Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MLL3 on histoni 3- lysiini 4 metyylitransferaasi tuumoriperäisten vaimennin ominaisuuksia, joka kuuluu perheeseen kromatiinin säätelygeenien mahdollisesti muuttunut neoplasia. Mutaatiot MLL3 löydettiin koko genomin analyysi paksusuolisyövän mutta niitä ei ole vahvistettu erillinen tutkimus.

Menetelmät ja tulokset

Analysoimme mutaatioita koodaavan alueen ja promoottorin metylaatio MLL3 käyttämällä 126 tapausta peräsuolen syöpä. Löytyi kaksi isoformia MLL3 ja DNA: n sekvensointi paljasti lukukehystä ja muiden mutaatioiden, jotka vaikuttavat sekä isoformia MLL3 peräsuolen syövän soluja, ja 19 134 (14%) ensisijaista peräsuolen näytteet analysoidaan. Lisäksi lukukehysmutaatioita olivat yleisempiä tapauksissa mikrosatelliitti epävakaus (31%) sekä CRC solulinjoissa ja ensisijainen kasvaimia. Suurin isoformi MLL3 on transkriptoitu CpG-saarekkeen liittyvä promoottori, joka on erittäin homologinen, jossa on pseudo-geeni kromosomissa 22 (psiTPTE22). Käyttämällä määritystä, joka mitataan sekä loci samanaikaisesti löydettiin merkittävä ikään liittyvä metylaatio normaalissa paksusuolessa (21% yksilöissä alle 25-vuotias 56% yksilöiden vanhempia kuin 70, R = 0,88, p 0,001) ja usein hypermetylaation (83 %) molemmissa CRC solulinjoissa ja ensisijainen kasvaimia. Olemme ensi tutkinut kahden loci erikseen ja todettiin, että ikä ja syöpään liittyvät metylaatio oli yksinomaan omaisuutta pseudogeenin CpG-saarekkeen ja että MLL3 loci oli metyloitumaton.

Johtopäätökset

Huomasimme, että lukukehysmutaatioita of MLL3 sekä CRC parit ja kasvain, jotka olivat yleisempiä tapauksissa microsatellite epävakautta. Lisäksi olemme osoittaneet, CpG-saarekkeen liittyvä promoottori MLL3 geenin ei ole DNA: n metylaation CRC soluissa, mutta myös primaarisen kasvaimen ja normaali paksusuoli, ja tämä alue on erittäin homologinen pseudo-geenin (psiTPTE22), joka oli ikä liittyvät DNA: n metylaation.

Citation: Watanabe Y, Castoro RJ, Kim HS, North B, Oikawa R, Hiraishi T, et al. (2011) Usein muuttaminen MLL3 lukukehysmutaatioita mikrosatelliitti Puutteellinen peräsuolen syövän. PLoS ONE 6 (8): e23320. doi: 10,1371 /journal.pone.0023320

Editor: Esteban Ballestar, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), Espanja

vastaanotettu: 10 helmikuu 2011; Hyväksytty: 15 heinäkuu 2011; Julkaistu: 11 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Watanabe et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Institutes of Health Avustukset # CA098006 ja CA105346. J-PJI on American Cancer Society Clinical Research Professor tukee antelias lahja F. M. Kirby Foundation. DNA: n sekvensointi Core Sequencing laitokseen M. D. Anderson Cancer Center tukee Core Grant # CA16672 National Institutes of Health. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta varten. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC), analysoida järjestelmällisesti 13023 hyvin selityksin ihmisen proteiinia koodaavan geenien paljasti mutaatioita 69 kandidaattigeenit [1]. Näistä histoni metyylitransferaasin geenin seka-linjan leukemia 3 (MLL3) mutatoitiin 6 tapauksessa. MLL3 on jäsenenä TRX /MLL geeniperheen ja karttoja kromosomiin 7q36.1. Se koodaa ennustettua proteiinia 4911 aminohappoa, joka sisältää kaksi kasvi homeodomains (PHD), ATPaasi alfa- /beeta allekirjoituksen, joka on suuren liikkuvuuden ryhmä, SET (suppressori kirjavassa, Enhancer of zeste, Trithorax) ja kaksi FY (fenyylialaniinin tyrosiini) rikas verkkotunnuksia. PHD ja SET verkkotunnuksia proteiinit ovat chromatin sääntelyviranomaisten ja useat niistä ovat muuttuneet syöpä [2]. Inaktivointi MLL3 hiirissä johtaa epiteelin kasvaimen muodostumista, mikä viittaa siihen, että se toimii kasvain-vaimennin-geenin [3]. Myös MLL3 on raportoitu usein poistettava myeloidileukemiat [4], [5]. Lisäksi muut raportit osoittavat somaattisten mutaatioiden MLL3 geenin glioblastooma ja haiman adenokarsinooma [6]. Kuitenkin myöhemmät raportit eivät ole vielä vahvistaneet MLL3 mutaatioita paksusuolensyöpä [7]. Siten rooli MLL3 patogeneesissä ja peräsuolen kasvainten edelleen epätäydellisesti määritelty.

