Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Arvioimme terapeuttisia vaikutuksia histonideasetylaasi estäjä PXD101 yksin ja yhdessä tavanomaisten kemoterapiaa hoidettaessa kilpirauhassyöpä.

Menetelmät /Principal havainnot

Tutkimme kahdeksan solulinjoja neljänlaisia ​​kilpirauhassyöpä (papillaarinen, follikulaarinen anaplastinen ja medullaarinen). Sytotoksisuus PXD101 yksin ja yhdessä kolme tavanomaista kemoterapia-aineiden (doksorubisiini, paklitakseli ja doketakseli) mitattiin LDH määritystä. Western blot arvioitiin ilmaus asetylaatio histoni H3, histoni H4 ja tubuliinin proteiineja liittyy apoptoosiin, RAS /RAF /ERK ja PI3K /AKT /mTOR signalointireittien, DNA-vaurioita ja korjaus. Apoptoosi ja solunsisäinen reaktiivisten happiradikaalien (ROS) mitattiin virtaussytometrialla. Hiirillä, joilla on kylki anaplastinen kilpirauhassyöpä (ATC) on päivittäin käsiteltiin intraperitoneaalisesti PXD101 varten 5 päivää viikossa. PXD101 estää tehokkaasti kilpirauhassyöpä solujen proliferaatiota annoksesta riippuvaisella tavalla. PXD101 aiheuttama ROS kertymistä ja estivät RAS /RAF /ERK ja PI3K /mTOR reittejä herkkien solujen. Kaksijuosteisen DNA: n vaurioita ja apoptoosia indusoitiin PXD101 sekä herkkiä tai resistenttejä solulinjoja. PXD101 hidastunut kasvu 8505C ATC ksenograftikasvaimissa lupaavia turvallisuus. Yhdistelmähoito on PXD101with doksorubisiinin ja paklitakselin osoittivat synergiavaikutuksia vastaan ​​neljä ATC riviä

vitro

.

Johtopäätökset

PXD101 tukahduttaa kilpirauhassyövän lisääntymistä ja on synergistinen vaikutukset yhdessä doksorubisiinin ja paklitakselin hoidettaessa ATC. Nämä havainnot tukevat kliinisissä tutkimuksissa PXD101 potilaille tällä synkkä tauti.

Citation: Lin SF, Lin JD, Chou TC, Huang YY, Wong RJ (2013) Utility of Histonideasetylaasi estäjä (PXD101) varten Kilpirauhasen Cancer Treatment. PLoS ONE 8 (10): e77684. doi: 10,1371 /journal.pone.0077684

Editor: Alfredo Fusco, Consiglio Nazionale delle Ricerchen (CNR), Italia

vastaanotettu: 16 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 03 syyskuu 2013; Julkaistu: 14 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Shu-Fu Lin. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Chang Gung Memorial Hospital ja Chang Gung University (CMRPG3A0161, CMRPG3A0162, CMRPG3A0163, CMRPG370581, CMRPG370582 ja CMRPG370583) (https://www.cgmh.org.tw/. https://www.cgu.edu.tw/bin /home.php). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

esiintyvyys kilpirauhasen syöpä on lisääntynyt kolmen viime vuosikymmenen ajan maailmanlaajuisesti [1]. Lisääntynyt havaitseminen pieniä kasvaimia (≤ 1 cm) osuus puolet kasvusta, vaikka muitakin etiologies tätä lisäystä vielä määritettävä [2,3]. Yleisin patologinen tyyppisiä kilpirauhasen syöpä peräisin munarakkuloiden (papillaarinen, follikulaarinen huonosti eriytetty ja anaplastinen syöpä) ja parafollicular kilpirauhassolut (medullaarista syöpä). Potilaat, joilla on hyvin kilpirauhassyöpäpotilailla (papillaarinen ja follikulaarinen syöpä) on yleensä suotuisa ennuste. On kuitenkin rajallinen hoito potilailla, joille kehittyy metastaattinen ja radiojodin tulenkestävät kilpirauhassyöpä, joka on usein parantumaton [4]. ATC on harvinainen ja yleensä kohtalokas maligniteetin, joiden mediaanielossaolosta vain kuusi kuukautta. Medullary kilpirauhassyöpä (MTC) osuus on noin 4% kilpirauhasen pahanlaatuisten Yhdysvalloissa vuonna 2012. Vaikka kaksi estäjät vandetanib ja cabozantinib parantaa ilman taudin etenemistä MTC ja hyväksyttiin FDA äskettäin, ei parannettavissa hoidot ovat saatavilla metastaattisen MTC [ ,,,0],5]. Kaiken kuolleisuus kilpirauhasen syöpä on hieman kasvaa vuosittain vuodesta 1992 [1]. Uusien hoitomuotojen parantamiseksi tarvitaan tuloksia potilaiden Refraktorista kilpirauhassyöpä.

