Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida chemopreventive vaikutus romaanin flavonoidi, ampelopsin (AMP) kasvuun ja etäpesäkkeiden eturauhassyöpäsolujen. AMP osoitti voimakkaampi aktiivisuus inhiboimaan androgen-herkkien LNCaP ja vähemmän määrin, androgeenistä riippumaton PC-3 ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa in vitro, ensisijaisesti apoptoosin induktio liittyy alas-säätely bcl-2. Toisaalta, AMP osoitti paljon vähemmän aktiivisuutta inhiboimaan normaalin eturauhasen epiteelisolujen kuin eturauhassyöpäsolulinjoissa. AMP esti myös migraation ja invaasion PC-3-solujen in vitro liittyy alas-säätely CXCR4 ilmaisua. Eläinten tutkimuksessa käyttäen ortotooppisten eturauhassyövän malli, AMP (150 ja 300 mg /kg) inhiboi kasvua PC-3 kasvaimia ja imusolmukkeiden ja keuhkojen metastaasien annoksesta riippuvalla tavalla. Verrattuna kontrollihiiriin, hiiret, joita käsiteltiin AMP 300 mg /kg oli alentunut lopullinen kasvaimen painoksi 49,2% (P 0,05), imusolmukemetastaaseja 54,5% (P = 0,3), ja keuhkometastaasien 93% (P 0,05), mutta ei ollut ilmeistä muutos- ravinnosta tai kehon painoa. In vivo anti-kasvua ja anti-metastaasin toimintaa AMP liittyi apoptoosin induktion ja proliferaation estossa eturauhassyöpäsolujen, vähentäminen eturauhasen tuumorin angiogeneesi, ja vähentäminen CXCR4 ilmaisun. Tuloksemme tukeva näyttö perusteeksi lisätutkimuksia kehittää AMP uutena tehokas ja turvallinen ehdolla oleva aine vastaan ​​etenemisen ja etäpesäkkeiden eturauhassyöpä.

Citation: Ni F, Gong Y, Li L, Abdolmaleky HM, Zhou JR (2012) Flavonoidi Ampelopsin estää niiden kasvun ja metastaasin Eturauhassyöpä in vitro ja hiirissä. PLoS ONE 7 (6): e38802. doi: 10,1371 /journal.pone.0038802

Toimittaja: Rakesh K. Srivastava, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 27 joulukuu 2011; Hyväksytty: 10 toukokuu 2012; Julkaistu: 05 kesäkuu 2012

Copyright: © 2012 Ni et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Foundation of Kiinan terveysministeriön United Fujianin maakunnan Health and Education (WKJ2008-2-60), Foundation of Fujian Department of Science Technology (2011Y0015) ja tieteellinen Research Foundation hyödyntämisasteita Industrial Technology Fujianin kehittäminen ja uudistaminen komission (2008-762) ja FN, ja puolustusministeriön (PC073988) ja NCI /NIH (R21 CA133865) ja JRZ. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelu menuscript.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

eturauhassyöpä on yleisin invasiivisia maligniteetti ja toiseksi suurin syy syövän kuoleman miehillä Yhdysvalloissa on arvioitu, että 241740 uutta tapausta eturauhassyövän diagnosoidaan ja noin 28170 miestä kuolee eturauhassyövän Yhdysvalloissa vuonna 2012 [1]. Nykyiset hoitomuodot eturauhassyövän yleensä vaihteleva tehokkuus, kehittää etäpesäke ja lääkeresistenssideterminantit, ja on korkea myrkyllisyys normaaleissa kudoksissa. Siksi etsivät tehokasta hoito on keskivaikea kielteiset vaikutukset chemopreventive väliintulon eturauhasen syöpä on edelleen etusijalla eturauhassyövän tutkimukseen.

bioaktiiviset komponentit kasvien ja kasviperäisten lääkkeet voivat tarjota tehokkaita ja turvallisia ehdokkaita kemopreventiolle ja /tai syövän hoidossa. Klassista kiinalaista lääketieteellisten tekstien on laajoja empiirisiä kirjaa kasvitieteellisen hoitoon käytetyistä syöpäpotilaiden ja syöpään liittyvien järjestelmien. Kuitenkin suurin osa näistä ehdokas kasvitieteellisen kaavat suositellaan perustuttava kliinisiin havaintoihin vain. Lisäksi nämä kliiniset havainnot olivat lähes aina hallitsemattomasta, havainnointitutkimukset tai empiirisiä tapauskertomuksiin. Aivan viime aikoihin asti, on ollut rajallinen pyrkimys kehittää prekliinisissä, mekanistinen, tieteellisen arvioinnin kasvitieteellinen kasviperäisten tuotteiden edellytyksenä kliinisissä tutkimuksissa.

