Krooninen sairaus

tiivistelmä

Koirien syöpä solulinjoja ovat asteittain kehitetty, mutta ovat edelleen liian vähän resursseja säteilybiologian tutkimukseen. Mittaaminen solujen luontainen radioherkkyyttä on tärkeää, koska ymmärtäminen ero voi tarjota puitteet selvennettäessä profiileja ennustamiseksi sädehoitoa vasteen. Meidän tutkimukset ovat keskittyneet luonteenomaiset monipuolinen koiran syövän solulinjoissa

in vitro

ja ymmärtää parametrit, jotka saattavat osaltaan luontainen radioherkkyyttä. Ensimmäinen, luontainen radioherkkyyttä 27 koiran syövän solulinjat, jotka ovat peräisin kymmenen kasvaintyypeissä määritettiin käyttäen klonogeenisten määritystä. 27 solulinjat olivat vaihtelevia radiosensitivities riippumatta kasvaimen tyyppi (hengissäsäilymisosuus 2 Gy, SF2 = ,19-0,93). Jotta ymmärtäisimme parametreja, jotka saattavat edistää luontaisen radioherkkyyttä, arvioimme suhteita solujen radioherkkyyttä perustiedot solun ominaisuuksiin solulinjoista. Ei ollut mitään merkittävää korrelaatiota SF2 S–faasifraktiolla kaksinkertaistaa ajan, kromosomiluku, ploidia tai useita vaihtokeskuskorkeuden kromosomien, vaikka oli tilastollisesti merkitsevä korrelaatio SF2 ja pinnoitus tehokkuutta. Seuraavaksi valitaan viisi eniten säteilylle solulinjat kuin säteilylle ryhmässä ja viisi eniten säteilyresistenteille solulinjat kuin säteilyresistenteille ryhmään. Sitten arvioimme tunnettu parametrit solukuolemaa ionisoiva säteily, kuten säteilyn aiheuttamista DNA kaksinkertainen lohkon murtuma (DSB) korjaus- ja apoptoosin, että säteilylle ryhmässä verrattuna säteilyresistenteille ryhmään. Korkea jäljellä γ-H2AX pesäkkeitä at sivustoja DSB oli läsnä neljässä viidestä säteilylle koiran syöpäsolun linjat. Tutkimustemme ehdotti, että huomattavia eroja luontainen radioherkkyyttä olemassa koiran syövän solulinjoissa, ja säteilyn aiheuttamien DSB korjaus liittyi radioherkkyyttä, joka on yhdenmukainen aiempien ihmisillä tehdyt tutkimukset. Nämä tiedot voivat auttaa lisätutkimuksia keskitytään havaitsemiseen DSB ennustamiseen yksittäisten vaste sädehoitoa koirille, riippumatta kasvaimen tyypistä.

Citation: Maeda J, Froning CE, Brents CA, Rose BJ, Thamm DH, Kato TA (2016) luonnostaan ​​säteilyherkkyyttä ja Cellular karakterisointi 27 Canine Cancer Cell Lines. PLoS ONE 11 (6): e0156689. doi: 10,1371 /journal.pone.0156689

Editor: Ying-Jan Wang, National Cheng Kung yliopisto, Taiwan

vastaanotettu: 14 tammikuu 2016; Hyväksytty: 18 toukokuu 2016; Julkaistu: 03 kesäkuu 2016

Copyright: © 2016 Maeda et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Rahoitusta saatiin tohtori Akiko Ueno Radiobiologia Fund (TAK). Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syöpä on merkittävä kuolinsyy koirilla kuin ihmisillä. Ihmisen ja koiran syövistä ovat ominaisuuksiltaan samanlaisia, paitsi anatominen ja histopatologisia ulkonäön lisäksi myös biologista käyttäytymistä, kasvaimen genetiikan ja vastaus perinteisiin hoitoihin [1, 2]. Koirien syöpä mallit ovat nousseet arvokkaita resursseja tutkimuksessa ihmisen syövän [2]. Ihmisen syöpätutkimuksessa, lukuisia hyvin tunnettu ihmisen syövän solulinjoja ovat saatavilla syöpätutkimukseen. Syöpä solulinjat on laajalti käytetty

in vitro

kokeellisessa mallijärjestelmiin ja ovat osoittautuneet hyödyllisiksi tutustumiseen taustalla biologia syövän [3]. Koiran syöpäsolulinjoissa on vähitellen kehitetty ja käytetty, mutta ne eivät ole täysin tunnettu, koska ihmisen solulinjoja. Tutkiminen solubiologian kautta luonnehdintoja koiran syövän solulinjat voivat antaa lisätietoja syöpäbiologian, tiettyjä koirille, ja joitakin mahdollisesti täydentämällä raportoitu ihmisen syövän.

