Krooninen sairaus

tiivistelmä

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi johtavista pahanlaatuisia syöpiä nopeaan kasvuun ilmaantuvuuden ja kuolleisuus. Toistuminen CRC jälkeen parantavaa resektion voida aina välttää ja usein tapahtuvat ensimmäisen vuoden jälkeen leikkauksen. MikroRNA voivat toimia biomarkkereina ennustaa varhaisessa toistumisen CRC, mutta niiden tunnistamiseksi yli 1400 tunnettujen ihmisen MikroRNA on haastavaa ja kallista. Vaihtoehtoinen lähestymistapa on analysoida olevaan kaavaan tietoja RNA: iden (mRNA: t), koska yleisesti ottaen ekspressiotasot MikroRNA ja niiden kohde-mRNA: ne ovat käänteisesti verrannollisia. Tässä tutkimuksessa poimimamme kuusi mRNA ekspressiotietojen CRC neljässä tutkimuksessa (GSE12032, GSE17538, GSE4526 ja GSE17181) päässä geeniekspressiota omnibus (GEO). Me päätellä microRNA ekspressioprofiileja ja suorittaa laskennallisen analyysin tunnistamiseksi MikroRNA liittyvän CRC toistuminen käyttäen IMRE perustuva menetelmä mikrokosmos tietokanta, joka sisältää 568071 microRNA kohde-yhteyksiä 711 MikroRNA ja 20884 geenikohteet. Kaksi MikroRNA, miR-29a ja miR-29c, paljastettiin ja edelleen meta-analyysi Kuuden mRNA ilmaisu aineistoja osoitti, että nämä kaksi MikroRNA olivat erittäin merkittäviä perustuu Fisher p-arvo yhdistelmä (p = 9,14 x 10

– 9 miR-29a ja p = 1,14 x 10

-6 mir-29c). Lisäksi nämä kaksi MikroRNA kokeellisesti testattu 78 ihmisen CRC näytteitä vahvistaa niiden vaikutusta aikaisin toistumisen. Meidän empiiriset tulokset osoittivat, että molemmat MikroRNA olivat huomattavasti alassäädetty (p = 0,007 Mir-29a ja p = 0,007 Mir-29c) on varhaisen uusiutuminen potilailla. Tämä tutkimus osoittaa mahdollisuutta käyttää mRNA profiilien osoittamaan MikroRNA. Olemme myös osoittaa miR-29a /c voisivat olla mahdollisia biomarkkereita CRC varhaisen uusiutuminen.

Citation: Kuo TY, Hsi E, Yang IP, Tsai PC, Wang JY, Juo S-HH (2012) Computational analyysi mRNA Expression Profiilit Osoittaa MicroRNA-29a /c Predictor paksusuolisyövän Early toistuminen. PLoS ONE 7 (2): e31587. doi: 10,1371 /journal.pone.0031587

Editor: Steve Horvath, University of California, Los Angeles, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 9. tammikuuta 2012 Julkaistu: 13 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Kuo et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Kaohsiung Medical University Hospital (KMUH98-8I04) (https://www.kmuh.org.tw/), Excellence for Cancer Research Center Grant kautta rahoitusta Department of Health, Executive Yuan, Taiwan, Republic Kiina (DOH100-TD-C-111-002) (https://science.doh.gov.tw/), ja National Science neuvosto Kiinan tasavallan (NSC 99-2320-B-037-014- MY3 ja NSC 94-2314B037-104) (https://www.nsc.gov.tw/). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi johtavista pahanlaatuiset syövät yli 500000 kuolemantapausta vuosittain maailmanlaajuisesti [1], [2]. Ilmaantuvuus ja kuolleisuus CRC Kiinan ovat lisääntyneet nopeasti viime vuosikymmeninä [3]. Nykyisin tehokas hoito CRC on parantava resektio kasvaimen kemoterapian kanssa, mutta uusiutumista voida aina välttää [4]. Niistä potilaista, joilla uusiutumisen, 40% -50% heistä tapahtuu ensimmäisen vuoden jälkeen alkuperäisen kirurgisen resektion, ja yli 90% tapahtuu neljän vuoden kuluessa [5]. Kasvaimen vaiheen ja patologiset ominaisuudet ovat yleisesti käyttää ennustamaan ennustetta ja helpottaa hoito CRC potilaiden käytännössä. Tähän mennessä ei ole saatavilla biomarkkereiden ennustaa toistumisen CRC.

