Krooninen sairaus

tiivistelmä

Cellular heterogeenisuus on keskeinen rooli erilaisia ​​toiminnallisia prosesseja in vivo, mukaan lukien syövän synnyn. Kuitenkin meidän tietoa solu-solu monimuotoisuuden ja miten erot yksittäisissä soluissa ilmenevän muutoksiin väestön tasolla vain hyvin vähän lähinnä puute asianmukaisia ​​välineitä, joiden avulla opinnot yksisoluisia tason. Me esittää selvityksen muutoksista solujen heterogeenisyys yhteydessä premaligneja etenemistä vastauksena hypoksinen stressiä. Hyödyntämällä premaligneja etenemisen Barrettin ruokatorvi (BE) sairaudeksi malli järjestelmä tutkittiin molekyylitason mekanismit etenemistä metaplastiset kohteeseen dysplastic (pre-syöpä) vaihe. Käytimme äskettäin kehitetty menetelmiä, joiden avulla mittaukset solusta soluun eroja Kopiomääränä mitokondrion DNA, ekspressiotasot joukko mitokondrioiden ja ydinvoiman geenien hypoksiavaste polkuja, ja mitokondrion kalvon potentiaalia. Toisin kuin suurin solututkimuksia aiemmin ilmoitettua, tutkimuksemme osoittaa huomattavia eroja metaplastiset ja dysplastic BE solujen sekä keskiarvojen ja yksisoluiset parametri jakaumia mtDNA kopioida numeroita, mitokondrioiden toimintaa, ja mRNA: n ilmentymisen tasoja tutkittiin geenejä. Perustuen yksisoluiset data-analyysi, ehdotamme, että mitokondriot voivat olla yksi tärkeimmistä tekijöistä premaligneja etenemisen BE.

Citation: Wang J, Shi X, Johnson RH, Kelbauskas L, Zhang W, Meldrum DR (2013) Single-Cell analyysi osoittaa varhainen ilmeneminen syöpä fenotyypin premaligneja Ruokatorven solut. PLoS ONE 8 (10): e75365. doi: 10,1371 /journal.pone.0075365

Editor: Nagendra Yadava, UMass-Amherst /Tufts University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 4. kesäkuuta, 2013 Hyväksytty: 12 elokuu 2013; Julkaistu: 08 lokakuu 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Rahoitus tuli National Institutes of Health (NIH), National Human Genome Research Institute (NHGRI), Center of Excellence in Genomic Sciences (CEGS) ja mikrotason Life Sciences Centerin Grant nro 5 P50 HG002360 (PI DRM) http: //www.genome gov /. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ruokatorven adenokarsinooma (EAC) on erittäin tappava syöpä tyyppi ja uskotaan kehittyä ruokatorven epiteelisolujen läpi sarjan monimutkaisia, vaiheittaista muunnokset klo biomolekyylitason tasolla [1] – [6]. Kun transformoituja, EAC-solut tuottavat huomattavasti korkeampi antioksidantti molekyylien tekee niistä resistenttejä kohonneet reaktiivisen hapen (ROS) [2]. Vaikka viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että muutos sekvenssi tavoitteena on kehittää liikakasvun ja metaplasiaa aiheuttama krooninen tulehdus squamous ruokatorven epiteelin, jonka jälkeen multifokaalinen dysplasia, karsinooma

in situ

ja lopuksi invasiivisia EAC [1], [7], [8], yksityiskohtaiset molekyylimekanismin taustalla muutos on vielä selvittämättä.

Hypoksia on keskeinen rooli syövän [9] – [16]. Kuten lähes kaikki kiinteät kasvaimet, hapensaannin syöpäsoluihin huomattavasti heikentyä hallitsemattoman solukasvun ja heikkoa kehitystä hiussuonisto. Mitokondrion, voimanpesä solun ja merkittävä lähde Adenosiinitrifosfaatti (ATP) normaaleissa soluissa, on paikka, jossa oksidatiivisen fosforylaation (OXPHOS) tapahtuu. Mitokondriot on myös todettu olevan tärkeä rooli ohjelmoidun solukuoleman eli apoptoosin, ja niiden toimintahäiriö liittyy erilaisia ​​sairauksia. Esimerkiksi vaihtelut mitokondriaalisen DNA (mtDNA) kopiomäärä on liitetty ei ainoastaan ​​eri solun fysiologisia olosuhteita, mutta myös erilaisia ​​muutoksia sisäisen ja ulkoisen mikroympäristöihin [17], [18]. On osoitettu, että mitokondriot voivat lisätä tasoja ROS aikana hypoksiaa [19], joka johti olettamus, että mitokondriot, ensisijainen tavoite hapettumista, voi toimia endogeeninen happisensori.