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet MLL3 muutoksia paksusuolen syövän ja löysi kaksi isoformi MLL3 jonka enää isoformin on aikaisemmin tunnistamattomia CpG saari päällekkäisiä promoottori. Lisäksi olemme löytäneet uusia geneettisten muutosten CRC solulinjoissa ja myös ensisijainen kasvaimia.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tämä hyväksyi tutkimuksen University of Texas MD Anderson Cancer center ja Yonsein yliopisto Wonju Christian Hospital Institutional Review Board, ja kirjallinen lupa saatiin.

solulinjat ja näytteet

Kahdeksan peräsuolen syövän solulinjoissa (DLD1, SW48, RKO, HCT116, Caco2, SW620, LoVo ja SW480) saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Kaikkia solulinjoja pidettiin yllä tarvittaessa väliaineessa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia muovi viljelylevyillä. DNA uutettiin käyttäen standardi fenoli kloroformi menetelmällä, ja kokonais-RNA: t uutettiin korjatuista soluista käyttämällä Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) [8]. Tutkimme 72 näytettä ensisijainen Kolorektaalituumorien saatu Yonsein yliopisto Wonju Christian Hospital (Wonju, Korea) ja 54 näytteitä ensisijaisen Kolorektaalituumorien ja 8 viereisen normalisointi esiintyvät kudoksia potilailta M. D. Anderson Cancer Center (Houston, Texas). Tutkimme myös paksusuolen koepalanäytteistä alkaen 21 henkilöä, joilla ei ole suvussa paksusuolisyövän eikä paksusuolen vauriot seulonta koko kolonoskopia.

mutaatio ja DNA metylointianalyysi

DNA eristetään selvästi mikropaloitelluista syövistä analysoitiin määrittää somaattisen mutaation MLL3 käyttämällä suoraa sekvensointia, ja molemmat metylaatiostatus MLL3 ja pseudo-geenin psiTPTE22 (pseudo-geenin transmembraanisen fosfataasin kanssa tensin homologia kromosomissa 22) käyttäen bisulfiitin pyrosekvensointi [9]. Suora sekvenssianalyysi tehtiin mutaatioiden tunnistamiseksi kaikissa 59 MLL3 eksonit käyttäen sekä genomista DNA: ta ja cDNA: n kahdeksan peräsuolen syövän solulinjat, ja vahvistaa nämä sekvenssit mutaation alueilla käyttäen genomista DNA: ta kahden erilaisen ensisijaisen CRC (taulukko 1). Primer sekvenssit esitetään taulukossa S1. Kaikki alukkeet syntetisoitiin Invitrogen (San Diego, CA). PCR suoritettiin 22,5 ui Platinum PCR SuperMix High Fidelity (Invitrogen, San Diego, CA), 5 uM eteenpäin ja 5 uM reverse-alukkeita ja 10 ng genomista DNA: ta. Reaktiot suoritettiin 96 kuopan MJ -lämpöreaktoreita (MJ Research, Waltham, MA) käyttäen 30 sykliä PCR-monistamisen protokollan (denaturoida 94c 30 sekuntia, hehkuttaa 55c 30 sekuntia pidentää 68c 60 sekuntia). PCR-tuotteet sekvensoitiin suoraan MD Anderson Core Sequencing Facility.

