Krooninen sairaus

tiivistelmä

BBF2H7 on Endoplasmakalvosto (ER) -resident transmembraaninen perus- leusiinivetoketjupeptidit (bZIP) transkriptiotekijä, joka on katkaistiin transmembraanidomeeni säänneltyjen intramembrane proteolyysin vastauksena ER stressiä. Katkaistun sytoplasminen N-pää, joka sisältää transkription aktivaatiota ja bZIP domeenit translokoituu tumaan edistää ilmentymistä kohde- geenejä. Kondrosyyteissä, pilkotun luminal C-pää on solun erittämä ja helpottaa leviämisen viereisiin soluihin aktivoimalla Hedgehog signalointi. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että

Bbf2h7

ekspressiotasot kasvoi merkittävästi 1,070-2,567-kertaisesti useita kasvaimen muodoissaan, mukaan lukien glioblastoma verrattuna vastaaviin normaaleissa kudoksissa, käyttämällä ONCOMINE Cancer profilointia Database. Joissakin Hedgehog ligandista riippuvan syövän solulinjojen glioblastooma U251MG solujen BBF2H7 C-päähän erittyi soluista elatusaineeseen ja edistää syöpäsolujen lisääntymistä aktivaation kautta Hedgehog signalointi. Knockdovvn

Bbf2h7

ilmaisu tukahdutti leviämisen U251MG solujen vähen- tämisessä Hedgehog signalointi. Heikentynyt solujen lisääntymisen ja Hedgehog signalointi otettiin talteen lisäämällä BBF2H7 C-terminuksesta kasvatusalustaa

Bbf2h7

-knockdown U251MG soluja. Nämä tiedot viittaavat siihen, että eritetyn luminaalinen BBF2H7 C-pää on mukana Hedgehog ligandista riippuvan syövän solujen proliferaatiota aktivaation kautta Hedgehog signalointi. Siten BBF2H7 C-pää voi olla uusi kohde kehittämiseen syöpälääkkeiden.

Citation: Iwamoto H, Matsuhisa K, Saito A, Kanemoto S, Asada R, Hino K, et ai. (2015) edistäminen Cancer soluproliferaation katkeavat ja eritetty Luminal Verkkotunnukset ER Stress Anturi BBF2H7. PLoS ONE 10 (5): e0125982. doi: 10,1371 /journal.pone.0125982

Academic Editor: Maria Cristina Vinci, Centro Cardiologico Monzino, ITALIA

vastaanotettu 15 joulukuuta 2014; Hyväksytty: 27 maaliskuu 2015; Julkaistu: 08 toukokuu 2015

Copyright: © 2015 Iwamoto et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi.

Rahoitus: Tätä työtä tukee osittain avustuksia Takeda Science Foundation, The Yasuda Medical Foundation, The Nakajima Foundation, Tokion Biochemical Research Foundation, Kobayashi International tukisäätiön, NAGASE Science Technology Foundation , Mitsubishi Foundation, SEI Group CSR Foundation ja The Japan Society for Promotion of Science KAKENHI (25/677, 25251014, 25650069, 25861324, 24300135, 26460099). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

solulimakalvostoon (ER) on keskeinen solun organelle vastaa synteesin, taitto ja translaation jälkeisiä modifikaatioita proteiinien tarkoitettu eritysreitille. Erilaiset patofysiologisissa tiloissa, kuten ER kalsiumin ehtyminen, oksidatiivisen stressin, hypoglykemia, ilmaus mutanttiproteiinien ja hypoksia, aiheuttaa virheellisen proteiinien laskostumista, ja väärin laskostuneet tai avattu proteiinit kerääntyvät ER onteloon. Tällaiset ehdot, jotka kollektiivisesti kutsutaan ER stressiä, on potentiaalia aiheuttaa soluvaurioita. ER vastaa näihin häiriöihin aktivoimalla integroitu signaalinvälitysreitin kutsutaan avatulla proteiinivaste (UPR) [1,2]. Aktivointi UPR johtaa lyhytaikaisiin translaation vaimennus pienentää asetetut vaatimukset ER, transkription induktio koodaavien geenien ER-asukas chaperones helpottamiseksi proteiinilaskostumisen, ja ER-liittyvää hajoamista (ERAD) hajoaminen avatulla proteiineja, jotka ovat kertyneet ER. Nisäkässoluissa, on kolme vakiintunutta ER stressiä anturit: kaksijuosteinen RNA-riippuvaisen proteiinikinaasin kaltainen solulimakalvoston kinaasi (PERK), inositoli vaativa entsyymin 1 (IRE1), ja aktivoimalla transkriptiotekijän 6 (ATF6) [ ,,,0],3-5]. PERK suoraan fosforyloi α-alayksikköä, eukaryoottinen aloittamisesta tekijä (eIF2α), joka johtaa dramaattiseen vähenemiseen solun proteiinisynteesiä [6]. Kääntäen, ja paradoksaalisesti, fosforylaatio eIF2α myös ylössäätelee ilmentymisen ATF4 [1]. ATF4 transaktivoi ilmentymisen pro-apoptoottisen proteiinin, C /EBP-homologista proteiinia (CHOP), pro-selviytyminen proteiinit, kuten ER chaperones, ja anti-oksidatiivisen stressin proteiinit [7]. IRE1 käsittelee silmukoitumattoman muodot

