Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cancer puolella väestöstä (SP) solut, joita usein kutsutaan syövän kantasoluja, ovat ajatellaan olevan vastuussa keuhkosyöpä kemoterapian resistenssin, ja tällä hetkellä ole lääke voi erityisesti näiden solujen. Oletamme, matalan molekyylipainon hepariini (LMWH) voivat vaikuttaa biologisiin ominaisuuksiin SP-soluja ja niitä voidaan käyttää kliinisesti kohdistaa näitä soluja. Tämän testaamiseksi SP solut eristettiin sisplatiinin (DDP) kestävä keuhkoadenokarsinooma A549 /DDP-solujen virtaussytometria-lajittelu. Verrattuna ei-SP-soluissa, SP-soluissa muodostunut lisääntynyt pesäkkeiden lukumäärät

in vitro

, ja oli 1000-kertainen kasvainten muodostumiseen

in vivo

. Lisääntymistä ja apoptoosin analyysit osoittivat LMWH ei ollut merkittävää vaikutusta keuhkojen SP soluproliferaatioon tai apoptoosin. Kuitenkin LMWH keuhkojen SP solujen pesäkkeiden muodostumista kyky ja proteiinin ilmentymistä monilääke kuljettaja, ABCG2, FACS ja western blot -analyysit vaikuttamatta sen mRNA-tasoja RT-PCR. Johdonmukaisesti, immunohistokemia värjäykset on ABCG2 in LMWH-kasvaimen kudokset olivat vähentyneet huomattavasti verrattuna kontrolleilla. Lisäksi löysimme proteasomaalisten estäjä MG132, mutta ei lysosomaalisiin estäjiä leupeptiiniä ja pepstatiini A, voisi palauttaa ABCG2 proteiinin tasot LMWH-käsiteltyjen SP-soluissa. Nämä viittaavat siihen, LMWH ablates keuhkojen SP solujen chemoresistance by proteasomin välittämän vähentämiseen ABCG2 proteiinin tasot vaikuttamatta sen mRNA-tasoja. Olemme myös päättäneet LMWH yhdistettynä sisplatiinin voisi voittaa sisplatiini-vastus ja aiheuttaman keuhkotulehduksen SP solujen apoptoosin sekä

in vitro

ja

in vivo

. Tutkimus tarjoaa kokeellisen perustan yhdistämällä LMWH, joka kohdistuu keuhkojen SP soluja, kemoterapian kanssa parantaa keuhkosyöpää selviytymistä.

Citation: Niu Q, Wang W, Li Y, Ruden DM, Wang F, Li Y et ai. (2012) pienimolekyylinen hepariini Ablates Keuhkosyöpä Cisplatin-Resistance indusoimalla Proteasome välittämä ABCG2 proteiinien hajoaminen. PLoS ONE 7 (7): e41035. doi: 10,1371 /journal.pone.0041035

Editor: Giuseppe Viglietto, University Magna Graecia, Italia

vastaanotettu: 12 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 17 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 23 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Niu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Hanke tukivat tieteellisen tutkimuksen säätiön Palautetut Overseas Kiinan Scholars, China State Opetusministeriö (nro 2007-1108) ja QN ja National Institutes of Health myöntää ES012933 DMR. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin syöpäkuolemien syy maailmanlaajuisesti. Tällä hetkellä, keuhkosyöpä eloonjäämisluvut ovat köyhiä, jossa on 5-vuoden eloonjäämisaste 15% [1].

Syöpä kantasolu (CSC) teorian mukaan kasvaimia järjestetään hierarkkinen tavalla kuin normaaleissa kudoksissa , jossa osa-populaatio tuumorigeenisen kantasolujen kaltaisia ​​soluja, jotka ovat solunsalpaajaresistentti ja tuottaa eriytetty kasvainsolut [2]. Side väestöstä (SP) soluja CSC kaltaisia ​​ominaisuuksia ensin tunnistettu leukemia ja myöhemmin eristetään kiinteä kasvain, kuten rinta-, aivo-, keuhko-, maksa-, eturauhassyöpä, paksusuolen, haiman, ja pään ja kaulan alueen syövät [3] – [9] . SP-solut ilmentävät korkeita tasoja ATP: n sitoutuminen kasetin (ABC) multidrug transporter proteiinit, joiden uskotaan olevan perusteella kemoterapian resistenssin ja hoidon epäonnistumisen. Rintasyöpä resistance protein (BRCP /ABCG2), jäsen ABC-proteiinien perhe, on merkittävä lääke kuljettaja, joka pidetään avainasemassa suojaamisessa SP solujen sytotoksisten aineiden, kuten sisplatiinin, ja on mukana monilääkeresistenssin [10 ] – [12].

Vaikka monia aineita, jotka kohdistuvat CSC soluja on tunnistettu, nämä mahdolliset aineet ovat kaukana käytettäväksi klinikalla. Ehdokas CSC solu kohdennusmolekyylejä vaikuttaa Wnt, EpCAM, Hedgehog, ja Delta /Notch signalointi, kun taas muut lähestymistavat mukaan lukien anti-Delta-like 4 ligandi (DLL4) vasta-aine, salinomysiinin, metformiini, TGFli, sulforaphane, ja muut on testattu muuttaa CSC lääkeresistenssideterminantit ominaisuudet [13] – [17]. Vaikka monet näistä aineista vaikuttavat lupaavilta, erityisesti

in vitro

, suuri ongelma erityisten kohdistamista CSCS soluihin ja välttäminen

in vivo

myrkyllisyys säilyy.

