Krooninen sairaus

tiivistelmä

vaeltavia kyky syöpäsolujen on yksi tärkeimmistä tunnusmerkeistä mikä metastaattista potentiaalia. Ouabain, endogeeninen sydänglykosidi tuotetaan lisämunuaisen, on aikaisemmin raportoitu olevan kasvaimen vastaisia ​​aktiivisuuksia; kuitenkin, sen rooli säätelyssä syöpäsolun siirtymä pysyy tuntematon. Tämä tutkimus on osoittanut, että hoito ouabainia fysiologisessa pitoisuuksina kykenee estämään muuttavia toiminnan ihmisen keuhkosyövän H292-soluissa. Kielteisiä vaikutuksia ouabainia havaittiin välittyvän tukahduttaminen maahanmuuttoa säätelevien proteiinien, kuten polttoväli adheesiokinaasi (FAK), ATP-riippuvaiset tyrosiinikinaasi (Akt), ja solunjakautumisen kierron 42 (Cdc42). Olemme havainneet, että havaittu toimia ouabain välitettiin kautta reaktiivisen hapen (ROS) -riippuvaista mekanismia, koska lisäämällä ROS puhdistavien (N-asetyylikysteiini ja glutationi), voi kääntää päinvastaiseksi ouabain solujen siirtoa. Lisäksi ouabaiini on osoitettu estävän pallomainen kasvaimen kasvua ja vähentää syöpäsolujen tarttumista endoteelisolujen. Kuitenkin yhdisteellä ei ollut merkittävää vaikutusta anoikis solujen. Yhdessä nämä havainnot valottavat ymmärrystä syövän solubiologian tutkimalla uusia toimia tämän ihmisen endogeenisen aineen.

Citation: Pongrakhananon V, Chunhacha P, Chanvorachote P (2013) ouabainia estää muuttavien Behavior of Lung syöpäsoluja. PLoS ONE 8 (7): e68623. doi: 10,1371 /journal.pone.0068623

Editor: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Lasten Hospital Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu 4 helmikuuta 2013 Hyväksytty: 30 toukokuu 2013; Julkaistu: 10. heinäkuuta 2013

Copyright: © 2013 Pongrakhananon et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Thaimaan Research Fund ja Ratchadaphiseksomphot Endowment Fund. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ymmärtäminen molekyylitason syöpäsolujen vastauksena biologisesti johdettuja aineita pidetään keskeisenä tukea löytämässä uusia kohdemolekyylit lääkehoitoja. Merkittäviä todisteita on ilmoittanut, että ouabainia, natrium /kalium pumppu estäjä, on läsnä ihmisen plasmassa ja kudoksissa välillä +0,002-+0,77 nM [1] – [3]. Lisäksi ouabaiini havaittiin olevan säädelty useilla patologiat kuten sydämen vajaatoiminta [1], [4], munuaisten vajaatoiminta [5] ja verenpainetauti [3], [6]. Viime aikoina olemme antaneet näyttöä siitä, että ouabainia herkistää tuumorinekroositekijä liittyvää apoptoosia indusoiva ligandi (TRAIL) -välitteisen keuhkosyöpä apoptoosia, ja tämä havainto viittaa siihen, että ouabainia voivat vaikuttaa syöpäsolun biology [7].

vuonna keuhkosyöpä, etäpesäkkeitä on tullut kiinnostava tutkimusala koska korkea kuolleisuus tähän tautiin liittyy syövän etäpesäkkeitä [8]. Aikana solu leviää, syöpäsolut täytyy olla kyky siirtää niiden alkuperäisestä sivustoja läheiseen vikaa. Lisääntynyt kinaasiaktiivisuutta fokaalisen adheesion kinaasin (FAK), keskeinen signalointireitin ohjaamalla solun liikkuvuus, voimistaa kasvaimen kehittymisen ja etäpesäkkeiden [9]. Tällaisia ​​muutoksia havaittiin myös aikana hankintaprosessia metastasoituneen syöpäsolujen [10], [11]. FAK ohjaa signaalinvälityksessä integriini-rikastettu fokaalisen adheesion kohtiin soluväliaineen vuorovaikutuksen [12]. Sääntelyn osalta syöpäsolun muuttoliikkeen, FAK fosforylaation Tyr-397 ja rekrytointi Src-ryhmän kinaasit ovat tärkeitä prosesseja käynnistää siirtoa [12] – [13]. Lisäksi aktivoitua asemaa useita muuttavien sääntelyviranomaisten kuten ATP-riippuvaiset tyrosiinikinaasi (Akt) ja solunjakautumista kierron 42 (Cdc42) [14], [15] ovat kriittisiä prosessin solun liikkumista. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että aktivointi Akt parantaa kykyä syöpäsolujen siirtyä ja hyökätä [15], [16]. Akt, joka on lokalisoitu reunalla liikkuvien solujen vuorovaikutuksessa aktiinia sitovien proteiinien ja indusoi aktiini remodeling ja muodostumista kalvon ulkonemat, helpottaa solun liikkuvuus [15]. Tämä käsite vahvistettiin tutkimuksessa osoittaa, että alas-säätely Akt käyttäen antisense tekniikkaa aiheuttaa dramaattinen esto syöpäsoluinvaasiota

