Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarjoamme uusia toiminnallisia tietoja, jotka posttranskriptionaalisella vaiennettu geeni

RPL19

käyttäen RNAi paitsi kumoaa pahanlaatuinen fenotyyppi PC-3M syöpäsolujen mutta on valikoiva suhteessa transkription ja käännös muita geenejä. Vähentäminen

RPL19

transkription moduloi osajoukko geenien, osoituksena geenin ilmentymisen array analyysiä ja Western-blottaus, mutta ei vaaranna solujen lisääntymistä tai apoptoosia

in-vitro

. Kuitenkin kasvu Ksenosiirretyn kasvaimia sisältävien tippuu alas

RPL19 in vivo

vähenee merkittävästi. Analyysi moduloidun geenien paljastaa induktio ei-pahanlaatuinen fenotyyppi pääasiallisesti liittyy häiriön verkkojen transkriptiotekijöiden ja soluadheesiota geenejä. Tiedot osoitettava, että extra-ribosomaalisen sääntelyyn tehtäviä

RPL19

, kuin proteiinisynteesiä, ovat kriittisiä säätelijöitä solun fenotyypin. Kohdistaminen keskeiset jäsenet vaikuttavat verkkojen tunnistetaan geenin ilmentymisen analyysi nostaa esiin mahdollisuuden terapeuttisesti vakauttaa hyvänlaatuinen fenotyyppi syntyy ilmentymisen moduloimiseksi yksittäisen geenin ja sen jälkeen joka rajoittaa pahanlaatuisen fenotyypin jättäen ei-pahanlaatuisten kudosten vaikuta.

Johdanto-osan : Bee A, Brewer D, Beesley C, Dodson A, Forootan S, Dickinson T, et al. (2011) siRNA knockdovvn ribosomaalinen proteiini Gene

RPL19

kumoaa Aggressiivinen fenotyyppi Human Eturauhassyöpä. PLoS ONE 6 (7): e22672. doi: 10,1371 /journal.pone.0022672

Toimittaja: Steven R. Ellis, University of Louisville, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 tammikuu 2011; Hyväksytty: 04 heinäkuu 2011; Julkaistu: 22 heinäkuu 2011

Copyright: © 2011 Bee et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat North West Cancer Research Fund (UK), Cancer Research-UK, National Cancer Research Institute (MRC-UK), joka on erikoistunut tutkimus- Excellence (SPORE) avustusta US National Cancer Institute (USA), Grand hyväntekeväisyys vapaamuurarien, Rosetrees Trust, Bob Champion Cancer Trust, Orchid Appeal ja David Koch Foundation. Tukiorganisaatioissa ollut mukana hankkeen suunnittelussa ja tutkimuksen tekeminen, keräämiseen hallinta, analysointi ja tietojen tulkinta, tai valmisteilla, tarkastuksen ja hyväksymisen paperin.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, että ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ribosomaalisen proteiinit (RP) käsittävät monitahoisen super-perheen proteiinien [1] erittäin säilyneitä koko evoluutio, mikä osoittaa niiden toiminnallinen merkitys eläviin organismeihin [2]. Tätä väitettä tukee useissa RP pseudogeenien ja geeni päällekkäisyyksiä sekä yhteisiä alueita ovat samat homologisten proteiinien prokaryooteissa ja eukaryooteissa [3]. Eukaryoottisia ribosomeja sisältävät noin 80 RP yhdessä neljän ribosomaalisen RNA: iden (rRNA) ja vaativat noin 150 ei-ribosomaalisen tekijät tulla järjestetty niihin kuuluvia pieniä (40S) ja suuri (60S) alayksiköistä [4]. Aluksi katsotaan mukana vain proteiinisynteesiä, tietyt RP tunnustetaan pleiotrooppista ja välittävän erilaisia ​​extra-ribosomaalisen sääntelytoiminnot [5], [6]. Tällaisia ​​RP, sisältävät L5 [7], L11 [8], L13 [9] ja S7 [10]. Seeprakalasta (

Danio rerio

) tehokas rooli RP kasvaimen vaimentimet on osoitettu, jolloin mutaatio tai poistaminen millä tahansa useista RP geenien heikentää p53: n kontrollin, mikä edistää maligniteetti [11], [12]. Äskettäin käsite ”ribosomopathy” on tullut vakiintunut jolloin mutaatio tietyn RP patogeenisen tietyn taudin [13]. Noin 25%: ssa tapauksista Diamond-Blackfan anemia johtuvat mutaation ribosomaalisen proteiinin geenin

RPS19

kun taas toinen 20%, mutaatiot muissa ribosomaalisen proteiinin geenejä [14]. Tällä hetkellä noin 77 yksittäistä

RPS19

mutaatioita on kuvattu [15]. Lisäksi, haploinsufficiency ribosomin proteiineja, on osoitettu, että joissakin tapauksissa olla perimmäinen syy Diamond Blackfan anemia [16].

