Krooninen sairaus

tiivistelmä

Syöpäsolut pääasiassa käyttää Glykolyysivaiheen ATP tuotantoa jopa läsnäollessa runsas hapen, ympäristö, joka normaalisti johtaa energian tuotantoa oksidatiivinen fosforylaatio . Vaikka molekyylitason mekanismia metabolisen kytkin aerobinen Glykolyysivaiheen ei ole täysin selvitetty, on todennäköistä, että mitokondrioiden vauriot elektroninsiirtoketju ja tuloksena lisääntynyt reaktiivisten hapen lajien merkittäviä voimat. Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet roolia transkriptiotekijä Ets-1 säätelyssä mitokondrioiden toimintaa ja aineenvaihduntaa. Ets-1 yli-ilmentynyt käyttäen stabiilisti sisällyttää tetrasykliini-indusoituva ekspressiovektorilla munasarjasyövän solulinja 2008, joka ei ilmennä havaittavissa pohjapinta tasoja Ets-1-proteiinin. Mikrosiruanalyysi vaikutusten Ets-1 yli-ilmentyminen näissä munasarjasyöpäsoluja osoittaa, että Ets-1 up-regulation avain osallistuvien entsyymien Glykolyysivaiheen ja liittyvän syöttöliikenteen polkuja, rasvahappojen aineenvaihduntaan, ja antioksidanttipuolustuksen. Sen sijaan, Ets-1 down-regulation geenien sitruunahappokierron, elektroninsiirtoketju, ja mitokondrioiden proteiineista. Tällä toiminnallisella tasolla, olemme havainneet, että Ets-1 ekspressio suoraan korreloi solujen hapenkulutus jolloin lisääntynyt ilmentyminen aiheuttaa vähentynyt hapen kulutusta. Ets-1 yli-ilmentymisen on myös aiheuttanut lisääntynyttä herkkyyttä glykolyyttiset estäjät, sekä kasvun estäminen glukoosista köyhdytettyä kulttuurin ympäristössä. Yhdessä meidän havainnot osoittavat, että Ets-1 osallistuu säätelyyn solujen aineenvaihduntaa ja vastaus oksidatiivista stressiä munasarjasyöpäsoluja.

Citation: Verschoor ML, Wilson LA, Verschoor CP, Singh G (2010) Ets- 1 säätelee energia-aineenvaihdunta syöpäsoluissa. PLoS ONE 5 (10): e13565. doi: 10,1371 /journal.pone.0013565

Editor: Jen-Tsan Ashley Chi, Duke University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 4. kesäkuuta, 2010 Hyväksytty: 24 syyskuu 2010; Julkaistu 22 lokakuuta 2010

Copyright: © 2010 Verschoor et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat apuraharahoitusta Kanadan Institutes of Health Research (CIHR). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Yli 50 vuotta sitten, Otto Warburg ensimmäinen ehdotti, että mitokondriaalisen vamma, joka johtaa masentunut elektroninsiirtoketju toiminta ja hengitysteiden vikoja on tärkeä askel kehittymistä ja etenemistä syövän [1], [2]. Kahden viime vuosikymmenen aikana monet tutkimukset ovat osoittaneet, että kasvaimia ensisijaisesti käyttävät Glykolyysivaiheen energiantuotantoon yli oksidatiivinen fosforylaatio, ominaisuus, joka on tullut tunnusmerkki kasvain patofysiologian [3] – [5]. Tunnetaan Warburg vaikutus, syöpäsolut pääasiassa käyttää Glykolyysivaiheen ATP tuotantoa jopa läsnäollessa runsas hapen, ympäristö, joka normaalisti johtaa energian tuotantoa oksidatiivisen fosforylaation [2], [6]. Muutokset mitokondrioiden DNA vastaavat lisääntyneeseen tuotantoon ROS ja heikentynyt oksidatiivinen fosforylaatio, mikä laski ATP tuotanto ja lisääntynyt glykolyyttiset riippuvuus [5], [7]. Lisääntynyt reaktiivisten hapen lajien, erityisesti H