Pienmolekylaarinen hepariini (LMWH) hyväksyttiin FDA: n vuonna 1998 antikoagulanttihoitoa ja on ylläpitäjä turvallisesti yli 13 vuotta [18]. Tutkimukset osoittivat, että pienimolekyylinen hepariini vähensi syövän kuolleisuutta potilailla, joilla syvä laskimotukos erilaisissa syövissä, joka ei liity eroja kuolleisuudessa Tromboembolian [19] – [21]. Vaikka useat kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että LMWH vähensi kuolleisuutta ja pidensi elinaikaa potilailla, joilla oli pitkälle edenneitä kiinteitä maligniteetti, mekanismin, jolla LMWH kohdistaa syövän vastainen vaikutus jää määrittelemätön [22] – [25].

Hypoteesimme LMWH voi olla mahdollisuus muuttaa biologiset ominaisuudet keuhkojen SP solujen CSC kaltaisia ​​ominaisuuksia. Siksi tämä tutkimus tutkii onko LMWH vaikuttaa keuhkojen SP solujen lisääntymistä, apoptoosin, ja chemoresistance sekä kasvaimen kasvua

in vivo

ja jonka mekanismia LMWH kestää vaikutuksia. Meidän tutkimukset osoittavat LMWH voisi olla turvallinen keuhkojen SP solu huumeita, joita voitaisiin heti käyttää klinikalla voittaa kemoterapian resistenssin ja parantaa keuhkosyöpää selviytymistä.

Tulokset

Side Väestö lajittelu

Virtaussytometrianalyysi kanssa Hoechst33342 värjäys osoitti, että SP 10% -17% soluista oli olemassa A549 /DDP soluja. Positiivisena kontrollina, numerot SP-soluja vähentynyt läsnä ollessa Verapamiili, joka on lääke, jonka tiedetään estävän ABC trasporter pumpun vastaa puolella väestön fenotyyppi. Puhtaus SP-solujen oli 95% (keskimäärin 97%) ja puhtaus ei-SP-soluissa oli 95%. SP ja ei-SP A549 /DDP soluja lajiteltiin erikseen ja käytetään edelleen kokeissa (kuvio 1).

(A) A549 /DDP soluja inkuboitiin Hoechst 33342, ilman verapamiili, ja kehystetty alue osoittaa SP FACS. (B) A549 /DDP soluja inkuboitiin Hoechst 33342: n läsnä ollessa verapamiilin, ohjaus tunnistaa SP alueen FACS. Edustavia micrographs A549 /DDP muodostuneiden pesäkkeiden kuluttua 10 vrk (C) SP-soluissa ja (D) ei-SP-soluissa kasvatettu seerumittomalla alustalla ja (E) SP-soluissa (F) ei-SP soluja käsiteltiin LMWH, asteikko bar = 50 um. (G) Log pesäkettä muodostavaa tehokkuutta (TAE) SP ja ei-SP-soluja kasvatettiin seerumittomassa elatusaineessa,

p

0,05. (H) Kasvaimet muodostetaan siirrostuksen jälkeen erilaisten lukumäärien A549 /DDP puolella väestöstä (SP) ja ei-SP soluja NOD /SCID-hiirissä 14 päivän kuluttua.

LMWH Vähentää SP Cell Colony Formation Kyky

kyky SP ja ei-SP solujen muodostamaan pesäkkeitä testattiin

in vitro

. Colonies molempien solutyyppien näkyivät 10 päivän jälkeen; kuitenkin, pesäkkeiden lukumäärä lisääntyi merkitsevästi SP-soluissa verrattuna ei-SP-soluissa. Log 10 pesäkkeen muodostavaa tehokkuutta (TAE) ja SP-solujen oli merkittävästi suurempi kuin ei-SP-soluja (1,544 ± 0,150 vs. 0,301 ± 0,082,

p

0,05, kuvio 1). LMWH vähensi CFE SP-soluissa (1,544 ± 0,150 vs. 0,812 ± 0,082,

p

0,05) verrattuna ei-SP-soluissa (0,301 ± 0,082 vs. 0,295 ± 0,053, p 0,05).

SP solut ovat kasvaneet

in vivo

kasvainten muodostumiseen

in vivo

tuumorigeenisia määritys osoitti, että 5 x 10

3 SP soluja riittää kasvainten muodostumiseen

in vivo

, kun taas enemmän kuin 5 × 10

6 ei-SP soluja tarvitaan aloittamaan kasvaimia (kuvio 1). Kasvainten havaittiin kaikissa kuudessa hiiriä, joihin injektoitiin 5 x 10

5 ja 5 x 10

4 SP-soluissa, mutta ei tuumorin havaittiin hiirissä, joihin injektoitiin samalla määrällä ei-SP-soluissa. Ei havaittu kasvaimia, kun 1 x 10

6 ei-SP soluja istutettiin. Olemme päätellä, että oli suurempi kuin 1000-kertainen ero aiheuttavan kasvaimia välillä SP ja ei-SP-soluissa.

