Krooninen sairaus

tiivistelmä

Munasarjasyöpä G-proteiiniin kytketty reseptori 1 (OGR1) on osoitettu olevan protonin tunnistava reseptorin

in vitro

. Olemme osoittaneet, että OGR1 toimii kasvaimen etäpesäke vaimennin geeni, kun se yli-ilmentyy ihmisen eturauhasen syöpäsolujen

in vivo

. Tutkia fysiologiset toiminnot OGR1, me syntyy ehdollinen OGR1 hiirissä homologisella rekombinaatiolla. OGR1 hiirillä olivat elinkelpoisia ja kun brutto-tarkastus vaikuttivat normaaleilta. Yhdenmukainen

in vitro

tutkimukset osoittavat, että OGR1 on mukana osteoklastigeneesin, vähensi osteoklasteja havaittiin OGR1 hiirillä. PH-riippuvaisen osteoklastien eloonjäämisen vaikutus havaittiin myös. Kuitenkin yleinen poikkeavuus luut näistä eläimistä ei havaittu. Lisäksi, melanoomasolulinjat tuumorigeneesin estyi merkittävästi OGR1 hiirissä. OGR1 hiirillä seka taustalla tuotti merkittävästi vähemmän peritoneaalimakrofageille kun stimuloidaan tioglykolaattia. Nämä makrofagit osoittivat myös muuttuneessa solunulkoisen

signaali

-regulated kinaasien (ERK) aktivoituminen ja typpioksidin (NO) tuotantoa vastauksena lipopolysakkaridi. OGR1 riippuvaiset pH vasteet arvioitiin cAMP-tuotantoa ja solujen eloonjäämistä makrofageissa tai ruskean rasvan soluja ei havaittu, mikä johtuu oletettavasti on muita protonin tunnistava reseptoreihin näissä soluissa. Tuloksemme osoittavat, että OGR1 rooli osteoklastigeneesin ei ole tarpeeksi vahva vaikuttaa yleiseen luuston kehitykseen ja sen roolia kasvainten synnyssä optio lisätutkimuksia. Hiiret syntyy voidaan mahdollisesti käyttää useita taudin malleja, kuten syövät tai osteoklastien liittyviä sairauksia.

Citation: Li H, Wang D, Singh LS, Berk M, Tan H, Zhao Z, et al. (2009) poikkeavuudet osteoklastogeneesiä ja Laskua tuumorigeneesiä hiirissä, joilta puuttuu munasarjasyöpä G proteiini-reseptorin 1. PLoS ONE 4 (5): e5705. doi: 10,1371 /journal.pone.0005705

Editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Kanada

vastaanotettu: 02 huhtikuu 2009; Hyväksytty: 05 toukokuu 2009; Julkaistu: toukokuu 28, 2009

Copyright: © 2009 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: RO1 HL68804 , RO1-CA89228, ja Ralph C. Wilson, Sr ja Ralph C. Wilson, Jr. Medical Research Foundation avustusta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Olemme aikaisemmin kloonattu OGR1 peräisin munasarjasyövän solulinja HEI [1]. Viime aikoina olemme osoittaneet OGR1 on uusi etäpesäke vaimennin geeni eturauhassyövän [2]. OGR1 ja sen alaperheeseen G-proteiinikytkettyjen reseptorien (GPCR: t), GPR4, G2A ja T-solujen kuoleman, joka liittyy geenin 8 (TDAG8), on osoitettu olevan protoni-tunnistava kyky [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Monet näistä protonin tunnistava toiminnan on havaittu soluissa, jotka yli-ilmentävät yhtä tai useampaa näistä GPCR: ien. Viime aikoina, protoni tunnistava toiminta on havaittu solujen GPR4- ja TDAG8-, mutta ei G2A-hiirissä [8], [10], [11].

Hiiret puutteellinen G2A, TDAG8, tai GPR4 ovat kertyneet. Nämä Knockout (KO) hiiret ovat elinkelpoisia ja näytteille eri fenotyyppejä. G2A KO hiiret osoittavat normaaliin kulkuun T- ja B-solujen linjaa erottautumistaan ​​nuorena aikuisena. Kuitenkin ikäinen G2A puutteesta eläimiä ( 1 vuosi) kehittää toissijainen imujärjestelmäelinten laajentumiseen liittyy epänormaali laajentuminen sekä T- ja B-lymfosyytit [12]. Lisäksi, muita fenotyyppejä, jotka liittyvät luuytimen peräisin olevia soluja, mukaan lukien monosyytit /endoteelisolut ja makrofagit, samoin kuin maksan soluissa on raportoitu [8], [13], [14], [15], [16], [17]. TDAG8 on kopiointia ajatellen up-säännellään glukokortikoidit (GC) ja sekaantuneet yli-ilmentyminen tutkimukset psychosine estoa sytokineesin [18], [19]. Vaikka TDAG8 ilmaisu muistuttaa dynaamisen asetuksessa kuvattu tunnettujen modulaattorien GC-aiheuttaman apoptoosin aikana tymosyyttiantigeeneista kehitystä, se on tarpeeton psychosine aiheuttama muodostumista monitumaisiksi soluja. Lisäksi tymosyyttien vuonna TDAG8 KO hiirillä osoittavat normaalia apoptoosin seuraavia