histonideasetylaaseja (HDAC: t) poista asetyyli- ryhmiä lysiinijäämien histoni ja ei-histoni alustoille, kuten transkriptiotekijät ja proteiinien valvontaan solusyklin, lisääntymistä ja apoptoosin. HDAC jaetaan 4 luokkaan niiden homologisia niiden hiiva ortologeja ja näyttävät olevan lupaavia kohteita syövän hoidossa [6-8]. Esto HDAC: t käyttämällä pieniä molekyylejä indusoi useita biologisia vaikutuksia, kuten ROS kertymistä, solusyklin pysähtymisen, DNA-vaurioita ja apoptoosin, jotka voivat johtaa sytotoksisia vaikutuksia. Pahanlaatuisten solujen katsotaan olevan alttiimpia HDAC-inhibiittorit kuin hyvänlaatuinen soluihin [6]. FDA on hyväksynyt kaksi HDAC-inhibiittorit suberoylanilide hydroksaamihappo (SAHA) ja depsipeptidin hoidettaessa ihon T solujen lymfooma.

kilpirauhasen näytteitä, ATC on suhteellisesti eniten HDAC1 ja 2 yli-ilmentyminen (80% ja 92%), seurasi papillaarisen syöpä (61% ja 53%) ja normaali kilpirauhaskudokseen (0% molemmille), mikä viittaa HADC1 ja 2 edistävät kilpirauhassyöpä kasvaimien syntyyn ja erilaistamattomuuden [9]. Mukaisesti Näiden havaintojen Na

+ /I

– symporter ilmaisun ja jodi kerääntyminen voi indusoida HDAC-inhibiittorit huonosti eriytetty ja erilaistumaton kilpirauhassyöpä [10,11]. Edistämisen lisäksi solujen uudelleen erilaistumista, HDAC-inhibiittorit kykenevät indusoimaan apoptoosin kilpirauhassyöpä [12-14]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että HDAC-inhibiittorit ovat mahdollisesti hoidetaan kilpirauhassyövän läpi asiakkuutta syöpäsolu uudelleen erilaistumisen ja apoptoosin. Lisäksi yhdistelmähoito HDAC estäjä kemoterapian kanssa voi voimistaa terapeuttista tehoa vastaan ​​ATC [14-16]. Siksi HDAC-inhibiittorit ovat potentiaalisia aineina hoidettaessa potilaita, joilla on tulenkestävien kilpirauhassyöpä.

PXD101 (belinostat) on yleiseurooppalainen HDAC estäjä, jolla on voimakas sytotoksinen vaikutus erilaisia ​​syöpätyyppien läpi apoptoosin aiheuttamiseksi, riippumatta perijälle vastus kemoterapian [17,18]. Yhdistelmä PXD101 doketakselin kanssa osoitti myönteisiä vaikutuksia hoidettaessa munasarja- ja eturauhas- syöpäsolujen [19,20]. Kliinisesti, yhdistetty hoito PXD101, paklitakselin ja karboplatiinin johti osittainen vaste potilailla, joilla on kiinteitä kasvaimia faasin I tutkimuksessa [21]. PXD101 yhdistelmänä doksorubisiinin myös edullisia tuloksia hoidettaessa pehmytkudossarkooman faasin I /II tutkimus [22]. Nämä tiedot sai meidät tutkimaan terapeuttista tehoa PXD101 kilpirauhassyövän hoitoon. Olemme myös arvioi yhdistämisen vaikutuksia PXD101 ja kemoterapiaa hoidettaessa ATC, aggressiivisin tyyppi kilpirauhassyövän.

Tulokset

Sytotoksisuus ja asetylointi histonien H3, histoni H4 ja tubuliinin PXD101

PXD101 inhiboi soluproliferaatiota kahdeksan kilpirauhassyöpä riviä annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 1A). Nämä solulinjat sisältyi papillaarinen (BHP7-13) follikkelipunktio (WRO82-1) follikkelipunktio erilaistumaton (FRO81-2), neljä anaplastic (8305C, 8505C, KAT18, KAT4C) ja medullaarinen (TT) ihmisen kilpirauhassyöpä. PXD101 1,25 umol /l tukahdutettu vähintään 45% solujen kasvua 7 8 solulinjojen päivänä 4. PXD101 10 mikromol /l estivät yli 70% solukasvua follikkelisolujen-peräisin kilpirauhassyöpä linjat ja 95% vuonna parafollicular medullaarista syöpä (TT). Mediaani vaikutus annos (Dm) ja PXD101 päivänä 4 laskettiin kullekin solulinja (kuvio 1 B). Niistä follikulaarinen solut-peräisin kilpirauhassyöpä, neljä ATC linjat olivat herkempiä PXD101 kuin follikulaarinen erilaistumaton syöpä ja hyvin erilaistunut syöpä (Dm; 8305C = 0,59 umol /L, 8505C = 0,93 umol /L, KAT18 = 0,87 umol /l, KAT4C = 1,13 umol /l, FRO81-2 = 1,71 umol /l, WRO82-1 = 1,33 umol /l, BHP7-13 = 1,49 umol /l). DM MTC syövän linja TT oli 0,33 umol /l. Olemme tutkineet vaikutuksia PXD101 kolme follikulaarista johdettuja kilpirauhassyövän riviä seuraavat tutkimukset.