LMWH ei vaikuta SP Cell Proliferation

Vaikutus LMWH SP soluproliferaatioon oli määritettiin käyttäen MTT-määritystä. LMWH ei ollut merkittävää vaikutusta SP soluproliferaatioon kontrolliin verrattuna SP soluja (eston määrä LMWH käsiteltyjen SP-soluissa oli 3,11% ± 0,20%,

p

0,05, kuva 2).

anneksiini V-värjäyksen (A) kontrolli SP-soluissa (B) SP käsiteltyjä soluja LMWH (C) SP-soluissa sisplatiinia ja (D) SP soluja käsiteltiin LMWH sisplatiinia. (E) kvantifiointi apoptoosin hintojamme A549 /DDP SP solujen aiheuttama LMWH ja DDP. Mitään merkittävää eroa ei havaittu kontrolli ja LMWH käsiteltyjen SP-soluissa. Indusoiman apoptoosin LMWH ja DDP oli huomattavasti korkeampi kuin DDP yksinään (

p

0,05). (F) esto määrä LMWH-käsiteltyjen A549 /DDP SP solujen MTT-määritys. Mitään merkittävää eroa ei havaittu esto valvonnan ja LMWH käsiteltyjen SP-soluissa.

LMWH Lisäykset Sisplatiini (DDP) aiheutti apoptoosia SP Solut

Vaikutus LMWH on apoptoosin SP-soluissa analysoitiin FACS. Ei ollut merkittävää eroa määrä apoptoosin LMWH käsiteltyjen SP-soluissa ja ohjaus SP soluja (7,21% ± 0,81% vs. 8,01% ± 0,91%,

p

0,05); kuitenkin, määrä apoptoosin LMWH plus DDP käsiteltyjen SP soluja (65,89% ± 5,98%) oli merkittävästi suurempi kuin SP soluja käsiteltiin DDP yksinään (45.74% ± 4,12%,

p

0,05) ja ohjaus SP-soluja (8,01% ± 0,91%,

p

0,05, kuvio 2).

LMWH Vähentää ilmentäminen SP Cell Surface Marker ABCG2

A549 /DDP SP solut ilmentävät ABCG2, CD243 (p-gp) ja CD24 korkeilla tasoilla. Inkubaation jälkeen LMWH: ssa 36 tuntia, ABCG2 proteiinin ilmentyminen väheni merkittävästi SP-soluissa: ABCG2 ilmentävien solujen väheni 42,25% ± 4,11%: sta 9,92% ± 4,08%, (

p

0,05, kuvio 3) . Mitään merkittävää muutosta ei havaittu ilmentyminen p-gp ja Oct-4 kanssa inkuboinnin jälkeen LMWH (kuva 3).

(A) Expression of ABCG2 (CD338) valvonta SP-soluissa ja (B) aiheuttama LMWH A549 /DDP SP-soluissa. (C) Expression of ABCG2 (CD338) kontrolleissa tuumorisoluissa ja (D) aiheuttama LMWH A549 /DDP SP vierassiirrettä kasvainsoluja. (E) kvantifiointi ilmentymisen CSC merkki ilmaisun aiheuttama LMWH SP-soluissa ja ksenografti- syöpäsoluja. LMWH merkittävästi vaimentua ilmentymisen ABCG2 FACS (

p

0,05).

FACS analyysi ABCG2 ekspressio tuumorisoluissa

Solut saatu ksenografti kasvain kudokset ilmaisi ABCG2, CD243 (p-gp) ja CD24. Proteiini ilmentyminen ABCG2 kasvainkudoksissa LMWH käsitellyistä hiiristä olivat merkittävästi alhaisemmat kuin kontrollihiirillä (30.38% ± 2,13% vs. 20,22% ± 2,01%,

p

0,05, kuva 3). Mitään merkittävää muutosta ei havaittu ilmentyminen p-gp ja Oct-4 kanssa inkuboinnin jälkeen LMWH (kuva 3).

LMWH ei vaikuta ABCG2 mRNA ilmentäminen SP Solut ja kasvainsolujen RT-PCR

Sen määrittämiseksi, LMWH affets ABCG2 ilmentymisen mRNA-tasolla, suoritimme qRT-PCR-analyysi SP-soluja käsiteltiin LMWH: ssa 16 tuntia ja kasvainsolujen LMWH käsiteltyjen ja kontrollihiirten. Mitään merkittävää muutosta löytyi ABCG2 mRNA-tasolla seuraavat LMWH hoidon (kuva 4). Siten LMWH epätodennäköistä vaikuttaa ABCG2 ilmaus sen mRNA tasolla.

