Krooninen sairaus

tiivistelmä

mikrokystiinejä ovat voimakkaita fosfataasiestäjät ja solujen myrkkyjä. Ne edellyttävät aktiivista kuljetusta OATP1B1 ja OATP1B3 kuljettajat sisäänoton ihmisen soluja, ja korkea ilmentyminen näiden kuljettajat maksassa osuus valikoivan maksatoksisuus. Useat ihmisen kasvaimia, on osoitettu olevan korkea ilmentymisen OATP1B3 mutta ei OATP1B1, pääasiallinen kuljettaja maksasoluissa. Oletimme, että mikrokystiinin variantteja voitaisiin eristää, joita kuljetetaan ensisijaisesti by OATP1B3 suhteessa OATP1B1 edetä syövän vastaisina aineina, joilla on kliinisesti siedettävä maksatoksisuus. -mikrokystiini Variantteja on eristetty ja testattu sytotoksisuuden syöpäsolujen stabiilisti transfektoitu OATP1B1 ja OATP1B3 kuljettajat. Mikrokystiini variantteja sytotoksisen OATP1B1 /OATP1B3 IC

50 suhdeluvut vaihtelivat 0,2 ja 32 havaittiin, eli 150-kertaiseksi valikoima kuljettajan valikoivuus. Kuten mikrokystiinin rakenne on merkittävä vaikutus kuljettaja valikoivuus, on potentiaalisesti mahdollista kehittää analogien vielä selvempi OATP1B3 selektiivisesti ja siten mahdollistaa niiden kehityksen syöpälääkkeiden.

Citation: Niedermeyer THJ, Daily A Swiatecka-Hagenbruch M, Moskova jA (2014) selektiivisyyden ja tehon Mikrokystiini aromiyhdisteet vastaan ​​OATP1B1 ja OATP1B3 ilmaiseminen syöpäsoluja. PLoS ONE 9 (3): e91476. doi: 10,1371 /journal.pone.0091476

Editor: Matias A. Avila, Navarran yliopisto School of Medicine ja Center for Applied Medical Research (CIMA), Espanja

vastaanotettu: 19. joulukuuta 2013; Hyväksytty: 13 helmikuu 2014; Julkaistu: 10 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Niedermeyer et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain DanceBlue, opiskelija-run työtä, joka tukee kliinistä hoitoa ja tutkimusta lapsipotilaiden onkologian yliopistossa Kentucy, ja osittain Saksan liittovaltion talous- ja teknologia (KF2766301SB0). Open Access julkaiseminen tukee Deutsche Forschungsgemeinschaft ja Open Access Publishing Fund Tübingenin yliopistosta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Timo Niedermeyer ja Monika Swiatecka-Hagenbruch ovat työntekijät syaani Biotech GmbH. Ei ole kaupan tuotteita julistaa. Syaani Biotech GmbH on antanut luvan julkaista käsikirjoituksen. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

mikrokystiinejä (MC) ovat syklisiä heptapeptidien tuottavat useat syanobakteerien suvut kuten

Microcystis

,

Oscillatoria

,

Planktothrix

,

Nostoc

, ja

Anabaena

. Niiden voidaan katsoa olevan yksi parhaiten tutkittu syanobakteerien sekundäärimetaboliitteja [1] – [4]. Yhteinen rakenteellinen piirre mikrokystiinejä on polyketidisyntaasia johdettu aminohappo lyhenne ”Adda”, (2S, 3S, 8S, 9S) -3-amino-9-metoksi-2,6,8-trimetyyli-10-phenyldeca- 4,6-dieenihappo, joka on myös yksi kaksi pakollista alarakenteisiin voimakas proteiinin seriini /treoniini-fosfataasi (PP) 1 ja PP2A inhibitio havaittiin mikrokystiinejä [5] – [9]. Paitsi että näiden yhdisteiden biosynteesin polyketidisyntaasien ja ei-ribosomaalista peptidisyntetaasit erittäin hyvin ymmärretty [10] – [12], mutta myös enemmän kuin 90 yksittäistä jäsentä tämän kemiallisesti hyvin erilaisia ​​yhdisteen perhe on kuvattu tieteellisessä kirjallisuudessa päivämäärä (Fig. 1) [13] – [56]. Erityisen alttiita vaihtelua ovat L-aminohappoja sijaitsevat asemissa 2 ja 4 MC selkäranka. Liittyvät yhdisteet ovat nodulariini, löytyy