2O

2, jonka syöpäsolut on todennäköisesti seurausta mitokondrioiden toimintahäiriö, kuten mitokondriot katsotaan olevan vallitseva solujen lähde reaktiivisten hapen lajien [8]. Neljästä viiteen prosenttia O

2 kuluttamaan oksidatiivisen fosforylaation mitokondrioita on yleensä muunnetaan reaktiivisia happiradikaaleja; Näin ollen virhekuvioita elektroninsiirtoketju järjestelmän syöpäsoluissa johtaisi liialliseen reaktiivisten happiradikaalien muodostumista [8] – [10]. Liian tuotetaan, H

2O

2 voi toimia signalointimolekyylin hapettamalla kysteiini-molekyylien proteiineihin, aktivoivat useita signalointireittejä, kuten MAPK, sekä useita transkriptiotekijöitä, mukaan lukien AP-1, p53, NF-KB, ja Ets-1 [11] – [15].

Ets-1, jäsen Ets proteiinin perheen transkriptiotekijöiden, säätelee ilmaus monipuolisia proteiinien kautta vuorovaikutuksessa erityisten konsensussekvenssejä ylävirtaan kohdegeenien [16]. Yli-ilmentyminen Ets-1 on liittynyt useita eri syöpiä, erityisesti mitä tulee taudin etenemiseen ja invaasio [16] – [19]. Lisäksi yli-ilmentyminen Ets-1 on myös yhteydessä huonoon ennusteeseen rinta- [20], munasarjojen [21], ja kohdunkaulan karsinoomien [22]. Perinteisesti Ets-1 ajatellaan toimivan transkriptioaktivaattorina ja sen voimakasta ilmentymistä endoteeli- ja stroomasoluissa korreloi kasvainsolun invasiivisuus ja epäsuotuisa lopputulos munasarja- ja rintasyövän [23] – [25]. Laboratoriossamme ja että muut ovat korosti Ets-1 sääntelyssä eri osa syöpäsolujen käyttäytymistä, kuten soluväliaineen remodeling, invaasio, angiogeneesi [26], ja lääkeresistenssin [27]. Välinen yhteys Ets-1 ja syövän invasiivisuuden voidaan mahdollisesti selittää luettelon tunnettujen kohdegeenien säätelee tämän transkriptiotekijän. Useita MMP: ja integriini-geenit, samoin kuin urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA), jotka kaikki ovat tunnettuja välittäjäaineita soluväliaineen hajoamisen ja solujen vaeltaminen, ovat tunnettuja tavoitteet Ets-1 [28] – [31]. Monet geenit ratkaiseva angiogeneesin ja soluväliaineen remodeling, kuten metalloproteinaaseja (MMP-1, MMP-3, MMP-9), uPA ja Integrinβ3, ovat suoraan sääntely Ets-1 [26]. Tämä transkriptiotekijä Näin ollen katsotaan olevan tärkeä välittäjä syöpäsolun kehitystä ja syövän etenemiseen.

Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että Ets-1 on rooli säätelyssä energia-aineenvaihdunnan munasarjasyöpäsoluja. Käyttämällä suurikapasiteettisten genomista analyysiä, olemme havainneet, että Ets-1 säätelee joko suoraan tai välillisesti, useita tärkeitä geenejä mukana mitokondrion aineenvaihdunnan ja antioksidanttipuolustuksen reittejä meidän Ets-1 yli-ilmentyminen munasarjasyöpäsolu malli. Toiminnallisesti, olemme osoittaneet, että glykolyysi, oksidatiivinen fosforylaatio, ja solujen hengityselimiin on muutettu vasteena muutoksiin Ets-1 ilmentymisen. Yhdessä meidän havainnot osoittavat, että Ets-1 on keskeinen transkriptiotekijä mukana säännellä aineenvaihduntaa ja oksidatiivisen stressin syöpäsoluissa.