in vitro

[17] ja

in vivo

[18] . Lisäksi vuorovaikutus FAK ja ERK1 /2: n on osoitettu ohjaamaan solun liikkuvuus [19] – [20]. Äskettäin Rho perheen pieniä guanosiini triphosphatases (GTPaaseja), erityisesti Cdc42, on osoitettu keskeisessä asemassa aktiini uudelleenjärjestely ja filopodia muodostumista. Ilmaisu taso Cdc42 havaittiin olevan säädelty monissa syövissä kuten keuhkosyövän [21] – [22], ja Cdc42 induktio osoitettiin parantaa syövän maahanmuuttoa [23].

Toistaiseksi rooli endogeenisen tasojen ouabainia säätelyssä syövän solun liikkuvuus on suurelta osin tuntemattomia, ja tällainen ymmärrys voisi johtaa uusiin syöpähoitojen. Siksi pyrimme tutkimaan mahdollisia vaikutuksia tämän biologisen aineen syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. Ensimmäistä kertaa, osoitamme, että endogeeniset tasot ouabainia tukahduttaa kasvaimen soluliikkuvuus ja liittyy vähentynyt aktivoituminen FAK ja Akt ja ilmaus Cdc42. Tutkimuksemme osoittaa uuden hypoteesin, että tämä fysiologinen aineella on negatiivinen säätelevä rooli prosessissa syöpäsolumetastaasi.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja reagenssit

ei- pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) solulinjat H292 ja H460 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Soluja viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 5% naudan sikiön seerumia (FBS), 2 mM L-glutamiinia ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä /streptomysiiniä. Soluja inkuboitiin 5% CO

2 ympäristössä lämpötilassa 37 ° C. Ouabaiini dikloorifluoreseiiniliuosta diasetaatti (DCFH

2-DA), poly-2-hydroksietyylimetakrylaatti (poly-HEMA), 3- (4,5-dimetyyli-tiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT) ja phalloidin tetrametyylirodamiini B-isotiosyanaattia saatiin Sigma Chemical, Inc. (St. Louis, MO). Propidiumjodidia (PI) ja Hoechst 33342 saatiin Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Vasta-aineet pan-Akt, p473-Akt, FAK, p397-FAK, Cdc42, caveolin-1 ja β-aktiini, sekä peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineet saatiin Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA).

elinkykyyn ja apoptoosi Analyysit

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen MTT-määritystä. Sen jälkeen, kun asianomaiset hoidot, soluja inkuboitiin 500 ug /ml MTT: tä 37 ° C: ssa 4 tuntia. Intensiteetti käsittelyyn MTT tuote mitattiin 550 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa, ja elinkelpoisten solujen prosentuaalinen laskettiin suhteessa kontrollisoluihin. Apoptoosi määritettiin Hoechst 33342 /PI-värjäys ja DNA sisällön analyysi. Solut pestiin ja niitä inkuboitiin 10 ug /ml Hoechst 33342 ja 5 ug /ml PI: ssa 30 min. Nuclei tiivistyminen ja DNA: n fragmentoituminen apoptoottisten solujen ja PI-positiivisia necrotic soluja tarkasteltiin ja tekee fluoresenssimikroskopialla (Olympus IX51 kanssa DP70). Sub G0 DNA sisällön analyysi, kun määritetty hoidon, solut trypsinoitiin, pestiin fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kiinnitettiin 70% etanolia 37 ° C: ssa 3 h. Kun oli pesty fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, soluja inkuboitiin PI, joka sisälsi 0,1% Triton-X, 1 ug /ml RNaasi ja 1 mg /ml propidiumjodidia huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. DNA-pitoisuus analysoitiin käyttämällä virtaussytometrialla (FACSort, Becton Dickinson, Rutherford, NJ).