X-box-sitova proteiini-1

(

Xbp1

) mRNA tuottaa liitettyjä muotoja mRNA [4,8]. XBP1 peräisin olevat proteiinit liitettyjä muotoja on

Xbp1

mRNA indusoida ER asuvan chaperones ja ERAD liittyviä molekyylejä. ATF6 lohkaistaan ​​sen transmembraanidomeeni by site-1 ja -2 proteaasien (S1P ja S2P, vastaavasti) vastauksena ER stressiin [5,8]. Pilkotun ATF6 N-pään translokoituu tumaan ja indusoi ilmentymistä ER-asuvien chaperones helpottaa proteiinin laskostumiseen.

Lisäksi kolmen kanonisen ER stressiä anturit, on uudentyyppisiä ER-stressi antureiden, jotka jakavat domeenit korkea sekvenssin samankaltaisuuden kanssa ATF6. Nämä transkriptiotekijät on transkription akti- ja perus leusiinivetoketjua (bZIP) domeeneja niiden N-terminuksessa ja sisältää BBF2H7 /CREB3L2 [9], OASIS /CREB3L1 [10,11], Luman /LZIP /CREB3 [12], CREBH /CREB3L3 [ ,,,0],13] ja CREB4 /AIbZIP /Tisp40 /CREB3L4 [14]. Yksi OASIS perheenjäsenten, BBF2H7, ilmentyy edullisesti rustosolujen [15,16]. BBF2H7 lohkaistaan ​​transmembraanidomeeni säänneltyjen intramembrane proteolyysiä (RIP) vastauksena ER stressiä. Katkaistun sytoplasminen N-pää, joka sisältää transkription aktivaatio ja bZIP domeenit translokoituu tumaan edistää ilmentymistä kohde- geenejä, mukaan lukien

Sec23a

[15]. Sen sijaan, pilkottu C-pää on solun erittyy, ja sitä sitoutuu sekä Indian hedgehog (Ihh) ja sen reseptorin, Patched-1 (Ptch1), jota seurasi aktivaatio Hedgehog (Hh) signalointia [16]. Reitti välittämän BBF2H7 C-pää on rooli leviämisen kondrosyyttien kehittää rustoa. Toiminnot sekä N- ja C-terminus ovat välttämättömiä kehittäminen hiiren rustoa.

Hh-signalointia tarvitaan solujen erilaistumista ja elinten muodostumiseen alkionkehityksen aikana [17]. Aikuisen, Hh signalointi pysyy aktiivisena joissakin elimissä, joissa se on osallisena säätelyssä kantasolujen ylläpitoon ja lisääntymistä. Nisäkkäillä, Hh-signalointireitin aloitetaan kolme Hh ligandeilla (Sonic Hedgehog [Shh], Desert siili [Dhh] ja Ihh) [18]. Hh ligandit sitoutuvat transmembraanisen hh-reseptorin, Ptch1. Ilman Hh-ligandien, Ptch1 estää funktio transmembraanisen proteiinin, Smoothenedin (SMO), joka aktivoi gliooma liittyvän onkogeenin 1 (Gli1) [19,20]. Once Hh ligandit sitoutuvat Ptch1, Smo vapautuu inhibitiosta ja edistää aktivointi Gli1 transkriptiotekijän. Aktivoitu Gli1 aloittaa transkription Hh kohdegeenien, kuten

Gli1

,

Forkhead laatikko L1

(

Foxl1

),

Ptch1

,

sykliini D1

ja

sykliini E1

[21].

Hh signalointi osallistuu myös syövän edistämiseen. Potilaat, joilla Gorlin oireyhtymä (tai tyvisolusyöpä luomi oireyhtymä) on perinnöllinen inaktivoivat mutaatiot Ptch1, mikä konstitutiivisesti aktiivisia Hh signaloinnin puuttuessa Hh ligandien [22]. Näillä potilailla on suuri esiintyvyys tyvisolusyöpien (BCC), ihon kasvain keratinosyyttien lisäksi medulloblastoomien ja rabdomyosarkoomiin. Lähes kaikissa tapauksissa satunnaista BCC johtuvat aktivointi Hh-signalointireitin kautta Ptch1 heterotsygoottisuuden menetys ja /tai inaktivoimalla tai aktivoivat mutaatiot SMO, jotka vähentävät sen inhibitioon Ptch1. Lisäksi useat Hh ligandista riippuvan syöpiä yliekspressio Hh-ligandien on havaittu viime vuosina, mukaan lukien keuhko-, haima-, rinta- ja eturauhasen syövissä [23,24]. Kaikissa tapauksissa nämä syövät vastata Hh-ligandien autokriinisellä tavalla. Hh ligandeja eritetään syöpäsolujen vaikuttamaan erittävien solujen (tai naapurimaiden syöpäsolujen) stimuloimaan solujen lisääntymistä ja /tai eloonjääminen, joka johtaa kasvaimen kasvua. Näin ollen spesifiset inhibiittorit Hh-signaloinnin voi toimia syövän vastaisina aineina. On kuitenkin epäselvää, kuinka Hh-ligandien ja niiden reseptori Ptch1 ja alavirran signalointia säännellään syöpäsoluja.