Kasvaimet vaikka sama histopatologisten alkuperää voi näyttää monenlaisia ​​herkkyyttä sädehoitoa [4, 5]. Mittaaminen solujen luontainen radioherkkyyttä on tärkeää, koska ymmärtäminen ero voi tarjota puitteet selvennettäessä profiileja ennustamiseksi sädehoitoa (RT) vaste. Luonnostaan ​​radiosensitivities mitattuna

in vitro

pesäkkeiden muodostumisen määritykset ilmaistaan ​​SF2, osa solujen elossa yhden 2 Gy annoksen ionisoivan säteilyn (IR). Annos 2 Gy on myös yleisesti käytetty annos per jae kliinisissä RT ihmisillä. SF2 ihmisillä on osoitettu ennustaa kasvaimen vaste

in vivo

aiemmissa tutkimuksissa [6, 7]. Tällaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että erot luontainen säteilyherkkyyttä olemassa ja ymmärtämään mekanismeja voisi merkittävästi vaikuttaa käytännössä henkilökohtainen RT [4, 5].

mekanismit erot luontainen radioherkkyyttä syöpäsolujen todennäköisesti monitekijäinen [5] . Korjaus DNA kaksinkertainen katkeamisen (DSB: t) tunnetaan yhtenä tärkeimmistä joka määrittää luontainen radioherkkyyttä koska nämä vauriot, jos korjaamatta johtaa solukuolemaan [8]. Aiemmin jakelu solujen vaiheissa solusyklin ja DNA /kromosomin sisältö on ehdotettu tekijöitä, jotka voivat vaikuttaa luontainen radioherkkyyttä kasvainsolujen [9, 10]. Lisäksi osa eroista saattaa johtua taipumusta apoptoosiin vasteena säteilyn nähty imusolukasvaimista [11]. Kuitenkin ristiriidassa korrelaatiot radioherkkyyttä ihmisen kasvainsolujen on raportoitu mittaukseen Näiden parametrien ja perustamalla hyödyllinen määrityksen, joka ennustaa luontainen radioherkkyyttä on edelleen tutkittavana [4].

tutkimukset ovat keskittyneet luonteenomaiset monipuolinen koiran syövän solulinjoissa

in vitro

ja ymmärtää parametrit, jotka saattavat osaltaan luontainen radioherkkyyttä. Tämä Perusmäärittelyä voi antaa tietoa näistä solulinjoista jatkotutkimusta varten ennustaminen sädehoidon vasteen. Olemme tutkineet luontainen radioherkkyyttä 27 koiran syövän solulinjat, jotka ovat peräisin kymmenen kasvaintyypeissä. Kukin solulinja leimasi yhdistelmää edustavan datan solusyklin jakelu, solu kaksinkertaistamista aika, kromosomiluku, DNA ploidisia kuvio ja pinnoitus tehokkuutta. Tunnetut muuttujat, kuten DNA: n DSB korjaus tehokkuutta ja apoptoosin seuraava ionisoivaa säteilyä arvioitiin valittujen säteilylle ja säteilyresistenteille solulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

27 koiran kasvainten solulinjat ystävällisesti toimittanut Flint Animal Cancer Center of Colorado State University (Fort Collins, CO, USA) (taulukko 1) [12]. Liima tuumorisolulinjat kasvatettiin Minimum Essential Medium (MEM /EBSS, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Sigma-Aldrich, St Louis, MO), 1%: silla MEM vitamiineilla, ei- välttämättömiä aminohappoja, natriumpyruvaattia, penisilliiniä, streptomysiiniä ja Fungizonea. Suspension kasvaimen soluja kasvatettiin RPMI 1640-alustassa (Gibco Life Technologies), johon on sama kuin MEM. Solulinjoja pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa inkubaattorissa 95% ilmaa ja 5% CO

2.

Cell Proliferation

Jotta määrittämiseksi kaksinkertaistaa aikoina solulinjoista, solut maljattiin eri pitoisuuksina 35 mm viljelymaljoilla. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa. Solujen lukumäärä laskettiin 24 tunnin välein käyttäen Coulter-laskimella Z1 (Beckman Coulter, La Brea, CA). Cellular kaksinkertaistaa kertaa laskettiin Prism 5 -ohjelmaa (Graph Pad Software, La Jolla, CA). Ainakin kolme riippumatonta kokeet suoritettiin.

kromosomiluku

Soluja viljeltiin 0,1 ug /ml Kolkisiinia (Invitrogen, Carlsbad, CA) 6 tuntia, jotta sato metafaasikromosomeissa. Näytteet käsiteltiin hypotoniseen 75 mM KCl: a, liuos 20 minuutin ajan 37 ° C: ssa ja kiinnitettiin 3: 1 (metanoli: etikkahappo) kiinnittäminen liuos kolme kertaa. Metaphase leviää värjättiin Giemsa ratkaisu, ja kromosomiluku havaittiin alle Axioplan mikroskoopilla (Carl Zeiss, Jena, Saksa). Vähintään 100 metafaasisoluihin analysoitiin laskea kromosomeja solua kohti. Vähintään 50 metafaasisoluihin analysoitiin laskea vaihtokeskuskorkeuden kromosomeja solua kohti.