(A) ABCG2 mRNA: n ilmentymisen muutoksia LMWH kasvaimen soluihin ja LMWH käsiteltyjen SP-soluissa. Kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR osoittaa, että ilmaukset ABCG2 mRNA ei merkittävästi muuttunut LMWH kasvaimen solut tai LMWH käsiteltyjen SP-soluissa verrattuna kontrolleilla (

p

0,05). β-aktiini käytettiin sisäisenä referenssinä. (B) Western blot-analyysi ABCG2 ilmaisujen SP-soluissa käsitelty LMWH, LMWH + MG123, LMWH + pepstatiini A + leupeptiiniä, ja valvonta. SP-solut saivat ensin LMWH tai ohjaus 10 tuntia, ja sitten MG132 (10 uM), Pepstain A + leupeptiiniä (kutakin 100 ug /ml), tai kontrollina lisättiin vastaavasti ja inkuboitiin 6 tunnin ajan. Sitten solut kerättiin western blot analyysiä. β-aktiini käytettiin latauskontrollina. Tiheydet ABCG2 proteiinivyöhykkeet Länsi blot kvantitoitiin kanssa Määrä One-4.6.2-ohjelman. (C) ABCG2 ilmaisuja LMWH käsitelty ja ohjaus tuumorikudoksia (IHC, SP x 200). Keskimääräinen SI pistemäärä ABCG2 ilmaisun LMWH kasvaimen kudokset oli 3,63 verrattuna keskimääräiseen SI pistemäärä 9.13 hallinnassa tuumorikudoksissa (3,63 ± 1,69 vs. 9,13 ± 2,03,

p

0,05).

ABCG2 Protein Expression voidaan palauttaa jonka proteasomaalisten estäjä MG132 in LMWH saaneilla SP Cells

Koska emme löytäneet merkittävää muutosta ABCG2 mRNA tasojen SP ja kasvaimen soluihin, testasimme jos LMWH indusoima ABCG2 väheneminen johtuu ubikitiini-välitteisen protolysis tai lysosomissa. Tämän testaamiseksi SP soluja käsiteltiin LMWH, LMWH + MG132, ja LMWH + Pepstatin A + Leupeptiini. Kuten on esitetty kuviossa. 4, ABCG2 proteiinin ilmentymistä LMWH käsitelty SP-soluissa oli merkittävästi vähentynyt verrattuna hallinnassa 16 tunnin kuluttua hoidon. Vähennys voidaan palauttaa proteasomaalisten estäjä MG132 kohtelustaan ​​lysosomaalisen estäjät pepstatiinia plus leupeptiiniä ei ollut vaikutusta. Nämä viittaavat siihen, että LMWH aiheuttama ABCG2 proteiinien hajoaminen kautta proteasomireitillä reitin.

LMWH hoito Vähentää ABCG2 Protein Expression kasvainkudoksessa immunohistokemiallisesti

ABCG2 ilmentymistä esiintyy eri vahvuisia ja eri solujen jakaumia immunohistokemiallisesti värjäys . Merkittävästi alhainen ilmentyminen ABCG2 havaittiin LMWH kasvaimen kudokset verrattuna kontrolleihin. Sen jälkeen lavastus kriteerit tahra intensiteetti (SI), keskimääräinen SI pistemäärä ABCG2 ilmaisun LMWH kasvaimen kudokset oli 3,63 verrattuna keskimääräiseen SI pistemäärä 9.13 hallinnassa tuumorikudoksissa (3,63 ± 1,69 vs. 9,13 ± 2,03,

p

0,05, kuva 4).

Sisplatiini Vieraslajisiirteen Growth Delay korotetaan LMWH

hallinto LWMH plus DDP A549 /DDP tuumoreita kantavaa hiirtä merkittävän vähenemisen kasvaimen kasvu verrattuna DDP yksin (0,17 ± 0,05 cm

3 vs. 0.29 ± 0,06 cm

3

p

0,05) tai ohjaus hiirillä (0,44 ± 0,09 cm

3

p

0,05) 30 päivän jälkeen. A549 /DDP kasvainta kantavien nude-hiiriin, erot LMWH yhdistettynä sisplatiiniin ja sisplatiinin käsiteltyjen kasvainten oli merkittävä 25 vuorokauden kuluttua (0,17 ± 0,03 cm

3 vs. 0,24 ± 0,08 cm

3

p

0,05) ja sisällä 23 päivää kontrollieläimiltä (0,16 ± 0,09 cm

3 vs. 0,27 ± 0,09 cm

3

p

0,05, kuva 5). Mitään merkittävää eroa kasvaimen tilavuuden LMWH ja DDP ryhmiä havaittiin päivästä 8-30 (kuva 5).

A549 /DDP SP-soluja ympättiin Balb /c-nude-hiiret ja kasvainten tilavuudet kirjattiin alkaa päivänä 1 hoidon normaalilla suolaliuoksella ohjaus, LMWH, DDP ja DPP plus LWMH. Erot Kasvaimen koot LMWH yhdistettynä sisplatiiniin ja sisplatiinin käsiteltyjen kasvainten oli merkittävä 25 vuorokauden kuluttua (0,17 ± 0,03 cm

3 vs. 0,24 ± 0,08 cm

3

p

0,05) ja sisällä 23 päivää kontrollieläimiltä (0,16 ± 0,09 cm

3 vs. 0,27 ± 0,09 cm

3

p

0,05). Merkitsevää eroa kasvaimen tilavuuden LMWH ja DDP ryhmää löytyi päivä 8-30.

