Krooninen sairaus

tiivistelmä

eteneminen eturauhasen syöpien (PC) ja paikallisesti invasiivisia, androgen riippumaton ja etäpesäkkeitä valtioiden liittyy yleensä hoidon vastustuskyky ja taudin uusiutumisen. Tässä tutkimuksessa tehtiin sen määrittämiseksi mahdollisuus käyttää yhdistämällä erityisiä onkogeenisten tuotteiden, kuten epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR), Pakt, ydin- tekijä-kappaB (NF-KB) ja makrofagin inhiboiva sytokiini-1 (MIC-1) kuin biomarkkereita ja terapeuttisia kohteita optimointiin potilaiden hoidosta paikallinen PC aikaisemmissa taudin vaiheissa. Immunohistokemiallinen ja immunofluoresenssilla tiedot ovat osoittaneet, että ekspressiotasot EGFR, Ser

473-Pakt, NF-KB: n p65: n ja MIC-1-proteiinit olivat merkittävästi parantaa samalla osajoukko 76 tapauksissa eturauhasen adenokarsinooma yksilöiden aikana taudin etenemisen ja näiden biomarkkereita ilmaistiin pienessä alapopulaatiossa CD133

+ PC soluja ja suurin kasvain massa CD133

– PC soluja. Mikä tärkeintä, nämä biomarkkerit myös yli-ilmentynyt 80-100% 30 PC etäpesäkkeiden luun kudosnäytteet. Lisäksi tulokset ovat osoittaneet, että EGF-EGFR signalointireitin voi tarjota kriittisiä toimintoja itseuudistumisen puolella väestöstä (SP) solut jolla on kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia erittäin invasiivisia WPE1-NB26 soluissa. Terapeuttisen edun kohdentaminen EGFR, Pakt, NF-KB tai MIC-1 oli myös tehokas tukahduttaa pohjapinta ja EGF-edistänyt prostasphere muodostumista SP WPE1-NB26 soluihin, joka indusoi hajoaminen SP-soluista peräisin prostaspheres ja vähentämällä elinkelpoisuuden SP ja ei-SP WPE1-NB26 solufraktioita. Myös kohdentaminen näiden onkogeenisten tuotteiden indusoi kaspaasiriippuvaisen apoptoosin solunsalpaajaresistentti SP WPE1-NB26 solut ja parantaa niiden herkkyys sytotoksisille vaikutuksille aiheuttamien doketakselia. Nämä havainnot viittaavat siihen, että sekakäyttö EGFR, Pakt, NF-KB ja /tai MIC-1 voi edustaa lupaavaa kehittämisstrategioina tarkkuutta nykyisen ja ennustavia menetelmiä ja tehoa hoitojen PC potilaiden katsoessaan taudin heterogeenisyys, mikä estää PC eteneminen metastaattisen ja tappava tauti todetaan.

Citation: Mimeault M, Johansson SL, Batra SK (2012) Pathobiological seuraukset Expression EGFR, Pakt, NF-KB ja MIC-1 in Eturauhassyöpä Kantasolut ja niiden jälkeläisten. PLoS ONE 7 (2): e31919. doi: 10,1371 /journal.pone.0031919

Editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 24 joulukuu 2011; Hyväksytty: 20 tammikuu 2012; Julkaistu: 23 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Mimeault et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat tämän työn tukee National Institutes of Health avustus (R01CA138791) eturauhassyövän tutkimukseen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä (PC) on edelleen yleisimmin diagnosoitu kiinteitä kasvaimia miehillä ja metastaattisen PC lomakkeet ovat edelleen toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat [1] – [5]. Tärkeitä edistysaskeleita viime vuosina ovat johtaneet aiemman diagnoosin ja tehokas terapeuttinen väliintulo eturauhasen ja /tai sädehoitoa varten potilaalla on matala-asteinen ja elimeen rajoittunut tietokoneisiin [1], [4], [6], [7 ]. Taudin etenemistä paikallisesti edennyt, metastaattinen ja kastraatio kestävä eturauhasen syöpiä (CRPCs) liittyy hoitoon vastustuskyky ja taudin pahenemiseen [1], [4], [6]. Vaikka nykyinen anti-hormonaalisia ja solunsalpaajahoitojen erittäin invasiivisia ja metastaattinen tietokoneita yleensä ovat parantaneet elämänlaatua, nämä hoidot ovat vain lievittävä ja huipentuu kuolemaan useimpien potilaiden noin 12-19 kuukausi diagnoosin jälkeen [1], [4] , [6].