Yksi tärkeimpiä tekijöitä määritettäessä lääkevaste ja aggressiivisuus kasvaimia on suuri kasvaimensisäisenä heterogeenisyys. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että jopa solut klonaalisen populaation tai näennäisesti homogeenisen kudoksen esiintyy huomattavaa vaihtelua eri ominaisuudet vaihtelevat geenien ilmentymisen tasoa fenotyypin ominaisuuksia, [20] – [22]. Nyt on yleisesti hyväksytty, että mitokondrioiden epäyhtenäisyys, mukaan lukien vaihtelut mtDNA kopiomäärä, DNA mutaatio /ehtyminen, ilmaisun ja sääntelyn geenien koodaamien mtDNA, ja toiminnan tason, on tärkeä tekijä mitokondrioiden monimutkaisuutta ja edistää yleistä solu-heterogeenisuus [23] – [25].

Useimmat nykyiset bioanalyyttisiä tekniikoita kerätä tietoja käyttämällä tuhansista miljooniin soluja, luonnostaan ​​tuottaa tuloksia keskiarvona suuri solupopulaatio. Tällaiset bulk-solu lähestymistavat saattavat menettää tärkeitä ja arvokkaita käsiteltäessä hyvin heterogeeninen järjestelmiin [26], kuten syöpä [27]. Siksi kehittäminen ja tekniikan soveltaminen työkykyisiä, analyysejä yhden solutasolla ovat kriittisiä, paitsi ymmärrettäisiin paremmin ydin solun prosesseja, mutta myös uusia, tehokkaampia strategioita sairauksien ehkäisyyn, hallintaan ja hoitoon [28 ] – [31].

tässä tutkimuksessa käytetään kahta ikuisti ihmisen Barrettin ruokatorven epiteelisolujen linjat CP-A ja CP-C, jotka oli alun perin peräisin hoitoon Barrettin ruokatorvi (BE) ilman dysplasia ja dysplasia, vastaavasti [32]. Vaikka molemmat ovat ei-pahanlaatuisten epiteelisolujen todettiin, että CP-C-solut olivat resistenttejä oksidatiivisen stressin aiheuttamaa sappihapon (kenodeoksikoolihappo (CDCA)) kuin CP-A, mikä viittaa siihen, että ainakin osalta hapon vastauksen, CP- C-solut toimivat enemmän ruokatorven syöpä solulinjoja verrattuna CP-A-solut [2]. Tässä tutkimuksessa pyrimme selvittämään mahdollisia mekanismeja johtavat pahanlaatuisiksi BE mukaan määrällisesti eroja siinä, miten solut reagoivat oksidatiivisen stressin aiheuttama hypoksia. Olemme soveltaneet qPCR-pohjainen tekniikka kehittyi meidän lab määrittää mtDNA kopiomäärä ja ekspressiotasot mitokondrioiden ja ydinvoiman geenien yksittäisissä soluissa. Hyödyntämällä yksisoluiset analyysi meidän erottaa eroja mtDNA kopioiden määrä, mitokondrion kalvon potentiaalia, ja hypoksiavaste geenin ilmentymisen tasojen CP-A: n ja CP-C-soluja, joita ei voida ennustaa irtotavarana soluanalyysi. Sovellus Näiden uusien menetelmien sekä yksisoluiset O

2 kulutus mittaukset [33] – [35], sallitaan luonnehdinta hienoisia hypoksiavaste eroja CP-A ja CP-C-soluja. Parempi ymmärrys molekyyliperustan EAC aloittamisesta ja kehitys helpottaa pyrkimyksiä määritellä mahdollisia terapeuttisia kohteita.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja Hypoksia hoito

Barrettin ruokatorven epiteelisolulinjaa CP-A ja CP-C saatiin ATCC ja kasvatettiin Gibco® Keratinosyyttien Serum-Free Medium (SFM) solujen kasvua väliaineessa (Invitrogen, Carlsbad, CA), johon oli lisätty hEGF (Peprotech, Rocky Hill, NJ) on 5,0 ug /L, BPE (naudan aivolisäkeuutetta) 50 mg /l ja penisilliini /streptomysiiniä liuos (Invitrogen, Carlsbad, CA) on 100/100 ug /ml kudos- viljelmän inkubaattorissa 37 ° C: ssa kostutetussa ilmassa, jossa on 5 % CO

2. Ennen kokeita soluja viljeltiin 75 cm

2 pullo noin 80% konfluenssin. Solut G1 vaiheessa lajiteltu kanssa FACSAria (BD Biosciences, San Jose, CA) käytettiin qPCR kokeiluja tässä tutkimuksessa. Sillä hypoksia, CP-A: n ja CP-C-solujen 80% konfluenssiin inkuboitiin keratinosyyttien SFM alustassa, joka sisälsi 2% (v /v) Oxyrase (Oxyrase, Inc., Mansfield, OH), 37 ° C: ssa 30 minuuttia, jonka on optimaalinen Oxyrase käsittelyaika määritetty aiemmin [31]. Solut sen jälkeen trypsinoitiin 0,05% (v /v), trypsiini, joka sisälsi 2% (v /v) Oxyrase 37 ° C: ssa 9 min. Trypsinoimalla estettiin lisäämällä Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM) (Invitrogen) supplmented 5% naudan sikiön seerumia (FBS) (Invitrogen), joka sisälsi 2% (v /v) Oxyrase.