hetkellä, mekanismeja, jotka liittyvät mutaatiot RP geenien syöpää, ei tunneta [17]. Sillä proksimaalinen pitkä käsi kromosomin alueen 17, jossa

RPL19

geeni sijaitsee (17Q), tärkeimmistä syöpään erityisiä muutoksia on kuvattu. Näitä ovat monistukset ja kopioluvun muutoksia, erityisesti alueella, joka kuuluu onkogeeni

ErbB2

muodostuminen isochromosome 17Q, päällekkäisyydet, poistot, mutaatioita ja muut genomista uudelleenjärjestelyjä. Aiemmin [18] tunnistimme tehostettu ilmentyminen

RPL19

mRNA eturauhasen solulinjojen ja kudosten korreloivan aggressiivisen pahanlaatuinen fenotyyppi. Koska kohonnut

RPL19

mRNA tapahtui yhtenä suhteellisen pieni määrä sekvenssejä yliekspressoitu eturauhassyöpä, me arveltu, että sen vaikutus oli todennäköisesti valikoiva sijaan osa maailmanlaajuista epäspesifisen korkeus geeniekspressiossa . Ribosomaalisen proteiinin L19e (RPL19) kuuluu L19E super-perheen proteiinien ja eukaryooteissa, on osa ribosomaalisen suuri 60S-alayksikköön. Geeni ilmentyy suurimmassa evoluution, erityisesti eukaryooteissa ja arkkien mutta puuttuu bakteereista [19], [20] vaikka välinen homologia sekvenssit rotan L19 ja

E.coli

ribosomaalisen proteiineja L18, L30 ja S2 [21] Yllättäen tällaisen näennäisesti tärkeä geeni,

RPL19

on toistaiseksi kiinnitetty vain vähän huomiota. Ihmisillä

RPL19

karttoja kromosomissa 17 17q11.2-q12, jossa se koodaa 9 potentiaali silmukointimuunnokset. Sarjassa ihmisen rintasyövän koepaloja,

RPL19

on raportoitu ilmaistaan ​​ja yhteistyötä monistetaan yhdessä

ErbB2

ja geenien

PNMT

,

PSMB3

ja

NR1D1

[22]. Tämä monimutkainen alue, joka sisältää useita geenejä on ehdotettu mahdolliseksi amplikonin [23], [24], joka ulottuu jonkin ~547 kb

RPL19

läpi

STRAD3

ja

erbB2-

että

GRB7

alueella 17q11.2-Q12. Tällä hetkellä tietoja ei perusteltuja tätä spekulointia. Eturauhassyövässä monistaminen erbB2 on harvoin, on raportoitu vain 0,04% [25] 2% [26] tapauksista, ja siksi ole yhteistä mekanismia RPL19 yli-ilmentyminen. Koska alkuperäistä tunnistaminen RPL19 eturauhassyövän [18], sen ilmentyminen on osoitettu määritellä huono ennuste kolorektaalisyöpä [27], ja uutena kasvaimen antigeeni keuhkoadenokarsinooma [28].

Global muutokset geenit moduloitu ihmisen eturauhassyövän aiemmin profiloitu käyttämällä DNA ilmaisua erilaisia ​​analyysi [29], jotka ovat havainneet muutoksia geenien ilmentyminen seuraavissa selektiivinen ylössäätöä yksittäisten kohdegeenien [30], [31] tai seuraavanlaista geenin-pudotus käyttäen antisense [32 ] tai RNAi [33] teknologian johtuvat muutokset pahanlaatuisen fenotyypin. Differentiaalisesti-ilmaisivat geenejä ja niihin liittyviä verkkoja on arvioitu biomarkkereina erottelua eturauhassyöpä fenotyyppejä mukaan käyttäytymistä ja hoitovaste [34]. Kuitenkin muuntunut geeni-ilmentymisen ei,

ipso facto

, vahvistaa ensisijainen rooli pahanlaatuinen prosessissa. Genomin epästabiilisuuden on tunnusomaista pahanlaatuisen muutoksen [35] ja vaikutukset voitto tai tappio yhden geenin todennäköisesti siirtää läpi koko genomin minkä seurauksena ilmentymistä muiden geenien tulee toissijaisesti moduloitu [36]. Tällaiset muutokset joko saattavat olla välittömiä ja aktiivisia merkitystä tuloksena solujen fenotyypin tai niiden muuttuneen ilmaisun on passiivinen ja merkityksetön. Arvioida toiminnallista merkitystä tietyn geenin, tukahduttaminen sen transkription voidaan lisäksi arvioida sen välittömät vaikutukset genominlaajuisten ilme. Aiemmin olemme transfektoituja pahanlaatuista eturauhasen epiteelisolujen PC-3M solut 436 emäsparin mittainen antisense repiä alas ilmentymä

FABP5

että parantaisivat pahanlaatuinen kasvain fenotyyppi sekä

in vitro

ja

in vivo

[37]. Tässä olemme palkanneet entistä kirurginen tekniikka RNA-häirintää (RNAi) potentiaalisesti suurempi spesifisyys ja tehokkuus, riippuen tietyn geenin kohdistetaan [38].