Äskettäin MikroRNA on osoitettu olevan tärkeitä tekijöitä säädellä monien geenin toimintoja ihmisen syövissä [6], ja MikroRNA on ehdotettu uutena biomarkkereita syöpiä [7]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että microRNA ilmentyminen on muuttunut eri syöpien, mukaan lukien CRC-[8], [9]. MikroRNA ovat endogeenisiä lyhyitä ei-koodaavat RNA: t, jotka voivat sitoutua 3 ’transloimattomia alueita (UTR: t) niiden kohde-RNA: iden (mRNA: t). Ne toimivat posttranskriptionaalisen sääntelyviranomaisten geenien ilmentymisen [10] kautta translaation tukahduttamisen ja /tai mRNA: n hajoamisen monissa biologisissa prosesseissa kuten kehitys-, solujen erilaistuminen, soluproliferaatiota, apoptoosin ja aineenvaihdunta [11], [12]. Nämä prosessit ovat yleensä kasvaimien syntyyn liittyvien [13]. Vaikka useat tutkimukset ovat osoittaneet yhdistyksen välillä MikroRNA ja CRC kehittämiseen [14], [15], [16], [17], rooli MikroRNA ennustamisessa CRC toistuminen on tuskin tutkittu.

Lokakuuhun 2011, yli 1400 ihmisen MikroRNA on raportoitu [18], [19]. Se on haastavaa, aikaa vievää ja kallista arvioida toiminnallinen seurauksena jokaisen mikroRNA suhteessa CRC toistumisen. Tietotekniikassa on kehitetty saada enemmän tietoa mRNA ilmaisun data [20], [21], [22], [23]. Yleisesti uskotaan, että ekspressiotasot useimpien MikroRNA ja niiden mRNA tavoitteensa ne ovat käänteisesti verrannollisia, koska MikroRNA käyttää translaation tukahduttamisen tai hajoamisen mekanismi [21], [24]. Niinpä microRNA ekspressioprofiileja voidaan päätellä mRNA ilmaisun tietoja bioinformatiikka. Äskettäin IMRE on ehdotettu menetelmää [22] ennustaa microRNA ilmaisun käyttämällä mRNA aineistot ja microRNA tavoite tietokantoja. Tässä tutkimuksessa saimme kuusi mRNA ilmaisun aineistoja CRC potilasta geenien ilmentymisen omnibus (GEO). Käytimme laskennallisen analyysin ja meta-analyysi ennustaa MikroRNA liittyvän CRC toistuminen, erityisesti varhainen uusiutuminen. Lisäksi käytimme ihmisen CRC näytteitä validoiminen ehdokas MikroRNA.

Materiaalit ja menetelmät

Etsi strategia mRNA aineistoja GEO

lokakuussa 2010 etsittiin GEO ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) tutkimuksiin, jotka tarjotaan mRNA ekspressiotietojen CRC potilaista. Hakusanojen olivat ”peräsuolen syöpä” tai ”CRC” yhdistelmänä ”ihmisen [organismin]”. Kaikkiaan 110 tutkimuksissa tunnistettiin aluksi. Sitten rajoitettu määrä tutkimuksia avainsanoja ”toistuminen” ja ”uusiutuminen” niiden tiivistelmiä, joista neljä tutkimusta (GSE12032, GSE17538, GSE4526 ja GSE17181) purettu. Käytimme perin määritelty uusiutumisen näissä neljässä tutkimuksessa. Uusiutuminen oli yleisesti määriteltiin paikallisen uusiutumisen tai kaukana etäpesäke CRC sisällä seuranta-ajan, ja seuranta pituudet näissä tutkimuksissa vaihteli välillä 45,9 ja 68,6 kuukautta. GSE17181 ja GSE4526 tietoja vain ilmoitetaan kaukainen etäpesäke mutta kaksi muuta aineistoja ei täsmennetty, minkä tyyppinen uusiutumisen tietonsa. Me ladata niiden normalisoitu mRNA ilmaisun datan ja näyte tietoja GEO. GSE17538 ja GSE4526 tutkimuksissa käytettiin samaa geenien ilmentymisen alustalle (HG-U133Plus 2,0), kun taas kaksi muuta tutkimuksessa käytettiin kahta eri maissa (AceGene Human Oligo Chip 30 K ja Agilent-014950 CGH Microarray). Yksityiskohtaiset tiedot näistä ladatut aineistot on yhteenveto taulukossa 1.