A, annos-vaste-käyrät saatiin päivänä 4 soluista käsiteltiin sarjan kuusi 1: 1 laimennosta PXD101. B, Dm PXD101 päivänä 4 laskettiin CompuSyn ohjelmisto kustakin solulinjasta. Niistä seitsemän follikkelisolujen johdettuja kilpirauhassyöpä linjat, ATC solulinjat (8305C, 8505C, KAT18 ja KAT4C) oli pienin Dm, jonka jälkeen hyvin erilaistunut follikulaarinen (WRO82-1) ja papillaarinen (BHP7-13) syöpä, ja follikulaarinen eriytymättömiä kilpirauhassyöpä (FRO81-2). Medullary kilpirauhasen syöpäsoluja (TT) oli myös pieni Dm. C, PXD101 indusoima asetylaatio histoni H3 ja histoni H4 annoksesta riippuvalla tavalla. PXD101 myös lisääntynyt asetylointi tubuliinin vuonna BHP7-13, WRO82-1 ja 8505C.

histoni H3, histoni H4 ja tubuliinin voidaan asetyloitu estämällä HDAC: t. Vaikutukset PXD101 aiheuttaa asetylaatio näiden proteiinien arvioitiin 48 tuntia 3 solulinjoissa, jotka edustavat papillaarinen (BHP7-13), follikulaarinen (WRO82-1) ja anaplastinen (8505C) kilpirauhassyöpä (kuvio 1C). PXD101 ≥ 0,625 umol /l merkittävästi indusoi asetylaatio histoni H4 ja tubuliinin kaikissa solulinjoissa. PXD101 ≥ 1,25 mikromol /l lisääntynyt asetylaatio histoni H3 WRO82-1 ja 8505C. Vuonna BHP7-13, asetyloitu histoni H3 esiin, kun suuremman annoksen PXD101 (2,5 umol /l) levitettiin. Nämä tiedot osoittavat, PXD101 voi tukahduttaa HDAC: ien.

vaikutukset PXD101 apoptoosiin

BHP7-13, WRO82-1 ja 8505C altistettiin PXD101 48 ja 72 tuntia ja osa-G1-soluja arvioitiin (kuvio 2A). Verrattuna kontrolli, PXD101 1,25 ja 2,5 mikromol /l merkittävästi indusoi apoptoosia määritettynä osuus osa-G1 solut 48 ja 72 tuntia kaikissa solulinjoissa.

, apoptoosin analysoitiin mittaukset DNA sisältöä käyttämällä virtaussytometria 48 ja 72 tuntia. Kasvavia annoksia PXD101 indusoi suuremman osuuden sub-G1 solut kaikissa solulinjoissa. B, immunoblottaus osoitti PXD101 hajonnut pyöveli kaspaasi-3 kolmessa solulinjoissa.

Vahvista apoptoottinen vaikutus, kaspaasi-3 arvioitiin Western blot 48 tunnin kuluttua hoidon (kuvio 2B). Suuremmat annokset PXD101 aiheuttanut enemmän hajoamista apoptoottisten executioner kaspaasi-3 BHP7-13 ja 8505C. Hajoaminen kaspaasi-3 havaittiin myös WRO82-1 hoidetuilla PXD101 2,5 umol /l. Nämä havainnot tukevat apoptoosin on mekanismi sytotoksisuuden PXD101 kilpirauhasen syöpäsoluja.

Effects of PXD101 on ROS kertymistä

kertyminen ROS HDAC-inhibiittorit pidetään yhtenä mekanismeista osuus sytotoksisuuden (6). Arvioimme tämän vaikutuksen käyttämällä 2 ’, 7’-Dichlorofluorescin diasetaatti (DCFH-DA) määritykset havaitsemaan solunsisäisten ROS altistuneiden solujen PXD101 16 tuntia (kuvio 3A). Verrattuna kontrolli, PXD101 0,625 umol /l huomattavasti DCFH-DA fluoresenssin WRO82-1 (163,1 ± 0,8 ja 124,3 ± 2,4, P 0,001) ja 8505C (135,6 ± 0,9 ja 117,1 ± 0,5, P 0,001). Suuremmat annokset PXD101 aiheuttama enemmän ROS kertymistä näissä soluissa. Kuitenkin tämä vaikutus ei havaittu BHP7-13 joka on vähemmän herkkä PXD101. Pidemmät altistuminen PXD101 vieläkään saada aikaan ROS kertyminen BHP7-13 (24 ja 48 tuntia, tuloksia ei ole esitetty). Kaksi edustavaa solulinjat osoittivat kykyä PXD101 aiheuttaa ROS kertymistä (kuvio 3B). Nämä havainnot viittaavat siihen ROS kertymistä voi selittää sytotoksisuuden PXD101 vastustuskykyisten kilpirauhassyöpä solulinjassa.

, DCFH-DA fluoresenssia käytettiin mittaamaan ROS virtaussytometrialla kilpirauhassyövän syöpäsoluissa käsitelty PXD101 16 tuntia . Lisääntyvä annokset PXD101 tuotti enemmän ROS WRO82-1 ja 8505C, mutta tätä vaikutusta ei havaittu BHP7-13. B, kaksi solulinjaa edustavat kykyä PXD101 kerääntyä ROS. C, Immunoblot osoittaa PXD101 tukahdutettu p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p-AKT (Ser473), p-4E-BP1 (Thr37 /46) ja p-S6 ribosomaalisen proteiinin (Ser235 /236) in 8505C. Inhiboiva vaikutuksia ei havaittu, kun pieni annos PXD101 (0,625 umol /l) sovelletaan BHP7-13 ja WRO82-1. D, kasvavia annoksia PXD101 tehostetun hajoamisen Ku70, Ku80 ja RAD51, ja tehostettu ilmentyminen p-H2AX (Ser139), RAD52 ja ERCC1 in BHP7-13, WRO82-1 ja 8505C.