Cell Cycle Analysis

Soluviljelmät 60%: sta 70% konfluenssiin kiinnitettiin 70% etanolilla -20 ° C: ssa yön tai pidempään. Sitten soluja sentrifugoitiin 1500 rpm 5 minuutin ajan ja pestiin kerran PBS: llä. Sitten solut suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan värjäysliuosta (20 ug /ml propidiumjodidia, 0,1% Triton X-100, 500 ug /ml RNaasi A: ta) ja inkuboitiin 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Analyysi tehtiin käyttäen FACSCalibur virtaussytometria kanssa Cell Quest Pro (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) ja ModFit LT ohjelmisto (Verity, Topsham, ME). Kolmen erillisen kokeen kunkin solulinjan tehtiin. Ploidia arvioitiin, kun DNA-pitoisuus G1 solujen kasvainsolujen normalisoitu diploidi kiinanhamsterin munasarjasoluissa.

Säteilytys

Log vaiheen viljelmiä säteilytettiin erilaisilla annoksilla

137Cs gamma- säteet käyttäen JL Shepherd Model Mark I-68 nimellinen 6000 Ci

137Cs säteilyttäjällä (JL Shepard, Carlsbad, CA), toimitetaan noin 2,5 Gy /min huoneenlämmössä.

klonogeeninen eloonläämismääritys

radioherkkyyttä mitattiin klonogeeniset määritys nonsuspension solulinjoja. Satunnaisesti jakautuvien solujen in T-12.5 pulloissa oli säteilytetty, trypsinoitiin ja maljattiin kolmena päälle 100 mm tai 60 mm viljelymaljoihin sopivaan solutiheyteen. Kun oli inkuboitu 1-2 viikkoa, jotta pesäkkeiden muodostumista, astiat huuhdeltiin 0,9% NaCl, kiinnitettiin 100% etanolilla ja värjättiin 0,1% kristalliviolettia. Kukin pesäke koostuu yli 50 solua pisteytettiin perhe. Vähintään kolmen erillisen kokeen tehtiin sitten eloonjäämiskäyrien tehtiin käyttäen lineaarista-Neliöregressioyhtälön yhtälöt Prism 5 -ohjelmalla. Hengissäsäilymisosuus 2 Gy säteily (SF2) ja hengissäsäilymisosuus 5 Gy säteily (SF5) saatiin interpoloimalla solujen selviytymisen lisäksi arvioita luontaisten radioherkkyyttä kunkin solulinjan.

Ripustettujen kulttuureissa rajoittavan laimennuksen määritystä käytettiin, kuten aiemmin on käytetty ihmisen syöpäsolulinjoissa [13, 14]. Solut maljattiin 96-kuoppaisille mikrotiitterilevyille tiheydet 1-200 solua kuoppaa kohti on kaksi tai kolme solutiheyksiin per annos kohta. Säteilytyksen jälkeen levyjä inkuboitiin 37 ° C: ssa 2-3 viikkoa ennen pisteytys niin negatiivista tai positiivista kasvua perustuu mikroskooppinen tutkimus (ts kuopissa, joissa solujen kasvua oli tapahtunut ovat positiivisia). Perustuen Poisson-jakauman, hengissäsäilymisosuudet laskettiin kuten aiemmin on kuvattu [15].

γ-H2AX Foci G1-säteilytetty Cells

induktio, ja jäljellä DNA DSB: t IR arvioitiin käyttäen γ-H2AX määrityksessä. Toteutimme soluilla synkronoitu ja ylläpidetään G1 säteilytyksen aikana käyttäen isoleusiinia puute menetelmä [16]. Tämä tehtiin, koska ei säteilytetty soluja S-vaiheessa on paljon korkeampi γ-H2AX pesäkkeet, ja myös siksi, että määrä pesäkkeitä solua kohti riippuu DNA sisällöstä [17]. Soluja viljeltiin 24 tunnin ajan muovi- kammion liukuu noin 50% konfluenssiin ja pestiin PBS: llä kerran. Normaali kasvualusta korvattiin kahdesti 1,5 kaksinkertaistaa kertaa isoleusiini-puutteellinen MEM, joka sisälsi 5% 3 x dialysoitua FBS: ää synkronoida solut G1 vaiheessa. Sen jälkeen, kun G1 synkronointi ja altistuminen 0 Gy tai 1 Gy gamma-säteillä, soluja inkuboitiin 5-etynyyli-2′-deoksiuridiinin (edu) 30 minuuttia (joko välittömästi tai sen jälkeen, kun 5,5 tunnin inkubaation korjaus). Edu-leimaus käytetään arvioitaessa G1 synkronointi [18]. Sitten solut pestiin PBS: ssä ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja sen jälkeen läpäiseväksi 0,5% Triton-X-100 ja 0,1% SDS. Edu oli värjätään ensin kuin valmistajan ohjeiden. Levyjä pestiin kolme kertaa PBS: ssä, fiksoitiin 4% paraformaldehydillä ja blokattiin PBS: ssä, jossa oli 10% vuohen seerumia yli yön 4 ° C: ssa. Yön yli inkuboinnin jälkeen solut inkuboidaan fosforyloidun histoni H2AX-vasta-aine (Ser139) (γ-H2AX) (Millipore, Billerica, MA) ja sen jälkeen Alexa 594 Fluor-konjugoitua vuohen anti-hiiri-vasta-ainetta (Molecular Probes, Eugene, OR) . Solut asentaa ratkaisu DAPI sisältävä hidas fade (Invitrogen). Digitaaliset kuvat otettiin kiinni käyttämällä Axioskop moottoroitu Z-vaiheen mikroskooppi (Carl Zeiss) kanssa CoolSnapHQ2 (Photometrics, Tucson, AZ) ja Metamorph ohjelmistot (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Kuvat käytettiin laskemaan γ-H2AX pesäkkeitä solua kohti. Kolmen erillisen kokeen suoritettiin ja numerot γ-H2AX laskettiin vähintään 50 Edu värjäämällä negatiivisia soluja kutakin näytettä kussakin kokeessa.