Nodularia

sp., Jotka sisältävät myös Adda mutta ovat syklisiä pentapeptidinä sijasta heptapeptidien (Fig. 1) [57] – [60].

yleisyys jäämiä tavataan mikrokystiinejä (vasemmalla) ja nodulariini (oikealla) on verrannollinen fonttikokoa kunkin jäännöksen. Data käyttää tuottamaan tämä luku talletetaan https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.880756.

Koska voimakas proteiini seriini /fosfataasiestäjät, mikrokystiinejä ja nodulariini on merkittävä vaikutus solun signaloinnin ja solun tukirangan huoltoa, joka johtaa kuolemaan vaikuttaa soluihin [61], [62]. Kuitenkin suhteellisen suuri ja amfifiilisen MC eivät pysty läpäisemään solukalvoja passiivisella diffuusiolla. Sen sijaan he luottavat aktiivista ottoa soluihin. Kolme jäsentä orgaanisen anionin kuljettamiseen polypeptidejä (OATP) perhe ovat välittäjinä tätä ottoa MC eli OATP1B1, 1B3 ja 1A2 [63], [64]. OATP1B1 ja OATP1B3 ovat tehokkain mikrokystiinin kuljettajat, ja kuten terveillä ihmisillä molemmat kuljettajat ovat yksinomaan todettu ilmentyvän maksassa kudoksessa [64], [65], mikrokystiinejä ja nodulariini tiedetään aiheuttavan laajoja maksavaurioita [66] – [68 ]. Näin mikrokystiinejä tuli surullisen kuin maksatoksiineita aiheuttaa haittaa ihmisten ja karjan kun näitä yhdisteitä kertynyt juomavesilähteiden aikana levien vesi kukinta kertaa [69], [70]. Estäjät näistä OATP kuljettajat parantaa maksatoksisuuden mikrokystiinejä ja nodulariini [68], [71], [72]. Toisin kuin OATP1B1, joka on ilmaistu hepatosyyteissä koko maksalohko, OATP1B3 lokalisointi on rajoitettu keskiakselin ympärillä suoneen [64].

OATPs ovat tällä hetkellä keskustellaan kohteina syövän hoidossa [73] – [76] . Mitä mielenkiintoisinta on, OATP1B3, mutta ei OATP1B1, on havaittu ilmentää toiminnallisesti useita syövän kudoksissa, erityisesti paksusuolen kasvaimet, mutta myös rinta- kasvaimia, keuhko- kasvainten, haiman ja maksan kasvainten [75], [77] – [79] . Koska ero myrkyllisyys luonnon mikrokystiiniä muunnoksia, jotka ilmentävät joko OATP1B1 tai OATP1B3 on havaittu [78], [80], nämä havainnot esiin kysymyksen siitä mikrokystiinejä voisi olla sopiva johtaa lääkeaineille näitä syöpätyyppejä, ja jos on mikrokystiinejä joukossa yli 90 tunnettuja muunnelmia, jotka ovat selektiivisesti kuljetetaan OATP1B3 suhteessa OATP1B1. Selektiivisyys, joka suosii OATP1B3 yli OATP1B1 pitäisi johtaa pienentynyt maksapuhdistuman ja suosia MC in OATP1B3-ilmentäviä kasvaimia, luoden terapeuttinen ikkuna vastaavien yhdisteen pienentämällä maksapuhdistuman korko ja myrkyllisyyttä. MC ovat mielenkiintoisia uusina lyijy rakenteissa, koska ne ovat toimintatapa ei vielä käytetty, mutta tällä hetkellä keskustellaan syöpähoitoa (fosfataasi esto) [81] – [83], ja toisin kuin useimmissa nykyisin käytettävissä syöpälääkkeitä, he tarvitsevat aktiivinen kuljetus soluihin ja siten säästää kaikki kudokset eivät ilmennä mainittuja OATPs.