in vivo

ja

in vitro

GC hoito [11]. Lisäksi hapan solunulkoinen pH ei differentiaalisesti moduloi alttius TDAG8 villityypin (WT) ja KO tymosyyttien GC-indusoidun apoptoosin [11]. Kuitenkin, tymosyyteissä ja pernasoluja irrotetut reseptorista-hiirillä, TDAG8, mutta ei G2A, on havaittu olevan kriittinen pH-riippuvaisen cAMP-tuotantoa [8]. Vaikka tämä käsikirjoitus oli valmisteilla, Mogi

et ai

ovat osoittaneet, että TDAG8, mutta ei OGR1 on mukana pH-indusoidun estävä vaikutus tuumorinekroositekijä-alfa (TNF-α) tuotantoa makrofageissa [20]. GPR4 ilmentyy useimmissa endoteelisoluissa ja välittää sphingosylphosphorylcholine (SPC) aiheuttama angiogeeninen toiminta (11). GPR4 puutos johtaa osittain tunkeutunut verisuonipoikkeavuudet kehittämisen aikana ja että tämä reseptori toimii verisuonten pH tunnistava käytettäessä

ex vivo

aortan rengas määritys [10].

OGR1 on todettu vahvasti säädelty geeni aikana osteoklastigeneesia

CSF1

tl /CSF1

tl

rottia (CSF-puutosta rotta) käsiteltiin makrofagipesäkkeitä stimuloiva tekijä (M-CSF tai CSF-1) ja reseptorin aktivaattori tumatekijä κ B ligandia (RANKL, tai TRANCE, TNFSF11) aiheuttaman osteoklastien

in vitro

[21]. Mahdollinen funktionaalinen osallistuminen OGR1 on osteoklastigeneesin on osoitettu käyttäen anti-OGR1-vasta-aineen ja estämällä OGR1 pieniä estävän RNA: n (siRNA) [21]. Lisäksi systeeminen asidoosi on haitallinen vaikutus luustoon ja paikallinen asidoosi liittyy luun tuhoutumisen tulehdus- ja neoplastiset sairaudet. Survival ja kalsium signalointi osteoklastien merkittävästi parantaa happamoitumisen väliaineen käytettäessä OGR1-depedent tavalla [22]. Toiminnallinen osallistuminen OGR1 on pääosin tarkasteltu joko OGR1 vasta-ainetta, tai epäspesifinen OGR1 antagonisti Cu

2+ tai siRNA vastaan ​​OGR1. Koska kaikki nämä reagenssit kaikki mahdollisesti voi olla off-tavoite vaikutusten tarkempi järjestelmää tarvitaan arvioimaan fysiologisia rooleja OGR1.

mesenkymaaliset kantasolut (MSC: t) ja hematopoieettiset kantasolut luuytimestä pystyvät erilaistumaan osaksi monosyytit, osteoklastien osteoblastien ja rasvasolut muun solun fenotyyppejä. Nämä solutyypit ovat tärkeitä monille biologisia toimintoja. Normaaleissa fysiologisissa olosuhteissa erilaistumisprosesseihin niitä valvotaan. Epätasapainossa erilaistumista ja /tai aktivoinnin prosesseja johtaa patologisia tiloja ja sairauksia.

verestä monosyytit, makrofagit suhteellisen pitkäikäisen phagocytotic solujen nisäkkäiden kudoksissa. Makrofagit ovat mukana erilaisissa prosesseissa kuten taudinaiheuttajien tuhoutuminen, tulehdus, kudoksen korjaukseen ja remodeling. Niillä on erittäin muovinen fenotyyppi ja niiden toiminnallinen polarisaatio määräytyy sytokiinien ja tekijät tavataan paikallisia mikroympäristöihin [23]. Yksi toiminnoista makrofagien on tarjota puolustusmekanismi kasvainsoluja vastaan. Kuitenkin kasvaimeen liittyviä makrofagit (TAM), jotka edustavat suurta tulehduksellinen komponentti strooman monet kiinteiden kasvainten, liittyy kasvaimen etenemiseen ja etäpesäkkeiden [23].

ruskea ja valkoinen rasvakudoksesta (BAT ja WAT ) ovat keskeisiä toimijoita lihavuutta ja siihen liittyviä terveysongelmia, kuten tyypin 2 diabetekseen sekä sydän- ja verisuonitauteihin. BAT-riippuvaisten ei-vilunväristykset lämmöntuotanto merkittävästi vaikuttaa kehon energiatasapainon. Sen lisäksi energian varastointi-toiminto, rasvakudokseen erittävät myös useita hormoneja ja sytokiinejä, ja ovat mukana valvontaan kehon aineenvaihduntaa ja energiatase useisiin kohtiin [24], [25]. BAT on erityisen tärkeää vastasyntyneille, pieniä nisäkkäitä (kuten hiiret) kylmässä ympäristössä, ja eläimet, jotka lepotilaan, koska sen tärkein fysiologinen tehtävä on purkaa varastoidun energian lämpönä. Ihmislapsilla BAT käsittää korkeintaan 5% koko kehon painosta, joka sitten vähenee iän myötä lähes olematon tasoa aikuisuuteen.