suodattaminen oppiaineista ja koettimien aineistot

ladataan aineistot sisälsivät CRC potilasta eri kasvain vaihetta: vaihe II GSE17181 , vaihe III GSE4526, ja vaiheet I-IV GSE12032 ja GSE17538. Olemme valinnut vain potilaille, joilla on kasvain vaiheen II ja vaiheen III koska ne yhteenlaskettu osuus suurin osa CRC potilaista (-70%) [25], ja ne, joilla vaiheen I ja IV antaneet vain vähän tietoja. Siten yhteensä kuusi vaihespesifisiä aineistot (kolmivaiheinen II ja kolme vaiheen III aineistot) luotiin lisäanalyysiä. Koska nämä aineistot käytetään alustojen kanssa eri koettimina mRNA ilmaisun, suoritimme laadunvalvonnan näitä aineistoja käyttäen alla kahta kriteeriä. Ensin hävittää koettimet kanssa muun neljännekseen alue (IQR) pienempi kuin mediaani koko koetin-setin IQR poistamiseksi vähemmän ilmentyvät eri antureista. Toiseksi, jos geeni kuulustelivat useita koettimia, jolla on korkein IQR arvo säilyy ja loput poistettiin. Suodattamisen jälkeen menettely, yli puolet geenit suodattamalla kussakin näistä aineistot (taulukko 1).

Computational analyysi IMRE päätellä oletetun MikroRNA

IMRE menetelmä (http: //www.lussierlab.org/IMRE) on kehitetty kohdistaa microRNA ekspressiotasot mRNA ilmaisun tiedot perustuvat painotettu ja sijoittui ekspressiotasot ja otaksuttu microRNA tavoitteet [22]. Tässä menetelmässä oletetaan, käänteinen korrelaatio ilmentymistä MikroRNA ja niiden mRNA tavoitteet [26], [27]. Vaikka soveltamalla IMRE menetelmää kuhunkin datan tunnistimme joukko joko säädelty tai alassäädetty MikroRNA. Tätä menetelmää pistemäärä edustaa microRNA ilme taso laskettiin perustuen kuusi ladattua mRNA ilmaisun aineistot ja mikrokosmos tavoitteet että on microRNA kohdetietokannassa (katso alla osiossa ”Target ennustuksen tietokanta” yksityiskohtia). Yksityiskohtaiset menettelyt olivat seuraavat: (1) mRNA jokaisessa tutkimuksessa kohteena oli paremmuusjärjestykseen sen ekspressiotaso, ja sitten sijoitettiin mukaan sen sijoitus käyttäen OrderedList menetelmää [28] Bioconductor [29], ja (2) ilmaisu pisteet kukin microRNA oppiaineiden luettiin laskemalla ero keskimääräisen painotetun listalla tulokset sen kohdegeenien ja muiden kuin kohde-geenejä.