kiinalainen yrtti

Ampelopsis grossedentata

jakautuu laajalle Etelä-Kiinan ja hoidetaan kylmä ja vartalosilsa. Se sisältää runsaasti resursseja phytochemicals kanssa ampelopsin (AMP, (2R, 3R) -3,5,7-trihydroksi-2- (3,4,5-trihydroksifenyyli) -2,3-dihydrochromen-4-oni) tärkeimmistä flavonoidi. AMP kutsutaan myös dihydromyricetin ja sillä on samanlainen rakenne myrisetiiniä (3,5,7-trihydroksi-2- (3,4,5-trihydroksifenyyli) -4-kromenoni-), joka on luonnossa esiintyvä flavonoidi löytyy viinirypäleet, marjat, hedelmät, kasviksia, yrttejä ja muita kasveja tiettyjen syöpälääkkeen toimintaa. Koska suuret bioaktiivisia ainesosa

Ampelopsis grossedentata,

AMP osoitettiin olevan pääasiassa vastuussa raportoitu biologista aktiivisuutta, kuten hypoglycemic [2], anti-oksidatiivisen [3], [4] ja hepatoprotective [4], [5] toimintaan. AMP myös lisännyt chemokinesis ja kemotaksista vaikutukset neutrofiilisten granulosyyttien ja monosyyttien [6].

AMP oli osoitettu omaavan tiettyjä syöpälääkkeen toimintaa. AMP esti kasvua [7] ja invaasion melanoomasolujen in vitro [8], [9], ja se esti etäpesäke melanoomakasvainta in vivo [8], [9]. AMP inhiboivat keuhkotuumoreiden in vivo proliferaation estossa [10]. AMP oli anti-angiogeneesiä inhiboimalla eritystä verisuonten endoteelin kasvutekijän (VEGF) ja emäksisen fibroblastikasvutekijän (bFGF) ihmisen maksasyövän soluja in vitro ja esti myös kasvua ihmisen maksasyövän hiirissä [11]. AMP myös käänteinen monilääkeaineresistenssin leukemiasoluissa in vitro osittain kautta ekspression vähentämiseen p-glykoproteiinin [12]. Toisaalta, vaikutus AMP kasvuun ja etenemisen eturauhassyöpä ei ole tutkittu.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli arvioida järjestelmällisesti AMP mahdollisena chemopreventive ja terapeuttisen ehdokas eturauhassyöpää vastaan ​​etenemisen käyttäen sekä in vitro ja in vivo järjestelmissä, ja valottaa alla olevan solu- ja molekyylitason mekanismeja AMP toimia. Tuloksemme tarjotaan kokeellisia todisteita tukemaan tulevaa kehitystä AMP tehokkaana ja turvallinen ehdolla oleva aine ehkäisyyn ja /tai hoitoon eturauhassyöpää.

Tulokset

Effects of AMP yhteensä flavonoidi uutetta (TFE) ja myrisetiiniä proliferaatioon eturauhassyövän solulinjoissa ja normaalissa eturauhasessa epiteelisolut (PrEC) in vitro

ensimmäinen vertasi harjoittaneiden AMP, TFE ja myrisetiiniä estossa leviämisen eturauhassyövän solulinjoissa ja PrEC. AMP puhtaus analyysi korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC) osoitti, että AMP-puhtaus oli noin 95%, ja edustava HPLC-kromatogrammi on esitetty kuviossa. S1. TFE pitoisuudet laskettiin perustuen sen AMP tasolla, mikä ero toiminnan välillä TFE ja AMP johtuu muiden fytokemikaalit TFE. Kuten on esitetty kuviossa. 1 (A, B, C), AMP ja TFE osoitti vastaavaa toimintaa estossa leviämisen eturauhasen syöpäsolujen tai normaalin eturauhasen soluja, mikä viittaa siihen, että AMP on tärkeä bioaktiivinen flavonoidien in TFE. AMP tai TFE inhiboivat LNCaP-solulinjasta klo IC

50: n noin 25 uM (Fig. 1A), ja että PC-3 solujen rivi IC

50: n noin 60 uM (kuva. 1 B). Toisaalta, AMP tai TFE osoitti paljon vähemmän aktiivisuutta inhiboimaan normaalin eturauhasen epiteelisolujen kuin eturauhassyöpäsolulinjoissa (Fig. 1 C), viittaa siihen, että AMP tai TFE voi olla kohtalainen /minimaalinen sivuvaikutus.