Olemme eristetty erilaisia ​​mikrokystiinin kongeneerien peräisin syanobakteerien suvuista

Microcystis

,

Planktothrix

, ja

Nodularia

testata hypoteesia, onko eri kuljettaja selektiivisyys voi olla saavutettavissa. Välineinä valikoivuuden testaus, kohdunkaulan syöpä HeLa-solut ja paksusuolen syövän RKO pysyvästi transfektoitujen solujen ekspressiovektoreihin OATP1B1 ja 1B3 on käytetty. Esillä olevassa käsikirjoituksen, tulokset testauksen eristetty MC näitä solulinjoja on kuvattu. Määritetty IC

50 arvot sekä havaitut selektiivisyys erot osoittavat selvästi, että pienet rakenteelliset erot testattujen MC todellakin olla merkittävä vaikutus kuljettaja selektiivisyyden ja sytotoksinen potenssi.

Tulokset ja keskustelu

aminohappoa (AA) koostumukset testattiin MC on esitetty yhteenvetona taulukossa 1

rakenteet mikrokystiini yhdisteiden on määritetty perustuen tandem HRMS [51], [52], [84 ] tukemana

1 H- ja COSY-NMR-spektroskopialla. Kaikki MC sisältävät tunnusomaisen Adda ryhmä asemassa 5 ja d-Ala asemassa 1 molekyylin. Vain yksi yksittäinen yhdisteiden ominaisuuksia

O

metyloitu d-iso-Glu asemesta d-iso-Glu asemassa 6 (22). d-iso-β-MeAsp ja d-iso-Asp 3-asemassa ovat lähes tasan jakautunut, koska ovat Mdha ja Dhb asennossa 7. l aminohapot asemassa 2 käsittävät Leu, Tyr, Arg, HTY, Hil (laskevassa järjestyksessä of count), asemassa 4 Arg, Tyr, Trp, Phe, HTY ja Har löytyy. Lisäksi 22 MC variantteja, nodulariini (23), kuten syklinen Addan sisältävät pentapeptidi sekä okadahapon (24), kuten rakenteellisesti ei MC liittyviä PP-estäjä on testattu.

IC50-arvojen kaikki eristetty MC vastaan ​​OATP1B1- ja OATP1B3 ilmentävien HeLa tai RKO solulinjoja on määritetty. Tulokset on esitetty taulukossa 2.

Mielenkiintoista, selviä eroja sekä tehokkuus ja selektiivisyys yksittäisten MC-yhdisteiden voitiin havaita.

valikoivuus

Vaikka korvaaminen d-iso-β-MeAsp

3 d-iso-Asp

3 (esim yhdisteet 1/2 ja 13/14) ei näytä olevan merkittävää vaikutusta ei tehosta eikä valikoivuus, vaikutuksen läsnäolo joko Mdha

7 tai (

E

) -Dhb

7 (esim 3/4, 5/6, 8/9, ja 14/15) on moniselitteinen: Vaikka kyseessä 3/4 ja 5/6 vaihdosta Mdha

7 (

E

) -Dhb

7 lukemiin syvällinen kasvuun selektiivisyys OATP1B3 yli OATP1B1, tätä vaikutusta ei havaittu 8 /9 ja 14/15. Koska kuusi vähiten OATP1B3 selektiivisiä yhdisteitä (1, 2, 3, 5, 7, 23) kaikki ominaisuus Mdha

7 tai Mdhb

7 while (

E

) -Dhb

7 on löydetty 3 6 eniten OATP1B3 selektiivisiä yhdisteitä (4, 10, 12, 15, 16, 18), on todennäköistä, että (

E

) -Dhb

7 on vaikutusta selektiivisyyden mutta on ei ole ainoa rakenteellinen piirre annetaan selektiivisyys.