ROS Detection

Solunsisäiset ROS-tasot määritettiin virtaussytometrialla käyttämällä DCFH-DA kuin fluoresoiva koetin. Lyhyesti, soluja inkuboitiin 10 uM DCFH

2-DA 30 min ajan 37 ° C: ssa, minkä jälkeen ne pestiin, trypsinoitiin, suspensoitiin uudelleen fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen, ja analysoidaan välittömästi fluoresenssi-intensiteetti mikrolevylukijalla.

migraatiokokeessa

Migration määritettiin haavan paranemista ja Transvvell- määrityksissä. Haavan paranemista määrityksessä, yksinkertaisen kerroksen soluja viljeltiin 24-kuoppalevylle, ja haavan tilaa tehtiin 1 mm levyinen kärki. Huuhtelun jälkeen PBS: llä, yksisolukerrokset inkuboitiin asianomaiset hoidot ja annettiin kulkeutua 24 h. Micrographs otettiin alla faasikontrastimikroskooppia (Olympus DP70, Melville, NY), ja haavan tilat mitattiin 10 satunnaisesti näkökentät käyttäen Olympus DP-ohjaimen ohjelmisto. Kvantitatiivinen analyysi solumigraation suoritettiin käyttäen keskimäärin haavan tila niiltä satunnainen näkökenttien, ja muutoksen prosenttiosuutena haavan tilaan laskettiin käyttämällä seuraavaa kaavaa:% muutos = (keskimääräinen tila hetkellä 0 h) – (keskiarvo tila ajankohtana 24 h) /(keskiarvo tila hetkellä 0 h) x 100. Suhteellinen solujen muuttoliikettä laskettiin jakamalla prosentuaalinen muutos haavan tilaan käsiteltyjen solujen kuin kontrollisolujen kussakin kokeessa. Sillä transwell määritystä, solut ympättiin tiheydellä 5 x 10

4 solua /kuoppa ylemmän kammion transwell (8 um huokoskoko) 24-kuoppaisen levyn seerumittomassa väliaineessa ja inkuboitiin eri pitoisuuksia ouabaiini. RPMI-väliainetta, joka sisälsi 10% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon. Inkubaation jälkeen ei-siirretyn solut ylemmässä kammiossa poistettiin puuvilla-moppi pyyhkimällä, ja solut, jotka vaelsivat alapuolelle kalvon värjättiin 10 ug /ml Hoechst 33342: ssa 10 minuuttia ja visualisoitiin ja sijoitettiin alle fluoresenssimikroskooppia (Olympus IX51 kanssa DP70).

invaasiomääritys

invaasio määritys suoritettiin käyttäen 24-kuoppaista siirtokuoppaan yksikkö polykarbonaattia (PVDF) suodattimet (8 um huokoskoko). Membraani päällystettiin 0,5% matrigeeliä yläpinnalle kammion yön yli 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa. Solut maljattiin tiheydellä 2 x 10

4 solua kuoppaa kohden ylempään kammioon transwell yksikön seerumia. Joka sisälsi 10% FBS: ää lisättiin alempaan kammioon yksikön. Inkubaation jälkeen tietyn testin aineita 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa, väliaineen ylempään kammioon imettiin ja solut ylä- puolelle kalvon poistettiin pumpulipuikolla. Solut, jotka tunkeutuivat alapuolelle kalvon värjättiin 10 ug /ml Hoechst 33342: ssa 10 min, visualisoitiin ja teki fluoresenssimikroskoopilla.

Solumorfologia ja Filopodia karakterisointi

Solumorfologia tutkittiin jonka phalloidin-rodamiini ja sulforodamiini B värjäys määrityksessä. Solut ympättiin tiheydellä 10

4 solua /kuoppa 96-kuoppaiselle levylle yön yli. Soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla ouabain 24 tuntia. Sitten solut pestiin PBS: llä, kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 10 min ajan 37

°

C, läpäiseviksi 0,1% Triton-X100 PBS: ssä 4 minuuttia, ja blokattiin 0,2% BSA: ssa 30 min. Sitten soluja inkuboitiin joko 1:100 phalloidin-rodamiini PBS: ssä tai 0,4% sulforodamiini B: 1% etikkahapossa 15 min, huuhdeltiin 3 kertaa PBS: llä, ja kiinnitettiin 50% glyserolia. Solujen morfologia arvioitiin sitten loisteputki kuvantaminen (Olympus IX51 kanssa DP70). Filopodia pullistuma oli edustettuna keskimäärin filopodia /solun suhteessa käsittelemättömiin soluihin kullakin alalla.

In vitro 3D tumorigeneesin Pitoisuus

In vitro 3D tuumorigeneesiä suoritettiin Matrigel päällystettyä 96- kuoppalevylle. Levy päällystettiin 0,5% matrigeeliä ja lähti kiinteytystä yön yli 37

°

C. Solut suspendoitiin elatusaineeseen, joka sisälsi 4% matrigeeliä ja ouabaiini (0-30 pM), ja maljattiin tiheydellä 10

3 solua /kuoppa Matrigel-päällystetylle levylle. Medium sisältävä ouabainia (0-30 pM) korvattiin 3 päivän välein. 10 päivän jälkeen solut visualisoitiin ja tekee kuva-analysaattorilla mikroskoopilla.