V: annoksesta riippuva vaikutus AMP, TFE ja myrisetiiniä proliferaatioon androgen-herkkien LNCaP-solulinja; B: Annosvasteinen vaikutukset AMP, TFE ja myrisetiiniä proliferaatioon androgeenista riippumaton PC-3 solulinja; C: Annosvasteinen vaikutukset AMP, TFE ja myrisetiiniä proliferaatioon PrEC. Arvot ovat keskiarvoja ± SEM vähintään kolmen itsenäisen kokeen, kukin kolmena rinnakkaisena.

vastoin myrisetiiniä osoitti voimakkaampaa aktiivisuutta inhiboimaan PrEC kuin LNCaP tai PC-3. Vaikka myrisetiiniä inhiboivat eturauhassyövän solulinjoissa IC

50s 60 uM (Fig. 1A, 1 B), se esti kasvua PrEC-solujen IC

50 noin 35 uM (kuvio 1C). Koska voimakas syövän vastaista aktiivisuutta ja minimaalinen sivuvaikutus AMP, sitä käytettiin edelleen arviointiin.

vaikutukset AMP solusyklin etenemisen eturauhassyövän solulinjoissa in vitro

AMP 25 ja 50 uM lisäsi merkittävästi osa LNCaP-soluja S-vaiheessa 20%: sta 28% (P 0,05) ja 74% (P 0,001), vastaavasti (Fig. 2B). Toisaalta, AMP 25 ja 50 uM lisäsi osa PC-3-solujen S-vaiheessa 22%: sta 28% (P 0,05) ja 34% (P 0,05), vastaavasti (Fig. 2E), ja G2 /M-vaihetta 17%: sta 23% (P 0,05) ja 24% (P 0,05), vastaavasti (Fig. 2F).

A, B, ja C: annos-riippuvainen vaikutus AMP jakeluun LNCaP-soluja G1 (A), S (B) ja G2 /M (C) vaiheessa; D, E, ja F: annosriippuvainen vaikutus AMP jakautumiseen PC-3-solujen G1 (D), S (E) ja G2 /M (F) vaiheessa. Arvot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta, kukin kaksoiskappaleet. Sisällä paneeli, arvo kirjaimella on merkittävästi erilainen kuin ohjaus, a, p 0,05; b, p 0,01; c, p 0,001.

Useat solusyklin liittyvät biomarkkerit, kuten solunjakautumista sykli 2 (cdc2), CDC25c, sykliini B1 ja sykliiniriippuvaisen kinaasi 2 (CDK2), määritettiin Western blot analyysi. AMP merkittävästi vaimentua CDK2-proteiinia tasolla LNCaP-soluissa (kuvio. 3B, 3C) ja cdc2 proteiinin tason PC-3-solut (Fig. 3E, 3F), mutta ei muita solusykliä liittyviä biomarkkereita.

A ja D : Annosvasteinen vaikutus AMP osuudesta DNA hajanaisuus (sub-G

0), merkkiaine apoptoosin, LNCaP (A) ja PC-3 (D) solulinjoissa; B ja E: Edustava Western blot kuvat osoittavat vaikutuksia AMP proteiinin tasot solusyklin etenemisen ja apoptoosiin liittyvien biomarkkereita LNCaP (B) ja PC-3 (E) solulinjoissa; C ja F: n kvantitointi muutu merkitsevästi proteiinin tasot LNCaP (C) ja PC-3 (F) solulinjat densitometrisesti normalisoinnin jälkeen on P-aktiini. Kuvat kvantitoimiseksi olivat ainakin kahdesta toisistaan ​​riippumattomasta kokeesta. Arvot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta, kukin kaksoiskappaleet. Sisällä paneeli, arvo kirjaimella on merkittävästi erilainen kuin ohjaus, a, p 0,05; b, p 0,01; c, p 0,001.

Effects of AMP on apoptoosin induktioon eturauhassyövän solulinjoissa in vitro

AMP lisääntyi myös merkittävästi eturauhasen syöpäsolun DNA pirstoutuminen, tunnusmerkki apoptoosin. AMP 25 ja 50 uM merkittävästi indusoi DNA pirstoutumista LNCaP 15-kertaisesti (P ​​ 0,001) ja 70-kertainen (P 0,001) vastaavasti (Fig. 3A), ja PC-3-soluista 86% (P 0,05 ) ja 270% (P 0,001) vastaavasti (Fig. 3d), verrattuna vastaavaan valvontaa. LNCaP-soluja käsiteltiin edelleen AMP 25 ja 50 uM, ja apoptoosiin liittyvien geenien kopiomäärissä määritettiin Western blot -analyysillä. AMP: n indusoiman apoptoosin LNCaP-ja PC-3-solut, jotka liittyvät downregulation Bcl-2 (Fig. 3B, 3C, 3E, 3F).

apoptoosin vaikutuksesta AMP PC-3-solulinjan vahvistettiin edelleen käyttämällä anneksiini V-PI virtaussytometrialla määrityksessä. AMP osoitti annoksesta ja aikaa riippuvaisia ​​vaikutuksia asiakkuutta PC-3 solujen apoptoosin (Fig. S2).