Target ennustus tietokannan

ennustaa geenikohteet tietylle microRNA, me ladannut uusimman tavoite ennustus tietokannan mikrokosmos Targets, aikaisemmalta nimeltään miRBase tavoitteet [30], [31] (mikrokosmos tavoitteet versio 5, https://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/) ja noudetaan 568071 ennusti microRNA kohde-yhteyksiä 711 ihmisen MikroRNA ja 20884 geenikohteet. Microcosm tavoitteet käyttää Miranda algoritmia, joka on yksi ensimmäisistä miRNA tavoite Ennustusalgoritmien ja yksi yleisimmin käytetty algoritmeja. Algoritmi perustuu dynaamiseen ohjelma etsii maksimaalisen paikallisen täydentävät rinnastuksia. Validoida mikrokosmos tietokanta, vertasimme tuloksia välillä mikrokosmos Tavoitteet ja miRNome jota käytettiin tutkimuksessa GSE6631 [22]. Lisäksi käytämme myös Miranda [32] ja TargetScan [33] vahvistaa ehdokkaan MikroRNA ehdotti mikrokosmos tietokantaan. Mikrokosmos tietokanta tuotti enemmistö MikroRNA (mukaan lukien syy yksi), joka havaittiin alkuperäisessä tutkimuksessa [22] (taulukko S1). Toinen etu käyttää mikrokosmos tavoitteet oli, että uusin versio (tavoitteet julkaisuversio v5) sisältää enemmän MikroRNA kuin miRNome (tuotettu vuonna 2007). Niinpä käytimme mikrokosmos tietokantaan myöhempää tutkimuksiin.

Tilastollinen analyysi

Kun olet laskenut pisteet joka edustaa ekspressiotasot kunkin mikroRNA kunkin oppiaineen, me listattu mahdollisia MikroRNA joka voisi erillisiä uusiutuminen ei-toistuminen CRC potilaista. Jokaisen microRNA, empiirinen p-arvo saatiin käyttämällä 1000 permutaatiot. Cutoff p valittavia arvoja mahdollisten MikroRNA asetettiin olemaan yhtä suuri tai pienempi kuin 0,1. Käytimme tätä liberaali arvon vähentämiseksi tyypin II virheen alustava analyysi. Analyysi suoritettiin käyttäen R tilastollinen paketti Bioconductor paketti Twilight [34], [35].

Vähentää tyypin I virhe, me edelleen yhdistetty tulokset kuudesta aineistot käyttämällä meta-analyysi alun perin valitut MikroRNA. Cochranin Q tilastoa käytettiin testaamaan heterogeenisuus näitä aineistoja. Meta-analyysi suoritettiin perustuen vaikutuksen koko (ero ennakoidut tulokset välillä toistuvat ja ei-toistuvat CRC potilasta) ja keskivirhe. Yleinen vaikutus koko ja 95%: n luottamusväli (95% CI) on raportoitu. Tunnistaa merkittävimmät microRNA että pienin globaali p arvoa ja edelleen lisätä voimaa, teimme yhteisen analyysin yhdistämällä raaka p-arvot perustuvat Fisherin yhdistelmä p-arvot [36] kanssa cutoff p-arvo on 5 x 10

-5 (~0.05 /711, 711 MikroRNA).

Bench kokeita vahvistaa havainnot

Voit tarkistaa ehdokkaan MikroRNA edellä olevien laskentamenetelmä ja meta-analyysi, me lisäverinäytteet 78 CRC tuumorikudoksista klo Kaohsiung Medical University Hospital. Ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia nämä 78 potilasta on esitetty taulukossa S2. Nämä näytteet saatiin kirurgisesti CRC potilailla, joilla on UICC vaiheissa I-III ja jäädytettiin nestemäisessä typessä -80 ° C: ssa. Jotta vältettäisiin mahdollinen vaikutus neoadjuvant hoidon microRNA ilmaisua, kaikki potilaat eivät suoriteta neoadjuvant hoidon kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen leikkausta. Kirjallinen suostumus saatiin kunkin potilaan ja tutkimussuunnitelman hyväksyi Institutional Review Board of Kaohsiung Medical University Hospital. Nämä 78 potilasta ryhmittyneet varhainen uusiutuminen (43 tapausta) ja ei-varhainen uusiutuminen ryhmät (35 kontrollit). Ei ole mitään merkittävää eroa iän ja sukupuolen näiden kahden ryhmän välillä. Varhainen toistuminen määriteltiin paikallisen uusiutumisen (kasvaimen kasvua rajoitetaan anastomosis tai alueen ensisijainen toiminta) tai kaukana etäpesäke (kaukainen etäpesäke tai hajanainen vatsakalvon kylvö) sisällä 1 vuoden kuluttua radikaali resektio [5], [24], [37] . Non-varhainen uusiutuminen määriteltiin toistuminen 1 vuoden kuluessa. Huomattakoon, että joitakin ei-aikaista toistuvia potilailla voi olla uusiutumisen kuin seurannan jatkuu.