Anoikis Pitoisuus

anoikis arviointi, Kudosviljelytutkimusten kuuden kuopan levyille päällystettiin 6 mg /ml poly (2 -hydroksietyyli-metakrylaatti (poly-HEMA) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 95% etanolia, ja inkuboitiin 37 ° C: ssa kuivauksen. H292-soluja maljattiin poly-HEMA levyillä RPMI väliaineessa, joka sisälsi ilmoitettu hoitoja for 0-24 h. Kun oli inkuboitu 10 ug /ml Hoechst 33342 30 minuuttia, ytimet tiivistyminen ja DNA pirstoutuminen anoikis soluja tarkasteltiin ja tekee fluoresenssimikroskopialla (Olympus IX51 kanssa DP70).

Anchorage riippumaton kasvun määritys

Anchorage riippumattoman kasvun määritettiin pesäkemuodostusta pehmytagarissa. Lyhyesti, soluja 6-kuoppalevyllä yksikerrosviljelmiä valmistettiin yhdeksi-solususpensio. solut suspendoitiin RPMI, joka sisälsi 10% FBS: ää ja 0,33% alhaisen sulamispisteen agaroosia, ja 2 x 10

4-solut maljattiin 35 mm lautasen yli kerros kiinteytyi RPMI /10% FBS /0,6% agaroosia. Soluja syötettiin joka kolmas päivä lisäämällä 200 ui RPMI /10% FBS: ää. Pesäkkeet värjättiin 10 ug /ml Hoechst 33342 30 minuuttia, visualisoida ja tekee kuvan analysaattori loisteputken mikroskoopin (Olympus IX51 kanssa DP70).

Yksikerroksinen Soluadheesiokoe

HUV-EC- C stimuloitiin 10 ng /ml IL-1β 0-4 h. Jälkeen ilmoitettu hoidon, H292-soluja (2,5 x 10

4 solua /ml) lisättiin levylle semi-konfluentti yksikerrosviljelmä HUV-EC-C, inkuboitiin 20 minuutin ajan 37 ° C: ssa samalla pyörittäen 120 rpm, ja pestiin laajasti jättää epäspesifisen solujen kiinnittymistä. Määrä kiinnittyneitä soluja laskettiin suoraan fluoresenssimikroskoopilla.

Western-blottaus

jälkeen erityisiä hoitoja, soluja inkuboitiin lyysipuskuriin, joka sisälsi 20 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 % Triton X-100, 150 mM natriumkloridia, 10% glyserolia, 1 mM natriumortovanadaattia, 50 mM natriumfluoridi, 100 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia ja kaupallinen proteaasiestäjäseostabletit (Roche Molecular Biochemicals) 30 minuuttia jäillä. Solulysaatit otettiin talteen ja proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Bradford-menetelmällä (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Yhtä suuret määrät proteiinia kustakin näytteestä (60 ug) denaturoitiin kuumentamalla 95 ° C: ssa 5 minuutin ajan Laemmlin latauspuskuria ja sen jälkeen ladattiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelillä. Erottamisen jälkeen proteiinit siirrettiin 0,45 um nitroselluloosakalvoille (Bio-Rad). Siirretyn kalvoja blokattiin 1 tunnin ajan 5% rasvatonta kuivamaitoa TBST (25 mM Tris-HCI (pH 7,5), 125 mM NaCl, 0,05% tween 20), ja inkuboitiin sopivan primaarisen vasta-aineita, 4 ° C: ssa yön yli. Membraanit pestiin kaksi kertaa TBST: llä 10 min ajan, ja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasiin kytketty isotyyppispesifisessä sekundaarisia vasta-aineita 1 tunti huoneen lämpötilassa. Immuunikompleksien havaittiin lisäämällä kanssa kemiluminesenssimittaus alustan (SuperSignal West Pico, Pierce) ja kvantifioidaan analyytikko /PC densitometria ohjelmisto (Bio-Rad).

Tilastollinen analyysi

Mean tietoja riippumattomien kokeet normalisoida tulokset solujen kontrolliryhmässä. Kaikki kokeet toistettiin vähintään neljä kertaa. Tilastollinen analyysi kahden ryhmän välillä varmistettiin Studentin t-testiä, ja verrata useita ryhmiä, varianssin analyysiä (ANOVA) ja post-hoc suoritettiin. P-arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

vaeltavien ominaista ei-pienisoluinen keuhkosyöpä H292-soluissa

testaamiseksi vaikutuksen ouabainia on keuhkosyövän solujen vaeltamiseen, ensin tunnettu siirtymisen profiilia H292-soluissa käyttäen haavan maahanmuutto- ja Transvvell- määrityksissä. Kuviot. 1A ja B osoittavat, että H292 läpi vaeltaneet solut haavan tila on ajasta riippuva tavalla, ja tulokset olivat yhdenmukaiset saatu siirtokuoppaan migraatiokokeessa.