Effects of AMP muuttoliikettä ja hyökkäys PC-3-solujen ja downregulation CXCR4 proteiinin tason in vitro

PC-3 solulinjaa käytettiin arvioimaan vaikutuksen AMP eturauhassyövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota. AMP 25 ja 50 uM inhiboi merkittävästi PC-3 solumigraatio 26% (P 0,05) ja 63% (P 0,01), tässä järjestyksessä (Kuva. 4A), ja hyökkäystä 27% (P 0,05) ja 45% (P 0,01), vastaavasti (Fig. 4B). Estovaikutus AMP PC-3 solumigraation ja invaasio liittyi downregulation CXCR4 proteiinin taso (Fig. 4C, 4D), joka on tärkeä biomarkkeri syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäke. Alle koeolosuhteissa (16-h hoito), AMP ei aiheuttanut PC-3-solujen sytotoksisuuden, mitattuna trypaanisininen määrityksessä (kuvio. S3). Se viittaa siihen, että havaitut anti-muuttoliike ja anti-hyökkäys toiminnan AMP eivät toissijaisesti koska sen cytotixicity.

V: annoksesta riippuva vaikutus AMP siirtolaisuudesta PC-3-solut; B: Annosvasteinen vaikutus AMP on hyökkäyksen PC-3-solut; C: Annosvasteinen vaikutus AMP on CXCR4 proteiinin tasot PC-3-solut; D: n kvantitointi CXCR4 proteiinin tasot PC-3-solujen densitometrisesti normalisoinnin jälkeen ß-aktiini. Arvot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta, kukin kahtena kappaleena. Sisällä paneeli, arvo kirjaimella on merkittävästi erilainen kuin ohjaus, a, p 0,05; b, p 0,01; c, p 0,001.

Effects of AMP kasvuun ja etäpesäkkeiden androgeenista riippumaton PC-3 eturauhasen kasvaimia ja modulaatio kasvainsoluproliferaation, apoptoosin ja CXCR4 ilmaisun ja kasvaimen angiogeneesiä hiirissä

ortotrooppinen PC-3 kasvain eläinmallia käytettiin vaikutuksen arvioimiseksi AMP ehkäisemiseen kasvua ja etäpesäkkeiden eturauhasen kasvain. AMP esti sekä kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden in vivo annosriippuvaisesti. AMP 150 ja 300 mg /kg vähensi lopullinen kasvaimen painoksi 28% (P 0,05) ja 52% (P 0,05), vastaavasti (Fig. 5A), estivät imusolmukkeiden etäpesäkkeiden 27% (P 0,05) ja 43% (P 0,05) vastaavasti (kuvio. 5B), ja se esti keuhkoetäpesäkkeet 57% (P 0,05) ja 86% (P 0,05) vastaavasti (Kuva. 5C). Edustaja kuvia keuhkometastaasien on esitetty kuviossa. S4. Toisaalta, AMP hoitoja ei merkittävästi muuttanut yhteensä ruokailu (Fig. 5D) tai kehon painojen (Fig. 5E).

Arvot ovat ryhmän keskiarvona ± SEM (n = 8 /ryhmä). Sisällä paneeli, arvo kirjaimella on merkittävästi erilainen kuin ohjaus, a, p 0,05.

Analyysit solun markkereita osoitti, että AMP hoito merkitsevästi aiheuttama eturauhassyövän apoptoosia 200% (Fig. 6A, P 0,001), vähensi eturauhassyöpä solujen lisääntymistä 60% (Fig. 6B, P 0,001) ja se esti eturauhasen kasvain angiogeneesiä 58% (Fig. 6C, P 0,05). Nämä tulokset vahvistivat, että AMP esti kasvua eturauhasen kasvaimia indusoimalla apoptoosin, vähentää leviämisen, ja estämällä eturauhasen kasvaimen angiogeneesiä in vivo. Edustaja kuvia solun biomarkkereiden on esitetty kuviossa. S5. AMP hoito vähensi myös CXCR4 proteiinin ilmentymistä 30% eturauhasen kasvaimia (Fig. 6D, P 0,05).