Itse asiassa, erityisesti aminohappotähteet asemissa 2 ja 4 MC ytimen rakenne näyttää olevan tärkeää sekä tehokkuus ja selektiivisyys. Kun taas 80% kaikkein OATP1B1 selektiivisiä yhdisteitä on Leu asemassa 2, tämä aminohappo on täysin poissa kaikkein OATP1B3 valikoiva yhdisteitä. Kuitenkin Leu esiintyy myös asemassa 2 Useiden yhdisteiden, jotka ovat heikosti OATP1B3 valikoivia (6, 8, 9), mikä Leu yksin ei tee yhdiste OATP1B1 valikoiva. Arg asemassa 2 näyttää aiheuttavan OATP1B3 valikoivuus, kun taas Arg asemassa 4 ei ole vaikutusta selektiivisyyteen. Tämä on ilmeinen yhdisteiden 13 ja 16, joissa vaihto aminohapot asemissa 2 ja 4 on valtava vaikutus selektiivisyyteen. Arg yhdessä aromaattisten aminohappojen Phe, Tyr, ja HTY ovat näkyvästi monomeerit löytyy OATP1B3 selektiivisiä yhdisteitä. Varsinkin yhdistelmät Arg

2 ja Phe

4 (12) tai Arg

2 ja Tyr

4 (16) näytä antavan OATP1B3 valikoivuus. Mutta jälleen kerran, läsnäolo Arg asemassa 2 ei näytä olevan pakollisia OATP1B3 valikoivuus (4).

Mielenkiintoista, pentapeptidin nodulariini (23) on kaikkein OATP1B1 valikoiva joukossa Adda sisältävät yhdisteet tutkittiin.

Potency

tehon MC solukuolema testissä käytetty tämän tutkimuksen on kaksi puolta. Toisaalta, myrkyllisyys MC yhdisteiden riippuu siitä, miten heidän PP esto [85]. Toisaalta, voimakkuus riippuu kuljettavat kapasiteettia vastaavan OATP. Nämä kaksi vaikutusta ei ole erottaa esillä olevassa tutkimuksessa. Vaikka jotkut aiemmat tutkimukset viittaavat siihen, että

in vitro

ja

in vivo

myrkyllisyys liittyy entsyymin eston sijaan liikenne [78], [85], muut raportit osoittavat vastaavia PP esto eri mikrokystiini- kongeneerien , mikä tarkoittaa, että erot liikenteen kehittyminen

in vivo

myrkyllisyys [80], [86].

Ei ole yllättävää, 22, jossa

O

metyloitu d-iso- Glu

6, on yksi vähiten tehokkaita yhdisteitä. Muutokset vapaan karboksyylihapon Glu todennäköisesti johtaa tehokkuuden vähenemiseen menettämisen vuoksi vuorovaikutusta positiivisesti varautunut arginiini aktiivisessa keskustassa proteiinin fosfataasien [7], ja Glu (OMe), joka sisältää yhdisteiden on todettu estävät PP1 paljon vähäisemmässä määrin kuin analogisella Glu sisältävä MC [87] ja pienemmät

in vivo

myrkyllisyys [26]. Kiinnostavaa kyllä, myös 10, 11 ja 21 näytetään heikompi myrkyllisyys kuin useimmat muista yhdisteistä. Vaikka 10 estää PP2A noin kaksikymmentä kertaa heikompi verrattuna 1 [78], [80], [85], [86], sen myrkyllisyydestä olevassa määrityksessä on noin 500 kertaa pienempi. Tämä osoittaa, että kyseessä on 10 (ja myös sen analoginen 11), on todennäköistä, että toksisuus ei ole kyse vain PP inhibition tehokkuutta, mutta myös OATP kuljettaa valmiudet, kuten MC-RR on kaksikationinen fysiologisissa olosuhteissa, ja täten vähemmän todennäköisesti kuljetetaan solumembraanien läpi, jonka anioni kuljettajat. Yleisesti, sytotoksisuutta määrityksessä, ei korreloi proteiinin fosfataasilla inhibition tehokkuus, kuten kirjallisuudessa on kuvattu yhdisteitä, 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 18, 19, 20, 23 [56], [ ,,,0],78], [80], [85], [86]. Tuloksemme siis viittaavat siihen, että erilaiset liikenteen tehokkuutta on suurempi vaikutus

in vivo

myrkyllisyys kuin erilaiset Proteiinifosfataasiin eston teho.