Aikaisemmat tiedot [18] osoitti, että ilmaus

RPL19

voisi olla toiminnallisesti tärkeää edistää eturauhasen maligniteetti. Olemme nyt testannut tätä hypoteesia valikoivasti vähentämällä

RPL19

ilmaisua käyttäen RNAi. Tuloksena PC-3M soluilla näytteille kumottu pahanlaatuinen fenotyyppi sekä

in vitro

ja

in vivo

kun toimitettu fenotyyppisen arviointia ja geenien ilmentymisen analyysi. Tiedot tukevat mahdollisuutta toiminnallinen rooli

RPL19

, jotka toimivat spektrin muuttuneen geeniekspression, ylläpitää pahanlaatuinen fenotyyppi ihmisen eturauhasen syöpäsolujen. Vahvistus tällainen skenaario mahdollistaisi selektiivisen terapeuttinen kohdentamisen RPL19 joko immunologisesti [28] tai käyttämällä pieniä molekyylejä, moduloimaan diskreetti alaryhmiä solun proteiineja, jotka ovat keskeisiä edistäjiä pahanlaatuisen fenotyypin.

Tulokset

siRNA knockdovvn RPL19 vanhempien PC-3M solujen

Ohimenevä transfektio.

qPCR analysoidaan alkuperäiset PC-3M-soluissa käyttäen alukkeita määritelty taulukossa 1 paljasti vahvan

RPL19

mRNA ilmaisun varmistettiin nukleotidisekvensoinnilla.

Tämän jälkeen lyhytaikaista transfektiota siRNA sekvenssien

RPL19

eksonin 1 (taulukko 2) havaittiin kohde # 1 tehokkaimmaksi sekvenssi RNA hiljentäminen, vähentää sen ilme on vain 7% alkuperäisestä tasosta (kuvio 1A). Kun muut sekvenssit olivat tehokkaita, vain yhdistelmä kaikki kolme samanaikaisesti oli parempi kuin Target # 1, yksin. Sen jälkeen kohde # 1 käytettiin kaikissa seuraavissa kokeissa.

. qPCR analyysi

RPL19

ekspressiotasot seuraava ohimenevä vaiennettu eri tavoitteiden PC-3M

vanhempien soluja. Target # 1 (T1) oli tehokkain vain 7% jäljellä tasolla havaittu. Tämä vähennys oli vain ylittää samanaikaisesti yhdistelmän T1 + T2 + T3. B. qPCR analyysi

RPL19

ekspressiotasot seuraava vakaa vaiennettu Target # 1. Nämä tiedot on koottu kokeista suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Mittaukset ovat suhteessa ilmaus RPL19 in si-PC-3M

ryntäily soluja. Vertaileva tasot hyvänlaatuisia PNT2 soluissa on myös esitetty. C. Morfologiset esiintymisiä (i) PC-3M

vanhempien solujen ja eri pesäkkeistä (ii-iv) seuraavat vakaa knockdovvn

RPL19

. Jotkut pesäkkeet (ii) olivat heikosti kiinni enemmistön kasvavien solujen suspensiossa. Muut (iii) sisälsi pääasiassa multinucleate muotoja. Suurin osa (iv) käsitti soluja, jotka olivat pienempiä kuin vanhempien. Klooni ST-3 soluja käytetään kaikissa myöhemmissä kokeissa ne esitetään tässä paneelissa. (Suurennus x 200)

Stable transfektio.

Tasot

RPL19

mRNA mitattiin PNT2, PC-3M

vanhempien, PC -3M

ryntäily ja samanai-

RPL19-

PC-3M

kohde # 1 ohimenevä transfektanttisoluilla (kuvio 1 B). Mukaisesti edellisen tutkimuksen [33], ilmentyminen PC-3M

scramble soluja asetettiin yhtenäisyys ja suhteellinen ilmaisuja muissa solulinjojen verrattiin kuten taittuva eroja.