V: kasvaneita yksikerroksiset H292-soluissa haavoittui käyttämällä 1 mm levyinen kärki ja annettiin kulkeutua 0-24. Haava tila tehtiin näkyväksi mikroskoopilla, ja kulkeutuminen suhteessa tasot verrattuna 0 t aikapisteessä laskettiin. Data edustaa keskiarvoja ± SD (n = 4). *

P

0,05 vs. arvoon 0 t ajankohtana. B: H292 migraatiota tutkittiin jonka siirtokuoppaan määritystä varten 0-24. Vaeltavien solujen basolateraalisessa membraanin värjättiin Hoechst 33342: ssa 30 minuuttia ja visualisoitiin fluoresenssimikroskoopilla. Tulokset esitettiin graafisesti keskimääräinen solujen lukumäärä kussakin kentässä ja ovat keskiarvoja ± SD (n = 4). *

P

0,05 vs. arvoon 0 t ajankohtana. C: H292-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla ouabain (0-5,000 pM) 24 tuntia. Solujen eloonjääminen määritettiin 3- (4,5-dimetyyliamino–tiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi (MTT). Elinkelpoisuuden käsittelemättömien solujen edusti 100%. Data edustaa keskiarvoja ± SD (n = 4). *

P

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli soluja. D: Apoptoottista solukuolemaa arvioitiin käyttämällä Hoechst 33342 värjäystä. Data edustaa keskiarvoja ± SD (n = 4). *

P

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli soluja. E: Cellular apoptoosi määritettiin DNA-sisällön analysointia käyttämällä virtaussytometriaa.

Seuraavaksi sytotoksisuus koe suoritettiin sen testaamiseksi, onko biologinen pitoisuudet ouabain vaikuttaa H292 solujen elinkykyä. Soluja viljeltiin puuttuessa tai läsnä ollessa ouabain (10-5000 pM), ja solujen elinvoimaisuus määritettiin käyttäen MTT-määritystä 24 tunnin ajan. Tulokset osoittavat, että pitoisuudet ouabain on endogeenisten tasojen (2-770 pM) aiheutti ole myrkyllistä eikä proliferatiiviset vaikutukset näihin keuhkosyövän solut (Fig. 1 C). Vaikka pitoisuudet tätä ainetta jopa 1000 nM ei aiheuttanut apoptoosia, 5000 nM ouabaiini vähensi solujen elinkelpoisuuden (Fig. 1 C) ja välittämän solukuoleman havaita Hoechst 33342 tumavärjäystä määritystä (Fig. 1 D). Lisäksi, solut käsiteltiin 0-500 pM ouabain 24 tuntia, ja solut altistettiin virtaussytometrialla sub G

0 osa määritystä. Kuva. 1E osoittaa, että solujen käsittelyä kanssa 10-500 pM ouabainia ei aiheuttanut merkittävää muutosta sub G

0 murto verrattuna kuin käsittelemätön kontrolli soluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että pitoisuudet ouabainia löydetty ihmisen plasmasta ja kudokset eivät vaikuta elinkelpoisuutta H292-soluissa.

ouabainia Estää Keuhkosyöpä Cell Migration and Invasion

Endogeeniset pitoisuuksia ouabainia testattiin vielä niiden mahdolliset vaikutukset syövän solujen vaeltamiseen. Solut käsiteltiin 0-30 pM ouabain ja käytetään siirtymätesteissä määrityksissä 24 h. Haavan migraatiokokeessa osoittivat, että ouabain tukahdutetaan H292 solumigraatiota annoksesta riippuvalla tavalla verrattuna käsittelemättömään kontrolliin solut (Fig. 2A). Tällä pitoisuus 20 pM, ouabaiini aiheutti noin 50% pienempi vaeltavien solujen aktiivisuutta. Lisäksi siirtokuoppaan migraatiokokeessa tukevaa dataa, joka ilmoittaa, että ouabain esti merkitsevästi solujen vaeltamiseen (Fig. 2B). Vaikka määritelty ja sääntely syöpäsolun muuttoliikettä ja invaasiota ei täysin tiedetä, tutkimukset ovat osoittaneet, että on olemassa liittyy signalointireitteihin [24]. Vaikutus ouabainia sen invasiivisen potentiaalia syöpäsolujen testattiin lisäksi käyttämällä soluväliaineen päällystetyn transwell määrityksessä. Solut lisättiin transwell ja käsiteltiin osoitetuilla pitoisuuksilla ouabain 24 tuntia. Kuva. 2C osoittaa, että ouabainia hoito vähentää huomattavasti määrää hyökkäsi H292-soluissa verrattuna käsittelemättömään kontrolliin solujen noin 50%: n vähennys havaittu vastauksena 20 pM ouabainia.