Modulation proteiinin liittyy RAS /RAF /ERK ja PI3K /AKT /mTOR signalointipolkujen tekijänä PXD101

RAS /RAF /ERK ja PI3K /AKT /mTOR signaalitransduktioreittiin ovat tärkeitä kasvua ja selviytymistä kilpirauhassyöpä (4 ). Tunnetun raportti osoittaa, että HDAC-inhibiittori voi inhiboida näitä reitit leukemiasolujen [23]. Olemme tutkineet vaikutuksia PXD101 näihin reittejä BHP7-13, WRO82-1 ja 8505C (kuvio 3C). PXD101 johdonmukaisesti tukahdutettu p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p-AKT (Ser473), p-4E-BP1 (Thr37 /46) ja p-S6 ribosomaalisen proteiinin (Ser235 /236) vuonna 8505C, joka on herkkä solu linja. PXD101 oli vain vähäinen vaikutus p-AKT in BHP7-13 ja WRO82-1. Yllättäen pieni annos PXD101 (0,625 μmmol /L) aktivoitu p-ERK1 /2 ja p-S6 ribosomaalisen proteiinin BHP7-13 ja WRO82-1. p-4E-BP1 lisääntyi myös WRO82-1. Siksi PXD101 estää RAS /RAF /ERK ja PI3K /AKT /mTOR signa- herkässä solulinjassa.

Effects of PXD101 DNA vaurioita ja korjaa

HDAC-inhibiittorit voivat edistää kaksinkertaisen -stranded DNA tauot (DSB: t) ja lukemiin apoptoosin [24,25]. Tämä mekanismi voi myötävaikuttaa sytotoksisuuden PXD101 kilpirauhassyövän hoitoon. Olemme arvioineet proteiinien ekspression, jotka liittyvät DNA: n vaurioita ja korjaus käsitellyissä soluissa PXD101 48 tunnin ajan (kuvio 3D). p-H2AX (Ser139), perinteinen DSB markkeri on merkittävästi parannettu, ja annoksesta riippuvalla tavalla kaikissa solulinjoissa, tukemalla PXD101 voi aiheuttaa DSB kilpirauhasen syöpäsoluja. Ennen raportit osoittavat HDAC-inhibiittorit voidaan torjua DNA korjaukseen proteiineja, jotka edistävät DSB: ihin [24-26]. Olemme tutkineet tätä mahdollisuutta ja löysi PXD101 huomattavasti vähentynyt ei-homologisella end liittymällä (NHEJ) DNA korjaus proteiini Ku70 kaikissa solulinjoissa (kuvio 3D). Toinen NHEJ proteiini Ku80 myös tukahduttaa jossain määrin. Hajoaminen joko Ku70 tai Ku80 voi johtaa heikentyvän NHEJ korjaus. Homologinen rekombinaatio (HR) korjaus on toinen tärkeä DSB korjaukseen liittyvän reitin. Meidän eteni tutkia ilmentymistä keskeinen HR korjaus- proteiinin RAD51 ja löysi RAD51 oli erityisesti tukahdutettu PXD101 kaikissa solulinjoissa (kuvio 3D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että PXD101 voi estää HR korjaus. Kun keskeinen DSB kuntoutuskoneet NHEJ ja HR oli vaarantunut, yksiketjuisen DNA: n hehkutus (SSA) reitin voi olla vaihtoehtoisen mekanismin DSB korjaus [27]. Tätä mahdollisuutta tutkittiin tässä tutkimuksessa samoin, ja SSA proteiinit RAD52 ja ERCC1 lisääntynyt altistuminen PXD101 altistumista kaikissa solulinjoissa (kuvio 3D).

vuorovaikutus PXD101 ja kemoterapian ATC-soluissa

vaikutus yhdistämällä PXD101 eri kemoterapeuttisten aineiden vastaan ​​ATC-soluja arvioitiin. Kolme kliinistä asiaan kemoterapia-aineiden (doksorubisiini, paklitakseli ja doketakseli) käytettiin tätä tutkimusta varten [28]. DM Näiden aineiden kussakin ATC solulinjassa oli raportoitu aiemmin [29]. Vuorovaikutukset PXD101 ja doksorubisiini, paklitakseli ja doketakseli arvioitiin. Yhdistelmä PXD101 ja jokainen kemoterapeuttisen aineen osoitettiin suotuisa terapeuttinen vaikutus kaikissa ATC syöpälinjojen (kuva S1).