lukuisia tutkimuksia on tehty luomaan etiopathological syyt tietokoneisiin. Ulkoista ja sisäisiä piirteitä ennalta hävittää PC kehitykseen kuuluu voimakas oksidatiivisen stressin, tulehduksellinen atrofiaa ja fibroosia liittyy vakavia kudosvaurioiden, hormonaalista sääntelyn purkaminen ja erityisesti iän [8] – [13]. Aloittaminen ja eteneminen PC on yleensä ominaista alas-säätely monipuolinen kasvainsuppressorigeenin tuotteita, kuten fosfataasin tensin homologi poistetaan kromosomissa 10 (PTEN) ja p53 yhdistettynä up-ekspression säätelyn ja /tai aktiivisuutta lukuisia onkogeenisten merkinantoelementit PC-soluissa [4], [13], [14]. Vuorovaikutus monimutkaisten signalointi verkkojen erillisten syntyreitit aloittaman hormonit, kasvutekijät, sytokiinit ja kemokiinit kautta sukulais reseptorien on tyypillisesti mukana PC eteneminen paikallisesti edennyt ja etäpesäkkeitä [4], [10], [11], [ ,,,0],13], [15]. Niistä usein vapautettu geenin tuotteita, lisääntynyt ilmentyminen ja aktivaatio erilaisten reseptorityrosiinikinaasien, kuten epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR), aikana epiteelin-mesenkymaalitransitioon prosessi voi johtaa jatkuva aktivointi mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasien, fosfatidyyli-3 ’ -kinase (PI3K) /Akt, tumatekijä kappa-B (NF-KB) ja makrofagin inhiboiva sytokiini-1 (MIC-1) [4], [13], [14], [16] – [32]. Nämä onkogeeniset tuotteet voivat tehdä yhteistyötä edistääkseen kestävää kasvua, selviytymistä, invaasio ja etäpesäkkeiden PC solujen sekä niiden hankinnan androgeenista riippumaton (AI) ja solunsalpaajaresistentti fenotyypit, hoito vastustuskyky ja taudin uusiutumisen [4], [13] – [ ,,,0],16], [18] – [21], [23], [25] – [27], [30] – [39].

lisäksi, viime varaamiseen riviä kokeellista näyttöä ovat myös osoittaneet, että PC varsi /esisolujen, myös nimetty PC- ja etäpesäkkeiden-aloittamisen soluja, jotka ilmentävät kantasolun kaltaisia ​​markkereita, kuten CD133, CD44

korkea, aldehydi dehydrogense ”ALDH

korkea” ja /tai CXC kemokiinireseptorin 4 voi tarjota kriittiset toiminnot eturauhasen syövän synnyn, etäpesäkkeitä kaukaisiin sivustoja ja kasvaimen uudelleen kasvuun ja taudin uusiutumisen jälkeen hoidon aloittamisesta [4], [10], [13], [14], [40] – [58]. On osoitettu, että erittäin tuumorigeenisia PC varsi /progenitorisolujen pystyivät aiheuttaa

in vitro

ja

in vivo

irtotavarana massaa eriytetty PC soluja, jotka ilmentävät onteloerityssolut fenotyyppejä, mukaan lukien androgeenireseptorin ja eturauhasen hapan fosfataasi, ja palauttaa voimaan kasvaimet

in vivo

joiden histologinen arkkitehtuuria Gleason grade verrattavissa potilaan alkuperäistä kasvainten [13], [40] – [45], [47], [48] , [53]. On myös havaittu, että PC varsi /esisolujen, mukaan lukien puoli väestöstä (SP) eristetty PC-soluista käyttämällä Hoechst dye ulosvirtausta tekniikkaa, joilla AI fenotyyppi ja ilmentävät korkeita ATP-sitova kasetti (ABC) monilääke kuljettajat tällaiset kuten ABCG2, olivat myös kestävämpi kuin niiden eriytetty jälkeläisten ja ei-SP-soluissa anti-hormonaalisia ja kemoterapeuttisten hoitojen [13], [14], [50] – [52], [59]. Huolimatta näistä edistysaskeleista, lisätutkimuksia tarvitaan vahvistamaan erillisiä molekyyli- biomarkkereita ja terapeuttisia kohteita PC varsi /progenitorisolujen ja niiden jälkeläisten, joita voitaisiin käyttää yhdessä optimointiin hoitona PC potilaiden aikaisemmin tauti vaiheissa.

Tämä tutkimus suoritettiin sen määrittämiseksi kliinistä merkitystä yhdistämällä useita vapautettu onkogeenisten tuotteita, kuten EGFR, fosforyloidun muodon Akt, NF