V: kasvaneita yksikerroksiset H292-soluissa haavoittui käyttäen 1 -mm laajuinen kärki ja inkuboitiin ouabainia (0-30 pM) 24 tuntia. Haava tilaa analysoitiin ja edustettuina siirtymäarvo suhteessa muutoksen käsittelemättömistä soluista. B: muuttavien solut värjättiin Hoechst 33342 30 minuuttia, visualisoitu fluoresenssimikroskoopilla ja edustettuina keskimäärin solujen kussakin kentässä. C: Solujen invaasiota arvioitiin käyttäen siirtokuoppaan päällystetty matrigeelin kuten kohdassa

Materiaalit ja menetelmät

. 24 tunnin kuluttua solut, jotka tunkeutuivat kalvon läpi tehtiin näkyviksi fluoresenssimikroskoopilla ja edustettuina keskimääräinen solujen lukumäärä kussakin kentässä. Data edustaa keskiarvoja ± SD (n = 4). *

P

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli soluja.

ouabainia Vähentää Filopodia Formation H292-soluissa

Plasmamembraanin ulokkeita kutsutaan filopodia kasvu aikana solujen liikkumisen, ja muodostuminen filopodia on mukana syöpäsolu muuttoliike ja etäpesäkkeiden [25]. On osoittanut, että ouabainia esti muuttoliike ja hyökkäyksen soluja, me tutki tarkemmin Tämän aineen läsnäolosta filopodia in H292-soluissa. Soluja viljeltiin, kun läsnä tai poissa ouabain (30 pM) 24 tuntia, ja filopodia uloke vangittiin alle fluoresenssi ja vaihe-kontrastivaihtoehdoista mikroskoopin avulla phalloidin ja sulforodamiini B määrityksissä, vastaavasti. Kuva. 3A osoittaa, että H292 solut liikkuvat tilassa osoitti huomattavan määrän filopodia ulokkeita joka väheni dramaattisesti vastauksena ouabainia hoitoja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että vähentäminen filopodia soluissa voi, ainakin osittain, on rooli negatiivinen säätelevän roolin ouabainia. Riittävät todisteet on ilmoittanut, että filopodia muodostumista syöpäsolujen liittyy Cdc42 proteiini [26] – [28]. Koska ekspressiotaso Cdc42 osoitettiin tiiviisti liittyvän muodostumista filopodia, me tutki tarkemmin mekanismia ouabainia säätelyssä filopodia näissä soluissa määrittämällä solujen ilmentymisen Cdc42. Tulokset osoittavat, että ekspressiotaso Cdc42 dramaattisesti vähentynyt vaste ouabain hoitoja (Fig. 3B). Vaikka riittävä tämän proteiinin havaittiin käsittelemättömissä soluissa, 30 pM ouabaiini lähes poistanut Cdc42 ilmaisua. Tämä tieto viittaa siihen, että ouabainia voi vähentää muuttavien toiminta näiden solujen kautta Cdc42 vaimennus.

V: H292-soluja käsiteltiin 30 pM ouabainia (OB) tai jätetään käsittelemättä kontrollina soluja 24 tuntia. Solut värjättiin joko sulforodamiini B tai phalloidin ja visualisoitiin fluoresenssimikroskoopilla 40 x. Filopodia ulokkeet on merkitty nuolilla ja esitetään keskiarvona määrä filopodia per solu kunkin kentän suhteessa käsittelemättömiin soluihin. Data edustaa keskiarvoja ± SD (n = 4). *

P

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli soluja. B: Kun osoitettuun hoito, solut kerättiin ja analysoitiin solun jakautumisen syklin 42 (Cdc42) ilmentymisen Western-blottauksella. Täplät uudelleenseulottiin β-aktiini vahvista yhtä suuri kuormitus. Immunoblot-signaalit kvantitoitiin densitometrillä, ja keskimääräinen tietoja itsenäisestä kokeesta normalisoitiin tuloksiin. Tangot ovat keskiarvoja ± SD (n = 4). *

P

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli soluja.

ouabainia Vähentää aktivointi FAK, Akt, ja ERK kautta ROS-riippuvaisen mekanismin