vuorovaikutukset PXD101 ja kemoterapia-aineiden arvioitiin laskemalla yhdistelmä indeksi (CI) Chou-talalay yhtälö ( kuvio 4A), jossa CI 1 tarkoittaa synergismiksi CI = 1 esittää riippuvuutta, ja CI 1 osoittaa antagonismia [30,31]. Synergiavaikutuksen kirjattiin yhdistelmä PXD101 doksorubisiinin ja PXD101 paklitakselin kaikissa ATC linjat (CI; 8305C = +0,52-0,98 ja 0,68-0,91, 8505C = ,32-+0,39 ja ,03-+0,58, KAT18 = ,61-+0,76 ja 0.18- 0,94, KAT4C = 0,51-0,69 ja 0,68-0,71, vastaavasti). Yhdistelmä PXD101 doketakselin kanssa oli synergistinen 8305C, 8505C ja KAT4C (CI; 8305C = ,83-+0,84, 8505C = +0,04-+0,42, KAT4C = 0,42-0,76). Yhdistelmä PXD101 doketakselin kanssa vaihteli synergisoivat antagonisti KAT18 (CI, 0,1-1,2). Nämä tulokset osoittavat, että yhdistelmä PXD101 doksorubisiinin ja paklitakselin on synergistisiä vaikutuksia vastaan ​​kaikki ATC linjat, ja yhdistelmä PXD101 doketakselin kanssa on synergistinen kolme neljä riviä. Laskimme annoksen pienentämistä indeksi (DRI) kunkin kemoterapeuttisen aineen; DRI osoittaa kertaiseksi lääkeaineen annoksen pienentämisen, kun läsnä on PXD101 (kuvio 4B). Alle altistuminen PXD101 annokset doksorubisiinia, paklitakselin ja doketakselin voidaan vähentää (kaikki DRI 1,0).

, CI PXD101 keskenään kemoterapia-aineiden laskettiin käyttäen CompuSyn ohjelmistoa kullekin lennonjohdon solulinjan. PXD101 plus doksorubisiini ja paklitakseli osoittaneet synergistisiä vaikutuksia kaikissa solulinjoissa, jossa CI 0.8 korkeintaan olosuhteissa. PXD101 ja doketakselin oli synergistinen 8305C, 8505C ja KAT4C, ja yhteisvaikutukset on antagonistinen KAT18. Vaakasuorat katkoviivat at CI = 1 piirrettiin. B, tyypillinen alueet DRI arvojen kemoterapiaa yhdistettynä PXD101. Läsnäolo PXD101, doksorubisiini, paklitakseli ja dosetakseli kaikilla oli suotuisa DRI. Pienin DRI Doksorubisiinin, paklitakseli ja dosetakseli kaikki esiintyi KAT18 (1,8, 1,5 ja 1,6, tässä järjestyksessä). Vaakasuorat katkoviivat at DRI = 1 piirrettiin.

PXD101 hoito hiiren kylkeen kasvaimia

terapeuttisia vaikutuksia ja turvallisuutta PXD101

in vivo

arvioitiin kateenkorvattomiin kantavissa nude kylki ATC 8505C ja TT ksenograftit. Hiiret, joilla on todettu kyljen kasvaimia käsiteltiin intraperitoneaalisesti PXD101 (40 mg /kg) tai vehikkeliä päivittäin 5 annosta viikossa, kunnes 14 päivää (kuvio 5A). PXD101 merkittävästi tukahdutettu 8505C kasvaimen kasvua verrattuna kontrolliryhmään päivänä 7 (1,7 ± 0,1-kertaisesti ja 3,4 ± 0,5-kertaisesti, P = 0,004), ja päivä 14 (3,6 ± 0,3-kertaisesti ja 6,6 ± 1,0-kertaisesti, P = 0,014). PXD101 ei ollut merkittäviä vaikutuksia muuttaa kehon painon aikana tutkimusjakson aikana (kuvio 5B). Emme havainneet mitään sairastuvuutta näillä eläimillä.

, päivittäinen intraperitoneaalinen injektio PXD101 5 päivää viikossa tukahdutettu 8505C kasvaimen kasvua. Erot Kasvaimen tilavuuden kasvua vuosina PXD101 ja kontrolliryhmän oli tilastollisesti merkitsevä päivinä 7 ja 14. B, PXD101 ei aiheuttanut merkittävää laihtuminen hiirillä (P 0,05). C, 3 tunnin kuluessa, PXD101 lisääntynyt fosforylaatiota H2AX ja asetylointi histonien H3 ja H4, ja tukahdutettu p-AKT, RAD51, kaspaasi-3 ja PCNA. Muutostyöt näiden proteiinien väheni 6-16 tuntia.

proteiineja, jotka voivat vaikuttaa PXD101 arvioitiin näissä eläinten kasvaimissa (kuvio 5C). Yksi vatsaontelonsisäinen injektio PXD101 (40 mg /kg) lisäsi p-H2AX (Ser139) ja asetylointi histoni H3 ja H4 3 tuntia ja vaikutukset pieneni 6 tuntia. RAD51 oli tukahdutettu 3 tuntia ja se ilmestyi 6 24 tuntia (kuvio 5C, kuva S2). p-AKT (Ser473) vähitellen tukahdutettu 3 ja 6 tuntia ja tämä estävä vaikutus oli poissa 16 tuntia. Lisääntyminen merkki lisääntyvien solun tuma-antigeenin (PCNA) oli hieman vähentynyt 3-6 tuntia. PXD101 merkittävästi hajonnut kaspaasi-3: 3-6 tuntia. Nämä tiedot paljastavat, että PXD101 oli vankka, mutta ohimenevää vaikutuksia ATC ksenografteissa, ja viittaavat siihen, että useammin anto PXD101 voi parantaa terapeuttista tehoa.