Erilliset DNA metylointianalyysi välillä MLL3 ja psiTPTE22 geenin CpG-saarekkeiden varmistettiin bisulfaatti suoralla sekvensoinnilla jälkeen TOPO-TA kloonauksen sekä peräsuolen syövän solulinjoissa ja ensisijainen CRC. Tiedot mismatch korjaus (MMR) puutos solulinjoissa kerättiin julkaistuja [10], [11] ja tietokantaan Sanger-instituutin Cancer Genome Project (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/MSI /msi_page.shtml). Vuonna ensisijainen kolorektaalisyövän näytteitä, päätimme yhteensopimattomuuden korjauksen puutos mikrosatelliittien epävakaus (MSI) analyysi, kuten aiemmin raportoitu [12]. Kaikki alukesekvenssit ja PCR-olosuhteet on kuvattu taulukossa S1.

käänteistranskriptio-polymeraasiketjureaktio

Ensimmäisen juosteen cDNA valmistettiin käänteiskopioimalla 1 ug näytteitä kokonais-RNA käyttäen Superscript III päinvastaisessa transkriptaasia (Invitrogen, Carlsbad, CA). Reaaliaikainen kvantitatiivinen käänteistranskriptio-PCR suoritettiin käyttäen Taqman Gene Expression Assays [MLL3 eksonin raja 1 -2, Hs01005501_m1 (Probe A); MLL3 eksonin rajan 38 -39, Hs01005520_m1 (Probe B); MLL3 eksonin rajan 58 -59, Hs01005539_m1 (Probe C) ja glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi, Hs_00266705_gl (Applied Biosystems)] ja peräsuolen syövän solulinjoissa. (Kuvio 1). Ihmisen paksusuolen cDNA (BioChain, Hayward, CA) käytettiin normaalia valvontaa; ne on valmistettu normaalista paksusuolen limakalvon yhdistettiin terveistä kohteista.

MLL3 transkriboidaan kaksi erillistä promoottorit (nuolet), ja promoottorin suurempi transkripti sisältää CpG-saarekkeen, kun sellaista ei ole, että typistetty muoto. Paikoissa mutaatioiden löytyy tässä ja aiemmissa raporteissa on osoitettu nuolilla. Kukin nuoli vastaa yhden tapauksen, jossa on mutaatio, paitsi yhden alueen, jossa on useita nuolia, joka vastaa polyA-alue. MLL3 geeni koodaa ennustettua proteiinia 4911 aminohappoa, joka sisältää kaksi kasvi homeodomains (PHD), ATPaasi alfa- /beeta allekirjoituksen, joka on suuren liikkuvuuden ryhmä, SET (suppressori kirjavassa, Enhancer of zeste, Trithorax) ja kaksi FY (fenyylialaniinin tyrosiini) rikas verkkotunnuksia. Kukin mutaatioiden ensisijainen näytteet esitetty genomin rakennetta kaavion kuviossa 1.

Western-blottaus

Kanin polyklonaalista anti-MLL3-vasta-ainetta (SAB1300328 Sigma-Aldrich, St. Louis , MO)) käytettiin immunoblottauksella. Kokosolulysaateille valmistettiin kaapimalla yksisolukerrokset osaksi määrityspuskurissa ilman SDS: ää [joka sisälsi 150 mmol /l NaCI: a, 50 mmol /l Tris-HCI (pH 7,2), 1% deoksikoolihappo, 1% Triton X-100, 0,25 mmol /l EDTA (pH 8,0), proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit, 5 ug /ml leupeptiiniä, 5 ug /ml aprotiniinia, 1 ug /ml pepstatiini A: ta, 1 mmol /l fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 5 mmol /l NaF, ja 100 umol /l natriumortovanadaattia ], ja proteiini konsentraatiot määritettiin (Lowry reagenssi, Bio-Rad, Hercules, CA). Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-kalvoille (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Tilastollinen analyysi

metylointi tasot saadaan pyrosekvensointi (%) analysoitiin jatkuvana muuttuja vertailu MLL3 geenin metylaatio viittaavia tekijöitä; keskiarvo ja 95% luottamuksellisia välein (CI) laskettiin. Kaksipuolinen

P

0,05 pidettiin merkittävänä. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen PRISM 4 ohjelmistoa (GraphPad Prism, Inc., San Diego, CA).