Arvot ovat ryhmän keskiarvona ± SEM (n = 8 /ryhmä). Sisällä paneeli, arvo kirjaimella on merkittävästi erilainen kuin ohjaus, a, p 0,05; c, p 0,001.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme huomanneet, että AMP merkittävästi inhiboivat eturauhassyöpäsolulinjoissa kautta apoptoosin liittyvät downregulation Bcl2 ilmaisun, ja tukahdutti eturauhassyövän solumigraatioon ja invaasio liittyvät downregulation CXCR4 ilmaisun in vitro. Eläinten tutkimus vahvistivat lisäksi, että AMP vähensi lopullista kasvainpainoja liittyy asiakkuutta eturauhasen syöpäsolun apoptoosin, estämällä eturauhassyövän soluproliferaatiota ja vähentää eturauhassyövän angiogeneesi, ja estivät merkittävästi keuhkojen etäpesäkkeet. Toisaalta, AMP vaikuttavat annokset eivät osoittaneet merkittäviä haitallisia vaikutuksia ateriat tai kehon painoa. Tämä on ensimmäinen tutkimus, parhaan tietomme, että osoitti estävä vaikutus AMP kasvuun ja etäpesäkkeiden eturauhassyövän in vitro ja in kliinisesti merkittävää potilaalle tehdä kasvain malli.

Cellular mekanismi tutkimukset osoittivat, että AMP inhiboivat syöpäsolujen. Mielenkiintoista, AMP pidätettiin LNCaP S vaiheessa (Fig. 2B) osittain kautta alas säätely CDK2 (Fig. 3B, 3C), biomarkkereiden välttämätön G1 /S siirtymä, kun se pidätti PC-3 solujen S ja G2 /M vaiheiden (Fig. 2E, 2F) liittyy downregulation cdc2 (Fig. 3E, 3F). Cdc2, joka tunnetaan myös nimellä CDK1 (sykliiniriippuvainen kinaasi 1), on tärkeä rooli solusyklin aikana edistymistä. Cdc2 yleensä yhdistyy sykliini B ja säätelee S ja G2 /M vaiheessa etenemistä. Cdc2 on pidetty olennaisena molekyylikohteena suunnittelu terapeuttisen syöpälääkkeet [13]. Down-regulation cdc2 voi antaa tärkeän molekyylitason mekanismi, joka AMP pidättää solusyklin etenemistä PC-3 solujen S ja G2 /M vaiheessa. Analyysi in vivo kasvaimen näytteet myös vahvistanut, että AMP esti PC-3 kasvaimen kasvun estoon liittyvän kasvainsolujen proliferaatiota (Fig. 6B).

induktio eturauhassyövän apoptoosin on myös tärkeä mekanismi, jonka avulla AMP lukitus kasvun eturauhassyöpää. AMP: n indusoiman apoptoosin eturauhassyövän soluissa in vitro (Fig. 3A, 3D) ja in vivo (Fig. 6A). Lisätutkimukset osoittivat, että apoptoosin induktio liittyi säätelyä alaspäin Bcl-2-proteiinin tasot (Fig. 3C, 3F). Bcl-2 on tärkeä säätelijä apoptoosin. Expression of Bcl-2 on useammin korkea-asteen kasvaimet ja etäpesäkkeet kuin alemman asteen ja nonmetastatic kasvaimet [14], [15]. Apoptoosiresistenssiin liittyy korkeampi bcl-2 [15], [16], ja downregulation bcl-2 herkistää syöpäsolujen apoptoosin [17]. Näin ollen, downregulation bcl-2 voi olla tärkeä molekyyli mekanismi, jonka AMP indusoi eturauhassyövän apoptoosin.

Angiogeneesi on kriittinen vaihe kasvaimen kasvua [18]. Kasvu kaikkien kiinteiden kasvainten riippuu angiogeneesin ja tukahduttamiseksi kasvaimen verisuonen tarjoaa uuden vaihtoehdon ehkäisyyn ja syövän hoitoon [19]. Aiemmat tutkimukset osoittivat, että AMP oli anti-angiogeneesiä inhiboimalla eritystä pro-angiogeenisen tekijän VEGF ja bFGF ihmisen maksasyövän soluissa in vitro [11]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että AMP esti kasvua PC-3 eturauhasen tuumorin estoon liittyvän kasvaimen angiogeneesin (Fig. 6C). Vaikka emme mittaa VEGF ja bFGF tasot in vivo, meidän tulokset edellyttäen viittaavia kokeellisia todisteita, joiden mukaan yksi niistä mekanismeista, joilla AMP estää kasvaimen kasvua kautta angiogeneesin estämiseksi. Lisätutkimuksia tarvitaan määrittämään taustalla molekyylitason mekanismeja, jotka AMP estää kasvaimen angiogeneesiä.