κ

B p65 ja MIC-1 molekyyli biomarkkereita ja ennustaa riskiä PC etenemisen paikallisesti levinnyt kasvain ja terapeuttisten kohteiden poistamiseksi koko PC solumassa. Siksi immunohistokemiallinen analyysit ekspressiotasot ja kolokalisaation malleja näiden proteiinien tehtiin sama paneeli PC kudosten ja verrattiin ei-pahanlaatuinen viereisten kudosten ja normaalin eturauhasen kudosnäytteitä. Lisäksi prostasphere muodostava ja -disintegration määritykset ja kannattavuuden testaamiseksi SP solujen jolla on kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia ja ei-SP solujen fraktio erittäin tuumorigeenisemmiksi ja invasiivisia WPE1-NB26 solulinja suoritettiin tai ilman eksogeenista EGR: puuttuessa tai läsnä ollessa erityisen estävistä aineista näiden onkogeenisten tuotteita. Kaiken kaikkiaan tulokset ovat tukeneet yhdistämisen edut näiden onkogeenisten tuotteiden molekyyli- biomarkkereita ja terapeuttisia tavoitteita tarkkuuden parantamiseksi ja ennustavia menetelmiä ja tehoa hoitojen PC potilaiden aikaisemmin tauti vaiheissa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

ihmisen WPE1-NB26 solulinja oli alun perin saatu American Type Culture Collection (Manassas, VA). Emo WPE1-NB26 soluja ylläpidettiin rutiinisti keratinosyyttien seerumivapaassa väliaineessa (SFM), johon on lisätty antibiootteja (100 UI /ml penisilliiniä-100 ug /ml streptomysiiniä), L-glutamiinia, naudan aivolisäkeuutetta ja epidermaalista kasvutekijää (EGF) mukaan valmistajan ohjeiden 37 ° C inkubaattorissa mukana 5% CO

2. Keratinosyyttispesifisestä SFM, MitoTracker Red CMXRos väriaine ja muut kulttuurin materiaalit olivat Life Technologies (Carlsbad, CA). Dosetakseli, partenolide, Akt estäjä VIII, ja 3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT) ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), LY294002 Calbiochem Corp (San Diego, CA): n ja gefitinibin tuli LC laboratorio (Woburn, MA). Kanin polyklonaalinen anti-CD133-vasta-aine (H-284), hiiren monoklonaalinen anti-CD44 (HCAM, F-4) vasta-aine, kanin polyklonaalinen anti-ABCG2 vasta-aine (B-25), kanin polyklonaalinen anti-EGFR-vasta-aine (1005), vuohi polyklonaalinen anti-Tyr

1173-fosfo-EGFR-vasta-aine (1173) tunnustaa EGFR lomakkeen fosforyloitu tyrosiini 1173 ja kanin polyklonaalista anti-NF-KB p65-proteiinin alayksikön (C-20) ostettiin Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA). Hiiren monoklonaalinen anti-β-aktiini-vasta-ainetta (klooni AC-15) saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) ja kanin monoklonaalista anti-Ser

473-Pakt-vasta-aine (D9E) Cell Signaling Technology, Inc. kanin polyklonaalista vasta-ainetta vastaan ​​suunnattu pilkottiin kaspaasi-9-fragmentti hankittiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA) ja hiiren monoklonaalinen anti-sytokromi

c

(6H2) vasta-aine, jonka Santa Cruz Biotechnology, Inc (Santa Cruz, CA, USA). Kaniinin polyklonaalista anti-MIC-1-vasta-aine tuotettiin laboratoriossamme vastaan ​​C-terminaalinen aminohappo alueen kypsän MIC-1-proteiinia, kuten aiemmin on kuvattu [27], [29]. Fykoerytriinikonjugoidulla monoklonaalinen anti-CD133 /2-vasta-aine (293C3) hankittiin Miltenyi Biotec. Inc. ja työssä mukaan valmistajan ohjeiden. Vectastain avidiini-biotiini monimutkainen ”ABC” menetelmä peroksidaasi kit ja 3,3′-diaminobentsidiini ”DAB” substraattipakkausta varten immunohistokemiallista värjäystä ostettiin Vector Laboratories (Burlingame, CA).