Kuten edellä on mainittu, BBF2H7 C-päähän aktivoi Hh-signaloinnin suoraan sitovia sekä Hh-ligandin ja Ptch1, joka edistää solujen lisääntymistä. Mielenkiintoista,

Bbf2h7

geeni tunnistettiin ensin kumppanina

fuusioitu sarkooma

(

FUS

) on kimeerinen geeni löytyy huonolaatuisen fibromyxoid sarkooma (LGFMS) [25]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että Hh ja Hh kohde- geenien yläreguloituja LGFMS potilailla [25,26]. Siksi me arveltu, että BBF2H7 voi olla tärkeä rooli leviämisen Hh ligandista riippuvan syöpäsoluja. Täällä, huomasimme, että halkaistut BBF2H7 C-pää erittyy tietyntyyppisten syöpäsolujen ja edistää solujen lisääntymistä aktivoimalla Hh-signaloinnin.

Materiaalit ja menetelmät

ONCOMINE mikrosirujen aineistoja

Bbf2h7

ilmaisu

Microarray kerättyä glioblastoma (Cancer Genome Atlas-glioblastoma multiforme ja Brain Ala asteisen gliooman DNA Kopioi numero Data, 2013), invasiivisia ductal rintasyöpä (Cancer Genome Atlas-invasiivinen rintakarsinooma Gene Expression Data, 2011), kohdunkaulan levyepiteelikarsinooma syöpä [27], eturauhasen adenokarsinooma [28], koolonadenokarsinooma [29], mahalaukun adenokarsinooman (Cancer Genome Atlas-Vatsa adenokarsinooma DNA Kopioi numero Data, 2013), ja haiman adenokarsinooma (Cancer Genome Atlas-Haiman adenokarsinooma DNA Kopioi numero Data, 2013) on käsiksi käyttämällä ONCOMINE Cancer profilointi Database (versio 4.4.4.4, www.oncomine.org) tutkimaan

Bbf2h7

ilmentymistä erilaisissa syövissä.

Soluviljely

HEK293T- (peräisin ihmisen alkion munuainen; American Type Culture Collection [ATCC]),

Bbf2h7

– /- hiiren alkion fibroblastien (MEF johdettu

Bbf2h7

– /- hiirillä käyttäen aiemmin julkaistu protokollia [15 ]), MCF7 (johdettu ihmisen rintasyöpä, ATCC) ja HeLa (johdettu ihmisen kohdunkaulan syöpä; ATCC) soluja kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (Life Technologies), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (FBS). LNCap (johdettu ihmisen eturauhassyövän, ATCC) -soluja kasvatettiin Roswell Park Memorial Institute keskipitkän-1640 (Life Technologies), joka sisälsi 10% FBS: ää. U251MG (johdettu ihmisen glioblastooma; JCRB Cell Bank) ja LS174T (johdettu ihmisen paksusuolen syöpä, ATCC) -soluja kasvatettiin Eaglen olennaisessa vähimmäisalustassa (DS Pharma), joka sisälsi 10% FBS: ää. Lievittää ER stressiä, syövän soluja käsiteltiin 4-fenyyli- (4-PBA, Wako), kemiallinen chaperone. Indusoimaan ER stressiä, syövän soluja käsiteltiin 1 uM thapsigargin (TG, Wako), estäjä ER Ca

2 + -ATPaasin.

RNA: n eristämistä, käänteistranskriptio-PCR (RT-PCR) ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Kokonais-RNA eristettiin guanidiini-fenoli-menetelmällä käyttäen ISOGEN (NIPPON GENE) mukaan valmistajan protokollaa. N alikvootit 1 ug puhdistettua RNA: ta käänteistranskriptio ensimmäisen juosteen cDNA: ta 20 ul: n reaktiotilavuudessa käyttäen 200 U Moloney-hiiren leukemiaviruksen käänteistranskriptaasia (Life Technologies) [30]. PCR suoritettiin käyttämällä spesifisiä alukesarjoja kokonaistilavuudessa 20 ui, joka koostuu 1 ui cDNA: ta, 0,5 uM kutakin aluketta, 0,2 mM dNTP: itä, 1 U DNA-polymeraasia (Agilent), ja PCR-puskuria (Agilent). Alukesekvenssit olivat seuraavat:

Gli1

eteenpäin, 5’GAAGCCGTATGTATGTAAGCTCC-3 ’;

Gli1

kääntää, 5′-CTTGGGCTCCACTGTAGAAATG-3 ’;

Foxl1

eteenpäin, 5’ACAGGCATAGAGGTGACTTTTGG-3 ’;

Foxl1

kääntää, 5′-TTCACAGAGGCTGAGAGTTTGG-3 ’;

Xbp1

eteenpäin, 5’ATGGATGCCCTGGTTGCTGAAG-3 ’;

Xbp1

kääntää, 5’GGGTCCAAGTTGTCCAGAATGC-3 ’;

β-aktiini

eteenpäin, 5’TCCTCCCTGGAGAAGAGCTAC-3 ’;

β-aktiini

käänteinen, 5’TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3 ’. PCR-sykliä parametrit olivat 20 s 94 ° C: ssa, 20 s 58 ° C: ssa ja 25 s 72 ° C: ssa 18-33 kierrosta (

Gli1

, 33;

Foxl1

, 31

Xbp1

, 25;

β-aktiini

, 18) ja sen jälkeen 72 ° C: ssa 5 min. Alikvootit (5 ui) kutakin reaktioseosta ajettiin elektroforeettisesti 4,8% polyakryyliamidigeeleillä. Tiheys kunkin kaistan kvantitoitiin käyttäen Photoshop Elements 6.0 (Adobe Systems).

analysoimiseksi mRNA ekspressiotasot, kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen Light Cycler 480 II (Roche) ja Light Cycler SYBR Green I Master (Roche). PCR-reaktiot suoritettiin käyttäen KAPA SYBR FAST qPCR Kit optimoitu Light Cycler 480 (KAPA). Kaikki tulokset normalisoitiin endogeenistä

β-aktiini

mRNA ja ilmaistiin suhteellisena kasvaa tai pienenee ilmentymisessä kontrolleihin verrattuna.

Western blotting

proteiinit uutetaan soluista käyttäen soluhajotuspuskurin (1% Triton X-100, 100 mM EDTA, 50 mM NaCl, 10 mM HEPES, 500 mM sakkaroosia, ja proteaasiestäjäseostabletit [MBL International]). Proteiinipitoisuudet solulysaateista määritettiin käyttämällä Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo). Yhtä suuret määrät proteiinia, ajettiin elektroforeesissa 12% SDS-polyakryyliamidigeeleillä, ja sitten siirretään polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Bio-Rad). Immunoblottausta, seuraavilla vasta-aineilla ja sen laimennoksia käytettiin: polyklonaalinen kaniinin anti-BBF2H7 C-päähän (Abcam; 1: 1000), polyklonaalista hiiren anti-BBF2H7 N-pää (luotu vasta-aine [15], 1: 1000), hiiren monoklonaalinen anti-β-aktiini (Sigma, 1: 3000), kanin polyklonaalista anti-interleukiini 6 (IL-6) (Abcam; 1: 250), alkalinen fosfataasi-konjugoitua anti-kani-IgG: tä (Sigma, 1: 3000), ja emäksinen fosfataasi-konjugoitua anti-hiiri-IgG (Enzo, 1: 3000). Leimatut proteiinit havaittiin käyttäen nitro-blue tetratsoliumkloridi (Wako) ja 5-bromi-4-kloori-3′-indolylphosphatase p-toluidiini suola (Roche).

immunosaostus

havaitsemiseksi BBF2H7 C-terminaalissa elatusaineessa, supernatantit inkuboitiin anti-BBF2H7 N-pää, anti-BBF2H7 C-terminaalissa, tai anti-IL-6-vasta-aineita yli yön. Sitten näytteet saostettiin proteiini G-agaroosihelmillä (Life Technologies), jota seurasi Western-blottauksella. IL-6: ta käytettiin latauskontrollina.

immunohistokemia

Kasvaimen kerättiin leikkauksen aikana Hiroshima University Hospital, jäädytettiin nestemäisessä typessä ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Leikkeitä fiksoitiin kylmässä asetonissa -20 ° C: ssa ja sitten 4% paraformaldehydiä fosfaattipuskuriliuosta. Immunovärjäykseen BBF2H7 C-pään, käytettiin anti-BBF2H7 C-terminus vasta-ainetta primaarisena vasta-aineena ja Dako Envision Kit (Agilent) havaitsemiseksi mukaan valmistajan suositusten mukaisesti. Kaikki menettelyt olivat mukaiset eettisen komitean Human Genome Research Hiroshiman yliopistosta.