RPL19

ilmentymistä PC-3M oli 4,9 kertaa suurempi kuin PNT2 solujen ja yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten vahvistettiin Northern blot-analyysi [18]. Vuonna äänen-

RPL19-

PC-3M

klooni ST-3 transfektanttisoluilla, ilmentyminen

RPL19

väheni vain 1,3 kertaa suurempi kuin PNT2-soluissa. PC-3M

ryntäily solut paljasti 2,3 kertainen väheneminen

RPL19

verrattuna PC-3M

vanhempien, vaikka tämä arvo ei ollut tilastollisesti merkitsevä. Yhden solukloonausta [33] sen jälkeen qPCR ja Western blotting vahvisti äänen-

RPL19-

PC-3M

klooni ST-3 ilmaisi alhaisin

RPL19

mRNA ja proteiini. Tämä klooni solujen jälkeen käytetty yksityiskohtaista fenotyyppianalyysillä.

kasvuominaisuudet si-RPL19cells

in vitro

klooneja transfektoitujen äänen-

RPL19

-PC-3M soluja kasvatettiin standardiolosuhteissa näytteillä erot morfologiassa (kuvio 1 C). Verrattuna PC-3M

vanhempien soluja, äänen-

RPL19

-PC-3M solut olivat yleensä vähemmän kiinnittynyt alustaan. Kuitenkin, nämä solut pidettiin kyky lisääntyä, ja se voisi olla onnistuneesti osa viljeltiin, vaikka suuri osa soluista pysyi suspensiona. Muut Si-

RPL19

-PC-3M soluissa osoitti kasvua multinucleate muodoissa, mikä viittaa heikentynyt loppuun mitoosin. Proliferaatiomääritykset (kuvio 2A) paljasti, että aikana logaritminen kasvuvaihe, määrä solunjakautumisen jonka äänen-

RPL19-

PC-3M

klooni ST-3 transfektanttisoluilla ei vaikuttanut merkittävästi (

p

≥0.05) verrattuna PC-3M

vanhempien ja si-PC-3M

ryntäily. Kyky äänen-

RPL19-

PC-3M

klooni ST-3 solujen hyökätä ekstrasellulaarisen Kollageenimatriksin (ECM) verrattiin kuin PNT2, PC-3M

vanhempien ja PC -3M

scramble solulinjoja (kuvio 2B). Solujen lukumäärä, jotka hyökkäsi läpi ECM olivat: (PNT2) 0,6 ± 0,6, (PC-3M

vanhempien) 279 ± 33,7 ja (PC-3M

ryntäily) 317 ± 28,3 (

p

0,001). Äänen-

RPL19

-PC-3M solut osoittivat verrattain huono invasiivisia potentiaali vain 60 ± 10,7 transmigrating solut (

p

0,001). Siten hiljentäminen

RPL19

vähensi invasiivisia potentiaalia PC-3M soluja noin 5-kertaiseksi. Endogeeninen (pohjapinta) tasot apoptoosin sisällä PC-3M

vanhempien ja PC-3M

scramble soluja (taulukko 3 ja kuvio 2C) olivat samankaltaisia ​​kuin saatuja vertailukelpoisia tutkimuksia

PRKCZ

geeni [33]. Pohjapinta tasoilla apoptoosin neljän solulinjojen eivät olleet tilastollisesti erilaisia ​​(

p

0,05). Vaikka herkkyydet PC-3M

vanhempien ja samanai-

RPL19-

PC-3M

klooni ST-3-solut kamptotesiiniin ei muuttunut, tämä aine nousi apoptoosin PNT2 ja PC-3M

ryntäily solut (

p

0,0001).

. Suhteellinen kasvu solulinjoista yksikerrosviljelmässä paljastaen tilastollista eroa nopeudessa leviämisen välisen taintumisen solujen (äänen-

RPL19

-PC-3M

klooni ST-3), ja että PC-3M

vanhempien soluja. B. invaasiomääritys

in-vitro

verrataan saman solujen populaatiot kuin kuviossa (A) ja paljastaen 83% lasku invasiivisia kapasiteetin

RPL19

pudotus solujen suhteessa tietokoneeseen -3M

ryntäily soluja. C. Lepo tasot apoptoottisten indeksit eivät olleet merkittävästi erilaiset, että hyvänlaatuinen (PNT2), vanhempien (PC-3M) tai pudotus soluja. Sen jälkeen haasteeseen kiinilla mitään muutosta ei havaittu PC-3M

vanhempien tai äänen-

RPL19

-PC-3M

klooni ST-3-soluissa. Vaikka apoptoosin lisääntyminen havaittiin hyvänlaatuinen soluissa ja sekoituskoodin-transfektoituja soluja, nämä eivät ole merkittäviä. D. Kasvua kasvainsolujen

in-vivo

jonka arvioitu määrä paljasti erittäin merkitsevä (

p

0,005) suppression kasvua kahden stabiilin transfektantin klooneista, verrattuna PC -3M

vanhempien ja PC-3M

ryntäily soluja. Kasvua PNT2-soluissa ei ole mukana, koska olemme jo osoittaneet, [33] kasvainten kasvua on harvoin, erityisesti yli aikajänteellä näissä kokeissa. E. analyysi kasvaimen painot