immunohistokemiallinen ja double-immunohistofluorescence analyysit

immunohistokemialliset tutkimuksia ekspressiotasot ja sijainti solun EGFR, Ser

473-Pakt, NF-KB p65 ja MIC-1 proteiinien ei-pahanlaatuinen ja pahanlaatuinen eturauhaskudoksiin tehtiin eturauhasessa mikrosiruja valmistettu formaliinilla kiinnitetyt ja parafiiniin upotetut kudokset ostettu Biomax Inc. (Rockville, Maryland, USA), kuten aiemmin on kuvattu. Analysoidut kudosnäytteistä sisältävät PR954 kudos microarray dia sisältävät päällekkäisiä ytimien 36 tapauksissa primaarisessa eturauhasen adenokarsinooma (Gleason tulokset: 6-10; vaiheet T2-T4) ja vastaava sovitettu ei-pahanlaatuisten viereisiin kudoksiin samasta potilaiden, ja PR483 kudos microarray dia, joka sisältää yhden ytimen 40 tapausta primaarisessa eturauhasen adenokarsinooma (Gleason tulokset: 6-10; vaiheissa T2-T4) ja 8 normaalissa eturauhasessa kudoksia ruumiinavaus käytettiin verrokkeina. Lisäksi ilmaus kaikkien biomarkkerit analysoitiin myös 30 luumetastaasipotilailla kudoksia PC potilaista (Gleason tulokset: 6-10) (TriStar Technology Group, LLC, USA). Tekniikka, jota käytetään immunohistostaining on aiemmin kuvattu [36], [38], [52]. Lyhyesti, kudosleikkeet parafiini EZ-vahan ™ (Bio Genex, San Ramon, CA) ja rehydratoitiin käyttäen arvostellaan etanolia ratkaisuja. Pesun jälkeen objektilasit 3 kertaa fosfaattipuskurilla (PBS), 5 minuuttia, kudosleikkeet upotettiin mikroaaltouuni antigeenin haku liuos, joka sisälsi 0,01 M sitraattipuskuria, pH 6,0 ja altistetaan mikroaaltosäteilylle 3 kertaa 3 minuutin ajan. Epäspesifinen immunovärjäys on estetty laimennettiin Vectastain normaalia hevosen seerumia (Vector ”ABC” kit) 10 minuuttia ja levyt inkuboitiin sitten ensisijaisesti anti-EGFR, Ser

473-Pakt, -NF-KB: n p65-proteiinin alayksikön tai -MIC-1-vasta-aine: ssa kostutetussa kammiossa yön yli 4 ° C: ssa. PBS-pesun jälkeen, levyt inkuboitiin biotinyloidun yleinen sekundaarisen vasta-aineen kanssa 30 minuutin ajan ja pestään uudelleen PBS: llä. Endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus pysäytettiin käyttämällä 0,3% vetyperoksidia methanol:PBS (01:01) 10 min ajan. Kun oli kulunut vielä pesun jälkeen levyt inkuboitiin ABC Vectastain liuokseen 30 minuutin ajan. Kudoksen osat upotettiin värjäysliuoksena sisältävä 3,3′-diaminobentsidiinitetrahydrokloraattia ”DAB” alustaan ​​kuten valmistajan ohjeiden ja huuhdellaan 3 kertaa vedellä. Punaruskea väri sakan havaittiin kudosnäytteiden ilmaisee positiivisen immunoreaktiivisuus testatuilla ensisijainen vasta-aine. Objektilasit vastavärjättiin hematoksyliinillä, kuivattu ja pysyvästi asentaa vectamount Kiinnitysliiman media (Vector Laboratories). Otetut kuvat Nikon Eclipse E400 valomikroskoopilla (Nikon Corporation, Tokio, Japani) eri suurennuksilla edustavat analysoiduista näytteistä.

Kunkin kudoksen osassa, intensiteetti immunoreaktiivisuus EGFR, Ser

473-Pakt, NF-KB p65 tai MIC-1-proteiini semi-kvantitatiivisesti luokiteltava jonka urologic patologi (Dr. Johansson) on 0-3 asteikolla (0 = ei värjäystä, 1+ = viikko värjäystä, 2+ = kohtalainen värjäys, ja 3+ = voimakas värjäytyminen). Prosenttiosuus PC positiivisten solujen kunkin biomerkkiaineen analysoidaan tietyssä kudoksessa ydin myös pisteytettiin 1-4 (1 = 0-25% positiivisia PC-solut, 2 = 26-50% positiivisia soluja, 3 = 51-75% positiivisia soluja, ja 4 = 76-100% positiivisia soluja). Pisteet värjäyksen intensiteetin ja prosenttiosuus immunoreaktiivisia PC soluja sitten kerrotaan saamiseksi komposiitti pisteet välillä 0 12. värjäytymisen intensiteetti eri testattujen proteiinien eturauhasen adenokarsinooma näytteiden teki maalin ja verrattuna normaaliin eturauhasen kudoksia, ja arvo pidettiin parannettu, jos värjäytyminen intensiteetti oli korkeampi yhden tai useamman pisteen.

lisäksi kaksinkertaisen immunohistofluorescence analyysit kolokalisaation kantasolun kaltainen merkki, CD133 antigeeni (prominin-1) kanssa fosforyloitumaton EGFR tai sen aktivoitu Tyr

1173p-EGFR fosforyloitua muotoa, Ser

473-Pakt, NF-KB p65 tai MIC-1 suoritettiin myös siitä parafiini ja nesteytyksestä ei-pahanlaatuinen ja pahanlaatuinen ihmisen eturauhasen kudosnäytteitä päässä potilaat saatu UNMC n kudospankkia aiemmin raportoidun [52], [60]. Kudos Objektilasit estetty, kun läsnä oli 10% vuohen seerumissa 30 minuuttia, mitä seurasi inkubaatio fykoerytriinikonjugoidulla anti-CD133-vasta-aine plus anti-EGFR, anti-Tyr