Analyysi Apoptosis

Apoptoosin induktio IR arvioitiin käyttäen Caspase 3/7 aktivointi, anneksiini V värjäystä, ja terminaali deoksinukleotidyylitransferaasi (TdT) -välitteisen deoksiuridiinista trifosfaatiksi nick end-merkintöjä (TUNEL) määritys. Log vaihe kasvavat solut säteilytettiin 0 Gy tai 5 Gy gamma-säteitä. 16 tunnin inkuboinnin alussa apoptoosi mitattuna kaspaasi 3/7 kaspaasi-Glo 3/7 kit (Promega, Madison, WI). Glow luminenssi 10000 solua mitattiin Lumat LB9507 (Berthold tekniikat, Oak Ridge, TN). 24 tunnin kuluttua inkubaation aikainen /myöhäinen apoptoosi mitattiin anneksiini V-värjäys FITC anneksiini V apoptoosin detektioreagenssipakkaus 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA). Annnexin V positiivinen, mutta 7-AAD negatiivinen (varhainen apoptoottisia soluja) ja anneksiini V positiivisia ja 7-AAD positiivinen (myöhään apoptoosi) määritettiin Guava-PCA virtaussytometria. Sen jälkeen kun oli inkuboitu 48 tuntia, myöhään apoptoosi mitattiin TUNEL määritys ja hajanaista ydin- morfologia. Cytogentrifuged solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä ja jääkylmää 70% etanolia. Soluja inkuboitiin reaktioseoksessa, joka sisälsi 1,5 mM CoCl

2, 12,5 U TdT, 1 mM 5-bromi-2′-deoksiuridiini-5′-trifosfaatti in TdT-puskuria (Br-dUTP, Sigma-Aldrich: toiset Roche, Indianapolis, iN) 4 tuntia 37 ° C: ssa pimeässä. Levyjä inkuboitiin hiiren monoklonaalisella BrdU-vasta-aineen ja Alexa 488 Fluor-konjugoitua vuohen anti-hiiri-vasta-aine. Lopuksi solut vastavärjättiin DAPI. Noin 1000 ytimiä kustakin dia laskettiin, ja TUNEL positiiviset taajuudet laskettiin. Apoptosis suhteet määritettiin myös pisteyttämällä DAPI värjäämällä solut hajanaista ydin- morfologia.

Western-blottaus

Solut lyysattiin M-PER Nisäkkäiden Protein Extraction Reagent (Thermo Fisher Scientific) ja proteaasi-inhibiittorit. Proteiini uutteet (20 ug per näyte) on fraktioidaan koon NuPage 4-12% Bis-Tris geeleillä (Invitrogen), elektro-siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Bio-Rad) puskurissa (25 mM Tris, 192 mM glysiini, 20% (v /v) metanolia ja 0,01% SDS) virrantiheydellä 3,0 mA /cm

2 16 tuntia 4 ° C: ssa. Suodattimet blokattiin Tris-puskuroidulla suolaliuoksella, jossa oli 0,05% Tween 20, joka sisälsi 2% (w /v) kuorittua maitoa, ja saatetaan reagoimaan primäärisen vasta-aineen 2 tuntia huoneen lämpötilassa, jonka jälkeen inkubaatio sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huonelämpötila. Immunoreaktiivisia signaalit havaittiin käyttäen SuperSignal Western Blotting Detection Kit (Thermo Fisher Scientific) ja ChemiDoc XRS + System (Bio-Rad). Proteiinin ilmentyminen bändi lujuus analysoitiin Image Lab ohjelmisto (Bio-Rad). Primaaristen vasta-aineiden, joita käytetään tässä tutkimuksessa olivat hiiren anti-DNA-PKcs monoklonaalinen vasta-aine (Ab-4, Neomarkers, Fremont, CA), kanin anti-Rad51 polyklonaalista vasta-ainetta (H-92; Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA), kanin anti-FANCD2 polyklonaalista vasta-ainetta (NB100-182; Novus Biologicals, Littleton, CO) ja hiiren monoklonaalinen beeta-aktiini-vasta-aine (Abramin 8226; Abcam, Cambridge, MA). Toissijainen vasta-aineet vuohen anti-hiiri-IgG HRP konjugoitu vasta-aine (1: 10000) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) ja vuohen anti-kani-lgG-HRP-konjugoitu vasta-aine (1: 10000) (Cell signalointi, Boston MA ). Jokainen ilme bändi arvioitiin molekyylipaino jokaisen proteiinin ja bändi havaittiin ihmisen syövän A549.