Keskustelu

PXD101 tehokkaasti esti leviämisen kahdeksan kilpirauhassyöpä solulinjoissa peräisin neljä suurta histologisia tyyppejä. Niistä seitsemän kilpirauhassyöpä linjat, ATC oli herkempi kuin follikulaarisen ja hyvin eriytetty syöpiä. Nämä havainnot viittaavat siihen, että ATC todennäköisesti riippuu HDAC enemmän kuin muut syöpätyyppeihin. TT on myös alhainen Dm, mikä HDAC ovat tärkeitä parafollicular kilpirauhasen syöpäsoluja. PXD101 estää laajan kirjon HDAC: ien, mukaan lukien luokan I, II a ja II b, joka estää päätellä mikä HDAC on tärkeämpää selviytymisen kilpirauhassyövän.

Yksi terapeuttinen mekanismi HDAC-estäjien hoidossa maligniteetti on kautta induktion apoptoosin. PXD101 aiheutti apoptoottisen vaikutuksia annoksesta ja ajasta riippuvaa tavalla BHP7-13, WRO82-1 ja 8505C, mikä viittaa siihen, että tämä mekanismi muodostaa terapeuttisen tehokkuuden PXD101.

Ennen raportit osoittavat HDAC-estäjät vähentävät tioredoksiini aktiivisuutta, kerääntyä ROS ja johtaa apoptoosin transformoiduissa soluissa, mutta ei normaaleissa soluissa [6,32]. Siksi ROS kertymistä pahanlaatuiset solut voivat olla mekanismi syöpää spesifisyys sytotoksisuutta HDAC-inhibiittorit. Tässä tutkimuksessa, PXD101 kertynyt ROS annoksesta riippuvalla tavalla in WRO82-1 ja 8505C, mutta ei resistenttejä solulinjassa BHP7-13. Nämä havainnot ovat yhdenmukaisia ​​tämän mekanismin alttiutta HDAC-inhibiittorit.

RAS /RAF /ERK ja PI3K /AKT /mTOR signalointireiteissä ovat tärkeitä kilpirauhassyöpä kasvainten synnyssä, etenemistä ja eloonjäämistä [4,33]. Keskeytys Näiden signalointipolkujen on yksi strategia hoitoon kilpirauhasen pahanlaatuisen [29,34]. Tässä tutkimuksessa PXD101 esti näiden reittien herkällä solulinjassa 8505C, mutta ei WRO82-1 ja BHP7-13. Tiedot tarkoita, että kyky PXD101 estää RAS /RAF /ERK ja PI3K /AKT /mTOR reitit voivat antaa herkkyys.

p-H2AX on klassinen markkeri DSB, vakava tyyppi DNA-vaurioita [35 ]. PXD101 merkittävästi indusoi p-H2AX kolmella kilpirauhassyöpä solulinjoissa, tukee DSB kuin yksi mekanismi osuus sytotoksisuuteen PXD101. Osoitamme, että PXD101 vähenee DSB korjaus proteiineja NHEJ (Ku70 ja Ku80) ja HR (RAD51) polkuja. Sillä NHEJ The Ku70-Ku80 heterodimeeri tunnistaa DSB, ja rekrytoi DNA proteiinikinaasikompleksi. Vähentynyt ilmentyminen Ku70 tai Ku80 voi heikentää NHEJ korjaukseen liittyvän reitin [27,36]. HR, RAD51 sitoutuu resektoitua loppuun yksijuosteista DNA: ta (RAD51-ssDNA nukleoproteiini filamentti), mikä mahdollistaa synteesin riippuvainen läpivetohehkutus DSB korjata [37]. Analyysi osallistujien osuuden laajuuteen yksittäisten HR proteiinien DNA korjaukseen ja totesi, että ehtyminen RAD51 indusoi merkittävimmistä HR vika [37,38]. SSA reitti on vaihtoehtoinen mekanismi DSB korjaus kun NHEJ ja HR ovat viallisia [27,39]. PXD101 lisääntynyt RAD52 ja ERCC1, mikä viittaa SSA koulutusjakso on aktivoitu. Kuitenkin, kun p-H2AX on lisääntynyt aktivaatio SSA näyttää riitä korjaus DSB: ihin [40]. Lisäksi PXD101, muut HDAC-inhibiittorit voivat tukahduttaa DSB korjaus proteiineja [41-43]. Jotkut HDAC vastaavat DNA: n korjaukseen; HDAC1 ja 2 edistävät NHEJ, ja HDAC 9 ja 10 tarvitaan HR [44,45].

PXD101 hoitoa merkittävästi tukahdutettu 8505C kasvaimen kasvua tutkimusjakson aikana. PXD101 ohimenevästi lisääntynyt asetylaatio histoni H4, joka on yhdenmukainen tunnetun raportin [17]. Lisäys p-H2AX ehdottaa PXD101 aiheuttama DSB sisään 8505C ksenografteissa. Anti-kasvain vaikutus PXD101 voi olla apoptoosin kautta ja proliferaation esto, koska kaspaasi-3 ja PCNA laskivat. Mitään merkittäviä laihtuminen tai myrkyllisyydestä tässä tutkimuksessa havaitut, mikä viittaa suotuisa turvallisuusprofiili. Tutkimme myös terapeuttisia vaikutuksia PXD101 hiirissä, jotka kantoivat TT kasvaimia. Päivittäinen intraperitoneaalinen injektio PXD101 (40 mg /kg) 5 annosta viikossa ei tukahduttaa kasvua TT ksenograftien (tuloksia ei ole esitetty). On mahdollista, että intensiivisempää PXD101 hoito-ohjelma voi vaikuttaa kasvuun TT ksenograftien.