Plasmidit ja transfektio

Ihmisen BBF2H7 täyspitkä, N- ​​ja C-pään cDNA saatiin blunt- end ligaatiolla PCR-tuotteita, jotka vastaavat aminohappoja 1-520, 1-377 ja 431-520 (GenBank, NP_919047.2), jossa on BiP (sitova immunoglobuliiniproteiinia) signaalipeptidin sekvenssin (aminohapot 1-16, GenBank , NP_005338.1) N-terminuksessa. BBF2H7 täyspitkä, N- ​​ja C-pään cDNA: t kloonattiin pcDNA3.1 (+) -vektoriin. HEK293T-soluja ja

Bbf2h7

– /- MEF-soluihin transfektoitiin kukin plasmidi käyttämällä Lipofectamine 2000 (Life Technologies) mukaisesti valmistajan protokollan.

Biotestejä soluproliferaation

U251MG-solut (1 x 10

5) maljattiin 6-cm: n maljoihin, viljeltiin 37 ° C: ssa 24 tuntia, ja sitten transfektoitiin salattu tai

Bbf2h7

pieni häiritsevä RNA (siRNA) käyttäen Lipofectamine 2000 mukaan valmistajan protokollaa. Sillä

Bbf2h7

pudotus, seuraavat sekvenssit käytettiin: 5′-GGAAGAAGGUAGAGGUUCU-3 ’(siBBF2H7-1) ja 5′-CCAGAAACCUGCUGAUCUA-3’ (siBBF2H7-2). U251MG soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 24 h transfektion jälkeen, ja sitten elatusaine korvattiin. Solujen lukumäärät laskettiin osoitettuina päivää transfektion jälkeen. siRNA: t hankittiin Bioneer (Daejeon, Etelä-Korea).

Lisäksi, sen jälkeen, kun transfektio salattu tai

Bbf2h7

siRNA: t,

Bbf2h7

-knockdown U251MG solut altistettiin kasvualustassa kerätään HEK293T-solut transfektoitiin tyhjällä vektorilla (vale) tai BBF2H7 C-päähän (C-Sup.), tai C-Sup. jossa BBF2H7 C-terminaalissa purettiin immunosaostuksella käyttämällä anti-BBF2H7 C-päässä vasta-ainetta (C-Sup. + Ab.). Solujen lukumäärät laskettiin osoitettuina päivää transfektion jälkeen. Solun proliferaatiomäärityksessä myös käyttää solun laskenta kit (WST-8-määritys, Dojindo) mukaan valmistajan protokollan.

Vahvista aktivointi Hh-signaloinnin BBF2H7 C-päähän, U251MG soluja käsiteltiin yhdistelmä-Shh (R 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

ilmentyminen BBF2H7 kasvaimissa ja eritys sen pilkotun C-pään syöpäsoluista

Bbf2h7

geeni tunnistettiin ensin kumppanina

FUS

on kimeerinen geeni löytyy LGFMS [25]. Näin ollen, on mahdollista, että BBF2H7 voi olla osallisena syöpäsolujen lisääntymistä. Olemme tutkineet ekspressiotasot

Bbf2h7

erilaisten kasvainten käyttäen ONCOMINE Cancer profilointi Database (kuvio 1A). Aineistot mukana 37, 61, 5, 28, 94, 94 ja 8 normaalia kudosnäytteitä, ja 582, 389, 40, 59, 52, 173 ja 32 pahanlaatuinen kudosnäytteistä glioblastooma, invasiivisen ductal rintasyöpä, kohdunkaulan levyepiteelikarsinooma syöpä, eturauhasen adenokarsinooma, paksusuolen adenokarsinooma, mahalaukun adenokarsinooman ja haiman adenokarsinooma, vastaavasti. Kuten on esitetty kuviossa 1A,

Bbf2h7

ekspressiotasot osoitti merkittävää lisäystä 1,070-2,567-kertainen useita kasvaintyypeissä verrattuna niiden vastaaviin normaaleihin kudoksiin. Sitä vastoin, ei ollut merkittävää voimistumista

Bbf2h7

ilmentymistä mahan tai haiman adenokarsinoomat, mikä osoittaa, että geeni-ilmentymisen on

Bbf2h7

on erityisesti parannettu joissakin kasvaintyypeissä.

(A) lisääntynyt ilmentyminen

Bbf2h7

ihmisen syövissä. Microarray aineistoja on kasvaimia saatavilla olevan ONCOMINE Cancer profilointi Database (versio 4.4.4.4, www.oncomine.org). Rasiakuvaajien osoittavat lisääntyneen ilmentymisen

Bbf2h7

aikana tuumorigeneesin erilaisten syöpien konstruoitiin ONCOMINE. Y-akseli edustaa tukin

2 mediaani-keskitetty intensiteetin (normalisoitu lauseke). Viiva laatikon sisällä edustaa mediaani lauseke arvo kullekin ryhmälle, ja ylä- ja alareunassa laatikon osoittavat 75

th ja 25

th persentiilit jakelun, vastaavasti. Linjat (viikset) kustakin laatikon ulotu 90

th ja 10

th persentiilit jakauman. Mustat pisteet ulkopuolella päät viikset muodostavat suurimman ja pienimmän datapisteitä. Rasiakuvaajien kuvaa jakelu