Koko eläimen elämää, luukudoksen on jatkuvassa liikevaihdon seurauksena yhdistelmä peräkkäisen poiston luukudoksen osteoklastit ja uuden luun laskeumia osteoblastien. Osteoklastien luuta resorboivien Monitumaisia ​​giant soluja, jotka ovat peräisin hematopoieettisten mononukleaaristen solujen esiasteiden valvonnassa sekä M-CSF: n ja RANKL: n [21]. Nämä solut tukea imevää ja poistamalla ylimääräinen luukudoksia remontin kasvavissa luissa tai vaurioitunut luun korjaus murtumia.

Olemme luoneet ja ominaista OGR1-puutoshiirissä käsitellä useita kriittisiä kysymyksiä: 1) fysiologiasta OGR1 hiirillä; 2) roolia OGR1 vuonna osteoklastigeneesin; 3) OGR1 riippuvainen pH vastata käyttämällä OGR1-vajaiden solujen; ja 4) toimintojen OGR1 muissa luun biologisissa prosesseissa, kun hiirille eksogeenisten ärsykkeet, kuten kasvainsoluja. Olemme havainneet, että yhdenmukaisuus julkaistujen tietojen kanssa, OGR1 todennäköisesti mukana osteoklastigeneesin. Meidän käsissämme, havaitsimme vähentää osteoklastien, jotka ovat peräisin luuytimen soluista OGR1 hiirillä. Heikko pH-riippuvaisen osteoklastien eloonjäämisen vaikutus havaittiin myös. Kuitenkin yleinen luusto hiirillä ei ollut vaikutusta, ja merkittävä pH-säännelty ja OGR1 riippuvainen biologinen vaikutus ei ole yleensä osoituksena OGR1 ilmentäviä soluja [mukaan lukien makrofagit ja ruskea rasvakudos peräisin olevat solut (BADCs)], mikä viittaa siihen, tarpeeton vaikutus muiden OGR1 subfamily GPCR:

in vivo

. Lisäksi vaikutus ja osallistuminen isäntäsolun OGR1 kasvainten synnyssä melanoomasolujen on erittäin kiinnostava ja optio lisätutkimuksia. Kaksi ylimääräistä poikkeavuudet liittyvät peritoneaalimakrofageille ja BAT havaittiin hiiren taustalla riippuvaisella tavalla, mikä viittaa osallistuminen muokkaamalla geenien eri hiirtä taustat.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

Sphingosylphosphorylcholine (SPC) ja lysofosfatidyylikoliinin (LPC) olivat Aventi Polar Lipids (Birmingham, AL) tai Toronto Research Chemicals (Toronto, Kanada). M-CSF: n ja RANKL olivat Peprotech (Rocky Hill, NJ). Anti-FLAG M2, H

2O

2, tioglykolaattia (TG), lipopolysacchride (LPS), lateksihelmiä, natriumnitriittiä, Griessin reagenssia, tartraatti-resistentti hapan fosfataasi (TRAP) värjäysreagensseja ja Massonin Trichrome-värjäys reagenssit olivat Sigma (St. Louis, MO). Anti-fosfo-ERK, anti-ERK, anti-fosfo-p38, anti-p38 olivat Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Vuohen anti-iNOS, TRITC- anti-kani olivat BD (San Jose, CA). Anti-F4 /80, anti-PCNA, kani Otsonin arginase ja anti-COX-2 (COX-2) oli Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Anti-CD31 oli peräisin TKI (Fitzgerald, Concord, USA). Sitraattipuskuria, universaali hevosen seerumia, VECTOR NovaRED, ja hematoksyliinillä QS olivat VECTOR (Burlingame, CA).

