaGreen Supermixiä (Bio-Rad). Kaikki geenin ilmentymisen alukesarjoilla saatiin Integrated DNA Technologies (Coralville, IA), lukuun ottamatta ARID3B (Life Technologies, Carlsbad, CA). kvantitatiivinen käänteistranskriptio polymeraasiketjureaktio (qRT-PCR) reaktiot suoritettiin kolminkertaisina ja normalisoitiin ilmentymisen GAPDH. Primer määritykset ovat seuraavat: APC: Hs.PT.56a.3539689, ARID3B: HS01084949_g1, BTC: Hs.PT.56a.3511718, CASP1: Hs.PT.56a.39699622, CENPK: Hs.PT.56a.40187080. g, CENPN: Hs.PT.56a.22431568.g, CEP55: Hs.PT.56a.279272.g, EGFR: Hs.PT56a.20590781, FZD5: Hs.PT.56a.3585264, GAPDH: Hs.PT. 39a.22214836, MYC: Hs.PT.49a.3659201.g, NOTCH2: Hs.PT.512811432, NUSAP: Hs. PT.51.21077614, WNT5A: Hs.PT.56a.22221435.

Western Blot

Koko-solu-proteiini lysaatit saatiin hajottamalla OVCA429 ja Skov3IP munasarjasyövän solut RIPA-puskurissa (50 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0,5% EDTA: a, 0,1% SDS, ja 1X Pysäytetään Proteaasi fosfataasilla Inhibitor Cocktail (Pierce, Rockford, IL)). Proteiinipitoisuus mitattiin käyttäen Bicinchoninic Acid (BCA) määritys standardin protokollan (Pierce, Rockford, IL). Proteiinit havaittiin käyttäen seuraavia vasta-aineita: ARID3B (# A302-564A, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, kanin polyklonaalinen, Synthetic Peptide antigeeni), FZD5 (# MC-4273, MBL, Woburn, MA, kanin polyklonaalinen, Synthetic Peptide antigeeni) , β-aktiini (# AM1829b, Abgent, San Diego, CA, Mouse Monoclonal, Recombinant Protein Antigen), GAPDH (# ab128915, Abcam, Cambridge, Englanti, Rabbit Monoclonal, Synthetic Peptide antigeeni), COXIV (# 4850, Cell Signaling Technology , Rabbit polyklonaalisia, synteettinen peptidi, joka vastaa tähteitä ympäröiville Lys29 ihmisen COXIV), ja ARID3A (kanin polyklonaalista vasta-ainetta, ystävällinen lahja H. Tucker UT Austin), jota seurasi sekundaarinen anti-kani-HRP-konjugoitu vasta-aine (GE Health Care, Knox , SISÄÄN). Imaging ja kvantitointi suoritettiin käyttäen Bio-Rad Chemidoc XRS + System, juokseva Imager Lab Software (Hercules, CA).

ECM adheesiomäärityksellä

Cellular kiinnitys ECM komponentit määritettiin käyttäen Kolorimetrinen ECM Cell Adhesion Array Kit (Millipore, Billerica, MA). ECM kiinnitys määritykset suoritettiin OVCA429 ja SKOV3- soluja, jotka ilmentävät ARID3B, FZD5, FZD5 shRNA tai sisältäviä CRISPR-muokattu ARID3B. 1 tunnin inkuboinnin jälkeen ei-kiinni solut pestiin pois, ja loput kiinnittyneet solut värjättiin mukaan valmistajan ohjeita. Värjätään solut pestiin vedellä, ja tahra liuotettiin kanssa kit uuttopuskuria. Valon absorptio 540 nm: ssä mitattiin Spectramax Plus (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Laskea eroja soluadheesiota, absorption mittaukset raportoidaan kertainen muutos yli OVCA429-RFP tai SKOV3-RFP tarttuvuus kullekin ECM komponentti.