ATC on kaikkein aggressiivinen kilpirauhassyöpä ja on tyypillisesti kohtalokasta, jossa on 1 vuoden eloonjäämisaste vain 20% [28] . Uusien hoitomuotojen kehittämiseksi tarvitaan synkkä tuloksia. Huomasimme, että yhdistelmä PXD101 doksorubisiinin ja PXD101 kanssa paklitakselilla oli synergistinen vaikutus vastaan ​​neljä ATC solulinjoja. Ennen raportti osoittaa heterogeenisyys syöpäsolujen näkyy jopa yhdessä kasvaimeen [46]. Siksi yhdistelmähoitoa hoito kanssa synergiavaikutukset vastaan ​​useita ATC solulinjoja, jotka ovat vaihdelleet geneettinen tausta voi olla kliinistä merkitystä. Doksorubisiini estää topoisomeraasi II ja aiheuttaa katkoksia genomista DNA [47]. PXD101 esti kaksijuosteisen DNA kuntoutuskoneet jotka voivat lisätä sytotoksisuutta doksorubisiinin. Paklitakseli on osoittanut 53% vaste vastaan ​​ATC faasin II tutkimuksessa [48]. Suotuisa yhdistelmä vaikutukset PXD101 paklitakselilla tuella huomioon tämän hoidon käyttöä potilailla, joilla ATC.

Äskettäin Chan et ai. Lisäksi on raportoitu, että PXD101 hidastaa kasvua PTC ksenograftikasvaimissa [49]. PXD101 siis on kyky estää kasvun sekä hyvin eriytetty ja erilaistumaton kilpirauhassyöpä

in vivo

. Nämä tiedot vahvistavat sitä mahdollisuutta, että PXD101 voidaan käyttää potilailla, joilla on tämä tappava tauti. Toisin kuin havaintomme, PXD101 johdonmukaisesti tukahdutettu p-AKT (Ser473) ja p-ERK tunnetussa tutkimuksessa. Yksi mahdollinen selitys tälle ristiriidassa keskenään kaksi tutkimusta on erittäin suuri annos PXD101 (≥ 20-kertainen), joka on sovellettu aiemmissa tutkimuksessa verrattuna nykyiseen tutkimus. Tällaiset suuret annokset PXD101 todennäköisemmin tukahduttaa p-AKT ja p-ERK. Tutkimuksemme lisäksi osoittaa, että useita molekyyli- tapahtumien aiheuttama PXD101 voi aiheuttaa sytotoksisuutta, ja näyttää tehoa yhdistelmähoitoa käyttämällä PXD101 tavanomaisen kemoterapian nykyisin käytössä anaplastinen kilpirauhassyöpä. Mikä tärkeintä, me osoittavat synergiavaikutuksen yhdistelmän PXD101 doksorubisiinin ja paklitakselin, mikä viittaa todennäköisesti kliinistä merkitystä hoidettaessa potilaita, joilla ATC.

Yhteenvetona PXD101 koitunut merkittävä sytotoksisuutta neljä suurta histologista tyyppiä kilpirauhassyöpä. Nudehiiriin 8505C ksenograftikasvaimissa osoittaneet terapeuttista tehoa ja turvallisuutta profiilit PXD101. Tärkeää on, PXD101 synergistisesti parantaa terapeuttista vaikutusta doksorubisiinin ja paklitakselin vastaan ​​neljä ATC solulinjoja. Nämä suotuisat tulokset tukevat suunnittelun tulevaisuuden kliinisissä tutkimuksissa tutkitaan hyödyllisyys PXD101 aineena sellaisten potilaiden hoitoon, joilla on edennyt kilpirauhassyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat

Kahdeksan vakiintunut kilpirauhassyövän solulinjat tutkittiin, kuten papillaarinen (BHP7-13) follikkelipunktio (WRO82-1) follikkelipunktio erilaistumaton (FRO81-2), neljä anaplastic (8305C, 8505C, KAT18, KAT4C) ja medullaarinen (TT) ihmisen kilpirauhassyöpä [29,50-52]. Kaikki solulinjat paitsi KAT4C olivat autentikointia DNA (lyhyt peräkkäistoistot) profiloinnin ja säilyttää nestetypessä ennen käyttöä [29,53]. BHP7-13, WRO82-1, FR081-2, KAT4C ja KAT18 pidettiin RPMI 1640 natriumbikarbonaatilla (2,0 g /l). 8505C ja 8305C pidettiin MEM natriumpyruvaattia (1 mmol /l) ja natriumbikarbonaattia (2,2 g /l). TT säilyi F12K. Kaikki väliaine sisälsi 10% FCS: ää, 100000 yksikköä /l penisilliiniä ja 100 mg /l streptomysiiniä. Kaikki soluja ylläpidettiin 5% CO2: a kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa.