in vivo

vahvisti kloonien ST-1 ja ST-3 tuottaa kasvaimia merkittävästi (

p

0,005) pienempi kuin PC-3M

vanhempien tai si-PC-3M

ryntäily soluja. F. immunohistokemiallinen analyysi kasvaimia kasvaa ksenografteissa

in vivo

tukenut mRNA data (kuvio 1 B), joka taas alkuperäisen PC-3M

vanhempien (i) ja si-PC-3M

ryntäily (ii) solut ilmensivät RPL19 proteiinia korkealla tasolla. Äänen-

RPL19

-PC-3M

klooni ST-3-solut (iii) ilmaistuna RPL19 heterogeenisesti ja vain hyvin matalalla tasolla. (Suurennus x 350)

tuumorigeenisyyteen ja RPL19 proteiinin ilmentymiseen

in vivo

Kaikissa ryhmissä eläinten kasvaimia kävi ilmi päivänä 2 seuraava siirrostus (taulukko 4). Kuitenkin enemmän ilmestyi nopeammin PC-3M

vanhempien (3/8) ja PC-3M

scramble (4/8) ryhmät. Kahdessa transfektantin klooni ryhmää, kasvaimet kesti kauemmin näkyviin (2/8 kasvaimia kantavat eläimet äänen-

RPL19-

PC-3M

klooni ST-3-soluissa ja 1/8 kasvaimia kantavista eläimistä äänen-

RPL19-

PC-3M

klooni # 2 solut). Aluksi kaikki kasvaimet olivat samankokoisia. 7 päivän jälkeen PC-3M

vanhempien ja PC-3M

scramble ryhmää kehitti suurempia kasvaimia kuin kaksi transfektantissa ryhmää (kuvio 2D). Ruumiinavauksessa 15 päivää inokulaation jälkeen, merkitsevä ero (

p

0,001) näkyi keskiarvopainot ohjaus- ja

RPL19-

taintumisen kasvaimet (kuvio 2E). PC-3M

vanhempien näytteillä monenlaisia ​​kasvaimen painoa, yksi eläin tuottaa kasvain 810 mg 15 päivässä, suurin sallima Project License. Toisaalta, toinen eläin kehitetty kasvain vain 10 mg. Vastaava ilmiö tapahtui sisällä PC-3M

scramble ryhmä kasvaimia vaihtelevat 10-140 mg. Lopullinen painot PC-3M

vanhempien kasvaimet eivät olleet merkittävästi erilaiset kuin PC-3M

scramble ryhmä (U-testi,

p

0,05). Siten si-RNA tukahduttaminen

RPL19

vaikuttaa koko kasvaimia syntyy

in vivo

(

p

0,05), mutta ei niiden latenssi. Ei micrometastases havaittu ruumiinavauksen tai histopatologiseen tarkastelu irrotettiin kudosten.

immunohistokemia tuumoriksenograftien havaittu voimakasta ilmentymistä RPL19 proteiinin sekä PC-3M

vanhempien ja si-PC- 3M

scramble soluja (kuvio 2F). Knockdown solulinjat äänen-

RPL19-

PC-3M

klooni ST-3 ja samanai-

RPL19-

PC-3M

klooni ST-1 näytteillä suhteellisen vähän värjäytymistä, mikä osoittaa, edelleen tukahduttaminen

RPL19

geenin useimmissa kasvainsoluissa. Detection of pieniä määriä RPL19 proteiinin tietyissä kasvainsoluissa katsotaan edustavan klonaalisia vaihtelun tuloksena edelleen matalan tason geenin ilmentymistä, sen sijaan, että sen koko inhibition, jonka osoittaa qPCR solut

in-vitro

ja tulokset Western blotting tutkimuksissa. Vaikka mRNA: n ja vastaavien proteiinia eturauhasen epiteelissä eivät aina yhdenmukaisia ​​[39], näennäinen eroavuudet

in vitro

ja

in vivo

tutkimukset voivat johtua

vuonna -vivo

vaikutukset ympäröivän tukikudosten matriisi vaikuttaa kasvainsolujen tarttumista tai muita vaikutuksia, mukaan lukien kasvutekijät moduloimiseksi yksittäisen matalan tason geenin ilmentymisen [40] – [42].

Vertailuesimerkki geenin ilmentymisen profilointi äänen- RPL19-PC-3M

klooni ST-3-solujen

genominlaajuiset ekspressioprofiileja saatu DNA oligonukleotidigeenisirumenetelmää (modifioimaton Agilent Human Genome 44K) käytettiin geenien tunnistamiseen moduloitu seuraavat