Mielenkiintoista, tehokkain MC, IC

50-arvot sub-nanomoolialueella (5, 6, 7, 8, 17, 18, 19), kaikki ominaisuus yhdistelmiä joko Leu

2 ja Tyr /Phe /Trp

4 tai Tyr /HTY

2 ja Tyr /HTY

4. Arg puuttuu voimakkain yhdisteistä. Vähiten voimakas yhdisteiden IC

50-arvot 100 nM (10, 11, 21, 22) kaikki on joko Tyr

2 ja Arg /Har

4 tai Arg

2 ja Arg

4. Läsnäolo Arg yleensä alentaa tehoa, mikä tukee hypoteesia, että positiivisesti varautuneet Arg haittaavat kuljetusten tehokkuuden vähentämisen lisäksi PP2A esto, ja siten alempi

in vivo

myrkyllisyys.

Yhteenveto ja johtopäätökset

meidän seulontaa 23 luonnon MC variantteja, olemme löytäneet useita MCS IC

50 alhaisen nanomoolialueella ja kuljettaja selektiivisyys, joka suosii OATP1B3 yli OATP1B1 tekijällä jopa kolmekymmentä. Kun läsnä Arg yleensä alentaa tehoa MC sytotoksisuuden, sen läsnäolo asemassa 2 MC ytimen rakenne näyttää myös olevan tärkeitä OATP1B3 selektiivisyys, mikä tarkoittaa, että tämän kuljettajaproteiinin voisi olla sietävät kationinen luonne Arg fysiologisissa olosuhteissa kuin OATP1B1. Lisäksi läsnäolo hieman hapan aromaattisten aminohappojen Tyr tai HTY 4-asemassa lisäksi Arg asemassa 2 näyttää hyödyllistä OATP1B3 selektiivisyyden.

Lisätutkimuksia tarvitaan erottamaan, onko havaitut erot teho johtuvat erilaisiin PP estoa tai eri kuljetuskyky OATP. Kuitenkin aiemmat havainnot viittaavat siihen, että

in vivo

myrkyllisyys riippuu pääasiassa OATP liikenteen kinetiikkaan kuin eroihin PP esto [80], [86].

Vaikka johdettu rakenneaktiivisuuden ovat epäselviä osissa, rakenteelliset piirteet havaittiin OATP1B3 selektiivisyys voidaan kondensoidaan tällä hetkellä todennäköisin valikoiva yleisrakenne syklo (-d-Ala

1-L-Arg

2-d- (Me) Asp

3-l-aromaattisen aminohapon

4-Addan

5-d-Glu

6 – (

E

) -Dhb

7). Tämä yleinen rakenne voidaan käyttää lähtökohtana tuottaa uusia yhdisteitä esim. esiasteiden ruokintaa tai biocombinatorial strategioita.

haasteena käyttää MC huumeiden johtaa edelleen: Vaikka valikoiva MC variantteja, maksatoksisuus saattaa silti olla merkittävä haaste, minkä vuoksi on tuottaa MC variantteja, jotka voivat olla metabolisesti detoksifioi terveitä maksasoluja ja /tai tehokkaasti effluksoidaan sappeen, ja siten hyödyntää maksan vieroitus ja selvittelyjärjestelmiä, joita ei löydy kasvaimia.

Materiaalit ja menetelmät

Sinilevien Material

Useat

Microcystis aeruginosa

ja

Planktothrix rubescens

kantoja sekä

Nodularia

-kanta on käytetty tuottamaan tutkittu mikrokystiinin yhdisteiden: 2 ja 3,

Microcystis aeruginosa

CBT 265; 4 ja 15,

Planktothrix rubescens

CBT 310; 5, 16, ja 17,

Microcystis aeruginosa

kognitiivinen 850, 6, 9, 18, 19, ja 20,

Planktothrix rubescens

kognitiivinen 862, 11,

Planktothrix rubescens

CBT 329, 12,

Microcystis aeruginosa

CBT 861, 14, 21, ja 22,

Microcystis aeruginosa

CBT 480, 23,

Nodularia

sp. CBT 786. kannat luokiteltiin perusteella PCR-analyysi ja sekvenssointi eri markkerigeeni sekä niiden morfologia, ja on talletettu syaani Biotech (CBT) Culture Collection talletusnumeroilla edellä todettiin (syaani Biotech, Berliini, Saksa). Kannat viljeltiin BG11 väliaineessa [88] 20 ° C: ssa jatkuvassa valossa (60-80 umol m