Farmakologiset aineet

PXD101 on yleiseurooppalainen HDAC-inhibiittori aiemmin on kuvattu [17], ja saatiin Selleck Chemicals. PXD101 liuotettiin DMSO: hon (10 mmol /L

in vitro

ja 100 mg /ml

in vivo

tutkimuksissa, Sigma) ja säilytettiin -30 ° C: ssa, kunnes kokeiluja. Sillä

in vivo

tutkimuksissa, PXD101 laimennettiin edelleen PBS: llä loppupitoisuuteen 8,6 mg /ml. Doksorubisiini, paklitakseli ja doketakseli saatiin Sigma Chemical Co: doksorubisiini (5 mmol /l) liuotettiin PBS: ään, paklitakseli (320 umol /l) ja doketakselin (640 umol /l) liuotettiin DMSO: hon ja niitä säilytettiin -30 ° C: ssa käyttöön asti.

vasta

vasta kohdistaminen asetyyli. histoni H3 ja histoni H4 olivat EMD Millipore. Asetyyli. tubuliinia ja α-tubuliinin vasta-aineet olivat yhtiöltä Sigma. Kaspaasi-3-, p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204), p-AKT (Ser473), p-4E-BP1 (Thr37 /46), p-S6 ribosomaalinen proteiini (Ser235 /236), p-H2AX (Ser139) , Ku70, Ku80, RAD52, ERCC1 ja PCNA-aineet olivat peräisin Cell Signaling. RAD51 vasta-aine oli Invitrogen-yhtiöstä.

Sytotoksisuusmääritykset

Solut maljattiin 2 x 10

3-2 x 10

4 solua per kuoppa 24-kuoppalevyille 1 ml: ssa media. Yön yli inkuboinnin jälkeen, PXD101 tai vehikkeliä lisättiin ilmoitetun pitoisuuden. Kuusi sarja 1: 1 laimennoksia PXD101 testattiin aloittaen 10 mikromol /l yli 4 päivän hoitojakso. Sytotoksisuus määritettiin päivänä 4. Solut pestiin PBS: llä ja lyysattiin Triton X-100 (1,35%, Sigma) vapauttaa solunsisäisiä laktaattidehydrogenaasin (LDH), joka kvantifioitiin kanssa CytoTox 96 kit (Progmega) 490 nM spektrofotometrillä (BT-MQX200R, Bio-Tek Instruments). Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena ja tulokset on esitetty prosentteina eloonjääneiden solujen määritettiin vertaamalla LDH kunkin näytteen suhteessa kontrollinäytteisiin, joita pidetään 100% elinkelpoisia. Dm päivänä 4 laskettiin kustakin solulinjasta käyttäen CompuSyn ohjelmiston [30,31].

yhdistelmähoitoa kokeissa, ATC-soluja käsiteltiin PXD101 ja kemoterapeuttisen lääkkeen (doksorubisiini, paklitakseli tai doketakseli) kiinteällä annos suhde. Soluja inkuboitiin ajoneuvon PXD101, kemoterapeuttinen aine, tai molemmat samanaikaisesti 4 päivän kurssi ja sytotoksisuus mitattiin. Kuudesta seitsemään sarja 1: 1 laimennukset käsitellään seuraavassa alkaa annoksia 8305C, 8505C, KAT18 ja KAT4C: PXD101 2,4, 3,6, 3,6 ja 4,4 umol /l, doksorubisiinia 0,64, 0,16, 0,22, 0,27 umol /l, paklitakseli 50,8, 22,4, 17,6 ja 13,2 nmol /l, doketakseli 34,4, 6,8, 5,2 ja 7,6 nmol /l. Annokset valitaan perustuivat Dm määritelty tässä ja aiemmissa tutkimuksissa [29].

Western blotit

Solut maljattiin 1 x 10

6 solua 10 cm petrimaljoille 10 ml: ssa väliainetta yön yli ja käsiteltiin PXD101 tai ajoneuvon 48 tuntia. Solunapit liuotettiin radioimmunologisissa määrityspuskuria ja proteaasiestäjäseostabletit, vorteksoitiin ja kirkastettiin sentrifugoimalla. Kokonaisproteiinista (20-50 ug) elektroforeesi 10-12% Tris-HCl geelit, siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja, tukossa, ja altistettiin ensisijainen vasta seurasi sekundäärinen vasta-aine oli konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin. Signaalit kehitettiin käyttäen parannetun kemiluminesenssi kit (Bionovas Biotechnology). α-tubuliinin toimi latauskontrollina.

Apoptoosi ja ROS arviointi

Solut maljattiin 1 x 10

5 solua kuoppaa kohti 6-kuoppalevyille 2 ml: ssa väliainetta yön yli ja käsiteltiin lumelääkkeeseen tai PXD101 ilmoitetuilla annoksilla 48 ja 72 tuntia. Kelluvat solut ja trypsinisoitiin kiinnittyneet solut kerättiin, pestiin PBS: llä, kiinnitettiin kylmällä 70% etanolilla ja inkuboitiin RNaasi A: lla (100 ug /ml; Sigma) ja propidiumjodidia (5 ug /ml; Sigma) 37 ° C: ssa 15 minuutin ajan . Apoptoottisten sub-G1-soluja havaittiin DNA-pitoisuus käyttäen virtaussytometriaa (BD FACScalibur -virtaussytometrillä, BD Biosciences).

Solut maljattiin 1 x 10

5 solua per kuoppa 6-kuoppaisille levyille 2 ml: ssa väliainetta 24 tuntia ja käsiteltiin lumelääkettä tai PXD101 ilmoitetuilla annoksilla 16 tuntia. Trypsinoitiin kiinnittyneet solut kerättiin ja niitä inkuboitiin 10 umol /l DCFH-DA (Sigma) 37 ° C: ssa pimeässä 30 minuutin ajan. 0,05.