Generation of OGR1 Knockout (KO) hiiriä

OGR1 kohdistaminen konstruktio on luotu läpi sopia AnTeq siirtogeenisiä hiiriä (Australia). Lyhyesti A 13,2 kb: n BamHI genominen fragmentti, joka sisälsi OGR1 geenin alakloonattiin bakteeri-keinotekoinen kromosomi (BAC), klooni (ystävällinen lahja Dr. Owen Witte laboratoriosta UCLA) osaksi pBS (KS) II vektori (plasmidi # 182) . 5′-homologia-alueella OGR1-lokuksen PCR-monistettiin käyttämällä OGR1 alukkeita # 1 ja # 2 ja plasmidi # 182 templaattina. Primer # 2 luonut uuden Nco1 sivusto alussa OGR1 (vaihdettava ensimmäisen ATG: stä CTC). PCR-fragmentti subkloonattiin pCR2.1.TOPO (Invitrogen), jolloin saatiin plasmidi # 183. Eksonin 1 OGR1 PCR-monistettiin käyttäen alukkeita # 7 ja # 8, kun taas aluke # 7 käyttöön Xbal edelleen kloonausta vaiheet. PCR-fragmentti subkloonattiin pCR2.1.TOPO saaden plasmidi # 188. Tämä täydellinen OGR1 sekvenssi varmistettiin sekvensoimalla analyysejä. 6,2 kb: n genominen fragmentti, 3’alueella OGR1 lokuksen alikloonattiin plasmidiin # 182, jolloin saatiin plasmidi # 189. A 1.4 kb Floxed-neo-kasetti kloonattiin sitten plasmidiin # 189 linearisoitiin Stul saaden plasmidi # 208. Stul leikkaa 5’pään 3 ’Hind III OGR1 alueella. 3xFLAG alue, joka koodaa kolmea vierekkäistä FLAG epitooppeja PCR-monistettiin plasmidista p3xFLAG CMV-19 käyttäen alukkeita # 3 ja # 4, ja viimeksi mainittu aluke sisälsi Xhol edelleen kloonausta. 353 bp: n PCR-tuote subkloonattiin pCR2.1.TOPO (plasmidi # 185). 400 emäsparin Ken ja XhoI-fragmentti # 185 edelleen subkloonattiin pBS (KS) II saada plasmidista # 196. 2,6 kb Kpn-Ncol-fragmentti (5 ’homoloy alue) plasmidista # 183 subkloonattiin sitten plasmidiin # 196 edessä 3 x FLAG alue (plasmidi # 199). LoxP on 5’-alue eksoni 1 kloonattiin käyttäen hehkutettu alukkeita # 5 ja # 6, ja ligatoitiin plasmidiin # 199 Xho I ja Xba I. Tämä synnytti plasmidin # 204, joka sekvensoitiin vahvistamaan eheyden 3xFLAG-LoxP-eksonin 1 risteyksessä. 1,8 kb: n Xba I-Sac I-fragmentin, mukaan lukien OGR1 eksonin 1 ja ”3’alue plasmidista # 188 subkloonattiin plasmidiin # 203 tuottaa plasmidin # 209. 7,7 kb: n Hind III-fragmentti, plasmidin # 208 kätkeminen neo-kasetin reunustaa loxP ja 3 ’OGR1 homologia-alueen subkloonattiin plasmidiin # 209 antaa OGR1 kohdistaminen vektori # 218. Toimivuus loxP vahvistettiin käytettäessä

E. coli

-kanta BNN123 konstitutiivisesti ilmentävien yhdistelmä-Cre. Sekvenssit käytetyt alukkeet olivat:

# 1: 5 ’GGT ACC GGA GGA CGT GAG CAA CAA CT

# 2: 5′ ATG TTC CCC ATG GTT GGG CCA GAA

# 3: 5 ’TCC TAC TTG GCA GTA CAT CT

# 4: 5′ ATC TCG AGC TTG TAC TCG TCA TCC TTG

# 5: 5 ’TCG AGA TAA CTT CGT ATA GCA TAC ATT ATA CGA AGT TAT

# 6: 5 ’CTA GAT AAC TTC GTA TAA TGT ATG CTA TAC GAA GTT ATC

# 7: 5′ TCT AGA GGG AAC ATC ACT ACA GAA AAC TC

# 8: 5 ’AGG AAC TTG GCT AAG GAC

OGR1 kohdistaminen konstruktit ruiskutettiin ES solut Siirtogeeniset Mouse Core Facility Case Western Research University (Cleveland, OH). Kimeerisiä hiiriä, joissa sukusolulinjaan FLAG-merkitty OGR1 geenejä reunustaa kaksi loxP luotiin. Kautta jalostukseen C57 /BL6-hiirissä, näitä hiiriä käytettiin tuottamaan heterotsygoottinen hiirille, joilla yksi kopio FLAG-merkitty OGR1. Myöhemmät jalostus heterotsygoottista OGR1

fl /+ hiirillä syntyy homotsygoottisia OGR1

fl /fl hiirillä. Kaikki jälkeläiset päässä jalostukseen heterotsygoottista OGR1

fl /+ hiirillä genotyypattiin DNA analyysi hännän leikkeitä. Aluksi molemmat Southern blot ja PCR analyysit tehtiin vahvista genotyypin. Myöhemmät -genotyypitys pääosin suoritettiin käyttäen PCR-analyysejä. Homotsygoottinen hiiriä OGR1 Floxed (OGR1

fl /fl) kasvatettiin iturataa Cre hiirillä Zp-3 (transgeeninen hiiri linjan inaktivoimiseksi loxP-reunustavat kohdegeenien erityisesti naisten iturataan [26]; Jackson Labs , Bar Harbor, Maine). Lisäksi ne kasvatettiin Prm (Protamine-Cre, siirtogeeninen hiiri, linja inaktivoimiseksi loxP-reunustavat kohdegeenien, erityisesti miehen ituradan hiirillä [27], ystävällisesti toimitti Dr. Guangbin Luo, Case Western Reserve University ) tuottaa OGR1

+/- Cre hiiriä, jotka oli kasvatettu edelleen tuottaa OGR1

– /- (KO tai puutteellisia) hiirillä. OGR1

fl /fl hiiret nimettiin OGR1 FL. OGR1

– /- hiiret sekoitettu taustalla on takaisinristeytettiin C57 /BL6 10 sukupolven ajan OGR1

+ /+ 10

th sukupolven hiiriä nimettiin OGR1 villityypin (OGR1 WT).