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että AMP esti in vitro hyökkäyksen ja in vivo etäpesäkkeiden kyky B16 [8]. Kuitenkin, se ei ole tutkittu, jos AMP ollut anti-etäpesäke aktiivisuus eturauhassyövässä. Tuloksemme osoittivat, että AMP oli voimakas toimintaa estävä vaikutus ja invaasion eturauhasen syöpäsolujen in vitro ja eturauhassyövän etäpesäke potilaalle tehdä eturauhassyövän eläinmallissa liittyy downregulation CXCR4 ilmaisua. CXCR4 on mukana useissa sairauksiin, kuten angiogeneesin, aineenvaihdunnan ja neurologiset sairaudet, nivelreuma ja eri muodoissa metastaattinen. CXCR4 on kriittinen tekijä invasiivisuus ja leviämisen rintasyövän solujen [20], [21], [22] ja on keskeinen rooli kasvun pahanlaatuisten hermosolujen ja gliatuumorit [23]. CXCR4-inhibiittorit ovat ehdottaneet hoitoon eri metastaattinen [24], [25], [26]. AMP on osoitettu olevan pieni molekyyli, CXCR4-antagonisti [27], [28]. Vaikka emme tutkia, jos CXCR4 oli suora molekyylikohteena AMP, meidän tutkimukset viittaavat siihen, että yksi molekulaarisia mekanismeja, joilla AMP estää eturauhassyövän etäpesäkkeiden voi tapahtua downregulation CXCR4 ilmentymistä ja toimintaa. Lisätutkimuksia soveltamisessa AMP ja /tai sen johdannaisia ​​uusina anti-etäpesäke aineita viivyttää ja /tai syöpäsolujen leviämisen estämiseen voi olla merkittäviä vaikutuksia ehkäisyyn ja syövän hoidossa.

Yhteenvetona päätuloksia edellyttäen ratkaisevan tärkeää kokeellista näyttöä siitä, että AMP voi olla uusi tehokas ja turvallinen ehdokasaineella kasvun estämiseksi ja etäpesäkkeiden eturauhassyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

kaikki toimenpiteet, joilla eläimet tarkistettiin ja hyväksyttiin Institutional Animal Care ja käyttö komitean Beth Israel Deaconess Medical Center kanssa opas hoito ja käyttö Laboratory Animals.

TFE, AMP ja myrisetiiniä

Sovelias uuttomenetelmää käytettiin poimia TFE alkaen

Ampelopsis grossedentata

AMP sisältö noin 80%. AMP puhdistettiin TFE preparatiivisella HPLC: llä; ja puhtaus varmistettiin analyyttisellä käänteisfaasi-HPLC: llä. Myrisetiiniä ostettiin LKT Laboratories (St. Paul, MN). HPLC-analyysiä käytettiin sen varmistamiseksi, laadun materiaaleja. Kaikki materiaalit liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) ja soluviljelmätutkimukset.

Culture eturauhassyöpäsolujen, normaalissa eturauhasessa epiteeli- ja endoteelisolujen

kaksi ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa, androgeeni-herkkä LNCaP ja androgeenista riippumaton PC-3 (American Type Culture Collection, Bethesda, MD) käytettiin in vitro kokeissa. Ihmisen eturauhassyövän solulinjoissa ylläpidettiin yksikerroksisina viljelminä, DMEM väliaineessa, jota täydensi 10% naudan sikiön seerumia, 2 umol L-glutamiinia /ml, 100 U penisilliiniä /ml ja 100 ug streptomysiiniä /ml 95% ilmaa, 5% CO

2, ja vedellä kyllästettyä ilmapiiri. PrEC-solut ostettiin Lonza (Walkersville, MD) ja viljeltiin PrEGM plus EGM-2 singlequotes (Lonza, Walkersville, MD), kostutetussa atmosfäärissä 95% ilmaa ja 5% CO

2.

solujen kasvua

vaikutus AMP, TFE ja myrisetiiniä on sytotoksisuutta eturauhasen syöpäsolujen tai PrEC määritettiin käyttäen Cell Titer 96 Aqueous Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI), kuten aiemmin on kuvattu [29] . Määritys määrittää elinkykyisten solujen lisääntymistä, sytotoksisuutta ja kemosensitiivisyys. Kaikki määritykset itsenäisesti toistettiin ainakin kolme kertaa, kukin kolmena rinnakkaisena, ja tulokset vahvistettiin suoralla solujen laskenta hemosytometrillä.