Yhden solun Sadonkorjuukoneet

yksisoluiset korjuu (aspiraatio ja annostelu) suoritettiin käyttäen mikromanipulaattoria kehittämää ryhmämme [36], [37] (Methods S1).

Primer suunnittelu ja valinta Gene Target

Fragments sisällä hypervariaabelialueen I (HVI) in mtDNA valittiin kopiomäärä analyysi [38], [39]. Yhteensä DNA eristettiin kokoomanäyte (1 x 10

4 solut) käytettiin mallina mtDNA kopioluvun mittaus, ja kvantitoitiin käyttäen Real-Time qPCR System (StepOne, Applied Biosystems, Foster City, CA) käyttäen optimoitua alukkeita ( menetelmät S1). RT-qPCR ilmentymisen tason analyysi, neljä mitochondrially koodattu geenit (16s rRNA,

COXI

,

COXIII, CYTBI

ja neljä ydinvoimalaitosyksikköä geenit (28s rRNA, VEGF, MT3, ja PTGES) (alukkeet sekvenssit, kuten [31]) valittiin (Methods S1).

yksisoluiset mtDNA Kopioi numero määritys

sadonkorjuun jälkeen putkiin, jotka sisältävät yhden solun keskeytettiin 6 ui DNaST hajotuspuskuria [26] jäädytettiin välittömästi kuivajäässä ja niitä säilytettiin sitten -80 ° C: ssa, kunnes qPCR-analyysillä. Jokainen qPCR ajettiin kokonaistilavuudessa 10 ui, joka sisälsi 2 ui lysaatti DNaST liuosta templaattina. määrittämiseksi mtDNA kopioiden määrä, qPCR tuotteet irtotavarana näytteitä puhdistettiin, määrällisesti ja sarjalaimennetun (kopiomäärä 10

6, 10

5, 10

4, 10

3, 10

2, 75, 50 , 25, 10, 5, 1, 0) ja sarjan qPCR reaktioita. tuloksia käytettiin piirtämään standardikäyrä jokaista geeniä. Ct-arvo kunkin yksittäisen solun siirrettiin sitten absoluuttiseen mtdna kopioluvun käyttäen standardikäyriä saatu.

Mitokondrioiden kalvojännite

mitokondrio kalvon potentiaali (MMP) kvantifioitiin konfokaalimikroskopialla analyysi käyttämällä potentiometristä väriainetta JC-1 (100 ng /ml) kuin fluorofori- ja julkaistu värjäys protokollat ​​[40 ], [41] (Methods S1).

Yhden solun Gene Expression Analysis

Yhden solun RT-qPCR suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [31], [42].

Data Analysis

Tilastolliset analyysit, kuten merkitsevyystestit, suoritettiin käyttäen OriginPro ohjelmistopaketti (v. 8, OriginLab, Northampton, MA). Tilastollinen merkitys tasot laskettiin käyttäen kaksisuuntainen epäparametrinen Mann-Whitneyn-Wilcoxonin testi.

Tulokset

qPCR-pohjainen menetelmä mtDNA Kopioi numero Adetermination Single Solut

useita mitokondriaalisen DNA alueilla, kuten HVI, on käytetty kohteina PCR-pohjainen mtDNA kopioluvun analyysi irtotavarana näytteitä, ennen kuin [43]. Yksi alukeparia alhaisimman Ct-arvo, erillinen negatiivinen kontrolli, terävä ja selvä huiput monistetun tuotteen sulamiskäyriä, ja oikean monistumisen tuote varmistettiin sekvensoimalla valittiin kunkin alueen edelleen yksisoluiset analyysi (Fig. S1

HV1

). Sarjalaimennoksia PCR-monistetun mtDNA fragmentti, joka sisälsi HVI alueella käytettiin tekemään qPCR Standardikäyrien mtDNA kopioluvun. Kun valittua alukeparia, HVI alue oli osoitettu olevan paras suorituskyky, jossa

R

2 = 0,9925, DNA kopiomäärä vaihtelee 10

2 ja 10

6 ( kuva S2).