Keskustelu

eristäminen keuhkojen SP solujen CSC kaltaisia ​​ominaisuuksia ja olemassa olevien lääkkeet, jotka muuttavat keuhkojen SP-soluissa ja voittamaan chemoresistance voivat tarjota innovatiivisia strategioita parantaa kliinistä tulosta keuhkosyöpä. Olemme osoittaneet, että SP soluja A549 /DDP sisplatiini kestävä ihmisen keuhkojen adenokarsinoomasolua rikastuvat CSC kaltaisia ​​ominaisuuksia kuin ne ovat huomattavasti pesäkkeiden muodostumisen

in vitro

ja tuumorigeenisyystesti

in vivo

, mikä osoittaa, että A549 /DPP SP solut antavat hyvän mallin tutkia keuhkojen SP-soluissa ja uusi järjestelmä tutkia chemoresistance.

Tutkimuksemme osoittaa, että LMWH ei suoraan tappaa keuhko- SP soluja tai indusoivat SP-solujen apoptoosin

vuonna vitro

. Kuitenkin LMWH sensitizes sisplatiini kestävä SP solujen sisplatiini aiheuttaman apoptoosin

in vitro

.

In vivo

kokeet osoittavat, että LMWH yhdistettynä sisplatiinin merkittävästi estyy sisplatiini kestävä -tuumoriksenografti kasvua. Lisätutkimukset osoittavat, että LMWH vähentää merkittävästi ABCG2 proteiinin ilmentymisen, FACS ja western blot-analyysit. Yoh havaittu, että ilmaus ABCG2, mutta ei Pgp, MRP1, MRP2, ja MRP3, oli ennustava tekijä köyhien kliinistä tulosta kehittyneiden pienisoluista keuhkosyöpää, vaikka rooli ABCG2 kuljetusmolekyyleinä platinaa konjugaattien on edelleen kiistanalainen [12]. Tuloksemme ovat yhdenmukaisia ​​havaintonsa ja kaikki nämä osoittavat selvästi ABCG2 on huume kuljettaja, jolla on merkittävä rooli sisplatiinin resistenssin SP-soluissa. Immunohistokemia analyysit osoittivat johdonmukaisesti, että LMWH vähentää merkittävästi ABCG2 proteiinin ilmentymistä LMWH-kasvaimen kudokset verrattuna kontrolleihin. Kaikki nämä viittaavat siihen, että LMWH voi estää chemoresistance SP solujen vähentämällä ABCG2 proteiinin ilmentymisen vaikuttamatta sen mRNA.

Lisätutkimukset paljastavat, että ABCG2 proteiini väheneminen SP-soluissa johtui aiheuttamaa hajoamista LMWH läpi ubiquitin- proteasomireitillä polku koska proteasomaalisten estäjä-MG132, mutta ei lysosomaalisiin inhibitors- leupeptiiniä ja pepstatiini A palauttaa ABCG2 proteiinin ilmentymistä LMWH-käsiteltyjen SP-soluissa. Spekuloida, että LMWH voi sitoutua ABCG2 SP solukalvojen ja aiheuttaa ubiquitinization ja hajoaminen, mikä vähentää chemoresistance keuhkojen SP-soluissa.

LMWH on turvallinen veren hyytymistä estävä aine, jota käytetään koagulantti ja muiden veren hyytymistä olosuhteissa, jotka on käytetään syövän hoidossa yli vuosikymmenen [18]. Takautuva tiedot viittaavat siihen, että se voisi parantaa selviytymistä joillakin syöpäpotilailla, mutta tarkka mekanismi on epäselvä [26]. Kokeellisissa malleissa osoittavat LMWH kykenee inhiboimaan tuumorin kasvua, invaasio, etäpesäke, angiogeneesi, matriisin muodostuminen ja kääntää monilääkeresistenssi [27] – [31]. Tämä tutkimus osoittaa, että LMWH voisi yksinään kohtalaisen vähentää kasvaimen kasvua

in vivo

vaikka se ei voinut aiheuttaa kasvainsolujen apoptoosin suoraan

in vitro

. Syynä voi olla se, että LMWH kykenee sen kasvainta estävä vaikutus häiritsemällä kasvainsolun sitoutuminen, invaasio, angiogeneesi, tai microenvironement [32], [33].

Tietääksemme tämä tutkimus on ensimmäinen raportti, joka LMWH voi estää chemoresistance keuhkojen SP solujen vähentämällä ABCG2 proteiini ilmaisuja proteasomin riippuvaa hajoamista. Kyky LMWH herkistää SP solujen kemoterapia indusoimalla ABCG2 hajoamisen kautta proteasomireitillä reitti voi antaa selityksen tuntemattoman mekanismin, jonka LMWH parantaa kemoterapia vasteen ja eloonjäämisen syöpäpotilailla [28], [34].

Lopuksi meidän tutkimusten mukaan LMWH vähentää keuhkosyöpää chemoresistance kautta asiakkuutta ABCG2 proteiinien hajoaminen kautta proteasomireitillä reitin. Yhdistelmä LMWH sisplatiinin voitaisiin kohdistaa sekä solunsalpaajaresistentti keuhko- SP-soluissa ja chemosensitive kuin SP syöpäsoluja, tarjoaa tehokkaan uuden strategian keuhkosyövän hoitoon. Kuten LMWH voidaan käyttää riippumatta hypercoagulant olosuhteet ja sivuvaikutukset ovat hyvin siedettyjä, kliininen käyttö LMWH keuhkosyövässä on paljon potentiaalia. On selvää, lisäksi kliinisissä tutkimuksissa LMWH yhdistettynä kemoterapiaa ja sädehoitoa keuhkosyövän tarvitaan, ja se on syytä tutkia, LMWH voi muuttaa SP solut muista syöpätyyppeihin.