Tilastollinen analyysi

Tilastoanalyysiin GraphPad Prism 5 ohjelmistoa käytettiin. D’Agostino-Pearson testiä käytettiin määrittämään, onko arvot normaalisti jakautunut. Erot, joiden P-arvo on vähemmän kuin 0,05 katsottiin tilastollisesti merkittäviksi. Korrelaatiot SF2 ja muiden parametrien määritettiin Pearson testi. Tilastollinen vertailut keskiarvojen että γ-H2AX määritys (vertailuryhmä vs. 6 tunnin kuluttua 1 Gy) suoritettiin käyttäen Kruskal-Wallisin testi seuraa Dunnin monivertailutestillä. Tilastollinen vertailu keskiarvojen että SF2 /SF5 (säteilyresistenteille vs säteilylle ryhmä) ja apoptoosin määritystä (0 Gy vs 5 Gy) suoritettiin käyttäen paritonta kaksisuuntaisia ​​t-testiä.

Tulokset

perusmäärittely Canine Cancer Cell Lines

Kukin solulinja leimasi yhdistelmää edustavan datan solujen kaksinkertaistumiseen aikaan solusyklin jakelu, ploidia kuvio, ja kromosomi numero, jossa data yhteenveto taulukossa 1. kaksinkertaistaa kertaa kunkin solulinjan vaihteli 15 tuntia (KML-6M, CTAC) 40 tuntia (STSA-1), joka osoittaa suurta vaihtelua. Mittasimme solusyklin jakautumisen kunkin solulinjan virtaussytometrialla. Solujen prosenttiosuus kussakin vaiheessa solusyklin vaihteli 39,3% (CLBL1) 69,6% (BR) G1 vaiheeseen, 17,3% (Parks) 50,1% (CLBL1) S vaihetta, ja 1,52% (BR ) 29,9% (Parks ja STSA-1) for G2 /M vaiheessa. Nämä solulinjat näkyy vaihteleva keskimääräinen lukumäärä kromosomeja, jotka vaihtelevat 57 (1771) 155 (17CM98). Koiran syöpäsolulinjoissa osoittivat lisääntynyttä määrää alkuvaihtokeskuskorkeuden kromosomien (X-muotoinen kromosomit) johtuvat Robertsonin translokaatio tapahtumat [19], lukuun ottamatta kahden solulinjan (Jones ja OSW) (taulukko 1). Taajuudet vaihtokeskuskorkeus kromosomien vaihteli solulinjat alle kaksi, normaali karyotyyppi, 43,2 (D17) solua kohti. Kaikki solulinjat paitsi BR oli suurempi kuin diploidinen määrä DNA. Löysimme yleinen väliset epänormaali ploidia ja lisääntynyt kromosomi numeroita, mutta ei aina. Nike, esimerkiksi oli pienempi määrä kromosomi solua kohti 64,4, mutta ploidia kuvio oli välillä diploidiaa ja triploidy.

klonogeeninen Survival altistuksen jälkeen gammasäteily

säteilytetty kukin 27 koiran syöpäsolulinjoissa 0, 1, 2, 3 tai 5 Gy gamma-säteitä ja mitatun pesäkkeiden muodostumista. Niiden selviytyminen käyrät on esitetty kuvassa 1. SF2 ja SF5 arvot laskettiin lineaarisen Neliöregressioyhtälön selviytymistä käyrä sekä maljaustehokkuus, on esitetty taulukossa 1. Nämä tiedot vastaavat välillä koiran kasvainsolun radiosensitivities eri kasvaintyypit . SF2 vaihteli 0,19-0,93, ja SF5 vaihteli 0,01-0,60. Maljaustehokkuus näistä solulinjoista myös osoittanut suurta vaihtelua, ja se vaihteli välillä 4%: sta 65%. Maljaustehokkuus BR (4%) oli liian alhainen saada luotettavaa hengissäsäilymisosuudet; siksi, sen radioherkkyyttä ei käytetty muihin tutkimuksiin. Radioherkkyyttä neljän koiran OSA solulinjoissa (D17, Moresco, Gracie ja MacKinley) mitattuna klonogeeniset määritys oli yhtäpitävä niitä, jotka ovat aiemmin julkaistu [20]. Siksi tiedot perus solujen ominaisuudet (esim kahdentumisaikoina, kromosomianalyysit) esitetään raportissa käytettiin myös analyysiin tässä tutkimuksessa. Arvioimme korrelaatiot muuttujan solujen ominaisuuksia ja radioherkkyyttä. Näissä solulinjoissa, ei ollut merkittävää korrelaatiota SF2 S–faasifraktiolla kaksinkertaistaa ajan, kromosomiluku tai useita vaihtokeskuskorkeuden kromosomien, vaikka oli vaatimaton, mutta tilastollisesti merkitsevä korrelaatio SF2 ja pinnoituksen tehokkuus (R