Tulokset

Tässä tutkimuksessa löydettiin usein inaktivaation MLL3 jonka lukukehysmutaatioita vuonna mikrosatelliitti puutteellinen CRC eikä DNA: n metylaatio klo MLL3 loci tahansa paksusuolen näytteissä.

mutaatio analyysiä, me seulotaan 8 CRC solulinjoissa käyttäen PCR ja sekvensointi kaikkien 59 koodausta eksonia. Löysimme mutaatiot 5 ulos 8 solulinjojen (63,0%). MLL3 on poly-A (A)

9-suolikanavan sisällä koodaavan sekvenssin eksonissa 38, joka on sisällytetty käsitellään transkriptin; homotsygoottista lukukehysmutaatioita löydettiin RKO ja HCT116, kun taas heterotsygoottinen mutaatiot löydettiin mikrosatelliittimerkki epävakaa solulinjat SW48 ja LoVo. Nämä ovat kaikki mikrosatelliittimerkkien epävakaita solulinjoissa. Lisäksi olemme havainneet, että SW48 ja DLD1 on erilliset somaattisista mutaatioista muiden koodaavat alueet MLL3 (kuvio 1, 2A). Nämä tulokset mutaation analyysi voisi vahvistaa käyttäen cDNA (tuloksia ei ole esitetty). Seuraavaksi analysoimme 3 somaattinen mutaatio alueilla (c.8382delA (kehyksenvaihdon), c.10313G A (p.G3438D), c.13630C T (p.R4544W)) in ensin yhteen 72 ensisijaisen CRC ja löysi kehyksenvaihdon mutaatioita (A)

9 suolikanavan 10 näytettä (MSI-H, 22,9% (8/35); MSS, 5,4% (2/37)) (taulukko 1). Sitten analysoimme 9 somaattinen mutaatio alueet mukaan lukien 3 sivustot löysimme ja 6 sivustoja saapuvat Sjöblom ym. [1] erillisessä joukko 54 ensisijaisen CRC ja 21 terveen potilaan näytteet (taulukko 1). Löysimme usein mutaatioita (A)

9 suolikanavan mikrosatelliitti epävakaa CRC (28,6%, 4/14, katso esimerkkejä kuviossa 2B), mutta ei muita mutaatioita näissä näytteissä. Kokonaisuudessaan, löysimme mutaatiot 19/134 tapauksissa analysoitiin (14%). Nämä mutaatiot ovat havaittavissa monilla koodaavan sekvenssin, jossa klustereiden poly (A) ruoansulatuskanavan, vahvistettiin analyysimme Mikrosatelliittimarkkerien epävakaa kasvaimia.

(A) MLL3 on poly-A (A)

9-suolikanavan sisällä koodaavan sekvenssin eksonissa 38. Homozygous lukukehysmutaatioita löydettiin RKO ja HCT116, kun taas heterotsygoottinen mutaatiot löydettiin mikrosatelliittimerkki epävakaa solulinjat SW48 ja LoVo. Erillinen somaattiset mutaatiot löydettiin SW48 ja DLD1 c.10313G A (p.G3438D), c.13630C T (p.R4544W). (B) Heterozygous mutaatioita havaittiin samalla poly-A (A)

9-suolikanavan sisällä koodaavan sekvenssin eksonissa 38.

tutkia DNA: n metylaatio, ensin huomattava, että MLL3 transkriboidaan kaksi erillistä promoottorit, joista yksi johtaa lyhennetyn proteiinin (kuvio 1). Promoottori suurimmissa transkriptin sisältää aikaisemmin tunnistamattomia CpG-saarekkeen, mutta yksi ei ole läsnä katkaistua muotoa. Analysoimme metylaatio tämän CpG-saarekkeen kvantitatiivisin bisulfite- pyrosekvensointi (esimerkit kuviossa 3A). Kuitenkin olemme huomanneet, että CpG-saari MLL3 alue on erittäin homologinen (~92%) on CpG-saarekkeen, joka limittyy promoottorin pseudo- geeni kromosomissa 22 (psiTPTE22, pseudo-geenin transmembraanisen fosfataasin kanssa tensin homologia kromosomissa 22 : NR_001591). Itse bisulfiitti pyrosekvensointi määrityksessä pystyi monistamaan tällä alueella sekä osoittaa mahdollisuutta vääriä positiivisia. Löysimme tiheä metylaatio kaikkiaan 8 solulinjoissa tutkittiin pyrosekvensointi (HCT116, 74%: RKO, 66%: LoVo, 77%: SW48, 50%: Caco2, 79%: SW480, 65%: DLD1, 72%: SW620, 74%), ja korkea metylaation perusterveydenhuollossa CRC (45 ulos 54 tutki tai 83,3%, kuvio 3A). Metylaatio tämän CpG saaren syöpään ei ollut yhteydessä yhteisiä viittaavia tekijöitä kuten ikä, sukupuoli, sijainti ja kliininen vaihe. Mitattavissa määrin metylaatio oli läsnä viereisessä normaalissa esiintyvät limakalvo useimmat potilaat analysoidaan, mikä viittaa siihen, että tämä lokus saattaa olla kohde ikään liittyvän metylaatio [13]. Todellakin, terveillä esiintyy normaalissa paksusuolen limakalvo näytteitä, löysimme vahvan ikään liittyviä metylaatio tämän CpG-saarekkeen (