Materiaalit ja menetelmät

Cancer Cell Culture ja reagenssit

sisplatiini-resistentti ihmisen keuhkoadenokarsinooma A549 /DDP saatiin American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) ja viljellään rutiininomaisesti RPMI 10% ihmisen AB-seerumia ja 2 umol sisplatiini (Qilu Pharmaceutical Co, Ltd, Shandong, Kiina). A549 /DDP soluja viljeltiin täydellisessä RPMI-väliainetta ilman sisplatiinia 3 päivää ennen kuin niitä käytettiin kokeissa. Leupeptiiniä pepstatiini A ja MG132 ostettiin Sigma (St Louis, MO, USA).

Side Väestö lajittelu ja analyysi

A549 /DDP solut suspendoitiin 1 x 10

6 solua /ml PBS: ssä, joka sisälsi 4% FBS, inkuboitiin 37 ° C: ssa 60 minuutin ajan 5 ug /ml Hoechst 33342 (Sigma, St Louis, MO, USA) joko yksin tai kun läsnä oli 500 umol verapamiilia (Sigma, St Louis, MO, USA). Inkubaation jälkeen, 1 ug /ml propidiumjodidia ja sitten lisättiin suspensio suodatettiin 40 um: n solusiivilän (BD Bioscience, San Diego, CA, USA), jolloin saatiin yksisolususpensio. Virtaus cytometery analyysi ja lajittelu suoritettiin käyttäen FACS Vantage SE (BD Bioscience). Hoechst 33342 oli innoissaan laser-UV 350 nm ja fluoresenssiemissio mitattiin 405 /BP30 (Hoechst sininen) ja 570 /BP20 (Hoechst punainen) optisia suodattimia. Puhtaus SP-solujen ja ei-SP-solut testattiin uudelleen käyttämällä FACS: llä. Sen jälkeen FACS lajittelu, SP ja ei-SP A549 /DDP soluja on pidetty täydellisessä RPMI, ja käytettiin edelleen kokeiluja 2 tunnin kuluessa.

pesäkemuodostusta

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä oli arvioimiseksi suoritettiin klonogeeniset kykyä SP ja ei-SP-soluissa. Lajittelun jälkeen 100 SP tai 100 ei-SP A549 /DDP-soluja maljattiin RPMI 1640/10% 6-kuoppalevyille kolmena kappaleena. Kasvualusta vaihdettiin kahdesti viikossa ja 10 päivän jälkeen, pesäkkeiden määrä kussakin kuopassa määritettiin mikroskoopilla ja edustava kentät valokuvattiin. Prosenttia pesäkettä muodostavaa hyötysuhde (% TAE) laskettiin = (lukumäärä pesäkettä saatu /lukumäärä viljeltyjen solujen) x 100 ja log muunnettuja arvoja laskettiin [35], [36].

In vivo

tuumorigeenisyystesti Experiment

Kaikki eläinkokeet suoritettiin suostumuksella Institutional animal Care ja käyttö komitea 304 PLA sairaalan Institute for Biological Sciences. Kaksikymmentä neljä viiden viikon vanha ei-lihavilla diabeetikko /sekamuotoinen immuunipuutos (NOD /SCID) koirashiirien ostettiin Kiinan Association for Laboratory Animal Science (CALAS, Peking, Kiina) ja sijoitetaan erityisissä taudinaiheuttajista vapaissa olosuhteissa, hallitusti lämpötilan ja kosteuden ympäristössä 12 h valo /pimeä jaksoissa. Hiiret injektoitiin ihonalaisesti toiselta puolelta 5 x 10

5, 1 x 10

5, 5 x 10

4 tai 5 x 10

3 SP soluja tai 1 x 10

7, 5 x 10

6, 5 x 10

5 tai 5 x 10

4 non-SP solua 100 ul suspensiot ja kasvaimen kasvua seurattiin. 0,3 mg /0,20 ml LMWH ruiskutettiin ihonalaisesti LMWH hoitoryhmän päivänä -1. Hiiret lopetettiin päivänä 60 tai kun kasvaimet saavuttivat suurin tilavuus 1,000 mm

3. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen (leveys

2 x pituus) /2. Kertainen ero aiheuttavan kasvaimia laskettiin vähimmäismäärä ei-SP soluja tarvitaan tuottamaan tuumori /vähimmäismäärä SP solujen tarvitaan tuottamaan kasvain.