RT-qPCR Gene Expression Analysis yhden Solut

Äskettäin raportoimme uusi tekniikka, jonka avulla eristämis-, puhdistus-, ja käänteistranskriptio kokonais-RNA yhdestä nisäkässolu, jonka jälkeen RT-qPCR analyysi ekspressiotasot ydin–koodattujen geenien [31]. Seuraamalla samaa menetelmää, päätimme yksittäisissä soluissa ekspressiotasot useiden valittujen geenien hypoksiavaste, mukaan lukien mitochondrially-koodattu

COXI

,

COXIII

, ja

CYTBI

[43] – [45], ja

VEGF

,

MT3

,

ANGPTL4

ja

PTGES

geenien koodaama tuman DNA, jossa 16S rRNA ja 28S rRNA käytettiin sisäisen valvonnan [31], [38], [46] – [48].

yksisoluiset mtDNA Copy Number Analysis in CP-A ja CP-C Cell Lines

Aikaisemmat tutkimukset perustuvat bulk-solun analyysi osoitti, että keskimääräinen mitokondrioiden massa ei merkittävästi eroa CP-A ja CP-C-solujen [2]. Tässä tutkimuksessa, alkuperäistä bulk-solujen analyysin tulokset osoittivat myös hieman korkeampi, mutta tilastollisesti merkitsevä keskimääräinen mitokondrion kopioluvun CP-C-soluja (~1,530 solua kohti) verrattuna CP-A (~1,392 solua kohti) (kuvio. S3). Yhden solun analyysin, joka perustuu 99 yhdessä soluista kustakin solulinjasta paljasti tilastollisesti merkitseviä eroja (p 0,002) in mtDNA kopioluvun välillä CP-A: n ja CP-C-solut (Fig. 1A, B). 92 ulos 99 (92%) CP-A-solut osoittivat mtDNA kopioida numeroita vaihtelee 106-1,900 solua kohti vain 8 (8%) soluista, jotka sisältävät yli 2000 kopiota solua kohti, kun taas 92 ulos 99 CP-C-solujen mtDNA kopioluvut vaihteli 171-2,952 solua kohti, jossa 8-soluista, joissa on enemmän kuin 3000 kopiota solua kohden (Fig. 1A). Keskimäärin, CP-C-solujen oli noin 43% enemmän mtDNA kuin CP-A-soluja (1363 (CP-C) vs. 951 (CP-A); Fig. 1B, taulukko 1). Tarkempi parametrit mtDNA väestöstä histogrammeja, kuten vinous (mitta symmetria), huipukkuus (mitta peakedness) ja Fano kerroin (hajonnan) laskettiin. Sekä vinous ja huipukkuus arvot olivat tilastollisesti merkitsevästi vähemmän CP-C-solujen verrattuna CP-A-solut, kun taas Fano tekijä ei ollut merkitsevästi erilainen (taulukko 1).

A) Single solujen mtDNA kopioiden määrä jakaumat metaplastiset (CP-A) ja dysplasia (CP-C) solut, B) kohtaan kaavioita kahden jakaumien esitetty paneelissa A. jälkeen arvot on kuvattu: avoin neliö – keskimääräinen; Yhtenäinen viiva – mediaani; ylemmän ja alemman laatikon linjat – 75

th ja 25

th persentiilit, vastaavasti; ylempi ja alempi viikset – 95

th ja 5

th persentiilit, vastaavasti; x – minimaalinen ja maksimaalinen jakauman arvot. P-arvo 0,002 laskettiin käyttäen kaksisuuntaisia ​​ei-parametrinen Mann-Whitney tilastollisen merkittävyyden testi (n = 99); mtDNA kopioluvut vaihtelevat 150-1,900 C-D) JC-1 fluoresenssin mikroskooppikuvia hypoksinen CP-A (C) ja hypoksinen CP-C (D) solujen kanssa; yhden solun jakaumat suhteellisen mitokondrion kalvon potentiaalia CP-A (E) ja CP-C (F-solut). JC-1 signaaleja noin 100 solua solulinjaa ja kunto analysoitiin; G) tilastollinen edustus MMP jakelun molemmissa solutyypeissä /olosuhteet.

Differential Vastaukset Hypoksia välillä CP-A ja CP-C solut yksisoluiset Level

mitokondrioiden kalvon potentiaali eroaa huomattavasti CP-A ja CP-C-soluja.

mitokondrioiden kalvon potentiaali (MMP) tuottama mitokondrioiden elektroninsiirtoketju heijastaa toiminnallisen tilan mitokondrioita. Se on yhdistetty fysiologinen vaste ja tuotanto ROS [49]. JC-1 on laajalti käytetty apoptoosin, joissa seurataan mitokondrioiden terveyden ja toimintahäiriöitä yhteydessä syövän ja neurodegeneratiivisten sairauksien [40], [41].