r

= 0,88,

p

= 0,0001).

(A) Esimerkki pyrogram tuloksia käyttämällä CpG-saarekkeen (aluke alueella pyrosekvensointi on esitetty kuviossa 1), jossa polymorfisen C /T korostettuna. Sequence lukee TC /TGTC /TGGAGGAGGATAAGAG, Pyrogram vasemmalla puolella shows.normal paksusuolen ja ensisijaisen CRC (oikea puoli). (B) tulos suhteellinen ekspressio normaalissa paksusuolen ja paksusuolen syövän solulinjat analysoitiin qPCR koko pituuden transkripti (Probe: Hs01005501_m1) ja seosta, jossa täyspitkän ja katkaistun transkriptien (Probe B ja C: Hs01005520_m1, Hs01005539_m1) . Suhteellinen ilmentyminen koetin A alassäädetty 5 ulos 6 solulinjojen tutkittu. Ja kaksi muista antureista (Probe B ja C) osoittavat vähäistä alassäätöä (tai jopa ylössäätöä) näissä solulinjoissa.

vieressä pyrkineet ymmärtää paremmin DNA metylaatio kahden homologisen loci suorittamalla bisulfiitti suoralla sekvensoinnilla määritykset joka voi syrjiä kaksi lokusta. Koska psiTPTE22 geeni on 10 emäsparia pienempi kuin MLL3 geenin, että alueen (kuvio 4A). Mielenkiintoista, metylaatio MLL3 geenin vaihteli 0-5% normaalissa limakalvon ja CRC-solulinjoissa lukuun ottamatta RKO (14,7%). Kuitenkin, psiTPTE22 geeni oli erittäin metyloitua paksusuolen näytteitä sekä CRC solulinjoissa ja ensisijainen kasvaimia. Lisäksi, metylaatio psiTPTE22 loci liittyi ikään liittyvä metylaation normaalissa paksusuolen limakalvossa (kuvio 4J).

(A-I) bisulfiittimodifiointi suora-sekvensointi suoritettiin käyttäen alukkeita, jotka kattavat promoottorialue sekä MLL3 ( suurempi muoto) ja psiTPTE22 eri iässä normaalin paksusuolen epitheliums (Ikä: 24, 31, 38 41, 48, 52, 68 ja 82 vuotta vanha). (J) Dots piirtämällä osoittaa yhdistyksen välillä DNA-metylaation psiTPTE22 ja kunkin näytteen ikä. Tulokset osoittavat, että psiTPTE22 metylaatio korreloi ikääntymisestä, mutta ei MLL3 (

r

= 0,830,

p

= 0,015).

tutkimiseksi ilmaisun profiilia MLL3 käytimme qPCR (kvantitatiivinen polymeraasiketjureaktio) ja kolme erilaista Taqman kattaa täyspitkän transkripti (NM 170606) ja katkaistun transkripti (NM 021230) (kuvio 1). Kuten kuviossa 3B, täyspitkän transkripti (Probe) on olennaisesti säädellä vähentävästi 5 ulos 6 solulinjoista tutkitaan, mikä viittaa geneettinen etiologia tälle hiljentäminen (kuva 3B). Sitä vastoin kaksi muista antureista (Probe B ja C), jotka tunnistavat sekä katkaistu ja täyspitkä transkriptien, osoittaa minimaalinen alassäätöä (tai jopa ylössäätöä) näissä solulinjoissa. Yhdessä tiedot osoittavat, että somaattiset mutaatiot erityisen lukukehysmutaatioita syövän hiljentää täyspitkä transkripti jättäen katkaistu transkriptio ehjä.