Analyysi eturauhassyövän solusyklin etenemisen ja DNA: n fragmentoituminen

vaikutus AMP hoito solusyklin jakautumista eturauhassyövän solulinjoissa määritettiin virtaussytometrialla jälkeen kuvattuja menetelmiä [30]. Solut, joita käsiteltiin eri pitoisuus AMP kerättiin, värjättiin propidiumjodidilla (lopullisessa konsentraatiossa 50 ug /ml) ja RNaasi (lopullisessa konsentraatiossa 50 ug /ml), ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Stained solut analysoitiin sitten FACScan (Becton Dickinson, Immunocytometry Systems, Mountview, CA) solusyklin jakeluun ja hajanainen DNA. Kokeet itsenäisesti toistettiin ainakin kolme kertaa, kukin kahtena rinnakkaisena.

anneksiini V: n ja PI-värjäyksen apoptoosin havaitsemiseksi

vaikutus AMP on apoptoosin PC-3-solujen lisäksi määritettiin anneksiini V-PI apoptoosin havaitseminen kit (Chemicon International Inc, Billerica, MA) seuraavan ohjeen kit. Lyhyesti, käsiteltiin PC-3-solut suspendoitiin uudelleen anneksiini V-liuosta ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 15 min ajan, PI Sitten lisättiin vielä 5 minuutin inkubaation pimeässä. Apoptoottiset solut analysoitiin virtaussytometrillä (Becton Dickinson, Immunocytometry Systems, Mountview, CA). Kokeet itsenäisesti suoritettava vähintään kahdesti, kukin kaksoiskappaleet.

Syöpä solumigraatioon ja invaasiota määritykset

Suspensiota PC3-solujen (6000 solua maahanmuutosta ja 30000 solujen invaasiota) 250 ui seerumitonta DMEM AMP tai ajoneuvo (DMSO) ladattiin fibronektiiniä päällystetty insertti migraatiokokeessa tai Matrigel pinnoitettu insertin invaasiomääritys (BioCoat, 24-kuoppalevylle, 8 um, Becton Dickinson). Kukin viljelyinsertistä asetettiin kaivoon, joka sisälsi 750 ui DMEM 5% FBS. Kun oli inkuboitu 16 tuntia 37 ° C: ssa, solut päälle insertit poistettiin varovasti puuvilla kärki, ja solut alapuolella insertin kalvo värjättiin Diff-Quick-Stain ratkaisuja (Dade Behring Inc., Newark, DE) ja kuvat otettiin kiinni. Solut laskettiin mikroskoopin alla. Kaikki määritykset itsenäisesti suoritettava vähintään kolmasti, kukin kolminkertaisena.

Varmista, että anti-muuttoliike ja anti-hyökkäys toiminnan AMP eivät toissijaisesti koska sen sytotoksisuus PC-3-solut, PC-3-solujen käsiteltiin AMP (0, 25, ja 50 uM) 16 tunnin ajan, ja solujen lukumäärä mitattiin trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä. Koe suoritetaan itsenäisesti ainakin kolmesti, kukin kahtena rinnakkaisena.

Western blot-analyysi

in vitro -tutkimus, soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla AMP, solulysaatteja valmistettiin, ja proteiini -tasot määritettiin Western blot -analyysillä sen jälkeen, kun menettelyjä olemme aiemmin on kuvattu [31]. Primaaristen vasta-aineiden, joita käytetään Western blot ihmisen antigeenejä olivat seuraavat: sykliini B1 (1:200), cdc2 (1:500) ja bax (1:500) (Oncogene Research Products, Boston, MA), bcl-2 (1 :100), p21 (1:200) ja p53 (1:500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), CDK2 (1:1,000) (Selleck Chemicals, Houston, TX), CXCR4 (1:200) ( R (Ii) AMP 150 mg /kg kehon paino (BW); ja (iii) AMP 300 mg /kg. Kukin hiiri implantoitiin sitten ortotooppisesti PC-3-soluja (2 x 10

6 solua /50 ui) ja sitä jatkettiin vastaaviin hoitoja koko kokeen ajan. Ravinnonotto ja painon mitattiin viikoittain. Lopussa kokeen (8 viikkoa sen jälkeen, kun PC-3-solujen implantointia), hiiret lopetettiin; primaareja kasvaimia leikattiin irti ja punnittiin. Kasvain viipale kullekin primaarikasvaimen kudos leikataan huolellisesti ja kiinnitettiin 10% puskuri-neutraloitu formaliini, parafiiniin upotettuja, ja leikattiin 4 pm: n paksuudelta immunohistokemiaa. Kaikki toimenpiteet, joilla eläimet tarkistettiin ja hyväksyttiin Institutional Animal Care ja käyttö komitean Beth Israel Deaconess Medical Center kanssa Opas hoito ja käyttö Laboratory Animals [32]. Eläin tutkimus toistettiin.