Fluoresenssi kuvantaminen käyttäen JC-1-värjäys paljasti suuria eroja välillä CP -A ja CP-C-soluja (100 solua kunkin) mukaisesti sekä ohjaus- ja hypoksisissa olosuhteissa (Fig. 1 C, D). Under normoxic kasvuolosuhteet (21% O

2), CP-A-solut osoittivat suhteellisen pieni punainen (590 nm) ja vihreän (529 nm) fluoresenssin intensiteetin suhdetta keskimäärin 2, kun taas CP-C-solujen osoitti keskimääräinen suhde 3,8 (Fig. 1 E-G). Altistumisen jälkeen hypoksia 30 minuutin ajan (katso menetelmät), soluja molempia oli vähentynyt punainen /vihreä fluoresenssin voimakkuuden suhde, keskimäärin 0,6 ja 1,5 CP-A ja CP-C-soluissa, vastaavasti (kuvio. 1G). Kuvailevia tilastoja tiedoista esitetään yhteenveto taulukossa 2.

Mitokondrioiden heterogeenisyys sisällä ja eri solutyyppien raportoitiin aikaisemmin, paljastaen suuret vaihtelut MMP solujen kesken samantyyppinen yhden ainoan viljelyastia [23] . Tutkimuksessamme analyysi yksisoluiset MMP paljastivat tilastollisesti merkitsevästi suurempi huipukkuus arvoja normoxic CP-C-solujen verrattuna normoxic CP-A-solut, kun taas vinous oli vertailukelpoinen. Hypoksisissa olosuhteissa havaitsimme päinvastainen suuntaus, jossa CP-A-solut osoittavat merkittävästi suurempi arvot huipukkuus kuin CP-C-solut, kun taas vinous arvot eivät olleet merkittävästi erilaiset. Nämä tiedot osoittavat erilaisia ​​vasteita hypoksia kahden solulinjojen ja merkitsee sitä, että näiden kahden solun reagoida hypoksia eri tavalla, ei ainoastaan ​​keskimääräisen MMP, mutta myös suhteessa sen jakautumisen yksittäisiä soluja. MMP jakelu huipukkuus arvot viittaavat korkeampia MMP heterogeenisuus mitokondrioiden dysplastisia (CP-C) kuin metaplastiset (CP-A) BE soluja.

Analyysi mitokondrioiden geeniekspression yksittäisissä soluissa.

Three mitochondrially koodattu geenit,

COXI

,

COXIII

ja

CYTBI

, valittiin ilmentymisanalyysiä johtuen niiden merkitys mitokondrioiden toimintaa ja osallistumista hypoksiavaste [44], [45]. Ensimmäinen, vertasimme suhteellisten ekspressiotasojen näiden geenien välillä normoxic ja hypoksisissa olosuhteissa irtotavarana solujen näytteitä mitokondrioiden 16S rRNA sisäisenä viitteenä. Kaikki kolme mitokondrioiden geenit osoittivat hyvin samankaltainen hypoksiavaste kuvio: missä oli kasvua 1,5-2,6 kertaiseksi korkea vaihtelu havaittiin sekä CP-A ja CP-C-solut (Fig. S4A, B).

geeni ilmentymisanalyysit klo yksisoluiset tason, yhteensä 24 soluja kunkin solun tyyppi ja kunto (normoksia ja hypoksiaa) olivat eristyksissä. Tulokset osoittivat suurta solusta-soluun vaihtelua ekspressiotasot kaikki neljä mitokondrioiden geenien soluissa molempia (Fig. 2-4). Esimerkiksi Ct-arvot 16s rRNA CP-A solut vaihtelivat 20 ja 26 (jopa 30 yhdessä tapauksessa), ja vaihteluväli CP-C-soluissa oli 20 ja 25 Ct-arvot

COXI

COXIII

ja

CYTBI

molemmissa solulinjoissa oli välillä 20 ja 35, joiden keskimääräinen Ct arvojen 22.4~27.9, 26.8~28.2, ja 28.3~30.2, vastaavasti (kuvio. 2, 3 ). Merkittävä väheneminen Ct arvon 16s rRNA (

p

0,05, n = 24) havaittiin hypoksinen CP-Yksittäinen soluissa, kun taas vain vähän, mutta tilastollisesti merkittäviä muutoksia havaittiin hypoksinen CP- C-solut (

p

0,05, n = 24) (Fig. 3,

16s rRNA

). Vastaavasti merkittävä lasku Ct-arvo

COXI

(

p

0,001, n = 24) havaittiin CP-A, mutta ei CP-C-solut hypoksisissa olosuhteissa verrattuna normoksia (Fig. 2, 3,

COXI

). Koska alempi Ct-arvoja tarkoittaa korkeampia mRNA kopioida numeroita, 16s rRNA ja

COXI

mRNA tasot CP-A solut olivat merkittävästi ajan säännelty hypoksia, mikä osoittaa, että molemmat geenit CP-A solut reagoivat hypoksia. Mielenkiintoista, jolloin keskimääräinen Ct