Bbf2h7

ilmaisu kussakin näytteessä ja Studentin

t

-testi antaa

P

arvon vertailun

Bbf2h7

ilmaisun välillä normaalien ja malignien otettiin kudosnäytteet suoraan ONCOMINE. Normaali paksusuolen kudosnäytteet mukana nouseva paksusuoli, laskeva paksusuoli ja peräsuoli. (B) Ennustettu peptidi piirteitä ihmisen BBF2H7. Transkription aktivaatio, perus leusiinivetoketjupeptidit (bZIP) ja transmembraanidomeenia, sekä site-1 proteaasin (S1P) päällä on merkitty. (C) alle ER stressin olosuhteissa, BBF2H7 kuljetetaan ER: sta Golgin laitteeseen ja katkaistiin S1P sivustolla [9]. Pilkotun BBF2H7 N-pään toimii transkriptiotekijän sitoutumisen kautta syklisen AMP-vaste-elementin (CRE) kohdegeenien [15]. Sen sijaan, pilkottu BBF2H7 C-pää on solun erittyy [16]. (D) Western blotting endogeenisen täyspitkän BBF2H7 ja N- tai C-päähän BBF2H7 käyttäen solulysaateista (vasen paneeli) tai elatusaineet (oikea paneeli) useiden ihmisen syöpäsolulinjojen. BBF2H7 N-päähän, BBF2H7 C-päähän tai IL-6 viljelyalustassa immunosaostettiin käyttäen anti-BBF2H7 N-pää (yläpaneeli), anti-BBF2H7 C-terminaalissa (keskimmäinen paneeli), tai anti-IL-6-vasta-aineita ( pohjapaneeli), tässä järjestyksessä. β-aktiini tai IL-6: ta käytettiin loading valvontaa. (E) RT-PCR-analyysi

Xbp1

mRNA: n ekspression useissa ihmisen syöpäsolulinjoissa.

Xbp1-s

ja

Xbp1-u

osoittavat saumattu ja silmukoimattoman muodot

Xbp1

, vastaavasti. Huomaa, että

Xbp1-s

todettiin kaikissa syöpäsolulinjoissa, mikä osoittaa, että nämä solut ovat parhaillaan ER stressiä. (F) RT-PCR-analyysi

Xbp1

mRNA: n ekspression U251MG soluissa, joita käsiteltiin 2 mM 4-PBA, kemiallinen chaperon, 3 tuntia. (G) kvantifiointi

Xbp1-s

ilmentymisen F. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD viidestä riippumattomasta kokeesta. **

P

0,01. (H) Western blottaus BBF2H7 in U251MG soluissa, joita käsiteltiin 1 uM thapsigargin (TG), estäjä ER Ca

2 + -ATPaasia, 6 tuntia. (I) Immunohistokemia aivojen osien välillä glioblastooma potilailla, jotka käyttävät anti-BBF2H7 C-terminus vasta-aineen. Vahvoja signaaleja havaittiin sekä sytosoliin syöpäsolut (merkitty nuolenkärki), ja niitä ympäröivien solunulkoiseen tilaan (merkitty nuolilla). Vasen paneeli esittää alhainen suurennos, ja oikea paneeli esittää suurennettuna vasemman paneelin. Scale palkit osoittavat 50 um (vasen paneeli) ja 10 um (oikea paneeli).

BBF2H7 lohkaistaan ​​transmembraanidomeeni vastauksena ER stressin (kuvio 1 B ja 1 C) [9]. N-päähän edistää ilmentymistä kohde- geenejä, mukaan lukien

Sec23a

[15]. Sen sijaan C-päähän erittyy soluista ja helpottaa leviämisen viereisten solujen aktivaation kautta Hh-signaloinnin kondrosyyteissä [16]. Seuraavaksi tutkimme ilmentyminen täyspitkän BBF2H7 ja sen pilkottiin N- ja C-terminaalissa lysaateissa seuraavista syöpäsolulinjoissa: glioblastoma U251MG, rintasyöpä MCF7, kohdunkaulan syöpä HeLa, eturauhassyövän LNCap ja paksusuolen syövän LS174T. Olemme havainneet, 80 kDa: n täyspitkä BBF2H7 ja sen pilkottiin N-pään (50 kDa) ja C-pää (20 kDa) lysaateissa lähes kaikki syövän solulinjat, paitsi LS174T-soluja (kuvio 1 D). BBF2H7 C-terminaalissa, mutta ei täyspitkä BBF2H7 tai sen N-päässä, havaittiin myös, että elatusaineet näistä solulinjoista, mikä osoittaa, että lohkaista C-pää erittyi näiden solujen elatusaineeseen. Pilkkominen BBF2H7 riippuu ER stressiä [9]. Siksi pyysimme onko syöpä solulinjoja käynnissä ER stressiä. Kuten on esitetty kuviossa 1 E-1G, silmukoitu muodot