TCF /Lef reportterianalyysi

Transfektoimme 293FT soluja kasvatettiin 80% konfluenssiin 12-kuoppaisen levyn, käyttäen Lipfectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), 500 ng DNA: ta. Kaikki solut transfektoitiin TOPflash tai FOPflash toimittaja plasmideja yhdessä vektorin voima-ilmentävien ARID3B (Plenti-suCMV-Rsv, Gentarget, San Diego, CA), FZD5 (Plenti-C-mGFP, Origene, Rockville, MD) Wnt5a (pLenti- C-mGFP), tai tyhjä Plenti-C-mGFP vektori. Kaikki näytteet myös kanssatransfektoida Renilla lusiferaasin ohjaus normalisoimaan solujen määrä ja transfektion tehokkuutta. Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttäen Promega Dual Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI), mukaisesti valmistajan ohjeiden ja mitattu TD 20/20 luminometrillä (Turner Designs, Sunnyvale, CA). Samanlainen koe suoritettiin 3T3 ”Leading Light” solut (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY). Koska nämä solut ilmentävät Wnt Reporter lusiferaasi, ne olivat vain transfektoitiin edellä mainittujen ARID3B, FZD5, ja Wnt5a vektorit, ja normalisoidaan proteiinin pitoisuus. Kaikki olosuhteet suoritettiin kolminkertaisina ja normalisoitiin Renilla sisäisen valvonnan.

Tilastot

qPCR tiedot ja soluadheesion t-tilastoista laskettiin käyttäen Smith-Satterthwaite käsittävä epätasainen väestön varianssien. Tilastollinen merkittävyys määrätty vertailuja p-arvo 0,05 tai pienempi. Yliedustus Gene ontologia (GO) ehdot laskettiin käyttäen Chi-Square-testin.

Tulokset

ARID3B sitoo säätelyalueita DNA

saadaan käsitys siitä, miten ARID3B säätelee munasarjojen kasvaimen kasvua pyrimme tunnistamaan ARID3B säännelty geenejä. Ensimmäinen askel oli tunnistaa säätelyalueita (kuten promoottoreita ja tehostajat) sitoo ARID3B kautta chip Chip analyysi munasarjasyöpäsoluja yliekspressoivat ARID3B (6xHis-ARID3B). OVCA429 solut transdusoitiin ARID3B kuten aikaisemmin on kuvattu [23]. Koska ekspressiotasot ARID3B soluissa käytetään chip-Chip olivat erittäin korkeita (noin 300-kertainen lisäys) päätimme vahvistaa geenien enemmän kohtuullisesti ARID3B ilmaisun jotka ovat todennäköisesti kohdataan

in vivo

(kuvio 1). Leikatut kromatiinin kompleksit sidottu His-merkittyjen ARID3B eristettiin käyttäen Ni

2 + -NTA magneettiset helmet, sitten hybridisoidaan NimbleGen Human 2.1M Deluxe Promoottori Array. Tilastollinen analyysi on siru-Chip array paljasti 2367 genomialuetta sitoo ARID3B (S1 taulukko). Genominen alueet tunnistetaan chip Chip vaihteli 397 emäsparia ja 3198 emäsparin (mediaani: 1131 emäsparia).

Seuraavaksi arvioidaan, jos ARID3B sidottu geenien klusterin erillisiin polkuja tai biologisia toimintoja. Genominen ympäröiviltä alueilta kukin ARID3B sitoutumiskohta skannattujen transkription aloituspaikkoja (TSS) läheisyyteen, mikä osoitetaan kukin sitoutumiskohta on todennäköistä säätelyalueen. Noin 11%: n ARID3B sitoutumiskohtien sijaitsevat tällä tavalla, ovat välittömässä promoottorialueen geenin (määritelty 0-2Kb päässä TSS), 18% ovat lähellä tehostaja-alue (2-5Kb päässä TSS), 52 % ovat kauempana enhancer alueilla, ja 19% on introneissa (kuvio 2).

(A) jakelu ARID3B sitoutumiskohtien suhteen transkription aloituskohdasta lähimmän geenin. (B) Graafinen esitys laskennallisesti johdettuja ARID3B konsensus sivuston, syntyy MEME.