COXI

arvot normalisoitiin vastaan ​​ilmentymistason 16s rRNA Ct

16S

, vakio vaihe laskemiseksi suhteellisen mRNA irtotavarana solunäytteiden vähentäminen

COXI

Ct-arvoja vasteena hypoksialle ei ollut merkittävä, mikä on sopusoinnussa bulk geeni-ilmentymisen analyysi tämän tutkimuksen tulokset (Fig. S4). Sitä vastoin merkittävä Ct-arvo kasvoi havaittiin

CYTBI

(

p

= 0,03, n = 24) CP-C-soluja, mutta ei CP-A-soluja (

p

= 0,43, n = 24) (Fig. 2, 3,

CYTB1

), joka ehdotti säätö alas hypoksia tämän mitochondrially koodatun geenin CP-C-soluja. On mielenkiintoista huomata, että ekspressiotasot 16S rRNA in normoxic CP-C solut ovat korkeammat kuin normoxic CP-A-soluja (C

t (CPC) = 22,73 vs. C

t (CPA) = 23,66 , p 0,006) ja lähestyy tasot hypoksinen CP-A-soluja (C

t (CPA) = 22.09). Kuitenkin meidän tutkimus on myös osoittanut, että keskimääräinen mtDNA kopioiden määrä solua kohden ovat korkeammat CP-C-solut (Fig. 1 B, taulukko 1). Siksi tehdä suoraa vertailua kahden solulinjoista mahdollista, laskimme suhteelliset erot geeniekspressiotasot ja normalisoitu niitä keskimääräiset mtDNA kopioida numeroita käyttäen seuraavaa yhtälöä: missä mtDNA on keskimääräinen mitokondrio-DNA kopioluku solua kohti. Laskemalla r

norm voimme määrittää suhteelliset erot geeni-ilmentymisen tasojen kahden solutyypin per mtdna molekyyliä. Tämä parametri voidaan tulkita myös mittana ”mtdna toimintaa”, koska se edustaa suhde suhteellisen geeni-ilmentymisen tasoja ja mtdna kopioluku. Hyödyntämällä tätä ilmaisua havaitsemme, että alle happiolosuhteissa 16S rRNA ilmaistaan ​​33% korkeampi kohti mtDNA molekyyliä CP-C soluissa kuin CP-A soluissa. Samanlainen tulos on voimassa

COXI

(28% suurempi CP-C kuin CP-A) ja

COXIII

(32%), kun taas

CYTBI

näyttelyitä 2.45- kertaa pienempi ilmaisu kohti mtDNA molekyyliä CP-C verrattuna CP-A soluissa. Lisäksi havaitsemme selkeitä eroja geeniekspression jakaumaparametrit-vinous ja huipukkuus-välillä hypoksia vasteet CP-A ja CP-C-solut (Fig. 4). Vaikka selvää suuntausta jakelu vinous tai huipukkuus on ilmeinen vastaus hypoksia CP-A-solut (Fig. 4A, C, E, G), CP-C-soluilla selkeä ja tilastollisesti merkittävä kasvu sekä vinouden ja huipukkuus että jakamiin

COXI

,

COXIII

ja

CYTBI

geenin ilmentymistä (Fig. 4F, H). Toisaalta, lukuun ottamatta

PTGES

, tutkittujen ydin- geenit eivät osoittaneet merkittäviä eroja jakaumaparametrit CP-C-solut (Fig. 4B, D). On tärkeää huomata, että keskiarvot

COXI

ja

COXIII

ekspressiotasot normoxic ja hypoksinen CP-C-solut eivät olleet merkittävästi erilainen bulk tasolla (Kuva. S4). Tämä havainto osoittaa jälleen hyödyllisyyttä yksisoluiset analyysit päästä tiedon käytettävissä toisin.

histogrammit geenien ilmentymisen tasot ohjaus (

tyhjä baareissa

) ja hypoksia-käsitelty (30 minuuttia

kiinteät pylväät

) CP-A ja CP-C-soluja. Jakauma histogrammit luotiin käyttäen samaa bin kokoa.

Rasiakuvaajat of yksisoluiset geeni-ilmentymisen tasoja ja

p

-arvot liittyvät erot normoxic ja hypoksinen olosuhteet kahdessa solulinjassa. Laatikko kaaviossa esitetään seuraavat tilastolliset arvot: Avoin neliö – keskiarvo, yhtenäinen viiva – mediaani, ylempi ja alempi laatikko linjat – 75. ja 25. prosenttipisteet vastaavasti ylempi ja alempi viikset – 95. ja 5th prosenttipisteet vastaavasti x – maksimaalinen ja minimaalinen arvot.

vertailu jakelun vinous (A, B, E, F) ja huipukkuus (C, D, G, H) arvot yksisoluiset geenin transkription tason jakaumia välillä normoxic ja hypoksinen olosuhteet . Selkeä suuntaus kasvoi sekä vinous ja huipukkuus of mitochondrially-koodatun geenin ilmentymisen jakaumia voidaan nähdä CP-C-solujen vastauksena hypoksia, mutta puuttuu CP-A soluissa. Niistä tutkittiin ydinvoiman geenit vain PTGES geenin havaittiin huomattavia muutoksia vinous ja huipukkuus parametrit CP-C-soluja.