MTT-määritys

A549 /DDP SP lajiteltu solut ympättiin 96-kuoppalevyille 7,5 x 10

3 per kuoppa ja käsiteltiin kanssa tai ilman 5 IU /ml LMWH (Low-molekyylipaino hepariiniin kalsiumia; Bopuqin, Tianjing Chase Sun Pharmaceutical Co, Ltd, Tianjing, Kiina) kolmena kappaleena. Kolme kuoppiin, jotka sisältävät kasvainsolujen suspendoitiin täydelliseen alustaan ​​käytettiin verrokkeina solujen elinkelpoisuuden ja kolme kuoppiin, jotka sisältävät ainoastaan ​​täydellistä alustaa käytettiin kontrolleina epäspesifisen väriaineen vähentämiseen. 48 tunnin kuluttua MTT väriaineen liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja näytteitä inkuboitiin 37 ° C: ssa 4 h, formatsaanipitoisuus tuote liuotettiin lisäämällä 100 ui DMSO: ta kuhunkin kuoppaan ja absorbanssi (A) luettiin 570 nm: ssä käyttäen ELISA- Reader (Anthos 2020 Salzbrug, Australia) esto korko (%) laskettiin 100% × (verrokkiryhmä arvoihin -experimental ryhmä A-arvot) /kontrolliryhmän arvoihin.

apoptoosimäärityksessä ja SP Cell Marker Expression Analysis

A549 /DDP SP soluja (1 x 10

6/96 kuoppalevyllä) oli hoidettu (kontrolli), tai hoidettiin 5 IU /ml LMWH, LMWH plus 2,2 ug /ml sisplatiinia (DDP ), tai DDP yksinään 36 tunnin ajan ja värjätään käyttämällä anneksiini V-FITC apoptoosin havaitseminen pakki (BioVision, Mountain View, CA, USA) ja analysoitiin FACScalibur -virtaussytometrissä (BD Bioscience). SP solumerkille analyysi, A549 /DDP SP soluja inkuboitiin LMWH 36 tuntia, sitten inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: monoklonaalisia vasta-aineita p-gp (Abcam, Hong Kong Science Park, New Territories, Hong Kong), ABCG2 (Abcam, Hong Kong Science Park, New Territories, Hong Kong), CD24 (Biolegend, Roselle Street, San Diego, CA, USA), ja Oct-4 (Biolegend, Roselle Street, San Diego, CA, USA), joka on kytketty FITC tai PE (Biolegend, San Diego, CA, USA) pitoisuudessa valmistajan suosittelemaa ja analysoitiin virtaussytometrialla. Apoptoosimäärityksessä ja SP solujen markkeri ilmentymisen analyysi toistettiin 3 kertaa.

Kvantitatiivinen reaaliaikainen RT-PCR

A549 /DDP SP solujen LMWH käsiteltyä tai käsittelemätöntä ja kasvainsolut kerättiin LMWH käsitelty tai käsittelemättömiä hiiriä suspendoitiin 1 x 10

6 solua /ml 5 ml: lla PBS: ää, kuten näytteen vastaavasti. Sitten eristäminen kokonais-RNA suoritettiin käyttäen TriPure Isolation reagenssia (Roche Diagnostics GmbH. Saksa) tai RNeasy Mini Kit (Qiagen, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti.

mRNA-tasot analysoitiin kvantitatiivisella reaaliaikaisen RT- PCR: llä käyttäen Bio-Rad iCycler järjestelmä (Bio-Rad, Hercules, CA). MRNA: t olivat käänteiskopioitu cDNA käyttämällä iScript cDNA-synteesi kit (Bio-Rad, Hercules, CA). Aluke sekvenssejä käytetään reaaliaikaisen RT-PCR ovat: 5′-GGGTAATCCCCAGGCCTCTA-3 ’(sense-aluke ihmisten ABCG2-geenin), 5′-CCAGCTCTGTTCTGGATTCCA-3′ (antisense-aluke ihmisten ABCG2-geenin), 5’-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT- 3 ’(sense-aluke ihmisen β-aktiini-geeni), ja 5′-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’ (antisense-aluke ihmisen β-aktiini-geeni). Reaktio suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: yksi sykli 48 ° C: ssa 45 min; 95 ° C 2 min; 40 sykliä 95 ° C: ssa 30 s, 55 ° C 1 min, ja 68 ° C: ssa 2 min. Kukin RT-PCR-monistaminen toistettiin kolmena kappaleena. PCR tehokkuus tutkittiin sarjalaimentamalla mallin cDNA ja sulamiskäyrää kerättiin tarkistaa PCR spesifisyys. Kukin cDNA-näyte kolmena rinnakkaismäärityksenä ja vastaava ei-RT-mRNA: n näyte sisällytettiin negatiivisena kontrollina. Β-aktiini aluke sisältyy jokaiseen levyyn välttää näytteen muunnelmia. MRNA taso kunkin näytteen normalisoitiin kuin β-aktiini-mRNA: n. Suhteellinen mRNA-tasolla esiteltiin 2

– [(Ct /ABCG2- Ct /β-aktiini) LMWH – (Ct /ABCG2- Ct /β-aktiini) ohjaus]. Kaikki tiedot esitetään olivat keskiarvoja ± SD kolmesta erillisestä kokeesta.