Tulokset

syöpäsolun malli Ets-1-geenin ilmentymisen

Ets-1 oli yli-ilmentynyt 2008 munasarjasyöpäsoluja käyttäen tetrasykliini-indusoituva järjestelmä, tuottaa 2008-Ets1 soluja. Ets-1-proteiinin ekspression tetrasykliini-käsiteltyjen 2008 ja 2008-Ets1 tutkittiin kautta Western-blottauksella (kuvio 1). Ets-1-proteiinin ekspressio ei ollut havaittavissa 2008 kokosolulysaateista, mutta helposti havaittavissa, että indusoidun 2008-Ets1 lysaattia. Lisääntynyt Ets-1 ekspressio havaittiin olevan spesifinen vaikutus kuin proteiinin tasot kahden samanlaisen Ets perheenjäseniä, Ets-2 ja PEA3 ei ole muutettu tässä mallissa Ets-1 yli-ilmentymisen (kuvio 2).

2008 munasarjasyöpäsoluja transfektoitiin stabiilisti yli-ilmentävät Ets-1 on tetrasykliiniä indusoituva järjestelmä. Proteiinin ilmentyminen 2008 ja 2008-Ets1 soluihin mitattiin kautta Western blot induktion jälkeen tetrasykliiniä (n = 3).

proteiini ilmentymistä ETS perheen transkriptiotekijöiden (A) Ets-2 ja (B ) PEA3 verrattiin vuonna 2008 ja 2008-Ets1 munasarjasyöpäsoluja spesifisyyden määrittämiseksi meidän Ets-1 ilmentymisen malli. Western blot-analyysi osoitti, että kumpikaan näistä transkriptiotekijöiden vaikuttivat Ets-1 ilmentymisen 2008 soluissa.

Ets-1 säätelee aineenvaihdunnan geeniekspression

mikrosiruanalyysi 2008 ja 2008- Ets1 solut paljasti, että 3131 geenit 28869 geenit tutkittiin oli säädelty tai alassäädetty vastauksena Ets-1 yli-ilmentymisen vähintään 1,45-kertainen (p≤0.001) (GEO tietokanta liittymistä # GSE21129). Tätä tutkimusta varten olemme valinneet raportoida ja tutkia muutoksia valittu mRNA: ita, joiden tehtävät ovat merkityksellisiä mitokondrioiden toimintaan, solujen aineenvaihduntaan ja oksidatiivisen stressin. Reaaliaikainen qRT-PCR validointi suoritettiin käyttäen 10 kohdegeenien edustavat eri kertamuutos arvoja, ja tulokset normalisoitiin 4 erillistä siivous geenejä. Vaikka sekä PPARg ja SDHB geeniekspression 2008-Ets1 solut eivät merkittävästi poikkea 2008 soluista, taitos muutokset määritetään reaaliaikainen qRT-PCR liittyivät mikromatriisi kertaiseksi muuttuu korrelaatiokertoimeksi 0,99 (taulukko 1). Siksi kertamuutoksia suurempi kuin 1,45 katsottiin olevan voimassa tuloksia ja olivat mukana tässä tutkimuksessa.

ilmentyminen G6PD, PDHA, HK, ja CYC tutkittiin Western blottauksella onko geeni ilmaisu havaitut erot olivat myös läsnä proteiinin tasolla. Emme löytäneet mitään merkittäviä eroja proteiiniekspressiossa vuosien 2008 ja 2008-Ets1 soluja tahansa tutkittujen entsyymien (tuloksia ei ole esitetty).