Differential ilmaus ydin- hypoksiavaste geenejä.

Olemme osoittaneet, että geeniekspressiotasot määritetään yksisoluiset analyysi ei aina yhdenmukaisia ​​saatu bulk-kennon analyysi. Differential ilmaus kaksi ydinvoimalaa geenien vastauksena hypoksia ei havaittu bulk CP-A ja CP-C näytteitä. Toisin kuin CP-A soluihin, jossa

MT3

oli säädelty -7-kertaiseksi ja

VEGF

osoittanut mitään muutosta, CP-C-solujen osoitti -5 kertainen lisäys

VEGF

ilme taas

MT3

ei ollut merkittävää muutosta (kuvio. S4A, B). Tällä yksisoluiset tason huomasimme, että jopa

28s

rRNA, jota yleisesti käytetään sisäisenä viitteenä irtotavarana solututkimuksia, osoittivat merkittäviä up-sääntelyn CP-A (

p

0,05, n = 36), mutta ei CP-C (

p

= 0,05, n = 36), soluja hypoksian (Fig. 5,

28s

). Koska eritasoisia ilmaisun

28s

rRNA, raaka Ct-arvot hypoksiavaste geenien sijasta perinteisen delta Ct (normalisoitu vasten taloudenhoito geeni) käytettiin lisäanalyysiä.

histogrammit geeniekspressiotasot hallinnassa (

tyhjä baareissa

) ja hypoksia-käsitelty (30 minuuttia,

kiinteät pylväät

) soluja. Jakelu histogrammit luotiin käyttäen samaa bin kokoa.

Vaikka

28s

rRNA ekspressiota havaittiin kaikissa yhden solujen tutkimuksessa, transkriptit kolme muuta ydin- koodatut geenit eivät olleet aina havaittu CP-A solut molemmista ohjaus ja hypoksinen ryhmiä, todennäköisesti johtuu niiden vähäistä. Esimerkiksi pois 36 yksittäisiä soluja,

MT3

transkriptit havaittiin 33 ohjaus ja 34 hypoksisia yksittäisiä soluja,

PTGES

29 ja 36, ​​ja

VEGF

16 ja 24. CP-C yksittäisiä soluja, kuitenkin lukuun ottamatta

VEGF

(33 ulos 36), selostukset kaikkien geenien havaittiin kaikki 36 yksittäiset solut. Perustuen raaka Ct-arvoja, kaksi hypoksiavaste geenejä

MT3

(

p

0,001, n = 33, 35 ohjaus ja hypoksinen ryhmässä) ja

PTGES

(

p

10

-4, n = 27, 36) oli merkittävästi lisääntynyt ekspressiotasot CP-A-solut (Fig. 5, 6). Mielenkiintoista on, että hypoksinen CP-C-solut vain

PTGES

osoitti merkittävää ylössäätöä (

p

0,001, n = 36, 36) kun taas kaksi muuta,

VEGF

ja

MT3

, ei (Fig. 5, 6). Differential

VEGF

geeniekspressiota hypoksiaolosuhteissa ei havaittu kummassakaan CP-A tai CP-C yksisoluisia tasolle. Toisin kuin tutkittu mitokondrioiden geenit, emme noudata niin monta tilastollisesti merkitseviä eroja vinouden ja kurtosis parametrit yhden solun geenien ilmentymistä jakaumat (Fig. 4A-D) välillä normoxic ja hypoksisten solujen molempia. Jakauma

PTGES

geeni esiintyi tilastollisesti merkitsevä sekä vinous ja huipukkuus arvot hypoksinen vs. normoxic CP-C-soluja. Jakelu muodot kolmen muun geenien ilmentymisen tasoja ei havaittu tilastollisesti merkittäviä muutoksia vasteena hypoksialle. CP-A soluissa vain

MT3

geeni osoitti selvästi lisääntynyt huipukkuus vastauksena hypoksia. Kaikki muut geenit eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia yksisoluiset ilme jakaumaparametrit.

laatikko kaaviossa esitetään seuraavat tilastolliset arvot: Avoin neliö – keskiarvo, yhtenäinen viiva – mediaani, ylempi ja alempi laatikko linjat – 75. ja 25. prosenttipisteet vastaavasti ylempi ja alempi viikset – 95. ja 5th prosenttipisteet vastaavasti x – minimi- ja maksimiarvot.