RPL19

knockdown. Vertailu geenien ilmaiseman PC-3M

vanhempien ja PC-3M

scramble solulinjoja eivät paljastaneet tilastollisesti merkitseviä eroja (

p

≥0.05), mikä osoittaa, että transfektiotekniikasta ollut vastuussa tuntuvaa off-tavoite vaikutuksia, joita bias kokeelliset tiedot. Kaikkiaan 916 DNA-sekvenssit, jotka edustavat 768 geenit, tunnistettiin ilmentyvät eri (

p

≤0.05, Benjamini ja Hochberg useita testaus korjausta). Näistä 404 oli parannettu ja 364 alassäädetty. Sisällä että tietojoukko, 184 erilaista geeniä moduloitu ainakin nelinkertaiseksi, 62 ollessa säädelty ja 122 alassäädetty. Top 50 differentiaalisesti ilmentyvien geenien Näissä kahdessa luokassa on esitetty yhteenvetona olevat tiedot taulukoissa S1 ja S2 sekä graafisesti (kuvio 3). Expression data johdettu paneelit todensi qPCR riippumattoman mitattavissa olevalla tavalla suuruutta ja suuntaa muutosta yksittäisten geenien. Se havainto, että vain 768-geenit moduloidaan seuraavasti

RPL19

pudotus, jossa mRNA monenlaisia ​​proteiineja joko säilyy tai korotetussa, viittaa siihen, että ribosomaalinen proteiini RPL19 differentiaalisesti mukana proteiinisynteesiä sijaan vaikuttavat kaikki solun proteiinisynteesiä ei-spesifisellä tavalla.

Heat kartta top 50 geenien säädelty ja top50 geenien alassäädetty seuraava lauseke-profilointi mRNA ilmaiseman äänen-

RPL19

-PC- 3M

klooni ST-3-soluissa verrattuna PC-3M

emosoluilta PC-3M

ryntäily solujen yhteinen nimittäjä. Hierarkkinen klusterointi näkyy. Vihreä tarkoittaa geenejä yli-ilmentynyt näytteessä verrattuna muokkaamaan-transfektoiduissa soluissa. Punainen osoittaa geenit alassäädetty näytteessä verrattuna muokkaamaan-transfektoiduissa soluissa. Vastaavat numeeriset tiedot esitetään tukeminen Tiedot taulukoissa S1 S2.

Functional rikastamiseen analyysi tunnistaa noin 20 Gene ontologia (GO) biologisen prosessin kannalta ja kolme molekyylien toiminta ehdot (tukeminen Information taulukko S3) olisi merkitsevästi yhteydessä (

p

0,001) kanssa taintumisen (

p

0,001). Lisäksi 13 Kegg polkuja oli huomattavasti yliedustettuina geenien differentiaalisesti ilmaisi välillä

RPL19-

PC-3M

klooni ST-3 ja PC-3M

scramble (tukeminen Information taulukko S4). Kekseliäisyyttä polku analyysiä käytettiin tunnistamaan merkittäviä biologisia verkkojen ja reittejä, joissa geenit ilmaistaan ​​differentiaalisesti seurauksena

PRKC-ζ

knockdown olivat mukana. Viisi sijoittui toisiinsa väyliä (tukeminen Information taulukko S5) ja kolme Gene ontologia (GO) molekyyli- funktio ehdot (tukeminen Information taulukko S6) ovat erittäin merkittäviä (

p

≤10

-27) suhteen geeneihin differentiaalisesti ilmaisi jälkeen

RPL19

knockdown.

ribosomaalisen proteiinin geenejä.

hypoteesi, että siRNA aiheuttama säätely alaspäin

RPL19

voidaan kompensoida moduloimalla muiden ribosomaalisen proteiinien on osoitettu arvioimalla suhteellisen ilmentymisen mitokondrion suuri ribosomaalinen proteiini geenisekvenssien (n = 71) ja sytoplasminen suuri ribosomaalinen proteiini geenisekvenssien (n = 136) ja selvittää, onko säätely ylöspäin geenin jo ilmaistuna tai neoexpression aikaisemmin hiljainen ribosomaalisen proteiinin geeni oli tapahtunut. Jälkimmäisistä kohortin 44 geenit koodata tunnetun RP 7 oli RP-kaltainen ja 5 olivat RP pseudogeenien. Sekvenssien lukumäärän, jotka edustavat kunkin geenin vaihteli yhdestä (19 geenit) ja 14 (

RPL21

). RPL19 tunnistettiin yhden sekvenssin. Mukaan SCOP (Rakenteelliset luokittelu Proteiinit, viimeisin julkaisu 9

th marraskuussa 2010 https://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop) RPL19 kuuluu proteiinin superperheen kääntämisen proteiineja sisältävä SH3 kaltainen tynnyri rakenteellista aluetta sisällä luokkaan kuuluvat kaikki beeta proteiineja. Perhe sisältää myös ribosomaalisen proteiineja RPL14e, RPL21e ja RPL24p ja C-terminaalisen domeenin RPL2 (https://supfam.org/SUPERFAMILY/cgi-bin/scop.cgi?sunid=50104). Vaihtoehtoisesti RPL19 proteiini voitaisiin korvata RPL29 tai RPL39e, joka rakenteellisesti samanlaisia ​​jäseniä α-kierteisen ryhmä pallomainen RP laajennetulla hännät pystyvät sitoutumaan mRNA [43]. Vaikka vaihtelut tapahtui ekspressiotasot yksittäisten RPL geenisekvenssien seuraavat