seuraava analysoitu kahta eri kokoa proteiinin MLL3 soluissa (sekä villityypin /kehyssiirtymän mutaatio). Proteiini analyysi tehtiin Western blot onko nämä solut voivat tuottaa sopivan MLL3 proteiinia (kuvio 3C). MLL3 on typistetty muoto on 3′-päässä. Näin ollen, olemme analysoineet MLL3 proteiinin tasolla käyttäen vasta-aineita (tätä vasta-aine oli suunniteltu keskustasta rajan MLL3 (Sigma-Aldrich, Cat. # SAB1300328 (St. Louis, MO)). Se tunnistaa vain pitkän isomuodon MLL3 proteiinituotteen.

Olemme löytäneet sopivan bändi Caco2 ja SW480, villin tyypin MLL3, ja LoVo ja SW48, heterotsygoottinen lukukehyksen, jonka MLL3 vasta-aineella. Sen sijaan ei ollut havaittavissa bändi RKO ja HCT116, molemmat homotsygoottisia että lukukehyksen. Nämä tulokset korreloivat geenin ilmentymisen tasoa ja proteiinin analyysi MLL3 (kuvio 3B, C).

keskustelu

tässä tutkimuksessa havaitsimme, usein inaktivointi MLL3 mukaan lukukehyksen mutaatioita, joita ei ollut aiemmin raportoitu.

Olemme osoittaneet, että (A)

9 suolikanavan MLL3 on mutatoitunut mismatch korjaus puutteellinen kasvaimia. Aiemmassa tutkimuksessa [1] ulkopuolelle mismatch korjaus puutteellinen kasvaimia ja silti löydetty mutaatiot 2,2%: ssa tapauksista (6/37). Sen ensisijainen kasvaimia, mutta me seulotaan mutaatioiden aiemmin raportoitu kärsivien alueiden ja löytyy vain polyA-alue mutaatioita. Olemme siis aliarvioineet tarkka mutaatioaste geenin, koska emme kulkua 59 eksonien kaikista kasvaimista. On kuitenkin selvää, että MLL3 mutaatiot muistuttavat muita tärkeitä tuumorin-vaimennin-geenin CRC – TGFBRII. Kummallekin geenille useimmat mutaatiot nähdään CRC ovat polyA-alue mutaatiot mismatch korjaus puutteellinen tapauksissa [14], mutta muutamia mutaatioita löydetään myös ulkopuolelta polyA-alue, mukaan lukien tapaukset, ilman mismatch korjaus puute. Parannuksia sekvensointiteknologioihin ja kustannukset pitäisi antaa tarkkoja lukuja MLL3 mutaatioita ensisijainen CRC lähitulevaisuudessa.

Yhdistelmä epigeneettiset ja geneettisten hiljentäminen luonnehtii useita kasvain-vaimennin ja syöpään altistavia geenejä, kuten P16, MLH1, VHL ja muut. MLL3 petollisen osoitti DNA hypermetylaation CRC soluissa, mutta myös primaarikasvainten kvantitatiivisen bisulfiitin pyrosekvensointi analyysi. Tätä määritystä analysoitiin DNA: n metylaatio CpG sivustoja +224 bp TSS mikä osoitti metylaation CRC solulinjoissa, ensisijainen kasvaimia ja normaalin paksusuolen. Kuitenkin olemme huomanneet, että noin TSS on MLL3 on erittäin homologinen (~92.0%), jolloin pseudo-geeni kromosomissa 22, joka on nimetty psiTPTE22 (pseudo-geenin transmembraanisen fosfataasin kanssa tensin homologia kromosomissa 22). TPTE (transmembraaninen fosfataasin kanssa tensin homologia) sijaitsee ihmisen kromosomissa 21 ja on monia homologisten kopiota /pseudogeenien kromosomissa 13, 15, 21, 22 ja Y [15].