Tumor Growth Vieraslajisiirteen Study

Kuusi viikkoa vanhoja sisäsiittoinen Balb /C nude hiiret saatiin Institute of Kiinan Association for Laboratory Animal Science (CALAS). A549 /DDP keuhkoadenokarsinooma soluja (5 x 10

6) inokuloitiin subkutaanisesti vasempaan yläkulmaan kylkeen päivinä 1. Kun halkaisijat kasvaimet olivat 5 mm, hiiret jaettiin ohjaus, DDP, ja LMWH kanssa DDP ryhmät (n = 10 kullekin) ja käsiteltiin ip injektio 8 mg /kg DDP tai yhtä suuri tilavuus suolaliuosta, kerran viikossa 3 viikon ajan. LMWH (0,3 mg /0,20 ml) tai suolaliuosta annettiin s.c. joka päivä päivästä 8 päivään 30. Kasvaimen tilavuus määritettiin kolme kertaa viikossa, kuten aikaisemmin on kuvattu, ja hiiret lopetettiin päivänä 30.

SP Cell Marker ilmentäminen Kasvain Eksplan-

kasvainnäytteet leikattiin hiirillä, huuhdeltiin, mekaanisesti jauhettu, ja pilkottiin 4 tunnin ajan 37 ° C: ssa ravistellen inkubaattorissa 0,1 Wünsch yksikköä /ml kollagenaasi I (Roche Diagnostics) DMEM: ssä. Pilkkomistuote eriteltyä käyttäen 18,5 neulan, seulottiin 100 pm solusiivilän ja valmistellaan virtaussytometria analyysi SP solumarkkerigeenien ilmaisua edellä kuvatulla tavalla.

Western Blot

SP soluja hoidetaan aluksi LMWH tai ohjaus 10 tuntia, ja sitten MG132 (10 uM), Pepstain A + leupeptiiniä (kutakin 100 ug /ml), tai kontrollina lisättiin vastaavasti ja inkuboitiin 6 tunnin ajan. Sitten solut kerättiin western blot analyysiä. Primaarinen vasta-inkubaatio suoritettiin 4 ° C: ssa 16 tunnin ajan hiiren anti-ABCG2-vasta-aine (Biolegend, San Diego, CA, USA) laimennettiin 1:300 3% naudan seerumin albumiinia, jota seurasi inkubointi piparjuuriperoksidaasia-konjugoitua hevosen anti-hiiren sekundäärisellä vasta-aineella, ja kehitettiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssidetektiojärjestelmää (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Anti-β-aktiini-vasta-ainetta käytettiin lastaus ohjaus (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA).

immunohistokemia Värjäys ABCG2 tuumorikudoksessa

parafinoidut kudokset leikattiin 4 um: n diat ja paistettiin 60 ° C: ssa 60 min. Leikkeitä de-paraffinized kanssa ksyleenit ja nesteytyksestä. Sitten leikkeet upotetaan EDTA antigeeninen haku puskuria painekeittimeen 10 minuuttia ja jäähdytettiin sitten huoneen lämpötilassa 20 minuuttia. Leikkeet käsiteltiin 3% vetyperoksidilla metanolissa sammuttamiseksi endogeenisen peroksidaasin aktiivisuus, jota seurasi inkubointi normaalin seerumin estää epäspesifisen sitoutumisen. Sitten laseja inkuboitiin puhdistetun anti-ihmisen ABCG2 vasta-ainetta (Abcam, Hong Kong Science Park, New Territories, Hong Kong, Kiina) laimennuksella 1:20 4 ° C: ssa yön yli. Toinen vasta-aine oli peräisin SP reagenssipakkauksen (Zhongshan Biotechnology Company, Peking, Kiina). Pesun jälkeen kudosleikkeet käsiteltiin biotinyloidulla anti-hiiri-vasta-ainetta, minkä jälkeen inkuboitiin edelleen streptavidiini-piparjuuriperoksidaasi monimutkainen 20 min. Värjätään diaminobentsidiinillä (DAB), leikkeet vastavärjättiin hematoksyliinillä. Tunnettu positiivinen kudosta käytettiin positiivisesta kontrollista. Ensisijainen vasta-aine oli jätetty pois käsittelemättömiä kontrolleja. Olympus (Olympus, Tokio, Japani) mikroskooppi käytettiin havainnollistamaan värjäys kohdennettuja proteiineja.

Värjätyt diat tarkistettiin ja teki itsenäisesti kaksi tarkkailijaa ja tulokset määritettiin yhdistämällä osuutta positiivisesti värjättyä kasvain solut ja värjäytymisen intensiteetti. Kasvainsolujen osuus pisteytettiin seuraavasti: 0 (ei positiivisia kasvainsoluja); 1 (≤30% positiivisia kasvainsoluja); 2 (31-50% positiivisia kasvainsoluja); 3 (51-80% positiivisia kasvainsoluja) ja 4 ( 80% positiivisia kasvainsoluja). Värjäytymisvoimakkuus luokiteltiin seuraavien kriteerien: 0 (-, ei värjäystä); 1 (+, heikko värjäys = vaaleankeltainen); 2 (++, kohtalainen värjäytyminen = keltainen ruskea) ja 3 (+++, voimakas värjäytyminen = ruskea). Värjäys (SI) laskettiin tuote värjäytymisintensiteettiä pisteet ja osuus positiivisia kasvainsoluja. Käyttämällä tätä menetelmää arvioinnin, arvioimme ABCG2 ilmentymistä tuumorikudoksissa määrittämällä SI, pistein 0, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 9 tai 12.

Tilastollinen analyysi

Tulokset esitetään keskiarvona ± SD