RPL19

pudotus, nämä eivät ole merkittäviä, mukaan lukien ribosomaalisen proteiinin geenin

RPL23A

myös sijaitsee kromosomissa 17q11.2. Vain ilmaus mitokondrioiden

MRPL42

merkittävästi alassäädetty (

p

0,05). O lisääntynyt ilmentyminen tahansa RP-geenin havaittiin. Siten esto

RPL19

menetys RPL19 proteiinia ei kompensoi eri RP-geenin. Toisaalta vaikutukset vähentää

RPL19

voitaisiin välittää koodauksen riippumaton geenin toimintaan tai sen pseudogeenin mRNA: iden [44].

glykosyylitransferaasi geenejä.

transformaatio epiteelisolujen hyvälaatuisesta pahanlaatuiseen fenotyyppiin liittyy usein rakenteellisia muutoksia oligosakkaridi verkkotunnusten solujen glykoproteiinien ja glykolipidien [45]. Erityisesti ilmaus sialyloidun ja

β-1,6

haarautunut N-sidotut oligosakkaridit vaaditaan syöpäsolujen invaasiota ja etäpesäkkeiden [46]. Keskeinen entsyymi tässä prosessissa on mannosyyli (

α-1,6

-) – glykoproteiinin

β-1,6

-N-asetyyli-glukosaminyylitransferaasia koodaa geenin

MGAT5

ja säätelee signalointireitin RAS-RAF-MAPK. Yhdessä

PTEN

,

MGAT5

säätelee kalvon dynamiikan PI3K /Akt signalointi edistää invasiivisia pahanlaatuinen fenotyyppi [47]. Siinä tapauksessa, että maligniteetti on lyhentynyt manipulointi solun fenotyypin, muutokset solun pinnalla oligosakkaridirakenteiden oletetaan esiintyä. Tällaiset muutokset, välittyy glykosyylitransferaaseja voidaan osoittaa muuttunutta ekspressiota vastaavien geenien. Niistä 768 geenit differentiaalisesti ilmaisi, vain kaksi glykosyylitransferaasigeenien vaikutti merkittävästi seuraavan

RPL19

taintumisen (tukeminen Information taulukko S7). Toisin kuin spektri glykosyylitransferaasien moduloidun seuraavista si-RNA knockdovvn

PRKC-ζ

PC-3M soluihin [33], ei muutosta näkyi silayl- tai fukosyylitransferaasia geenejä. Kuitenkin 4-kertainen pieneneminen tunnistettiin taso

MGAT4A

(

p

0,05), joka koodaa entsyymiä mannosyylitähteiden (

α-1,3 -) –

glykoproteiinin

β-1,4

N-asetyyliglukosaminyylitransferaasi ja on mukana välittämässä glykosylaatiota koodaamien proteiinien

SLC43A3

(proteoglykaanin 2), SLC14A1 (urea transporter) ja

SLC8A1

(natrium /kalsium lämmönvaihdin), ohjaten niiden solun pinnan ilmentyminen. Itse asiassa kaikki kolme jälkimmäinen geenit moduloitu seuraavat

RPL19

knockdown. Vastaavasti 2~3-kertainen tunnistettiin taso

GALNACT-2

(

p

0,05), joka koodaa entsyymiä kondroitiinisulfaatti N-acetylgalactosaminyltransferase 2 ja siirrot N- asetyyligalaktosamiini (GalNAc-) UDP-GalNAc [48] ja kondroitiinisulfaatti, kondroitiinisulfaatti, edullisesti kompleksin oligosacfocharides sisältävät

p1: n → 4

sidoksia [49], kuten syntyy

MGAT4A

.

ionikanavat ja niihin liittyviä geenejä.

pahanlaatuinen fenotyyppi eturauhasen epiteelisolujen voidaan moduloida ero ilmentyminen ionikanavien [50] – [52]. Tutkimuksia tämän laboratorion [52] ja muualla [53] ovat osoittaneet toiminnallinen suhde jännitteen-ionikanavien ja invasiivisen fenotyypin eturauhassyöpäsolujen [50]. Kuulustelu ilmaisun paneelit paljasti useita ionikanavia ja jotkut siihen liittyvät geenit moduloida seuraaviin

RPL19

taintumisen (tukeminen Information taulukko S3). Kaliumkanavia osoitti sekoitettu vastausta. Jännite säätelemiin K