keskustelu

toteaminen merkittävästi kohonneet mtDNA CP -C verrattuna CP-A-solut (Fig. 1, taulukko 1) on tärkeä, koska se kantaa mahdollisia toiminnallisia merkitystä. Mielenkiintoista on, että sekä lisätä ja vähentää määriä mtdna on raportoitu erilaisia ​​ihmisen kiinteän kasvaimen soluihin. Esimerkiksi vähentää mtdna tasoja on havaittu eturauhasen syöpä solut ja niihin liittyvä invasiivisen fenotyypin [50], downregulation mitokondrioiden biogeneesin korreloi invasiivisen rintasyövän [51] ja munasarjasyövän etenemistä [52]. Päinvastoin, kohonneita määriä mtDNA on raportoitu eturauhasen [53], haiman [54], pään ja kaulan alueen syöpä, gliooma [55], ja sen todettiin positiivisesti korreloi kliinis vaiheessa kolorektaalisyövässä [56], Shapovalov et ai . ovat osoittaneet kasvanut mtDNA tasot ja laski soluhengitysnopeuden aggressiivisissa luusarkoomasoluissa verrattuna osteoblastien tai hyvänlaatuinen luusarkoomasoluissa [57]. Lisäksi lisääntynyt mtDNA tasot on liitetty riski sairastua rintasyöpään [58], kun taas nousu mtDNA kopioida numeroita on raportoitu etenemistä normaalista pre-pahanlaatuinen ja pahanlaatuinen etenemistä endometrium [59], karsinogeneesi pään ja kaulan syöpien [60] ja etenemisen ruokatorven okasolusyöpä [61]. Vaikka toiminnallista roolia kasvoi mtDNA tasojen premaligneja pahanlaatuiseen eteneminen on vielä selvittämättä, säätelyä mitokondriaalisen biogeneesin ehdotettiin palvelemaan korvaavia mekanismi heikentynyt mitokondrioiden toimintaan vuoksi mtDNA vahinkoja premaligneja vaurioita [60], [61]. On siis mahdollista, että dysplastic ruokatorven epiteelisolujen upregulate mitokondrioiden biogeneesin lisätä yleistä saatavuutta mallin transkription, mikä puolestaan ​​pitäisi lisätä nettomääräisesti mitokondrioiden mRNA ja vastaavan proteiinin tasot säilyttää mitokondrioiden toimintaan. Toteamme, että vain yksisoluiset tason analyysi paljasti, että mtDNA tasojen CP-A ja CP-C-solut ovat merkittävästi erilaiset, kun taas bulk-tason analyysi osoitti merkitsevää eroa (Kuva. S3). Havaittu korkeampi epäsymmetrisyys ja peakedness arvot mtDNA sisällön jakelun CP-A solut ovat osoitus korkeamman poikkeama normaalijakaumasta CP-A verrattuna CP-C-soluja. Vaikka toiminnallinen Tämän löydöksen vielä selvittämättä, tulos itsessään on mielenkiintoinen, koska se osoittaa väestötason erot kaksi vaihetta esipahanlaatuisessa BE. On mahdollista, että johtuen selektiivisen paineen myönnetty sapen ja happo refluksi ruokatorveen, yhden tai useamman subklooneja on enemmän heterogeeninen populaatio metaplastiset (CP-A) solut valitaan johtaa vähemmän heterogeeninen, lähempänä normaalijakaumaa profiilin mtDNA sisällön kehittyneempiä, dysplastisia vaiheessa (CP-C-solut) BE. Tutkimukset keskittyvät heteroplasmy mitokondrio-DNA: klo yksisoluiset tason olisi tehtävä antaa yksityiskohtaisempia käsityksen tätä päätelmää. Kuitenkin havainto kohonneen mtDNA tasojen dysplastic BE soluissa osoittaa, että premaligneja BE eteneminen on samanlainen kuin muut tyyppisiä etenemisen (ESCC ja pään ja kaulan alueen syöpä) ja että sitä voidaan käyttää biomarkkerina varhaista havaitsemista dysplasia eri kudostyyppejä.

mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) mittaukset paljastivat selvästi suurempi suhteellinen arvoja normoxic CP-C (1,86 ± 0,41) verrattuna CP-A (0,80 ± 0,17) soluja (Kuva. 1, taulukko 2 ). Kun normalisoitu vastaan ​​mtDNA kopioiden määrä, keskimääräinen suhteellinen MMP-arvot ovat noin 37% suuremmat CP-C kuin CP-A soluissa. Tämä tulos osoittaa, että keskimäärin mtDNA molekyyliin, dysplastic solut säilyttää korkeammat MMP arvoja kuin metaplastiset soluja.