2s

-1) 20 l: n mittakaavassa valobioreaktorit ja korjattu osittain jatkuvasti ajan useiden viikkoa.

eristäminen mikrokystiinejä

syanobakteerit kantoja seulottiin HPLC-DAD /IT-TOF-MS (Kinetex C

18, 2,6 gm, 100 x 3 mm: n pylväs, Phenomenex, Torrance, USA) käyttäen lineaarista viitegradientissa vesipitoista CH

3CN (5-80% 25 minuutin ajan 0,6 ml /min; 0,025% tilavuus /tilavuus TFA: ta) vahvistaa MC läsnäolo niiden ominaisuus UV-spektri sekä ominainen tandem MS ioniosan osoitteessa

m /z

375 [52], [89]. Valitut positiiviset kantoja on viljelty BG11 väliaineessa [88] 20 ° C: ssa jatkuvassa valossa (60-80 umol m

2s

-1) 20 l: n mittakaavassa valokuvan bioreaktoreissa. Sen jälkeen, kun biomassa sadonkorjuu ja kylmäkuivaus, biomassat resuspendoitiin 50% MeOH (v /v), käsiteltiin ultraäänikäsittelyllä tangon (Bandelin, Berliini, Saksa) ja uutettiin ravistelijassa 30 min. Sentrifugoinnin jälkeen biomassojen jälkeen uutettiin käyttämällä 80% MeOH (v /v). 50% MeOH: ta ja 80% MeOH uutteet vastaavien biomassojen yhdistettiin ja kuivattiin

vakuumissa

. Raaka uutteita fraktioitiin käyttäen vesi-metanolia vaihegradienteilla on C

18 kasetit VersaFlash järjestelmä (Supelco, Bellefonte, USA), ja fraktiot, jotka sisältävät MC (seurattiin HPLC) kuivattiin

tyhjiössä

. Liuottamisen jälkeen nämä fraktiot altistettiin semi-preparatiivisella HPLC: llä. Yksityiskohtainen kuvaus eristysmenettelyin katso File S1. Mikrokystiinejä RR, LW, ja LF ja okadahapon saatiin Axxora, LLC (San Diego, CA), ja mikrokystiinejä LR ja YR saatiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).

rakenne selvittäminen

rakenteet eristetyn MC on määritetty korkean resoluution tandemmassaspektrometrian [51], [52], [84], ja vahvistettiin yksi- ja kaksiulotteisella NMR-spektroskopialla. Näytteet NMR-spektroskopia liuotettiin 600 ul: d

6-DMSO. NMR-spektrit rekisteröitiin 600 MHz (

1H taajuus) Bruker AV-III -spektrometrillä käyttäen cryogenically jäähdytetään 5 mm TCI-triple resonanssi koettimet varustettu yhdellä akselilla itsesuojaavaa kaltevuudet. DQF-COSY-spektri [90] rekisteröitiin käyttäen 2048 × 512 monimutkaisia ​​tietoja pistettä käyttämällä 8 skannaa. Spektrit viitataan välillisesti tetrametyylisilaaniin kautta jäännössignaalit d

6-DMSO: ssa (2,5 ppm

1 H). Tandem MS-tiedot on hankittu käyttämällä HPLC kytketty IT-TOF massaspektrometrillä (Shimadzu Europe GmbH, Duisburg, Saksa), jossa sähkösumutusionisaatioon positiivisessa tilassa ja arvioitiin käyttämällä myyjän ohjelmiston LCMSSolution versio 3.60.361 Formula Predictor versio 1.13. Laskentaa varten summan kaavoissa monoisotooppinen massa keskimäärin vähintään kolme skannausta on käytetty. Yhdisteet erotettiin Kinetex C

18-pylvästä (2,6 um, 100 x 3 mm, Phenomenex, Torrance, USA) käyttäen gradienttia vaihtelee 5-80% CH

3CN vedessä yli 25 minuutin ajan (0,1% muurahaishappoa lisätään muuntoainetta). Edeltäjä ioneja vastaten [M + H]