Xbp1

[8], joka on markkeri ER-stressi, havaittiin kaikissa syöpäsolulinjoissa. Hoito U251MG solujen 4-PBA [31], kemiallista chaperone, vähensivät saumattu muotoja

Xbp1

basaali tasoja ja lievittää ER stressiä, mikä osoittaa, että syöpäsolut pyysimme oli alle ER stressin olosuhteissa. Lisäksi olemme vahvistaneet, että BBF2H7 katkaistiin vastauksena ER stressiä syövän soluissa (kuvio 1 H). Nämä tiedot osoittivat, että BBF2H7 pilkottiin ja sen C-terminaaliseen päähän oli solun erittyy vasteena ER rasitus homeostaasin näissä syöpäsolulinjoissa, paitsi LS174T-soluja. Seuraavaksi vahvistaa, että BBF2H7 proteiini ilmentyy tuumoreissa, teimme immunohistokemialla käyttämällä aivoleikkeiden peräisin glioblastoma potilaiden ja anti-BBF2H7 C-terminus vasta-aineen (kuvio 1 i). Vahvoja signaaleja havaittiin sekä sytosoliin syöpäsolujen ja niitä ympäröivän solunulkoisen tilan. Nämä tulokset osoittivat, että BBF2H7 oli hyvin ilmaistu glioblastooma ja että pilkotaan C-pää on solun erittyy syöpäsoluja.

Cancer solujen proliferaatiota Shh-riippuvaisella tavalla

On tunnettua, että BBF2H7 C-pää sitoutuu sekä Hh ligandin ja sen reseptorin, Ptch1, ja edistää Hh signalointi [16]. Tutkia, onko syöpä solulinjoja koholla BBF2H7 ilme näyttää tehostettu solujen kasvuun ja aktivoitumisen Hh-signalointireitin ligandista riippuvalla tavalla, käsittelimme nämä syöpäsolulinjoissa rekombinantti Shh (kuvio 2A-2C). Hoito yhdistelmä-Shh johtanut merkittävään ylösajon Hh kohdegeenien, kuten

Gli1

ja

Foxl1

in BBF2H7 ilmentävä syöpä solulinjoja ja parantaa solujen kasvua. Kuitenkin LS174T soluja, mikä ei ilmaissut BBF2H7, ei osoittanut hoitovastetta rekombinantti Shh. Nämä tulokset viittaavat siihen, että neljä syöpäsolulinjoissa, jotka erittävät BBF2H7 C-pää on parannettu solujen kasvua käytettäessä Shh-riippuvaisella tavalla.

(A) RT-PCR-analyysi Hh kohdegeenien useissa syöpäsolulinjoissa käsiteltiin 500 ng /ml rekombinanttia Shh 48 tuntia. (B) Quantitative real-time PCR-analyysit Hh kohdegeenien ilmentyminen A. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD viidestä riippumattomasta kokeesta. *

P

0,05, **

P

0,01. (C) syöpä solulinjoja viljeltiin 5 päivää käsittelyn jälkeen 500 ng /ml rekombinanttia Shh ja analysoitiin WST-8 määritykset päivänä 5. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD viidestä riippumattomasta kokeesta. *

P

0,05.

BBF2H7 C-päähän tehostaa Hh-signalointi syöpäsoluissa

Kuten kuviossa 1A ja 1 D, BBF2H7 kohosi joissain kasvaimissa ja syöpäsolulinjoissa. Olemme tutkineet roolit BBF2H7 N-pään ja C-pään soluproliferaatioon transfektoimalla ekspressiovektoreita syöpäsoluja. BBF2H7 N-pää vaikuttaa tuskin solujen lisääntymistä, mikä osoittaa, että N-pää ei ole mahdollista edistää soluproliferaatiota syöpäsoluissa. Sen sijaan, BBF2H7 täyspitkät ja C-pään hieman solujen lisääntymisen tehostuneen kontrolliin verrattuna, mutta erot eivät olleet merkittäviä (tietoja ei näytetty). Tuotannon BBF2H7 koko pituus ja C-pää, jonka ekspressiovektorit ei voi olla tarpeeksi korkea, jotta merkittävästi edistää soluproliferaatiota. Olemme sitä mieltä, että tuotettu BBF2H7 täyspitkä ja C-pää, jonka ekspressiovektorit oli pienempi vaikutus solujen proliferaatioon, koska endogeeninen BBF2H7 oli hyvin ilmaistu U251MG soluissa. Siksi me transfektoitu ihmisen BBF2H7 täyspitkä, N- ​​tai C-päähän tulee

Bbf2h7

– /- MEF-solut [15], jonka solujen lisääntyminen oli alentunut verrattuna villityypin MEF, poistaa vaikutuksia endogeenisen BBF2H7 soluproliferaatioon (kuvio 3A ja 3B). Transfektio BBF2H7 täyspitkän tai C-päähän tulee

Bbf2h7

– /- MEF palauttaa solujen lisääntymistä, mutta transfektio BBF2H7 N-pään ei yksinään parantaa solujen lisääntymistä, mikä osoittaa, että ihmisen BBF2H7 C -pään, mutta ei N-päähän, on mahdollista edistää soluproliferaatiota.