Fenotyyppikuvaus analysoi

OGR1 KO hiiret olivat elinkelpoisia ja hedelmällisiä. Täydellinen hiiri fenotyyppi analyysi on suoritettu kaksi paria OGR1 KO ja FL hiiriä (8 viikkoa vanhoja, yksi uros ja naaras kussakin ryhmässä) klo Mouse Fenotyypit resurssin, Ohio State University, Columbus, OH. Määrittämiseksi adiposity indeksi, joka on aiemmin julkaistu menetelmää käytettiin [28].

kudosjakaumamäärityksissä

Urut leikattiin hiiriltä ja vahvistettu sinkki (BD, Franklin Lakes, NJ) 12 -24 h, sitten pidettiin 70% etanolia ennen sen upotettiin parafiiniin ja leikattiin 5 um. Post deparaffinization ja nesteytys, levyt käsiteltiin sitraattipuskurilla 20 min ja H

2O

2 (0,3%) etanolissa 15 minuutin ajan. Universal hevosen seerumia käytettiin estämään kudoksen, jota seuraa anti-FLAG-vasta-ainetta (1:200 laimennokset) hoitoon. VECTOR NovaRED käytettiin alustan ja hematoksyliinillä QS kuin laskuri tahra.

RNA: n eristys, käänteistranskriptio-PCR (RT-PCR) B

Kudokset leikattiin hiiriltä ja jauhettu jälkeen snap jäädyttäminen nestemäinen typpi. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen RNeasy mini kit (Qiangen, Maryland) ja käänteistranskriboitiin M-MLV (Invitrogen, Carlsbad, CA). Johdetut cDNA: t monistettiin käyttäen PCR master mix (Promega, Madison, WI). Alukesekvenssit OGR1 olivat seuraavat: 5′-CTCAATGACCTCCTTGTGATTG-3 ’ja 5′-CTACCAGAAAACTCCTCACTATC-3’. β-aktiini monistettiin kuin taloudenhoito geeni alukkeilla 5′-ACCGCTCGTTGCCATTAGTGATGA -3 ’ja 5′-AAGGCCAACCGTGAAAAGATGACC-3’.

Brown rasvakudoksen eristäminen ja leviämisen ruskean rasvakudoksen peräisin olevien solujen (BADCs) B

Brown rasvaa leikattiin selän näkökohta rintakehän lapaluiden välistä, ja formaliinia (10%) kiinteän sitten parafiiniin, mitä seurasi H E värjäys. Kulttuuriin BADCs, ruskea rasva leikattiin pieniksi paloiksi ja laitettiin samaan tilavuuteen kollagenaasin liuosta (DMEM, 1% penisilliini /streptomysiini, 1% BSA: ta, 1 mg /ml kollagenaasia, tyyppi I, suodatettu). Tämä suspensio laitettiin 37 ° C: ssa ravistelijassa nopeudella 200 rpm 60 minuutin ajan. Tämän jälkeen, DMEM-elatusainetta (10 ml), joka sisälsi 10% FBS: ää, 1% penisilliini /streptomysiiniä, 2% glutamiinia, 1% ei olennaisia ​​aminohappoja ja 1/1000 β-merkaptoetanolia lisättiin ruskeaan rasvasoluja. Kun oli sentrifugoitu 2000 rpm: ssä 5 min, valkoinen kerros poistettiin ja solupelletit suspendoitiin uudelleen 10 ml: aan viljelyalustaa, ja suodatetaan solusiivilän. Sitten solut siirrettiin soluviljelymaljoille ja annettiin konfluentteja. Proliferaatioon /selviytymisen määritykset, solut ravinnotta 24 tunnin ajan, käsiteltiin sitten eri ärsyke 24 ja 48 h [3]. 10 ui 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT, 5 mg /ml) lisättiin soluihin 3 tuntia ennen korjuuta. Absorbanssi liuosta 550 nm: ssä määritettiin käyttämällä Vector

3 spektrofotometrillä (PerkinElmer, Waltham, MA).

Makrofagi ja osteoklastien syntymistä ja karakterisointi

vatsakalvon makrofageissa, hiiret pistetään ip 1 ml TG (4%). Makrofagit kerättiin neljän vuorokauden kuluttua injektion. Solut kerättiin vatsakalvon pesuja käyttämällä RPMI. Pesun jälkeen soluja viljeltiin RPMI 10% FBS: ssa 2 tuntia. Ei-adherentit solut poistettiin ja yli 80% kiinnittyneet solut olivat makrofageissa [29]. Luuytimestä peräisin makrofageja (BMMs) saatiin reisiluista 6-10 viikon ikäisiä hiiriä [30]. Lyhyesti, päät luiden leikattu pois, ja luuydin huuhdeltiin amputoitu reisiluista käyttäen 1 ml ruiskua suspension saamiseksi, joka sitten viedään läpi 27 gaugen neula dispersion. Luuytimen solujen suspensioita (500 ui, 1 x 10