Geenit kanssa lähellä ARID3B sitovia ryhmiteltiin Gene ontologia (GO) Biologisen funktion (taulukko 1). Monet Oletetun ARID3B tavoitteet on GO liittyviä ilmaisuja solukuolemaan ja apoptoosiin (88 geenit), sydän kehittäminen (21 geenit), neuroni kehittäminen (47), ja kantasolujen merkkiaineita (6 geenejä). Pienempi määrä geenejä löydettiin GO ehdot raajasilmun (2 geenit) ja kallon muodostuminen (1-geeni). Totesimme myös, että ARID3B sitoutuu useita geenien sentromeerien tai metafaasissa (44 geenejä). Nämä luokat ovat osajoukko biologisia toimintoja, jotka ARID3B voi säädellä ja sotkea ARID3B tavoitteet monissa prosesseissa.

ARID3B säätelee geenin ilmentymistä

halusimme seuraavaksi tunnistaa ARID3B säädellä geenejä, jotka ovat mukana kasvaimen kasvun olemme eristetty soluja hiirimallissa munasarjasyöpä. Skov3IP solut, jotka ilmentävät punainen fluoresoiva proteiini (RFP) tai 6xHis-ARID3B ja RFP injektoitiin paljaisiin hiiriin. Kasvainten annettiin kasvaa. Keräsimme askites tai vatsakalvon pesuja peräisin Skov3IP-6xHis-ARID3B tai Skov3IP-RFP ksenograftien Askites kuvatulla [3]. RNA kerättiin pahanlaatuiset vesivatsat muodostavat Skov3IP-ARID3B kasvaimen kantavien hiirten tai vatsakalvon pesuja hiiristä kanssa Skov3IP-RFP kasvaimia. Microarray-analyysi suoritettiin käyttäen Affymetrix Human Genome U133 Plus 2 GeneChip-. Tässä kokeessa oli 813 geenien lisääntynyt ilmentyminen vasteena ARID3B, ja 201 geenien vähentynyttä ilmentymistä (S2 taulukko). Tiukemmat laskeminen ”erittäin muunnettu” geenejä (perustuu RMA normalisoinnin False Discovery Hinta alle 5%) saatiin 132 geenien lisääntynyt ilmentyminen, ja 39 on alentunut ilme. Samanlaisia ​​meidän chip Chip tiedot, nämä tulokset suodatettu GO termejä. Niistä geenejä, jotka ovat ARID3B indusoi ovat 44 solukuoleman geenejä, 13 sydämen kehityksen geenejä, 17 hermoston kehittymistä geenejä, 37 solunjakautumisen geenejä, ja 9 kantasolujen geenejä (taulukko 2). Suostumuksella meidän chip sirudata, useiden geenien tunnistimme suorina ARID3B tavoitteet aiheuttamien ARID3B ilmaisu kuten NOTCH2, CASP1, CENPN, ja CENPK. Tilastollinen analyysi GO aikavälin jakelu havaittu, että metafaasissa ja sentromeeriantigeenin liittyvät ehdot olivat merkittävästi yliedustettuina geenien voimistuvan ARID3B, kun neuroni kehitys ehdot olivat yliedustettuina geenien alas-säädellä ARID3B (S3 taulukko).