1173-pEGFR, anti-Ser

473 -pAkt, anti-NF

κ

B p65 tai anti-MIC-1-vasta-aineen 2 h. Levyjä pestiin kahdesti PBS: llä ja käsitellään immuunifluoresenssivasta havaitsemiseen kuten alla on kuvattu, että konfokaali mikroskooppisia analyysejä kiinnitettyjä soluja.

eristäminen SP ja ei-SP solufraktiois- ja CD133

+ PC solu alaryhmässä alkaen ihmisen tuumorigeenisiä ja invasiivisia WPE1-NB26 solulinja virtaussytometrialla

vanhempien WPE1-NB26-solut (1 x 10

6 solua /ml) värjättiin Hoechst, joka sisälsi lopulliseen konsentraatioon 2 ug /ml fluoresoiva Hoechst dye 37 ° C: ssa 2 tuntia. Pieni alaryhmien SP ja ei-SP-solut eristettiin fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelu (FACS), kuten aiemmin on kuvattu [52], [60], [61]. Analyysit ja lajittelu elinkelpoisten SP ja ei-SP solufraktiois- tehtiin käyttäen FACS Aria virtaussytometria DIVA -ohjelmistoa (Becton Dickinson Biosciences). SP ja ei-SP solujen fraktiot kerättiin talteen sen jälkeen, kun FACS ja ilmentymistason CD133 kantasolun kaltainen markkeri ilman ilmeisiä muita fenotyyppisiä ja erilaistumista muutoksia näiden kahden viljeltiin solualapopulaatioiden saatiin pitämällä soluja seerumittomassa keratinosyyttien viljelyalustassa sisältävät eksogeenisen EGF: ää (10 ng /ml) ennen niiden käyttöä.

immunoblot-analyysit

SP ja ei-SP solulysaatteja valmistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [36], [38], [60 ]. Proteiinin pitoisuudet arvioitiin käyttämällä pesuaineiden kanssa yhteensopivissa proteiinin iinianalyysikitissä Bio-Rad Laboratories, Inc. (Hercules, CA). Näytteet, jotka vastaavat 20 ug proteiineja erotettiin elektroforeesilla 8 tai 10% SDS-polyakryyliamidigeelillä pelkistävissä olosuhteissa. Proteiinit siirrettiin Immobilon-P siirto kalvo ja blokattiin 5% rasvatonta kuivamaitoa PBS: ssa 2 tuntia ja suoritettiin standardi immunodetektioon menettelyä. Lopussa Inkubaation jälkeen blotti pestiin TBST: ssä (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl ja 0,05% Tween), ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 1 tunnin . Vasta-aine-antigeeni-kompleksit tehtiin näkyviksi käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin (Amersham Biosciences).

Konfokaalimikroskopia analysoi

SP ja ei-SP solufraktioita päässä WPE1-NB26 solulinjaa kasvatettiin alhaisella tiheys on steriloitu kansi liukuu 24 tuntia, pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin jääkylmällä metanolilla -20 ° C: ssa 2 min [36], [38], [52]. Soluja blokattiin 10% vuohen seerumissa 30 minuuttia ja inkuboitiin fykoerytriinikonjugoidulla monoklonaalinen anti-CD133 /2-vasta-aine (293C3), hiiren monoklonaalinen anti-CD44 (HCAM, F-4) vasta-aine, kanin polyklonaalinen anti-ABCG2-vasta-ainetta ( B-25), kanin polyklonaalinen anti-EGFR-vasta-aine (1105), vuohen polyklonaalinen anti-Tyr

1173-pEGFR vasta-aine (1173), kaniinin monoklonaalinen anti-Pakt vasta-ainetta (D9E), kanin polyklonaalinen anti-NF-KB-aineella ( C-20), kanin polyklonaalinen anti-MIC-1-vasta-aine tai hiiren monoklonaalinen anti-β-aktiini-vasta-ainetta (klooni AC-15) laimennettuna PBS: ssä 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kolmen pesun jälkeen PBS: lla, soluja inkuboitiin sitten fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -konjugoitu vuohen anti-hiiri-FITC-konjugoidulla aasin anti-vuohi ja /tai Texas red-konjugoitua vuohen anti-kaniini-vasta-ainetta (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc. ., West Grove, PA) kanssa 1 h. Lisäksi SP-solut käsiteltiin erilaisilla sytostaattien aikana 4 päivää värjättiin MitoTracker Red CMXRos kosteutetussa kammiossa 37 ° C: ssa pimeässä 30 minuutin ajan ennen kiinnitystä ja värjäystä SP-soluja hiiren monoklonaalisten anti-sytokromi-c-vasta-ainetta 1 h, mitä seurasi inkubointi FITC-konjugoitua vuohen anti-hiiri-1 h. Sitten kaikki PC-solut pestiin jälleen PBS: llä, ytimet vastavärjättiin diamino-2-fenyyli (DAPI) ja asetettiin lasilevyille anti-fade Vestashield kiinnitysväliaine (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Immunofluoresenssivärjäyksen havaittiin alle konfokaalisella laserskannaus mikroskoopilla (LSM 410, Zeiss, Göttingen, Saksa).