In situ havaitseminen apoptoottisten indeksin

Apoptoottiset solut määritettiin terminaalin deoksinukleotidyylitransferaasin-välitteisen deoksiuridiini trifosfaatti-biotiini-nick end merkintöjä (TUNEL) määritys (Chemicon International Inc , Billerica, MA) noudattamalla kuvataan protokollat ​​[30], [33], [34]. Kuusi edustavalla kunkin osan ilman nekroosia valittiin ja sekä apoptoottisten solujen ja koko tumat solut laskettiin valomikroskoopin alla 400-kertaisella suurennuksella. Apoptoottista indeksiä ilmaistiin prosentteina positiivisia apoptoottisten kasvainsolujen yhteensä kasvainsoluja, ja käsittelyn vaikutus apoptoosin ilmaistiin prosentteina kontrolliin.

immunohistokemiallinen määritys kasvainsoluproliferaation

leviämisen-indeksi arvioitiin laskemalla osuus solujen Ki-67 värjäys, noudattamalla laboratoriossa [31]. Sekä Ki-67-positiivisia jakautuvat solut ja koko kasvaimen solut laskettiin kuuden ei-nekroottista alueita kunkin osan avulla valomikroskoopilla 400 kertaisella suurennuksella. Lisääntyminen indeksi laskettiin prosenttiosuutena Ki-67-positiivisia kasvainsoluja täydelliseen kasvainsoluihin, ja käsittelyn vaikutus leviämisen ilmaistiin prosentteina kontrolliin.

immunohistokemiallinen havaitsemisen mikroverisuonitiheys (MVD ) B

MVD käytettiin markkerina kasvaimen angiogeneesiä ja kvantifioidaan immunohistokemiallisella värjäyksellä tekijä VIII noudattamalla aiemmin kuvattua menetelmää [30], [33], [34]. MVD laskettiin laskemalla mikroverisuonten 200 × kentät valomikroskoopilla kuudessa edustava sivustoja ilman nekroosia kunkin osan, ja hoidon vaikutusta angiogeneesiin ilmaistiin prosentteina kontrolliin.

Tilastollinen analyysi

tulokset ilmaistiin ryhmän keskiarvoina ± SEM ja analysoitiin tilastollisen merkitsevyyden varianssi- analyysillä [35], jota seuraa Fisherin suojattua pienimmän-merkittävä ero, joka perustuu kahden side vertailu koeryhmien keskuudessa käyttäen Statview 5.0 -ohjelman (SAS Institute, Inc. , Cary, NC).

P

0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

tukeminen Information

Kuva S1.

edustaja kromatogrammi, joka esittää puhtautta AMP analyyttisellä käänteisfaasi-HPLC: llä. HPLC Koeolosuhteet olivat: Instrumentti: Waters 2695 auto-näytteenotin ja valodiodin array (PDA) detektori HPLC-kolonni: Phenomenox C-18 (5 mikrometriä sisähalkaisija, 10 x 250 mm); Mobile vaiheet: A (H

2O 0,1% etikkahappoa) ja B (asetonitriili); Gradient kunto: 0-30 min, 5% B 35% B; 30-35 min, 35% B 95% B: tä; 35-40 min, 95% B: 5% B; 40-45 min, 5% B; Virtausnopeus: 1 ml /min.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0038802.s001

(TIF) B Kuva S2.

Edustavia FACS histogrammit esittää ajasta riippuva vaikutus AMP hoitoja (0, 20, ja 50 uM) vaikutus apoptoosiin PC-3-soluissa, mitattuna anneksiini-PI virtaussytometrialla määrityksessä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0038802.s002

(TIF) B Kuva S3.

vaikutus AMP PC-3 solun sytotoksisuus, mitattuna trypaanisinieksluusiolla määrityksessä. Soluja käsiteltiin AMP eri pitoisuuksilla 16 tunnin ajan, samalla migraatioon ja invaasion määrityksissä. Arvot ovat keskiarvoja ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta, kukin kaksoiskappaleet. Arvot ovat tilastollisesti merkityksettömiä ryhmien keskuudessa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0038802.s003

(TIF) B Kuva S4.