Noin 100 mg kudosta homogenoitiin käyttäen penkki-top-homogenisaattorilla (Polytron PT1600E, Kinematica AG, Luzern, Sveitsi) vuonna 1 ml TRIzol-reagenssia (Invitrogen) ja puhdistettiin Qiagen RNAeasy Pylväät (Qiagen). Olemme uuttaa ja puhdistaa koko RNA: t kunkin kasvainkudoksen, ja TaqMan microRNA RT-qPCR (Applied Biosystems) määritykset käytettiin määrällisesti microRNA ekspressiotaso. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen Applied Biosystems 7500 Sequence Detector System. Kaikkien reaaliaikainen PCR reaktiot suoritettiin kolmena rinnakkaisena. U6b käytettiin sisäisen valvonnan, koska se on yleisesti käytetty sisäisen valvonnan microRNA ilmaisun normalisoinnin ja myös siksi U6b on osoitettu suhteellisen vakaa perusta meidän talon data. Suhteellinen ilmentymistason mikroRNA laskettiin käyttäen yhtälöä, log

10 (2

-ΔCt), jossa ACt = (CT

miR-CT

U6b). Keskiarvo log

10 (2

-ΔCt) ja sen keskihajonta (SD) laskettiin myös. Vertasimme ero microRNA ilmentymisen tasojen aikaisin ja ei-aikaista toistuvat ryhmät riippumattomat t-testiä ja useita ANCOVA analyysi säätö iän, sukupuolen ja vaihe kasvaimen. Meidän kokeelliset tiedot jaettiin kahteen ryhmään sen mukaan, mediaani kunkin miR-29a ja miR-29c dataa. Kaplan-Meier-menetelmää käytettiin havaitsemaan suhde uusiutumisen ajan leikkauksen jälkeen ja kahtia miRNA ilmaisun. Merkitsevyystasolla asetettiin 0,05. Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SAS9.1.

Tulokset

tunnistaminen miR-29a ja miR-29c ehdokkaaksi MikroRNA CRC uusiutumisen

Soveltamalla IMRE menetelmää kuusi riippumatonta CRC mRNA microarray aineistoja tunnistimme neljä MikroRNA (miR-29a, miR-29c, miR-100 ja miR-627) siinä vaiheessa II aineistot ja kolme MikroRNA (miR-29a, miR-29c ja miR-363) siinä vaiheessa III aineistoja ap arvo ≦ 0,1 (taulukko 2). Niistä miR-29a ja miR-29c oli ilmoitettu sekä vaiheen II ja III aineistoja. Kuvio 1 osoittaa, että miR-29a oli suurempi pistemäärä on toistuva potilailla (merkitty 1) kuin ei-toistuvat potilailla (merkitty 0) kaikissa kuudessa aineistoja. Koska pisteet laskettiin joukko miR-29a kohdegeenien ’ilme arvot, korkeampi pisteet tarkoittaa, että nämä tavoitteen geenit säädellään ylöspäin uusiutumisen ryhmässä. Toisin sanoen käänteinen korrelaatio välillä microRNA ja sen kohdegeenin osoitti, että miR-29a oli alassäädetty toistumiseen ryhmässä ja siten se voi olla rooli tuumorisuppressorina CRC. Samanlainen malli havaittiin myös miR-29c (tuloksia ei ole esitetty). Tässä tutkimuksessa emme tunnistamaan sääteli microRNA pääsisivät määritelty cutoff pisteen (P ≦ 0,1) välillä toistuvat ja ei-toistuvat potilaita kaikissa kuudessa aineistoja.

y-akseli on pisteet edustava ekspressiotasot miR-29a ja x-akseli on ryhmien kanssa ja ilman toistumisen CRC. Ryhmä ”1” tarkoittaa toistumisen ryhmään ja ”0” tarkoittaa ei-toistuminen ryhmä. Lukemat laskettiin joukko miR-29a kohdistettu geenien ilmentymisen arvot, korkeampi pisteet tarkoittaa, että nämä kohdennetut geenit olivat säädellään ylöspäin uusiutumisen ryhmässä ”1” kantavassa samansuuntainen todettiin miR-29c.