Prostasphere muodostamiseen ja hajoamiseen määritykset

SP ja ei-SP solufraktioita eristetty erittäin tuumorigeenisiä ja invasiivisia WPE1-NB26 solumassan pidettiin seerumittomassa keratinosyyttien viljelyalustassa. Itse uusimisen kapasiteetti SP-solujen

vs. of the non-SP solufraktio eristettiin erittäin tuumorigeeninen ja invasiivisia WPE1-NB26 solulinja arvioitiin niiden kyky muodostaa tarttumaton aggregaattien nimetty prostaspheres seerumin vapaa kulttuuri edellytykset ultra-low kiinnityslevyyn (Corning, Invitrogen). Sillä prostasphere muodostava määrityksissä, 500 elinkelpoisten SP tai ei-SP-solut saatiin sen jälkeen, kun solujen lajittelu suspendoitiin seerumittomassa-keratinosyyttien väliaineen kanssa tai ilman eksogeenisen EGF: ää (10 ng /ml) päälle 6-kuoppaisille ultra-low kiinnityslevyn puuttuessa tai esiintyminen eri huumeita. Testatuista lääkeaineista ovat erityisen estävä aine EGFR: (gefitinibin), PI3K (LY294002), Pakt (Pakt estäjä VIII), NF-KB (partenolide) ja MIC-1 (anti-MIC-1-vasta-aine) sekä nykyisen kemoterapeuttinen huumeiden doketakseli. Kaikki näytteet maljattiin kolmena kappaleena. 7 vuorokauden inkuboinnin, numerot prostaspheres muodostettu laskettiin ja edustava kuvat SP WPE1-NB26-soluista peräisin prostaspheres valokuvattiin käyttämällä Accu-soveltamisalaa faasikontrastimikroskoopissa suurennoksella 200 x.

lisäksi, että hajoamisen määrityksissä, 500 elinkelpoisen SP WPE1-NB26 soluja kasvatettiin seerumittomassa viljelyolosuhteissa alle ultra-low kiinnityslevy aikana 7 päivää muodostumista prostaspheres ja sitten testataan lääkkeet lisättiin elatusaineeseen ja inkuboitiin 4 ylimääräistä päivää. Päivänä 11, edustaja kuvia hajonneita prostaspheres valokuvattiin käyttämällä Accu-laajuus faasikontrastimikroskoopissa suurennuksella 200 ×.

TUNEL määritys

Päätelaite deoxynucleotidedyl transferaasi dUTP nick end merkinnät (TUNEL) määritys suoritettiin havaitsemaan DNA: n fragmentoituminen osoittaa apoptoottisen solukuoleman aiheuttama testattu sytotoksisten aineiden on SP WPE1-NB26 solujen alaryhmän. Pesun jälkeen kiinteän SP WPE1-NB26 solut PBS: lla, soluja inkuboitiin TdT Reaktioseosta, joka sisälsi nukleotidisekvenssin-merkintöjen yhdistelmä (TUNEL Label) sisältää fluoreseiini-dUTP ja -dNTPs plus TdT entsyymin (Roche Diagnostics, IN) kosteutetussa kammiossa 37 ° C: ssa pimeässä 1 tunti. SP-solut pestiin kolme kertaa PBS: ssä ja niitä inkuboitiin primäärisen vasta-aineen suunnattu katkaistun capsase-9-fragmentti 1 h huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen inkubaatio FTIC-konjugaatin sekundääristä vasta-ainetta 1 tunnin ajan. Kolmen huuhtelua PBS solut vastavärjättiin DAPI ydin- tahra ja visualisoitu konfokaali fluoresenssimikroskopialla kuten edellä mainittiin.

Solun luelinkykymäärityksillä

solujen elinkelpoisuuden määritykset, SP ja ei-SP solufraktioita eristettiin WPE1-NB26 solulinja istutettiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 3 x 10

4 solua kuoppaa kohti kokonaistilavuudessa 200 ui vapaan seerumin keratinosyyttien viljelyalustassa, kuten aikaisemmin on mainittu [36] , [38], [52]. Jälkeen 3 päivää, SP ja ei-SP WPE1-NB26 solut olivat käsittelemättömiä tai käsiteltiin eri pitoisuuksilla testatut huumeiden, kuten gefitinibi, LY294002, Pakt estäjä VIII, partenolide, anti-MIC-1-vasta-aineen tai doketakselista, yksin tai yhdistelmänä. 72 tunnin inkubaation jälkeen solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-kolorimetrinen koe.