+ eristettiin ioni ansa, hajanainen törmäysten aiheuttamaa dissosiaatio (CID) käyttäen argon kuin törmäyksen kaasu (törmäyksen energia asetettu 150%, törmäys kaasua 100%, ja q ( Frequency) 45,0 kHz), ja erotettu TOF-analysaattorin. MS /MS skannaa laskettiin keskiarvo ja muutettiin mzXML muotoon myyjän ohjelmiston ja arvioitiin käyttämällä ohjelmistoa mMass (laskettu fragmentti-ionit: M, a, b, c, ja z, muutokset: H

2O, -NH

3, + CO, määritelty, yhdistelmät, vastaavat toleranssilla 0,01 Da) [91]. Selityksin varustettu tandem HRMS ja

1H-NMR-spektrit kaikkien yksittäisiä yhdisteitä löytyy File S2.

Solulinjat ja -sytotoksisuusmäärityksiä

Ensisijainen maksasolujen eivät sovellu opiskeluun mikrokystiinin myrkyllisyyden ja liikenne kuten OATP kuljettajat ovat vaimentua muutamassa tunnissa asetettaessa soluviljelytutkimuksista [92]. Näin HeLa ja RKO solulinjat saatiin ATCC ja transfektoitu ekspressiovektorit OATP1B1 ja OATP1B3. Yksittäisiä klooneja eristettiin rajoittavan laimennuksen, ja eristettiin kloonit osoittavat ilmentymisen korkeita tasoja PCR: llä edelleen tunnettu siitä, kuten aikaisemmin on kuvattu [72], [93]. Yksittäiset HeLa ja RKO kloonit valittiin edelleen tutkittava osoitus suosia [

3H] -BQ123, alustan molemmille kuljettajat. Edelleen OATP1B3 kloonit havaittu olevan ottoa [

3H] -CCK-8, erityinen substraatti OATP1B3 muttei OATP1B1, kun OATP1B1 klooneista ei osoittanut ottoa [

3H] -CCK-8. Lisäksi, RKO ja HeLa-solut on stabiilisti transfektoitu tyhjällä ekspressiovektorilla käytettiin verrokkeina. Sytotoksisuuden määritykset, solut maljattiin kolmena rinnakkaisena 96-kuoppaisilla mikrotiitterilevyillä alustassa, joka sisälsi 5% naudan sikiön seerumia tiheydet 1000 solua /kuoppa. 24 tunnin kuluttua, alustaa, joka sisälsi MC rakenteellisia variantteja lisättiin soluihin. Kun vielä 3 päivää, solujen eloonjääminen määritettiin sulforodamiini perustuva määritys, kuten olemme aiemmin kuvattu [93] – [95]. Koska annos-vaste käyrät apoptoosin aiheuttavat mikrokystiinejä ovat jyrkkiä ja mene alas 0 72 tunnin kuluessa, sulforodamiini määritys osoittaa solukuolemaa [72], [93]. IC

50 laskettiin annos-vaste-käyrä, kun lääkkeen konsentraatio, joka tuotti 50%: n lasku absorbanssien keskiarvo verrattuna käsittelemättömiin kuoppiin ja ilmoitetaan keskimääräisenä vähintään kolme riippumaton määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisena käyttäen Prism-ohjelmiston .

tukeminen Information

Tiedosto S1.

Tarkemmat eristäminen Mikrokystiini aromiyhdisteet.

doi: 10,1371 /journal.pone.0091476.s001

(PDF)

Tiedoston S2.

Annotated tandem HRMS ja

1H-NMR-spektrit kaikkien yksittäisiä yhdisteitä. Raaka NMR ja MS-tiedot näistä yhdisteistä ovat saatavilla maksutta Internetissä osoitteessa https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.880755.

doi:10.1371/journal.pone.0091476.s002

(PDF)

Acknowledgments

TN ja MSH kiitos syaani Biotech GmbH tukea ja lupaa julkaista tämän käsikirjoituksen. Kiitämme R. Lethaus-Weiß hänen apua viljeleminen syanobakteerien kantoja ja talteen biomassasta ja P. Schmieder ja B. Schlegel (FMP Berlin-Buch) tallentamiseksi NMR-spektrit.