+ kanava alfa- ja beeta-alayksikköjen (

KCNQ2

ja

KCNAB2

) on alassäädetty 3,5- ja 2,25-kertaiseksi (

p

0,05 molemmille). Sisäänpäin-tasasuuntaaja K

+ -kanavia (

KCNJ6

ja

KCNJ12

) osoitti ristiriitaisempaa, joka sääteli 5,5-kertaiseksi ja alassäädetty 2,5-kertaisesti (

p

0,01 molemmille). Kaksi jänniteherkkiin Na

+ kanava geenejä (

SCN3A

ja

SCN9A

) olivat molemmat säädelty, 9-kertainen (

p

0,005) ja 2,3-kertaiseksi (

p

0,05), tässä järjestyksessä. Lopulta kaksi jänniteherkkiin CI

– kanavaa /CI

– H

+ antiport kuljettajat (

CLCN4

ja

CLCN5

) olivat molemmat sääteli, 2,1 ja 1,8-kertaisesti, vastaavasti (

p

0,05 molemmille).

Muut geenejä ja niihin liittyviä verkkoja.

Mikään solusyklin kontrolli geenejä, mukaan lukien 31 me aikaisemmin osoittivat olevan yhteydessä suurella todennäköisyydellä eturauhassyövän etenemisen [54] oli moduloitu ilmaisussaan seuraavissa knockdown tai

RPL19

. Vastaavasti mikään geenien tunnustettu välittävän apoptoosia moduloitu transfektanteista. Niistä 19 sekvenssit kattaa kaspaasi perheen apoptoosin geenien,

CASP1

oli alassäädetty -7-kertainen (

p

0,005) seuraavat

RPL19

knockdown. Ilmaisu muiden perheenjäsenten ei muutettu. Tueksi array data, Western blotting vahvisti, että pilkottu caspases -3 ja -9 ei ilmaista joko PC-3M

vanhempien tai äänen-

RPL19-

PC-3M

klooni ST-3 transfektanttisoluilla. Nämä havainnot tukevat ehdotusta, että muuttamalla ilmaus

RPL19

ei vaikuta solu- syklin tai apoptoottisia reittejä. Käänteisesti, suurten vaikuttavia reittejä seuraavat

RPL19

pudotus liittyy verkkoihin säätelevien geenien homeostaasin ja vuorovaikutusta pahanlaatuisten solujen ja niiden ympäristön (kuvio 4). Esimerkiksi ilmaus regulaattorin geenin

AGR2

tunnistimme olevan koholla eturauhassyövissä aggressiivinen fenotyypin [55] oli alassäädetty ~11-kertainen (

p

0,02) seuraavat

RPL19

knockdown. Tuotteensa Tämän geenin sitoutuu reseptoriin ErbB3 ja säätelee forkhead DNA: ta sitovien transkription säätävät Foxa1 ja Foxa2. Western blotting vahvisti poistamista tämän proteiinin taintumisen soluissa (kuvio 5), joka tukee array data (tukeminen Information taulukot S1 S2). Sen sijaan, HOXB13 koodaa transkriptiotekijä, joka kuuluu homeobox-geenin perhe, joka osoitimme olla kudosspesifisiä biomarkkeri hyvän- ja pahanlaatuisten eturauhasen epiteeli [56] on kohonnut ~ 3-kertainen (

p

0,001 ) seuraava

RPL19

knockdown.

analyysi geenien moduloidun seuraavista

RPL19

pudotus tunnistettu viisi toisiinsa väyliä pääasiallisesti vaikuttaa (tukeminen Information taulukko S5). Neljä näistä ovat geenejä, jotka koodaavat MMP-entsyymien (A); ICAM1-integriini kompleksi (B); NFKB kompleksi (C) ja PI3K asetuksen (D). Tämä analyysi vahvisti useita geenejä moduloidaan alassäädetty ilmentymä

RPL19

liitettävä yhteen, korostaen lukuisia väyliä cross-talk välillä ilmeisesti erillisiä biologisia prosesseja.

Näissä tutkimuksissa vertailu tehtiin äänen-

PRKC-ζ

-PC-3M

T1-6 [33] ja samanai-

FABP5

-PC-3M

klooni 3 [62] RNAi-pudotus solujen vahvistaa, että muutokset proteiinin tasot olivat ominaisia ​​

RPL19

knockdown eikä osa yleistä vastausta geeni esto käyttämällä si-RNA. Värjäyksen jälkeen ensisijainen vasta, kalvot uudelleen värjättiin beeta-aktiini. Intensiteetti bändi käytettiin normalisoimaan yksittäisen proteiinin tasoja. A. RPL19: Seurataan

RPL19

Knockdown, tasoja alennetaan -5% näistä PC-3M

vanhempien soluissa, kun taas tasot pidettiin äänen-

PRKC-ζ-

PC -3M

T1-6 ja samanai-

FABP5

-PC-3M

klooni 3 soluja. B. S11A4: Tasot pidettiin kaikissa solulinjojen, ei vaikuttanut

RPL19

knockdown.