Flow fluorometrilaitteen analysoi

SP WPE1-NB26 soluja kasvatettiin tiheytenä 5 x 10

5 solut 25 cm

2 annoksia edellä kuvatulla tavalla. SP-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla testattujen lääkkeiden, yksin tai yhdessä 5 nM doketakselin neljän päivän aikana. Apoptoottiset aiheutuvaa testattu agentit SP WPE1-NB26 soluissa arvioitiin, kun DNA värjäyksen kunkin näytteen kanssa propidiumjodidilla FACS-analyysit kuten aiemmin on kuvattu [36], [38], [52].

tilastolliset analyysit

tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Studentin

t

-testissä verrata tuloksia

P

arvojen 0,05 osoittaa tilastollisesti merkitseviä eroja. Tarkemmin immunohistokemiallista tiedot analysoitiin käyttämällä Windows-versio 9.6.4.0. ohjelmisto. Yhdistetty tulokset biomarkkereiden ilmaisun pidettiin jatkuva muuttujia ja verrattiin Studentin kaksisuuntaista t-testiä olettaen että varianssi on erisuuruinen itsenäiseen näytteitä.

Tulokset

immunohistokemiallinen analyysit ekspressiotasot EGFR, Ser

473-Pakt, NF-KB p65 ja MIC-1 merkinantoelementit ei-pahanlaatuinen ja pahanlaatuinen eturauhas- kudosnäytteiden

tulokset immunohistokemiallinen analyysit ovat osoittaneet erittäin heikko huomaamaton immuunivärjäykseen EGFR, Ser

473-Pakt, NF-KB p65 ja MIC-1 normaaleissa eturauhasen kudoksissa koepala ja viereisen ei-pahanlaatuisen eturauhaskudokset PC potilaista (kuvio 1). Sen sijaan, parannettu ilmaus kaikki nämä biomarkkerit havaittiin 66-75%: n 76 tapauksessa eturauhasen adenokarsinoomat (Gleason-tulokset = 6-10) analysoitiin

vs.

normaalissa eturauhasessa kudosten ja liittyvät vaiheet ( T2-T4) taudin etenemisen (taulukko 1). Tarkemmin sanottuna, heikko soluliman ja kalvo immuunivärjäykseen EGFR-proteiini havaittiin vain pieni määrä perus- ja luminaalisen eturauhasen epiteelisolujen hyvänlaatuisen eturauhasen kudoksissa, kun taas sen ilmentyminen vaihteli kohtalaisesta vahvana sytoplasmaan ja kalvon vastaavasti, että pahanlaatuisia epiteelisolujen lokalisoitu väli- ja luminaalinen osastojen osajoukko ensisijaisen eturauhasadenokarsinoomaa yksilöitä (kuva 1a). Värjäytymisintensiteettiä liittyvät EGFR-proteiinin ekspressio oli lisääntynyt 68%: lla 76 primaarisen eturauhasen adenokarsinooma yksilöitä analysoitiin, verrattuna normaaliin eturauhasen kudosta koepala (taulukko 1). Lisäksi komposiitti pisteet arvo saadaan EGFR PC yksilöt (3,4 ± 0,4) oli merkittävästi parempi kuin arvo normaalin eturauhasen kudoksia (0,4 ± 0,2); * P 0,0001) (kuvio 2a). Kuten kuviossa 1 b, ja c, aktivoitu Ser

473-Pakt fosforyloitiin muodossa myös yli-ilmentynyt 66% 76 tapauksessa, että eturauhasen adenokarsinoomista analysoidaan ja havaitaan sytoplasmassa PC epiteelisoluissa katsoo, että lisääntynyt ilmentyminen p65-alayksikön NF-KB transkriptiotekijä esiintyi 75% 76 tapausta eturauhasen adenokarsinooman ja pääasiassa havaittiin sytoplasmassa ja ytimet PC epiteelisolujen. Komposiitti pisteet saadut arvot Pa

473-Pakt ja NF-kB p65 ilmentymistä PC yksilöt (3,3 ± 0,4 ja 2,7 ± 0,3) on merkittävästi parannettu verrattuna arvoon normaalin eturauhasen kudoksia (0,3 ± 0,1 ja 0,3 ± 0,2; p 0,0001), vastaavasti (kuvio 2b ja c). Lisäksi vahva positiivinen immunovärjäyksellä havaittiin myös MIC-1-proteiinin sytoplasmassa ja lähellä kalvon PC epiteelisolujen sekä eritetyn MIC-1 kasvainten stroomassa 71%: 76 tapauksista eturauhasen adenokarsinoomat verrattuna normaali ja viereisen ei-pahanlaatuisen eturauhasen kudoksia analysoitiin (kuvio 1 d). Komposiitti pisteet saatu arvo MIC-1 ilmentymisen PC yksilöt (3,7 ± 0,4.) Oli merkittävästi parannettu suhteessa arvoon normaalin eturauhasen kudoksia (0,4 ± 0,3; * p 0,0001) (kuvio 2d). Tärkeää on, että tulokset ovat myös osoittaneet, että Ser

473-Pakt, NF-KB p65 ja MIC-1 koekspressoitiin EGFR samassa alaryhmässä vastaavat noin 54-62% PC kudosnäytteiden analysoiduista viittaa siihen, että nämä onkogeeninen signalointi elementit voivat kaikki yhteistyötä edistääkseen pahanlaatuisiin PC epiteelisolujen aikana taudin etenemisen paikallisesti edennyt sairaus tilan (taulukko 1).