Valaistaan mekanismeja syövän solun liikkuvuus inhibition ouabain, esillä oleva tutkimus määritti ilmaisun ja aktivoitu tasot proteiineja, jotka liittyvät solujen vaeltamiseen. Solut käsiteltiin myrkytön pitoisuudet ouabaiinin tai jätetään käsittelemättä, ja Akt, aktivoitu Akt (fosforyloitu Akt at Ser473) [29], FAK, aktivoitu FAK (fosforyloitu FAK on Tyr-397) [24] ja Cav-1-tasot määritettiin western blot -analyysillä. Kuva. 4 osoittaa, että solujen käsittelyä kanssa ouabainia (0-30 pM) olennaisesti alassäädetty ilmaus aktivoitua Akt ja aktivoitu FAK säilyttäen niiden ei-aktivoitua kollegansa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ouabainia häiritsi aktivoitujen taso proteiinien ja mahdollisesti säänneltyjen solumigraatio ja invaasiota estämällä Akt ja FAK loppupään polkuja. Viime aikoina me ja muut ovat osoittaneet huomattavaa roolia Cav-1 keuhkosyöpää invasiivisia ja muuttavat toimintaa. Testasimme lisäksi onko ouabainia vaimentaa soluliikkuvuus kautta laski Cav-1 tasot. Yllättäen taso Cav-1 vasteena ouabain hoitoon ei muuttunut (Fig. 4).

: H292-soluja käsiteltiin ouabain (0-30 pM) 24 tuntia. Solut kerättiin ja analysoitiin fokaalisen adheesion kinaasin (FAK), fosfo-FAK (p-FAK, Tyr397), ATP-riippuvainen tyrosiinikinaasi (Akt), fosfo-Akt (p-AKT, Ser473), ja caveolin-1 ( CAV-1) ilmentymistä Western-blottauksella. Täplät uudelleenseulottiin β-aktiini vahvista yhtä suuri kuormitus. B: immunoblot-signaalit kvantitoitiin densitometrillä, ja keskimääräinen tietoja itsenäisestä kokeesta normalisoitiin tuloksiin. Tangot ovat keskiarvoja ± SD (n = 4). *

P

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli solut.

Olemme osoittaneet, että siirtyminen syöpäsolujen on tiukasti liittyy hapettava tilan soluja. Edelliset tulokset osoittivat, että muuttava aktiivisuutta syöpäsolujen oli merkittävästi heikennetty vastauksena antioksidantti hoitoihin [30]. Selventää mahdollisen sääntelyn vaikutusta ouabainia tässä yhteydessä solut käsiteltiin antioksidantteja läsnä tai poissa ouabain ja niiden muuttavien käyttäytyminen ja solujen ROS tasot arvioitiin. Kuviot. 5A ja 5B osoittavat, että hoito tunnetut antioksidantit solun läpäisevä glutationin (GSH) ja N-asetyylikysteiini (NAC) lisäsi merkittävästi migraation ouabainia käsiteltyjä soluja, vahvistaa tehtävän ROS muuttolintujen aktiivisuuden soluja, jotka on tukahdutti ouabainia . Lisäksi, solunsisäiset ROS-tasot määritettiin soluja inkuboitiin ouabain, GSH, ja NAC. ROS havaitsee tietyn oksidatiivisen koetin osoitti, että solujen ROS lisääntynyt vastauksena ouabainia hoitoihin (10-30 pM), verrattuna käsittelemättömään kontrolliin, kun taas kumpikaan NAC eikä GSH yksin ollut vaikutusta joko soluliikkuvuus tai endogeenisten ROS tasoilla. Mikä tärkeintä, lisäys GSH ja NAC että ouabainia käsiteltyjä soluja merkittävästi tukahdutti ROS tuotanto laukaisee ouabainia (Fig. 1 C). Lisäksi olemme tarjonneet yhteyden solun ROS ja aktivoinnin tilan Akt ja FAK. Soluja esikäsiteltiin joko GSH tai NAC: n läsnä tai poissa ollessa ouabain ja tasojen Akt, aktivoitu Akt, FAK ja aktivoitu FAK määritettiin kuten edellä on kuvattu. Tulokset osoittavat, että hallinto antioksidantteja päinvastaiseksi alaspäin säätäminen vaikutus ouabainia aktivoiduissa Akt ja aktivoitu FAK, kun taas ei-fosforyloitua muotojen molemmat proteiinit pysyivät muuttumattomina (Fig. 6). Nämä havainnot eivät ainoastaan ​​tarjoa näyttöä esihapetinta vaikutus ouabainia, mutta ne osoittavat myös mahdollinen mekanismi ouabainia estossa solujen vaeltamiseen kautta ROS-riippuvaisen mekanismin.