Seuraava analysoinut CpG-sivuston avulla bisulfaatti suoralla sekvensoinnilla jälkeen TOPO-TA-kloonausvektoriin CRC solulinjoissa (kuvio S1A-I)) ja ensisijaisen normaalin paksusuolen näytteet (kuvio 4A-J)). Bisulfiitti suoralla sekvensoinnilla määritys kykeni erottamaan psiTPTE22 päässä MLL3 jälkeen sekvensointi koska promoottorialueen psiTPTE geenin 10 bp pienempi kuin MLL3-geeni (kuvio 4A). Huomasimme, että MLL3 osoitti vain 0-5% metylaation paitsi RKO joka metyloitu 13,0%. Toisaalta, psiTPTE22 metyloitiin välillä 65-90% kaikissa CRC solulinjoissa (kuvio 4B-I). Addtionally, psiTPTE22 oli metylaatiotasoilla normaaleissa paksusuolen kudoksiin samanlainen kuin mitä me aiemmin havaittu useita geenejä [16].

pseudogeenejä ovat kuollut sukulaisia ​​tunnettuja geenejä, jotka ovat menettäneet proteiinia koodaavan kyvyn, tai jotka muuten ei enää ilmentyvien solussa [17]. Vaikka jotkut eivät ole intronit tai promoottorit, useimmat joitakin geenin kaltaisia ​​piirteitä (kuten promoottoreita, CpG-saarekkeiden, ja liitoskohdat), ne ovat kuitenkin pidetään funktionaalinen, koska niillä ei ole proteiinia koodaavan kyky johtuvat eri geneettisestä vammautumista ( lopetuskodoneita, kehyksenvaihtoja tai puute transkriptio) tai niiden kyvyttömyys koodata RNA. Pseudogeenejä on tunnusomaista yhdistelmä homologiaa tunnetun geenin ja nonfunctionality. Se on, vaikka jokainen pseudogeenistä on DNA-sekvenssi, joka on samanlainen kuin jotkin funktionaalinen geeni, ne ovat kuitenkin kykene tuottamaan toiminnallista lopputuotteisiin [18].

Mielenkiintoista, Liang et al kuvataan, että psiTPTE22-HERV on vaiennetaan DNA: n metylaatio paitsi GI syöpiä vaan myös munuais-, maksa- ja keuhkosyövän [19]. Ja HERV liittyvät sekvenssit psiTPTE22-HERV useimmiten saumattu ulos intronia transkriptit, ja aminohapposekvenssi on 15 kDa: n proteiini ei ole homologista tahansa retroviruksen proteiineja. Nämä tekevät HERV liittyviä psiTPTE22-HERV geeni tavallisen somaattisen geeni-.

Yhteenvetona me raportoimme että MLL3 inaktivoidaan CRC geneettisellä muutos. Erityisesti olemme havainneet, että mikrosatelliittimerkkien epävakaa CRC solu siisteys on usein lukukehysmutaatioita sisällä (A)

9 suolikanavan koodausalue MLL3 aiheuttaa menetyksiä proteiinien toimintaa, ja aiemman tutkimuksen raportoinut mutaatioita ulkopuolella suolikanavan mikrosatelliitti vakaa syövissä . Lisäksi MLL3 promoottori-CpG-saarekkeen on erittäin homologinen CpG-saarekkeen, että promoottorialueen pseudogeeniä psiTPTE22. psiTPTE22 oli tiheään metylaation sekä ensimmäisen CRC ja korreloivat ikääntymisen normaaliepiteelissä muttei MLL3 (kuva 4A-J). MLL3 lakkaa toimimasta voi olla keskeinen varhaisen CRC kasvaimen kehittymisen.

tukeminen Information

Kuva S1.

bisulfiittimodifiointi suora-Sekvensointianalyysin sekä MLL3 ja psiTPTE22 metylaatiostatuksen 6 CRC solulinjoissa. (A-I) Löysimme 0-5% metylaation MLL3 kaikissa solulinjoissa. Sen sijaan pseudo-geenin (psiTPTE22) metyloitiin välillä 65-90% kaikissa solulinjoissa.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0023320.s001

(EPS)

Taulukko S1.

alukkeet käytetyt sekvenssit bisulfiitti-pyrosekvensointi ja suora-sekvenssianalyysi.

doi: 10,1371 /journal.pone.0023320.s002

(DOC) B