kuvaavat ARID3B sitoutumiskohdan

konsensus sitoutumiskohdan ARID3B n paralogi ARID3A on aiemmin osoitettu olevan ”AATTAA” [5]. Kuten edellä on kuvattu, genomiset sekvenssit sitoo ARID3B saatiin ChIP-Chip. Nämä sekvenssit analysoitiin käyttämällä kahta erillistä motiivi finding algoritmit (MEME [32] ja ALLEGRO [34]) löytää yhteinen AT-rikas motiivi. Molemmat menetelmät tuottivat konsensus sitova motiivi ”TGGGATTACAG.” (Kuvio 2) Osoittaakseen toiminnallisuutta laskennallisesti saatu motiivi, suoritimme siru havaita ARID3B sitoutuminen säädin alueille geenien tunnistettu kautta chip Chip. Sitoutuminen säätelyalueita näiden geenien määritettiin käyttäen qPCR suunniteltuja alukkeita monistamaan 200-300 alueen, joka sisältää yhden tai useamman otaksutun ARID3B sitoutumiskohtia, että olemme määritelleet bioinformatically. ChIP näytteet valmistettiin Skov3IP ja OVCA429 munasarjasyöpäsoluja, käyttäen sekä vanhempien linjat ja jotka ilmentävät 6xHis-ARID3B (kuvio 1). Kohdegeenien valittiin validointi perustuu sirun-Chip data, ja biologista merkitystä geenin. Valitun kohdegeenien jaettiin 4 luokkiin Gene ontologia: Wnt signalointia (Wnt5A, FZD5, MYC, APC) (kuvio 3A), Cell syöttämällä liittyvä (NOTCH2, CASP1, LPAR1, ja RIPK) (kuvio 3B), Cell jako (CENPN, CENPK, NUSAP, ja CEP55) (kuvio 3C), ja EGFR signalointi (EGFR ja BTC) (kuvio 3D). Kunkin alueen, qPCR tulokset ARID3B ChIP normalisoitiin tuloon DNA-näyte, ja verrattuna negatiiviseen (IgG) kontrolli. Kuten on esitetty kuviossa 3, lähes kaikki valitut kohdealueilla osoitti ARID3B sitova olennaisesti yli negatiivisen kontrollin ainakin yhdessä solulinjassa. Suhteellinen sitovia ARID3B ChIP versus vastaava negatiivinen kontrolli oli yleensä huomattavasti korkeampi soluissa yliekspressoivien ARID3B, verrattuna vanhempien solulinjojen (kuvio 3). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin tehtäessä siru korkealaatuisesta serous munasarjasyöpäsoluja (OVCAR3), joilla on merkittäviä ARID3B Sitoutumisen havaittu Wnt5a, RIPK, BTC, ja APC (kuvio 3E).

Kromatiini Immunosaostaminen (chip) seurasi by qPCR suoritettiin vanhempien ja 6xHis-ARID3B Skov3IP ja OVCA429 solujen sitoutumisen detektoimiseksi ARID3B kohdistaa geenien avain reittejä. Kaikki luvut on ilmoitettu suhteellisen sitoutumisen verrattuna vastaavaan tuloon DNA-näyte. Suluissa että sitoutuminen ARID3B-chippinäytteet on huomattavasti korkeampi kuin vastaava taustan (IgG) näyte (* p-arvo 0,05, ** – p-arvo 0,005). N = 3. Meillä validoitu ARID3B sitoutumalla geenien kanssa Gene ontologia (GO) liittyvät ehdot (A) Wnt Signaling, (B) solukuoleman ja apoptoosi, tai (C) Cell Division, tai (D) EGFR signalointi. (E) Samanlaisia ​​ChIP johtaa korkealaatuisesta serous munasarjasyövän solulinja OVCAR3.

ARID3B muuttaa geenien ilmentymistä keskeisten solureiteillä

Seuraavaksi selville jos ARID3B lauseke muuttaa ilmaisun oletettujen kohdegeenien. Eksogeeninen ilmentyminen ARID3B kasvoi geenien Wnt ja EGF signaloinnin väylät qRT-PCR. Vuonna OVCA429 soluissa, APC, FZD5, MYC, ja EGFR indusoituvat ARID3B. Vuonna Skov3IP soluissa, ARID3B lisää FZD5, MYC, BTC ja EGFR (kuvio 4A). Johdonmukainen induktio FZD5 ja MYC on erityisen kiinnostava, kun otetaan huomioon, että molemmat ovat usein ekspressoidaan korkeilla tasoilla munasarjasyöpäsoluja verrattuna kuolemattomiksi munasarjojen pinnan epiteelisolujen (IOSE398) (kuvio 4B ja 4C). Lisäksi olemme vahvistaneet, että ARID3B indusoi ilmentymisen monet ennustivat tavoitteista: ARID3B voimistunut NOTCH2, SORBS1, ja CASP1 vuonna Skov3IP solulinjoissa (kuvio 4D). Nämä geenit pidettiin kiinnostavia johtuen niiden Gene ontologia termejä. ARID3B sitoo myös useita metafaasissa ja sentromeerin liittyvien geenien (taulukko 1). Me vahvisti sitoutumisen ARID3B sääntelyn alueille CEP55, CENPN, ja CENPK käyttäen sirulla (kuvio 3C). Vuonna OVCA429 soluissa, CEP55 ja CENPN merkittävästi voimistuvan ARID3B (kuvio 4E).