Meta-analyysi miR-29a ja miR-29c

Me tehdään meta-analyysi arvioida intensiteetti yhdistysten välillä MikroRNA ja toistumisen CRC (kuva 2) . Käyttämällä meta-analyysi, odotimme saada yleistä ja luotettavampia tuloksia. Satunnaisen efektimalli osoitti vaikutus koko 213,36 (95% CI: 147,38-279,34) Mir-29a ja vaikutus koko 176,91 (95% CI: 111,63-242,18) Mir-29c. Todellakin, kiinteä vaikutus mallissa tuotti samat tulokset. Fisherin yhdistelmä p-arvot osoittivat p = 9,14 x 10

-9 Mir-29a ja p = 1,14 x 10

-6 Mir-29c. Ei ollut merkittävää välillä-aineisto heterogeenisuus kahden MikroRNA (p = 0,59 Mir-29a ja p = 0,69 Mir-29 c).

meta-analyysissä, vaikutus koko (ero ennakoidut tulokset välillä toistuvat ja ei-toistuvat CRC potilasta) ja keskivirhe laskettiin jokaiselle tutkimus. Kokonaisvaikutusta koko ja 95%: n luottamusväli (95% CI) on raportoitu p-arvot arvioidaan perustuen Fisherin yhdistelmä p-arvot [36].

analysoidaan sitten lisää mRNA: t ja niiden väyliä suhteessa CRC toistuminen saada lisää tietoa taudin synnyssä. Ensin lueteltu top 10 polkuja rikastettu miR-29a /29c kohdegeenien (taulukko S3). Sitten me lueteltu alkuun kohdegeeneissä jotka merkittävimmin liittyy CRC uusiutumisen GEO aineisto (taulukot S4). Cdc42, joka on mukana 3 suurta väyliä (katso taulukko S3), oli merkitsevästi erilainen toistuvien ja kertaluonteisten potilaalla (yhdistettynä p = 0,00053).

miR-29a ja miR-29c ekspressiotaso CRC näytteissä

lisäverinäytteet 43 CRC potilaiden varhaisen uusiutuminen ja 35 potilasta ei-aikaista toistuminen validoimiseksi miR-29a ja miR-29c osalta ennustamiseen CRC aikaisin toistumisen. Huomasimme, että molemmat miR-29a ja miR-29c oli huomattavasti pienempi ekspressiotasot alussa uusiutumisen ryhmässä kuin ei-varhainen uusiutuminen ryhmä (molemmat p-arvot olivat 0,007 oikaisun jälkeen sukupuolen, iän ja syövän vaihe). Molemmat MikroRNA säilyi merkitsevänä senkin jälkeen ilman 10 koehenkilöä (8 kuin varhain aiheita ja 2 varhainen aiheet) syövän vaiheen I (taulukko 3). Meidän empiiriset tulokset yhtyi havainnot laskennallisen analyysin perustuvat mRNA microarray aineistoja, mikä osoittaa, että kaksi MikroRNA tärkeä rooli varhaisessa uusiutumisen CRC. Vuonna Kaplan-Meier-analyysi, osoitimme, että joko korkean miR-29a tai miR-29c oli parempi eloonjäämisen 12

th kuukaudessa, mutta vain miR-29a voisi merkittävästi ennustaa varhaisessa toistumisen (kuva S1). Epäonnistuminen ennustuksen miR-29c on Kaplan-Meier-analyysi voi johtua lyhyen seurantaa tai sopimattoman cutoff johtuen pieni otoskoko.

Keskustelu

tutkimus MikroRNA on alkanut uuden aikakauden parempi käsitys tautimekanismien. Kuitenkin rooli MikroRNA uusiutumisen CRC ei ole vielä selvä. Tässä tutkimuksessa tunnistimme miR-29a ja miR-29c tärkeänä ehdokkaita käyttämällä nerokas menetelmä, joka priorisoitu ehdokas MikroRNA julkisesti saatavilla genominlaajuisten geeniekspression aineistoja. Käyttämällä meta-analyysi julkisesti saatavilla aineistoja ja kokeellinen vahvistus, me mitata suoraan ja validoitu miR-29a ja miR29c prediktiivisinä CRC aikaisin toistumisen. Tietääksemme nämä kaksi MikroRNA ei ole raportoitu liittyvän varhain toistumisen CRC.