V: kasvaneita yksikerroksiset H292-soluissa haavoittui käyttäen 1-mm leveä kärki ja inkuboitiin antioksidantteja, 1 mM solun läpäisevä glutationin (GSH) tai 5 mM N-asetyylikysteiini (NAC), läsnä ollessa tai poissa ollessa ouabain (0-30 pM) 24 tuntia. Haava tilaa analysoitiin ja edustettuina siirtymäarvo suhteessa muutoksen käsittelemättömistä soluista. B: solumigraation vangittiin mikroskoopilla. C: Solut esikäsiteltiin joko 1 mM GSH: ta tai 5 mM NAC: ssa 30 minuuttia, kun läsnä tai poissa ollessa 30 pM ouabaiinin tai ouabain (0-30 pM) yksin 0-3 h. Sitten soluja inkuboitiin dikloorifluoreseiiniliuosta diasetaatti (DCFH

2-DA) 30 minuutin ajan, ja fluoresenssin intensiteetti analysoitiin mikrolevylukijalla. Mean intensiteetti normalisoitiin käsittelemättömiin kontrollisoluihin ja edustettuina suhteellinen ROS tasoilla. Ovat keskiarvoja ± SD (n = 4). *

P

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli soluja.

#

P

0,05 vs. 30 pM ouabainia käsiteltyjä soluja.

V: H292-soluja esikäsiteltiin joko 1 mM GSH tai 5 mM NAC 30 min läsnä ollessa tai poissa ollessa ouabain (30 pM) 24 tuntia. Solut kerättiin ja analysoitiin fokaalisen adheesion kinaasin (FAK), fosfo-FAK (p-FAK, Tyr-397), ATP-riippuvainen tyrosiinikinaasi (Akt) ja fosfo-Akt (p-AKT, Ser-473), ilmentyminen Western blotting. Täplät uudelleenseulottiin β-aktiini vahvista yhtä suuri kuormitus. B: immunoblot-signaalit kvantitoitiin densitometrillä, ja keskimääräinen tietoja itsenäisestä kokeesta normalisoitiin tuloksiin. Tangot ovat keskiarvoja ± SD (n = 4). *

P

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli soluja.

#

P

0,05 vs. 30 pM ouabainia käsiteltyjä soluja.

ouabainia vähentää muuttoliike ja Invasion NSCLC H460 Cells

Voit testata, onko ouabainia kykeni inhiboimaan muuttoliikkeen muihin keuhkosyövän soluihin, käsittelimme ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä solulinja H460 kanssa ouabainia (0-30 pM) ja altistetaan solut on migraatiokokeessa. Huomattavaa on, että MTT tuloksia käyttämällä H460 soluja osoitti, että hoito ouabainia klo 0-30 pM ei aiheuttanut merkittävää vaikutusta solujen elävyys (tuloksia ei ole esitetty). Yhdenmukainen saatujen tulosten H292-soluissa, käsittely H460-solujen kanssa ouabain ilmoitettuina pitoisuuksina merkittävästi heikennetty solumigraatiota annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio. 7A). Lisäksi proteiinien ekspression ja niiden käyttöön kollegansa määritettiin. Western blotting tulokset osoittivat, että hoito ouabain samalla muuttaa aktivoitu Akt, aktivoitu FAK, ja aktivoitu ERK, kun taas ei-aktivoitu proteiineja ja Cav-1-tasot eivät vaikuttaneet hoitoa (Fig. 7B).

: kasvaneita yksikerroksiset H460 soluja haavoittui käyttäen 1 mm levyinen kärjen ja inkuboitiin ouabainia (0-30 pM) 24 tuntia. Haava tilaa analysoitiin ja edustettuina siirtymäarvo suhteessa muutoksen käsittelemättömistä soluista. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD (n = 4). *

P

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli soluja. B. Samoissa käsittelyolosuhteissa, solut kerättiin ja analysoitiin fokaalisen adheesion kinaasin (FAK), fosfo-FAK (p-FAK, Tyr-397), ATP-riippuvainen tyrosiinikinaasi (Akt), fosfo-Akt (p- AKT, Ser-473) ja caveolin-1 (Cav-1) ilmentymistä Western-blottauksella. Täplät uudelleenseulottiin β-aktiini vahvista yhtä suuri kuormitus. Immunoblot-signaalit kvantitoitiin densitometrillä, ja keskimääräinen tietoja itsenäisestä kokeesta normalisoitiin tuloksiin. Tangot ovat keskiarvoja ± SD (n = 4). *

P

0,05 vs. käsittelemätön kontrolli soluja.

ouabainia vaimentaa tuumorikasvun 3D Kasvain Sferoidiviljelmiä kunto ja Estää Solujen irrottaminen

oltuaan rooli ouabainia syövän solujen vaeltamiseen, tutkimme seuraavaksi mahdollisia sääntelyä syövän etäpesäkkeiden mukaan ouabainia.