(A) qRT-PCR suoritettiin kohde geenien OVCA429 ja Skov3IP vanhempien solujen ja OVCA429 ja Skov3IP soluja, jotka ilmentävät 6xHis-ARID3B. N = 5 (B ja C) qRT-PCR suoritettiin kokonais-RNA: valmistettiin IOSE398 ja paneelin munasarjasyövän solulinjoissa mitata ilmentymisen oletetun ARID3B kohdegeenien FZD5 ja MYC. N = 3 (D) qRT-PCR-analyysi Skov3IP vanhempien soluihin, Skov3IP-6xHis-ARID3B, ja Skov3IP-RFP soluissa. N = 3 (E) qRT-PCR-analyysi OVCA429 vanhempien soluihin, 6XHIS–ARID3B, ja RFP ilmentäviä OVCA429 soluissa. N = 4. * = p 0,05, ** = p 0,005 (F) Western Blot käyttämällä lysaatit OVCA429, OVCA-6xHis-ARID3B, SKOV3- ja Skov3-6xHis-ARID3B solujen FZD5. N = 2.

Koska Wnt signalointi on osallisena monissa kasvainten tyyppi, kuten munasarjasyövän me tutki tarkemmin sääntely FZD5 mukaan ARID3B. Säätelyä FZD5 vahvistettiin lisäksi Western blot (kuvio 4F), jossa proteiinin ilmentymistä FZD5 kasvoi 9-kertaisesti OVCA429 soluissa ja 2,8-kertaisesti SKOV3- soluissa vasteena ilmentymisen 6xHis-ARID3B. Tämä osoittaa, että ARID3B säätelee FZD5

in vitro

.

tukemiseksi edelleen roolia ARID3B in geenin ilmentymisen säätelemiseksi, OVCA429-solut transfektoitiin vektoreilla, jotka ilmentävät Cas9 nukleaasilla ja CRISPR opas-RNA: iden kohdistaminen ARID3B. Merkittävään vähenemiseen ARID3B ilmentyminen vahvistettiin Western blot (kuvio 5A) ja lukukehysmutaatioita varmistettiin sekvensoimalla (tuloksia ei ole esitetty). Expression of ARID3B kohdegeenien mitattiin käyttämällä qPCR kuin ennen, vertaamalla OVCA429 solujen CRISPR-muokattu ARID3B vastaan ​​OVCA429 soluja, jotka sisältävät ohjaus- Cas9 ja salattu sgRNA vektori. Löysimme merkittävästi vähentynyt ilmentyminen EGFR CRISPR-muokattu soluissa (kuvio 5B), ja sama pro-apoptoottisen tavoitteet TRADD ja TNF-reseptori TNFR2, joka meidän lab oli aikaisemmin varmistanut voimistuvan ARID3B [23].

(A) Western blot käyttäen koko solun lysaatti OVCA429 ja OVCA429 ARID3B CRISPR soluja, joissa tunnistus ARID3B. N = 2. (B) qRT-PCR suoritettiin EGFR, TRADD ja TNFR2 on kokonais-RNA OVCA429 soluista transdusoitu Cas9 nukleaasilla ja ohjaus salattu CRISPR opas RNA, ja OVCA429 solut ARID3B muokkasi kohdennetuilla CRISPR vektorit. (C) qRT-PCR suoritettiin ARID3B on OVCA429-GFP ja OVCA429 solut lajitellaan keskipitkän ARID3B-GFP tai korkea ARID3B-GFP: n ilmentymisen. (D) qRT-PCR suoritettiin EGFR, TRADD TNFR2, TNF, ja TRAIL on OVCA429-GFP, OVCA429 keskipitkän ARID3B-GFP, ja OVCA429 korkea ARID3B-GFP-soluissa. N = 3. * = p 0,05.