(A, B)

Bbf2h7

– /- MEF-solut viljeltiin 5 päivää transfektion jälkeen jossa BBF2H7 täyspitkän (Full), N-päässä (N), C-pää (C) tai tyhjän vektorin (vale), ja analysoitiin solujen laskemalla 5. päivänä (A) ja WST-8-määritys ilmoitettuina ajankohtina pistettä (B). WT ja KO osoittavat villityypin MEF ja

Bbf2h7

– /- MEF, vastaavasti. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD viidestä riippumattomasta kokeesta. *

P

0,05, **

P

0,01. (C) RT-PCR-analyysi Hh kohdegeenien useissa syöpäsolulinjoissa alttiina väliaine kerätään HEK293T-solut transfektoitiin BBF2H7 C-päähän (C-Sup. +) Tai tyhjällä vektorilla (C-Sup.-) 48 h. (D) Quantitative real-time PCR-analyysit Hh kohdegeenien ekspressiota C. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD viidestä riippumattomasta kokeesta. *

P

0,05, **

P

0,01. (E) RT-PCR-analyysi Hh kohdegeenien U251MG soluissa käsitelty C-Sup., C-Sup. tyhjentynyt BBF2H7 C-terminaalissa immunosaostuksella käyttämällä anti-BBF2H7 C-päässä vasta-ainetta (C-Sup. + Ab.), tai C-Sup. kun läsnä on 5 uM syklopamiinin (C-Sup. + CPN). Mock osoittaa kasvualusta kerätään HEK293T-solut transfektoitiin tyhjällä vektorilla. (F) Quantitative real-time PCR-analyysit Hh kohdegeenien ilmentyminen E. Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD viidestä riippumattomasta kokeesta. *

P

0,05, **

P

0,01. (G, H) U251MG soluja viljeltiin 5 päivää sen jälkeen, kun väliaine hoidon ja analysoitiin solujen laskemalla 5. päivänä (G) ja WST-8 määrityksiä osoitetussa päivää (H). Virhepalkit edustavat keskiarvoa ± SD viidestä riippumattomasta kokeesta. *

P

0,05, **

P

0,01.

erittyy BBF2H7 C-pää on raportoitu edistää soluproliferaatiota kondrosyyttien aktivaation kautta Hh-signaloinnin [16]. Jotta voitaisiin edelleen tutkia vaikutuksia eritetyn BBF2H7 C-terminus on syöpäsolujen proliferaatiota, syöpä solulinjoja altistettiin väliaine kerätään HEK293T-soluissa, jotka on transfektoitu ihmisen BBF2H7 C-päähän (C-Sup.), Joka sisältää BiP signaalipeptidisekvenssiä sen N-päästä, jotta sen erittymistä soluista. Hoito syöpäsolun linjat C-Sup. johtanut merkittävään ylösajon Hh kohdegeenien, kuten

Gli1

ja

Foxl1

, kaikissa solulinjoissa lukuun ottamatta LS174T soluja (kuvio 3C ja 3D). Erityisesti, U251MG ja LNCap-solut osoittivat merkittävämpiä induktiota Hh kohdegeenien, mikä osoittaa, että vaikutukset C-Sup. on Hh signalointi olivat erilaisia ​​joukossa syöpäsolun linjat. Sen varmistamiseksi, että erittyvän BBF2H7 C-terminaalissa edistetään soluproliferaatiota aktivoimalla Hh-signaloinnin, me tutki Hh-signalointi U251MG soluissa olisi silti aktivoidaan jälkeen ehtyminen BBF2H7 C-pään välillä C-Sup. immunosaostuksella käyttäen anti-BBF2H7 C-päähän-vasta-ainetta (C-Sup. + Ab .; kuvio 3E-3H). Kuten odotettua, ehtyminen BBF2H7 C-pään välillä C-Sup. aiheutti merkittävän laskun ilmaus Hh kohdegeenien ja solujen lisääntymisen. Lisäksi hoito syklopamiinilla (CPN) [32], joka on Smo antagonisti, joka estää Smo ja sen loppupään Hh signalointi, peruutettu vaikutukset C-Sup. induktioon Hh kohdegeenien, kuten

Gli1

ja

Foxl1

(kuvio 3E ja 3F). Lisäksi edistäminen soluproliferaation C-Sup. tukahdutettiin käsittelemällä CPN (kuvio 3G ja 3H), mikä viittaa siihen, että eritetyn BBF2H7 C-pää toimii vastavirtaan Smo ja parantaa Hh ligandista riippuvaa proliferaatiota.

vaikutukset

Bbf2h7

siRNA on