6 solua) maljattiin matalan M-CSF [3% L 929 cell-väliaine (L-CM) lähteenä M-CSF] RPMI: ssä, joka sisälsi 20% FBS: ää. L-CM tuotettiin ymppäämällä 2,5 × 10

5 soluja 175 cm

2 kudosviljelykolviin 50 ml perusravintoliuosta kunnes solut olivat kasvaneet yhteen. Sitten supernatantti kerättiin, suodatettiin 0,2 um: n suodattimen, ja jäädytettiin erinä -80 ° C: ssa. Sen jälkeen, kun strooman solujen kiinnittyä yön yli, tarttumattomat solut kerättiin ja maljattiin korkea M-CSF: ää (30% L-CM). Kolmen päivän jälkeen kasvualusta poistettiin yhdessä sitoutumattomien solujen, ja uusi alustaa, joka sisälsi 30% L-CM lisättiin. Adherentteja makrofagit olivat homogeenisia populaatiot kuluttua 7 päivän viljelyn. Solut värjättiin Diff-nopeasti ja laskettiin. Erilaistua makrofageihin osteoklasteiksi, tuoretta kasvualustaa RANKL (50 ng /ml) lisättiin kolmantena päivänä ja sijoitettiin kolme päivää myöhemmin laskemalla TRAP-positiivisia soluja.

fagosytoosi ja typpioksidin (NO) tuotantoa määritykset

peritoneaalimakrofageille (1 x 10

4 solua /300 ui) inkuboitiin 48-kuoppaisilla levyillä ja käsiteltiin lateksihelmiin (1 x 10

6) 3 tunnin ajan. Kokeet lopetettiin pesemällä soluja jääkylmällä PBS: llä. Solut kiinnitettiin sitten metanolissa 30 min. Fagosytoosin kvantifioitiin fluoresenssimikroskoopilla laskemalla internalized helmiä vähintään 200 solua, joka kirjattiin phagocytotic indeksi kaavalla: 100 x (solujen määrä yhdellä helmi + 3,5 × solujen määrä 2-5 helmiä + 8 × solujen määrä 6-10 helmiä + 20 × solujen määrä on yli 10 helmiä) /yhteensä solujen määrä. NO tuotanto, vatsakalvon makrofageissa (5 x 10

5) 100 ui RPMI: tä, joka sisälsi 10% FBS: ää viljeltiin 96-kuoppaisella levyllä 2 tuntia 37 ° C: ssa. Soluja käsiteltiin korvaamalla keskipitkän (0,5% FBS: ää 100 ui) ja LPS: ää (50 ui 1 ug /ml) 18 tuntia. Tasot NO supernatantissa määritettiin sekoittamalla sama tilavuus supernatantit (100 ui) ja Griessin reagenssia uudella 96- kuoppalevylle. Levyjä inkuboitiin 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja luetaan 570 nm: ssä käyttäen levylukijaa. Pitoisuus nitriitin viljelmän supernatantti laskettiin standardikäyrästä, joka muodostetaan laimentamalla natriumnitriittiä veteen pitoisuusalueella 0,01-100 uM.

Prostaglandiini tuotannon ja COX-2: n ilmentymisen

95% konfluentteja soluja 24-kuoppalevyillä käsiteltiin eri pH-puskurit 9 h tai 25 h [31], [32]. Supernatantit kerättiin prostaglandiini analyysiä käyttäen HPLC-massaspektrometrialla (API-4000, Applied Biosystems). Lyhyesti, prostaglandiinit uutettiin solusupernatanteista (500 ui kussakin näytteessä), kun läsnä on 14:0 lysofosfatidihappo (LPA, 10 pmol) sisäisenä standardina käyttäen kloroformia (2 ml), metanolia (2 ml), ja HCl: ää (6 N, 10 ui). Ionit kanssa m /z at 351 (emoionin) ja 271 (tytär ioni) käytettiin tunnistamiseen prostaglandiinien. TARGA C18 5 uM, 2,1 mm ID x 10 mm TR-0121-C185 (Higgins Analytical, Southborough, MA USA) HPLC-kolonnia, ja liikkuva faasi oli MeOH /vesi /NH

4OH (90:10: 0,1, v /v /v), 6 min /näyte. Solupelletit kerättiin analysointia varten COX-2: n ilmentymisen.