2 = 0,34, p = 0,002, Pearson testi) (kuvio 2). Arviointi vastaan ​​SF5 osoittivat samanlaisia ​​tuloksia näiden saadut SF2 (R

2 = 0,24, p = 0,01, Pearson testi).

Kokeet suoritettiin vähintään kolme kertaa ja virhe palkit osoittavat keskivirheen keinoista. Valitsimme eniten säteilylle solulinjoissa (punainen käyrät) ja kaikkein säteilyresistenteille solulinjoissa (sininen käyrät) seuraaville analyysiin.

Jokainen piste edustaa solulinjassa. Korrelaatiot arvioitiin käyttäen Pearson testi. Linjat olivat sovitettiin pienimmän neliösumman menetelmällä.

Valikoima säteilylle ja säteilyresistenteille Ryhmät

27 koiran syövän solulinjat paremmuusjärjestykseen radioherkkyyttä parametrit, SF2 ja SF5, ja viisi herkin tai resistentti linjat kunkin parametrin määriteltiin herkkiä ja resistenttejä ryhmät (kuvio 3A ja 3B). Valittu säteilyresistenteille ryhmä näkyy SF2 arvot 0,19-0,44 (Nike, KML-C2, Blileyn, MacKinley, STSA-1). Säteilylle ryhmä osoitti SF2 arvot yli 0,86 (CMT-12, K9TCC, DEN-HSA, CMT-27, Abrams). Erot kasvainsolun radioherkkyyttä olivat parempia syrjityillä kun radioherkkyyttä kasvainsolujen ilmaistiin hengissäsäilymisosuudet suuremmalla annoksella (SF5). Solulinjat näissä kahdessa ryhmässä perustuu SF5 vertailuun olivat hieman erilaiset kuin perustuu SF2 vertailuun. Selviytymisen jakeet kahden ryhmän välillä solulinjoja perustuvat joko SF2 tai SF5 vertailua olivat tilastollisesti erilaisia ​​(p 0,001) (kuvio 3C ja 3D).

27 Solulinjat paremmuusjärjestykseen perustuvat SF2 (A) ja SF5 (B). Punainen ympyrä: säteilylle ryhmä, sininen ympyrä: säteilyresistenteille ryhmä. (C, D) vertailu keskiarvoja kaksi ryhmää, joka perustuu SF2 (C) tai SF5 (D). Virhe pylväät osoittavat keskihajonnan. * P 0,001 versus herkkiä ja resistenttejä ryhmä (pariton t-testi).

suhde Luonnostaan ​​säteilyherkkyyttä ja DNA DSB: t G1-Irradiatied Cells

tutkia solujen vaste DNA DSB korreloi radioherkkyyttä että koiran syövän solulinjoissa, käytimme γ-H2AX määritystä viisi eniten säteilyresistenteille ja viisi eniten säteilylle solulinjat valitaan SF2 sijoitusta. Nuclear pesäkkeitä fosforyloidun histoni H2AX (γ-H2AX) johtuvat DNA-vaurioita ovat herkkiä markkereita DNA DSB: t [21]. Mittasimme määrä γ-H2AX pesäkkeitä jälkeen 1 Gy gammasäteilyä G1-vaiheessa synkronoitu soluissa 30-min tai 6 tunnin korjausaika (kuvio 4). Vuonna isoleusiini puutteellinen median synkronoimaan solut G1, useimmat DEN-HSA soluja kuoli 24 tunnin inkubaation, ja CMT-12 solulinjaa eivät olleet samat mediassa. Näin ollen, nämä kaksi solulinjaa ei käytetty tässä analyysissä. Toinen solulinjat osoittivat G1 synkronointi alle 16% S-vaihe isoleusiini puutteellinen media 1,5 kaksinkertaistaa kertaa. Joissakin soluissa ei ole S-vaiheessa 0 Gy hoitoon, suuri määrä endogeenisen γ-H2AX pesäkkeitä havaittiin kaikissa koiran syöpäsoluja. Me ulkopuolelle soluja, joilla on korkea pesäkkeitä ulkopuolella IR aiheuttamaa jakelun analyysin havaitsemiseksi tasot pesäkkeitä aiheuttamien IR. Analyysin perusteella ilman soluja, joilla on korkea endogeenisen γ-H2AX pesäkkeitä numerot, 1 Gy gamma-säteitä indusoi merkittävästi korkeampi γ-H2AX pesäkkeitä jälkeen 30 min säteilytyksen kaikissa solulinjoissa käyttää tässä analyysissä (p 0,05 vs 0 gy, jota ei ole esitetty kuviossa) (kuvio 4B). 30 minuutin säteilytyksen jälkeen, lukumäärän mediaani γ-H2AX pesäkkeitä oli riippuvainen DNA-pitoisuus kustakin solulinjasta. Lisäksi säteilylle KML-10c2 Nike, STSA-1 ja MacKinley oli suurempi määrä γ-H2AX pesäkkeitä kuluttua 6 tunnin kuluttua 1 Gy säteilytys verrattuna niiden verrokkitasojen (p 0,05 vs 0 Gy). Toisaalta, kaikki kolme säteilyresistenteille solulinjojen ja yksi säteilylle solulinjan, Blileyn, eivät osoittaneet merkittäviä eroja valvontaa solujen ja solujen 6 tunnin kuluttua säteilytyksen.