Microarray osa ei-pahanlaatuisten ja pahanlaatuista eturauhas- kudosnäytteiden koetettiin anti -EGFR, Ser

473-Pakt, -NF-KB p65 tai -MIC-1-vasta-aineen jälkeen esto seerumin kanssa. Kaikki leikkeet tutkittiin mikroskoopilla ja immunoreaktiivisuus arvosteli tummanruskea värjäystä. Edustavia kuvia värjätään kudosnäytteiden normaalin eturauhasen, hyvänlaatuisen viereisten kudosten eturauhasen kasvain ja eturauhasadenokarsinoomaa saatu (a) EGFR, (b) Ser

473-Pakt, (c) NF-KB p65 ja (d) MIC-1 näkyvät alkuperäinen suurennoksia x 100 ja × 400. Nuolet osoittavat lokalisoinnin tyvisoluista normaalissa ja ei-pahanlaatuiset eturauhasen epiteelin ja immunovärjäämällä havaittu näiden biologisten merkkiaineiden eturauhasadenokarsinoomaa kudosnäytteessä. Lisäksi positiivinen immunovärjäystä havaitaan eritettyä MIC-1-proteiinin strooman osaston vieressä eturauhasen kasvainkudosta on myös merkitty.

Rasiakuvaajat esittää ekspressiotasot (a) EGFR, (b) Ser

473-Pakt, (c) NF-KB p65 ja (d) MIC-1 aikana PC etenemisen etäpesäkkeitä vaiheita. *,

P

0,0001, osoittaa merkittävää kasvua vuosina komposiitin tulokset saadaan eturauhasadenokarsinoomaa ja PC luumetastaasipotilailla yksilöitä suhteessa komposiitti tulokset saadaan normaalin eturauhasen kudoksia.

Tärkeää on, positiivinen immunovärjäytyminen vaihtelee kohtalaisesta vahva, sytoplasmassa ja lähellä kalvon tai ytimet myös havaittu EGFR, Ser

473-Pakt, NF-KB p65 ja MIC-1 PC soluissa 80 -100% luun etäpesäke kudosten analysoitiin 30 PC potilaista (Gleason pisteet = 6-10) (kuva 3, taulukko 1). Lisäksi MIC-1 immunovärjäys vaihtelivat hyvin heikko tai kohtalaisia ​​nähtiin stroomaan PC luumetastaasin kudoksissa (kuvio 3d). Komposiitti tulokset, jotka on saatu ilmentymisen kaikki nämä biomarkkerit luun etäpesäkkeen kudoksissa PC potilaista olivat myös parempia arvoja havaittiin normaalin eturauhasen kudosten ja eturauhasen adenokarsinooma näytteissä (kuvio 2; * p 0,0001).

microarray osat PC luumetastaasin kudosnäytteiden koetettiin anti-EGFR, Ser

473-Pakt, -NF-KB p65 tai -MIC-1-vasta-aineen jälkeen esto seerumin kanssa. Kaikki leikkeet tutkittiin mikroskoopilla ja immunoreaktiivisuus arvosteli tummanruskea värjäystä. Edustavia kuvia värjättyä PC luukudoksen näytteet saadaan EGFR, Ser

473-Pakt, NF-KB p65 tai MIC-1 näkyvät alkuperäinen suurennoksia x 100 ja × 400.

Double immunohistofluorescence konfokaalimikroskopia analyysit ilmentymistason CD133 kantasolun kaltainen merkki ja sen kolokalisaation EGFR, Ser

473-Pakt, NF-KB p65 ja MIC-1 merkinantoelementit ei-pahanlaatuinen ja pahanlaatuinen eturauhasessa yksilöt

Saadakseen kokeellista näyttöä mahdollisista vaikutuksista ja tehostetun ilmentymisen ja /tai aktivointi EGFR, Pakt, NF-KB p65 ja MIC-1 pahanlaatuinen muutos CD133

+ aikuisten eturauhasen varsi /kantasolujen CD133

+ PC varsi /esisolujen, olemme myös ominaista yhteistyössä lokalisoinnin CD133 kantasolun kaltaisia ​​markkeri näiden onkogeeninen merkinantoelementit ei-pahanlaatuinen ja pahanlaatuinen eturauhaskudokset potilailta (kuvio 4) .