päätellä microRNA ilmaisua, me soveltanut IMRE menetelmän yhdistelmällä mikroRNA kohde ennustuksen ja mRNA: n ilmentymisen tiedot. Suurin etu tässä menetelmässä on käyttää julkisia mRNA ilmaisun aineistoja tunnistamiseksi otaksutun MikroRNA liittyvien sairauksien kiinnostava. Kuitenkin vankka arviointi varten microRNA ilme riippuu myös luotettava kohde ennusteen tietokantaan. Tässä käytimme mikrokosmos tavoitteet ennustamisessa mikroRNA kohdegeenien. Emme käytä liitto yhdistelemällä eri ennustaminen algoritmeja, kuten miRNome, koska se todennäköisesti vähentää valta johtuu monista väärin ennustivat tavoitteita. Lisäksi mikrokosmos Targets, me myös käyttää vielä kaksi ennustus tietokantoja, Miranda [32] (elokuu 2010 release hyvät mirSVR pisteet, säilyneitä microRNA) ja TargetScan [33]. miR-29a ja miR-29c oli osoitettu myös näiden kahden microRNA ennakoivaa ohjelmisto olla mukana CRC toistuminen, mikä osoitti kestävyydestä IMRE menetelmän. Kuitenkin merkitys taso oli alhaisempi käyttämällä Miranda (p = 0,0173 Mir-29a ja p = 0,00197 Mir-29c in p arvoyhdistelmä) kuin mikrokosmos Targets (p = 9,14 x 10

-9 Mir-29a ja p = 1,14 x 10

-6 mir-29c). Syynä voi johtua enemmän ennusti tavoitteita Miranda kuin mikrokosmos tavoitteet.

Merkittävä edistystä on tunnistaa assosiaatioita MikroRNA ja useiden yleisten sairauksien, mutta se on edelleen kallista suorittaa genominlaajuisten ilme array paljastaa taudin liittyviä MikroRNA. Vaikka käyttämällä bioinformatiikan työkaluja, kuten IMRE menetelmä voi vähentää ehdokkaiden ja priorisoida nämä ehdokkaat, suuri määrä vääriä positiivisia ovat väistämättömiä. Tässä tutkimuksessa olemme huomanneet, että jotkut erittäin merkittäviä MikroRNA ennusti tätä kautta laskennallisen analyysin yhdessä aineisto ei voitu toistaa muissa aineistoja. Sen sijaan käyttää konservatiivinen Bonferroni korjaus, analysoimme useita aineistoja tunnistaa yhdenmukaisia ​​MikroRNA vähentää tyypin I virhe. Kokeilu Ihmisen näytteistä varmistettiin lisäksi in silico havainto.

Tuloksemme osoittavat, että alas-säätely miR-29a ja miR-29c liittyy varhainen toistumisen CRC. Alas-sääntely miR-29 perhe on raportoitu eri ihmisen syöpiä, kuten keuhkosyöpä [38], eturauhassyöpä [39] ja invasiivisen rintasyövän [40]. Tuore tutkimus on osoittanut, että miR-29 on mukana p53-reitin, tärkeä tuumorisuppressoriproteiinia säädin [41]. MiR-29 aktivoi p53 ja indusoi apoptoosin kautta tukahduttaminen Cdc42 ja p85α [41]. Analyysimme Mir-29 tavoitteet ehdotti, että Cdc42 (yhdistetty p-arvo = 0,00053 taulukossa S4) ja muut mRNA: t ovat todennäköisesti mukana mahdollisen reitin CRC kehitystä. Lisäksi mutantti muoto p53 havaittiin 51-74% kaikista CRC ja muiden ihmisen kasvaimissa [42]. Edellä esitetyt tutkimukset tarjoavat biologiseen uskottavuuteen tukemaan roolia miR-29 perheen tukahduttamaan CRC toistuminen.