Western blot -analyysit

Makrofagit (10

6) viljeltiin 6-kuoppaisella levyllä huuhdeltiin PBS: llä ja stimuloidaan LPS: llä ( 100 ng /ml), SPC tai LPC (2,5 uM) 30 minuutin ajan. Solut lyysattiin 100 ui Laemmlin näytepuskuria (BIO-RAD, Hercules, CA), uute erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelillä ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvo. Membraanit blokattiin kuoritun maidon 5%: ssa 2 tuntia ja sitten inkuboitiin ilmoitetuilla primaarisilla vasta-aineilla yli yön 4 ° C: ssa. Inkubaation jälkeen johdetun vasta-aineiden kanssa 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa, kalvot kehitettiin käyttämällä ECL-plus western blotting tunnistusjärjestelmä (GE Healthcare, Buckinghamshire UK). Proteiini lastaus varmistettiin strippaamalla ja reprobing blottien kanssa vasta-aineita β-aktiini

.

syklinen AMP (cAMP) tuotanto ja solujen eloonjäämistä eri pH

peritoneaalimakrofageille maljattiin 24 -kuoppaiset levyt, käsiteltiin eri pH: ta sisältäviä puskureita fosfodiesteraasiestäjä isobutyylimetyyliksantiinin (IBMX, 1 mM) 30 min, ja sitten ne lyysattiin 0,1 M HCl: llä (60 ui). Solulysaatteja käytettiin cAMP mukainen määritys pakkaus ohjeet (Cyclic AMP EIA Kit, Cayman, Cat # 581001). Selviytymisen määritykset, makrofagit tai luuytimestä peräisin osteoklasteja maljattiin 96-kuoppaisille levyille 2 tunnin ajan 37 ° C: ssa, 5% CO

2, ja sitten viljeltiin väliaineessa eri pH-arvoissa 37 ° C: ssa ja 0% CO

2 20 h.

Bone histomorphometrical ja immunohistokemiallinen analyysit

Bone näytteitä 8 viikon ikäiset eläimet kiinnitettiin Bouinin liuoksessa yön yli, kalkittomat EDTA (14%) 12 päivää, ja upotettiin parafiiniin. Sitten leikkeitä värjättiin Masson Trichromilla Stain Kit morfologisen havainnon.

Melanooma tumorigeneesin

B16-F10-soluja viljeltiin RPMI 10% FBS. 1 x 10

7 ja 5 x 10

5 solua 100 ul: ssa PBS: ää injektoitiin subkutaanisti osaksi kylkien sekoitetun tausta ja puhtaan C57 /BL6 tausta hiirissä, vastaavasti. Hiiret lopetettiin, kun ne ilmestyivät kuolemaisillaan (9-14 päivää injektion jälkeen). Eläin tutkimus ovat kaikkien asiaankuuluvien liittovaltion suuntaviivat ja politiikkaa Laboratory Animal Resource Center Indiana University School of Medicine.

Tilastolliset analyysit

Kaikki tiedot tässä tutkimuksessa ilmaistiin keskiarvona ± SD kolme tai useampia itsenäistä koetta kolmena kappaleena. Erot hoitoryhmien analysoitiin Studentin

t

testi ja kaksisuuntainen jakelu Microsoft Excel.

Tulokset

Generation of OGR1 hiirillä ja OGR1 ilmentymistä kudoksissa

tutkia fysiologinen rooli OGR1, olemme laatineet OGR1 puutteellinen hiiren rasitusta. Sukupolven OGR1 hiirissä on kuvattu yksityiskohtaisesti osassa Materiaalit ja menetelmät. Yleinen strategia rakentamiseksi OGR1 kohdistaminen vektori on esitetty kuviossa 1A. Tulokset OGR1 genotyypin oli kuviossa 1B on esitetty. OGR1 ilmaistiin keuhkoissa, kiveksissä, sydämessä, aivoissa, perna, kateenkorva, ruskea rasva, ohutsuoli, paksusuoli, ääreisveren leukosyyteissä (PBL), makrofagit, mahassa, munasarjassa, ja valkoinen rasvaa, mutta ei maksassa, munuaisissa, ja luustolihasten OGR1 FL hiiret, havaittuna RT-PCR: llä. OGR1 ilmentyminen eturauhasessa oli heikko, mutta havaittavissa (kuvio 2A). Täydellinen puuttuminen OGR1 ilmaisun OGR1 KO hiirillä varmistui kaikissa tutkituissa kudoksissa. Lisäsimme kolmen FLAG edessä OGR1 että knock-konstruktissa siten, että endogeenisen OGR1 ilmentymisen proteiinin taso voidaan havaita kudoksissa käyttäen anti-FLAG M2-vasta-ainetta. Immunohistokemiallinen värjäys ja keuhkosta OGR1 FL hiirillä osoittivat, että OGR1 on ilmaistu cuboidal /columar epiteelisolujen, jotka kattavat suuren hengitysteiden keuhkojen ja verisuonten sileän lihaksen solujen ympärillä suuri verisuonen (kuvio 2B). Tätä kudosta ekspressiokuviota OGR1 oli samankaltainen kuin ihmisen kudoksissa osoitettiin aiemmin [1], [33].

(A) strategia rakentamiseksi OGR1 kohdistaminen vektori. (B) Genotyping suoritettiin tunnistamaan Floxed (FL), – /- (KO) ja + /+ (WT) hiirillä.