Solut synkronoidaan G1 käyttäen isoleusiinia puutteellinen media ja sitten säteilytetään 1 Gy gamma-säteitä. Seuraavat 30 min tai 6 tunnin inkuboinnin ajan, solut värjättiin γ-H2AX. (A) Esimerkkejä γ-H2AX pesäkkeitä (vihreä) ydin- DAPI (sininen) värjäys valvonta, 1Gy seurasi 30 min inkubaation ja 1 Gy seurasi 6 tunnin inkuboinnin in edu negatiivisissa soluissa. (B) kvantitatiivinen analyysi gamma-H2AX pesäkkeitä solua kohti. Saadut yhdistetyt tiedot kolmen erillisen kokeen pisteytys 50 solua kussakin kokeessa on esitetty. Palkki osoittaa keskiarvon. Tilastollinen merkitykset on esitetty vain ohjaus vs. 6 h kuluttua 1 Gy (nonparametric Kruskal-Wallisin testi).

Suhde Luonnostaan ​​säteilyherkkyyttä ja apoptoosi Taajuus Irradiated Solut

Viisi säteilyresistenteille solu linjat ja viiden säteilylle solulinjoja arvioitiin myös apoptoosin 18, 24, ja 48 tuntia säteilytyksen jälkeen (0 Gy ja 5 Gy) (kuvio 5). Kaspaasi 3/7 aktivointi analysoitiin 18 tunnin kuluttua säteilytyksen (kuvio 5A). Anneksiini V: n ilmentyminen analysoitiin 24 tuntia säteilytyksen jälkeen (kuvio 5B). Aktiivisuus kaspaasi 3/7 lisääntyi yli kaksi kertaa havaittiin CMT-12, Abrams, CMT-27, CML-10c2 Blileyn, MacKinly, ja STSA-1. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen lisääntynyt merkittävästi 5 Gy säteilytys CMT-12, Abrams, CMT-27, CML-10c2 Blileyn, ja MacKinley anneksiini V analyysi. Apoptoottisia soluja laskettiin TUNEL värjäytymistä (kuvio 5C) ja DAPI todetaan (kuvio 5D) ja ilmoitetaan erikseen. Vaikka apoptoosin nähtiin kaikissa kontrolliviljelmien vaihtelee 0,1-3,4% TUNEL värjäys ja 0,37-3,3%: iin DAPI Solujen värjäytyminen, riippuen solulinjasta, ei ollut merkitsevää eroa solulinjoja. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen lisääntynyt merkittävästi 5 Gy säteilytys Abrams, Nike, ja KML-10c2 by DAPI värjäystä suhteessa 0 Gy näytettä (p 0,05, pariton t-testit) (kuvio 5C). Mittaus- apoptoottisten solujen TUNEL määrityksen, samanlaisia ​​tuloksia näiden by DAPI värjäytyminen havaittiin. Merkittävä lisäys apoptoosin taajuudella IR havaittiin yhdessä (Abrams) viidestä säteilyresistenteille solulinjoja ja kolmessa (Nike, KML-10c2 ja MacKinley) viidestä säteilylle solulinjoissa (kuvio 5D).

(A) kaspaasi 3/7 aktiivisuus mitattiin luminomator 16 tuntia säteilytyksen jälkeen. (B) anneksiini V ja 7AAD värjäytyminen mitattiin virtaussytometrillä 24 tuntia säteilytyksen jälkeen. (C) TUNEL värjäys ja (D) DAPI-värjäys mitattu fluoresenssimikroskoopilla. Solut säteilytetty 0 Gy ja 5 Gy gamma-säteitä. *, P 0,05 versus 0 Gy ja 5 Gy kunkin solulinjan (pariton t-testi).