Lisäksi MikroRNA, toistumisen CRC voitaisiin myös vaikuttaa kasvaimen vaiheet ja ajan seuraavat up. Vuonna laskenta analyysi, me vain keskittyneet CRC potilaalla on kasvain vaiheen II ja vaiheen III koska ne edustivat enemmistön CRC potilaista. Vain harvat potilaat vaiheessa Kehitin toistumisen ja useimmat potilaat vaiheessa IV kehittynyt uusiutuminen leikkauksen jälkeen johtaa vähemmän hyödyllistä tietoa tutkimuksemme. Vaikka empiirinen Tutkimuksessa käytettiin varhain toistumisen (ts uusiutuminen tapahtuu 1 vuoden kuluttua leikkauksen) kuin fenotyyppi edun viimeaikaiset raportit osoittivat, että 40-50% uusiutumista käyvät ilmi ensimmäisen vuoden jälkeen alustavan resektion, ja aika alkuperäisestä hoito uusiutumiseen liittyy vahvasti selviytymisen [43] meidän kokeellisia tuloksia ihmisen näytteistä varhaisen uusiutuminen yhtyi toteamukseen siitä laskennallisen analyysin, joka perustui potilaiden seurantaan 3-6 vuotta, mikä osoittaa, että kokeellinen havainto on vähemmän todennäköisesti vaikuttaa seurannan pituus.

validoitu miR-29a ja miR-29c biomarkkereina CRC aikaisin toistumisen. Muut kolme MikroRNA (miR-100, miR-627 ja miR-363) oli myös tunnistetaan laskennallisen analyysin mutta ne olivat ainoa merkittävä potilailla joko vaiheen II tai III vaihe. Siksi niitä ei tutkittu tarkemmin tässä tutkimuksessa takia huonompi etuoikeus kuin miR-29. Meidän rajoitettu määrä kokeiluista voi myös ole riittävä teho analysoida nämä kaksi MikroRNA jotka ovat merkittävä vain yksi syövän vaiheessa. Koska tärkein Tämän tutkimuksen tarkoituksena on osoittaa toteutettavuus tämän laskennallisen lähestymistapa tunnistaa hyödyllinen MikroRNA analysoimatta nämä kolme mahdollista MikroRNA ei merkittävästi vähentää tieteellinen panos Tutkimuksemme.

Johtopäätöksenä tässä tutkimuksessa osoittivat tehokkaan strategian yhdistämällä in silico analyysi ja empiirinen koe ehdottaa microRNA-29a ja microRNA-29c mahdollisina biomarkkereita ennustaa varhaisessa uusiutumisen CRC. Käyttämällä näitä biomarkkerit voivat sallia terveys tarjoajat ja potilaat ottamaan tehokkaampi tapa estää CRC toistumisen. Lisäksi tutkimuksemme tarjoaa myös suuntaa lisätutkimuksen mekanismia toistuvia CRC.

tukeminen Information

Kuva S1.

Koehenkilöt kahtia olla korkea tai matala microRNA tasojen mukaan mediaani 1,39 Mir-29a ja 0,58 Mir-29c. Kiinteä viiva osoittaa korkean tason ryhmän ja katkoviiva tarkoittaa alhainen ryhmää.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0031587.s001

(DOC) B Taulukko S1.

Merkittävät MikroRNA p-arvojen ja väärien löytö määrä (FDR) [1], [2] miRNome ja mikrokosmos omat tavoitteet GSE6631. Suurin osa merkittävistä MikroRNA (mukaan lukien syy yhden, miR-204, merkitty alaviiva linja) osoitettiin molemmat kaksi tavoite ennustus tietokanta, miRNome ja mikrokosmos tavoitteet, vuonna GSE6631.

Doi: 10,1371 /journal.pone. 0031587.s002

(DOC) B Taulukko S2.

ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia 78 kolorektaalisyövän potilaalla.

doi: 10,1371 /journal.pone.0031587.s003

(DOC) B Taulukko S3.

Top 10 rikastettua polkuja kanssa miR29a tai miR29c kohdegeenien analysoidaan MetaCore reitin analysointijärjestelmä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0031587.s004

(DOC) B Taulukko S4.

Merkittävä yhdistys mir-29a /29c kohdegeenien kanssa toistuminen CRC että aineistot.

doi: 10,1371 /journal.pone.0031587.s005

(DOC) B