(A) OGR1 ilmentyminen eri kudoksissa FL ja KO-hiirten havaita RT-PCR: llä. PCR-ohjelma oli 94 ° C, 2 min; 25 sykliä, aktiinin ja 35 sykliä OGR1 (94 ° C, 30 s; 55 ° C, 1 min; 72 ° C, 1 min); 72 ° C, 10 min, paitsi sekä aktiini ja OGR1 makrofageissa monistettiin 30 sykliä. BAT, ruskea rasvakudos; BM, luuydin; PBL, perifeerisen veren leukosyytit. Nuolet osoittavat DNA tikkaat 500 emäsparia. (B) OGR1 jakeluun keuhkokudosanalyysin FL ja C57 /BL6-hiirissä. Anti-FLAG M2-vasta-ainetta (1:200) käytettiin. Edustaja positiivisesti värjäytyneiden solujen on osoitettu nuolilla. Asteikko bar = 100 pm.

Yleiset fysiologinen analyysit OGR1 KO hiirten ja ruskea rasvakudos (BAT) poikkeavuus seka taustalla

OGR1 KO hiiret olivat elinkelpoisia ja hedelmällisiä. Täydellinen hiiri fenotyyppi analyysi on suoritettu kaksi paria OGR1 KO ja OGR1 FL hiiriä (8 viikkoa vanhoja, yksi uros ja naaras kussakin ryhmässä). Kehon painot eivät eronneet merkittävästi joukossa hiirillä tutkittiin. Näissä kaksi paria hiiriä, pernat OGR1 KO-hiirten näytti olevan jonkin verran pienempi kuin FL hiirillä, kun taas maksa ja sydämet KO-hiiret olivat jonkin verran suurempia kuin FL-hiirissä. Kuitenkin lisäanalyysi enemmän hiirillä eivät osoittaneet tilastollisia eroja näiden elinten painoissa (tuloksia ei ole esitetty). Histologinen analyysit FL ja KO eivät paljastaneet merkittäviä eroja useimmissa kudoksissa, ja edustavia tietoja on esitetty kuvassa 3.

Edustaja H E-värjäys, maksan, munuaisten, kives-, eturauhas-, munasarja- ja kohdun esitettiin. Asteikko bar = 100 pm.

Ensimmäinen analysoi paljasti myös, että intrascapular BAT talletus oli raskaampi KO (0,35 ja 0,28 g) kuin FL (0,10 ja 0,11 g) hiirillä, jotka voivat olla liittyvä muuttunut painoindeksin vuonna KO hiirillä. Johdonmukainen erot BAT painot ja koot havaittiin ylimääräistä paria FL ja KO-hiirten (kuvio 4A). H E värjäys osoitti, että vaikka valkoinen rasvakudokselle (WAT) välillä FL ja KO hiiret olivat samanlaisia, BAT alkaen KO hiiret olivat vähemmän tiheää verrattuna niillä, FL hiirten (kuvio 4B), jotka voivat liittyä osittain sen suurennettuna olevien tekniikoiden OGR1 KO hiirillä.

(A) Brown rasvakudoksesta, että KO-hiiret olivat suurempia kuin FL hiirillä. (A) painot BAT (9 hiiriä FL ja 9 hiiriä KO). (B) edustaja ulkonäkö BAT peräisin FL ja KO hiirillä. (B) H E värjäys BAT ja WAT ​​FL ja KO hiirillä. * Edustaa

P

arvo 0,05 ja *** edustaa

P

arvo 0,001. Asteikko bar = 100 um.

OGR1 on osoitettu olevan protoni-havaitessaan aktiivisuutta erilaisissa soluissa [3], [6], [9], [34]. Lisäksi SPC voi moduloida OGR1 toimia [6], [9]. SPC: n on osoitettu indusoivan proliferaatiota ihmisen rasvakudos-johdettujen mesenkymaalisten kantasolujen aktivoimalla c-Jun N-terminaalisen kinaasin (JNK) [35]. Voit testata, onko BAT päässä FL ja KO hiiret reagoivat eri tavalla pH ja /tai SPC, me eristetty BADCs ja testattu vaikutukset SPC tai pH muutoksia solujen lisääntymisen. SPC (2,5 uM) vaatimattomasti stimuloi soluproliferaatiota 24 tuntia ja tämä vaikutus ei ollut merkitsevästi erilainen BADCs välillä FL versus KO hiiret (kuvio 5A). Hapan pH aiheuttama alhaisempi leviämisen kuin fysiologinen pH (7,4), ja jälleen tilastollista eroa ei havaittu BADCs välillä FL

vs.

KO hiiret (kuvio 5B). Olemme takaisinristeytettiin OGR1 hiirillä osaksi C57 /BL6 tausta (10 sukupolvea). Kun me tutkimme BAT WT ja KO hiiret C57 /BL6 tausta, mitään eroa ei havaittu (tuloksia ei ole esitetty), mikä viittaa siihen, että BAT poikkeavuus liittyy hiiri tausta.

(A) SPC stimuloi proliferaatiota ei ollut merkitsevästi erilainen BAT välillä FL

vs.

KO hiirillä. SPC (2,5 uM) tai LPC (2,5 uM) käytettiin. (B) pH: n vaikutusta proliferaatioon ei ollut merkitsevästi erilainen FL

vs.

KO. Tulokset Tässä kuvassa ne edustavat vähintään 3 itsenäisen kokeen. H (B).