Protein Expression DNA Repair väylän säteilylle ja säteilyresistenteille Ryhmät

Koska DNA DSB korjaus reitit liittyvät läheisesti solun tappaminen IR, tutkittiin proteiinin tilan suurten reittejä koiran syöpäsoluja. Olemme keskittyneet kaksi suurta kuin homologisen pää tuloaan (NHEJ) ja homologinen rekombinaatio (HR) on DSB korjaus- ja Fanconin anemia (FA) reitin, joka mahdollisesti vaikuttaa DNA-vaurioiden korjauksen säteilytys. Proteiinin ilmentyminen merkittäviä toimijoita kussakin polku, DNA- PKcs in NHEJ, RAD51 HR ja FANCD2 FA reitin havaittiin Western-blottauksella että säteilyresistenteille ja säteilylle ryhmissä (kuvio 6). Ilmentyminen DNA-PKcs, FANCD2 ja RAD51 eivät yhtenäiset eri solulinjoissa, ja ei ollut selvää suuntausta välillä ekspressiotasot näissä kahdessa ryhmässä, kuten on esitetty kuviossa 6B. Ilmaisua kolmen proteiinien koiran syöpäsolut olivat kokonaisuudessaan suurempia kuin normaalissa koiran fibroblasteissa. Havaitsimme vähemmän ilmentymistä DNA- PKcs proteiinien Nike (1,4-kertainen normaaliin) ja korkein ilmaisun STSA-1 (5,4-kertainen normaaliin). Sillä FANCD2 proteiini, alin ilmaus oli DEN-HSA (0,8-kertainen verrattuna) ja korkein ilmaus oli CMT-27 (7,2-kertainen normaaliin). Sillä RAD51 proteiini, alin ilmaisun DEN-HSA (0,4-kertainen verrattuna) ja korkein ilmaus oli MacKinley (3,0-kertainen normaaliin). Kun verrataan koiran ja ihmisen syövän solulinja (A549), ilmentymisen tasoja DNA-PKcs in STSA-1, joka osoitti korkeimman ekspression koiran solulinjojen, oli 10 kertaa vähemmän kuin A549.

(A) Western blot -analyysi DNA-PKcs (460 kDa), FANCD2 (165 kDa) ja RAD51 (37 kDa). β-aktiinin (42 kDa) ilmentymistä käytettiin kontrollina. Jokainen ilme bändi arvioitiin molekyylipaino. (B) Band intensiteetti western blot. (C, D) edustaja kuvia RAD51 pesäkkeet (C) ja FANCD2 pesäkkeet (D) yhdessä lokalisoitu gamma-H2AX in Moresco soluissa.

Myös havaittu pesäkkeitä RAD51 ja FANCD2 toiminnallisesti co-paikallistaa γ-H2AX on replikointi stressiä ilman säteilytystä kaikkiaan 27 solulinjoissa (kuvio 6C ja 6D). Toinen etu testaamiseksi RAD51 ja FANCD2 oli se, että näiden proteiinien pesäkkeitä kokoonpanojen vaatia muita ylävirran proteiineja, kuten viisi RAD51 paralogi proteiineja ja kahdeksan Fanconin anemia proteiineja [22-24]. Siksi havaitaan pesäkkeitä muodostuminen meille mahdollisuuden läsnäolon seulomiseksi näiden ylävirtaan proteiinien kaikissa 27 koiran syöpäsolulinjoja. Havaitsimme toiminnallinen pesäkkeitä RAD51 ja FANCD2 kaikissa solulinjoissa.

Keskustelu

27 koiran syövän johdetut solulinjat kymmenen eri kasvaintyypeissä käyttää esillä olevassa tutkimuksessa olivat vaihtelevia radiosensitivities riippumatta kasvaimen tyypin kanssa SF2 arvot 0,17-0,94 (kuvio 1 ja taulukko 1). Edellisten radioherkkyyttä dataa käyttämällä erilaisia ​​ihmisen kasvaimia, SF2 vaihteli 0,038-0,95 [13]. Alarajan SF2 raportoitu ihmisen tutkimuksessa oli lähinnä imusolukasvaimista, jotka eivät olleet erittäin säteilylle meidän koiran tulokseen, jossa SF2 mitattiin käyttäen samaa määritystä. Imusolukasvaimista tiedetään olevan herkkiä sädehoitoa sekä ihmisille että eläimille onkologian [2]. Tämä ero saattaa johtua vaihtelusta imukudoksen kasvainsolulinjoja kuten raportoitu aiemmin [25], koska vain neljä solulinjoja tutkittiin tutkimuksessamme.

Jotta ymmärtää parametreja, jotka saattavat edistää luontaisen radioherkkyyttä, arvioimme suhteet solujen radioherkkyyttä perus solun ominaisuudet 27 koiran syöpäsolun linjat. Laaja vaihtelu on havaittu myös solujen ominaisuuksien suhteen kromosomimäärän, S–faasifraktiolla kaksinkertaistaa aikaa ja pinnoituksen tehokkuus näissä solulinjoissa (taulukko 1). Tutkimuksessamme emme löytäneet korrelaatiota säteilyherkkyyttä ja solujen ominaisuuksia, myös kromosomiluku, S–faasifraktiolla ja kaksinkertaistaa aika (kuvio 2). Aiemmin suurin kromosomien lukumäärä on havaittu joissakin säteilyresistenteille ihmisen syöpäsoluja [9].