Glykolyyttinen kyky syöpäsolujen säätelee Ets-1

Microarray-analyysi 2008-Ets1 munasarjasyöpäsoluja paljasti, että Ets-1 on osallisena säätelyssä mitokondrioiden stressiä ja toimintahäiriöitä kuten metabolisen geenejä, jotka ovat mukana Glykolyysivaiheen, glykolyyttisissä syöttölaite polkuja, TCA sykli, ja rasva-aineenvaihdunnan (taulukko 2), ja geenit, jotka osallistuvat antioksidanttipuolustuksen (taulukko 3) on muutettu Ets-1 yli-ilmentäviä soluja. Sen arvioimiseksi, solut vakaana-ilmentyminen Ets-1 eduksi Glykolyysivaiheen yli oksidatiivinen fosforylaatio energian, kuten on ennustettu meidän mikrosiruanalyysillä, soluja kasvatettiin glukoosi-vapaa-alusta täydennettynä glykolyyttisellä estäjän 2-DG, analoginen glukoosia. Soluja kasvatettiin, kun läsnä on vaihtelevia määriä 2-PO, ja tyypillinen kasvukäyrät muodostettiin kunkin solulinjan. Solujen kasvua väliaineessa, joka sisälsi 2-DG estyi suuremmassa määrin soluihin, joissa on suurempi Ets-1 ilmentymisen kuin vanhempien soluissa (kuvio 3A). 2-DG IC

50 annosta, tai annokset jossa 50% soluista oli lakannut lisääntyvissä, laskettiin 4 itsenäisestä kokeesta. Tuloksemme osoittivat, että 2008-Ets1 solujen indusoidut tetrasykliiniä olivat herkkiä 2-DG, jossa IC

50 0,75 mM, mikä oli huomattavasti pienempi kuin vanhempien 2008 solut, IC

50 4,29 mM ( p≤0.01). C13 * soluja, sisplatiini kestävä variantti 2008 soluja, oli IC

50 2,04 mM, mikä oli myös huomattavasti pienempi kuin vanhempien 2008 soluja (p≤0.05). Väheksyä mitään hoitoa vaikutusta, vanhempien 2008 soluja käsiteltiin tetrasykliiniä, ja ei ollut merkittävää kasvua inhibition 2-DG kanssa IC

50 3,67 mM (tuloksia ei ole esitetty). Solujen kasvun normaalissa tai glukoosi-free Media (täydennetty natriumpyruvaattia) verrattiin yli 96 tuntia, minkä jälkeen havaittiin, että proliferaation solujen lisääntyneen ekspression Ets-1 on selvästi hitaampaa kuin vanhempien 2008-soluja (kuvio 3B ). Hoidon glukoosi-free Media johti vähentynyt proliferaatio hinnan kaikkien solujen testattu verrattuna normaalisti täydennettyä elatusainetta (tuloksia ei ole esitetty).

(A) 2008, C13 *, ja 2008-Ets1 soluja käsiteltiin glykolyyttisen inhibiittori 2-DG, ja solujen kasvu mitattiin seuraavan 96 tunnin inkubaation jälkeen. 2008-Ets1 ja C13 * soluja, jotka ilmentävät Ets-1 osoitti merkittävästi vähentynyt kasvun seuraavat glykolyyttisissä esto 2008-Ets1 verrattuna vanhempien 2008 soluja (n = 4). (B) 2008 ja 2008-Ets1 soluja kasvatettiin ilman glukoosia, ja proliferaatiota testit suoritettiin 24 tunnin välein. 2008-Ets1 munasarjasyöpäsoluja ilmentävät korkeita Ets-1 osoitti heikentymisen kasvun glukoosi viljelyalusta, mikä viittaa lisääntynyt riippuvuus Glykolyysivaiheen energian (n = 3).

Ets-1 säätelee solujen hapenkulutus syöpäsoluissa

mikrosirujen analyysien mukaan Ets-1 yli-ilmentyminen johti yleiseen alas-säätely koodaavat geenit elektroninsiirtoketju komponentteja, mikä viittaa siihen, että näissä solulinjoissa todennäköisesti näyttö laskenut O

2 kulutus (taulukko 4). Tämä olettamus arvioitiin käyttämällä korkean resoluution respirometria, jossa pohjapinta hapenkulutus mitattiin lisäyksen jälkeen solujen kohteena on oxygraph. Basal hapenkulutus oli merkitsevästi pienempi aiheuttama 2008-Ets1 soluja (26,23 pmol O

2/1 x 10

6 solua /s; p≤0.05) vuoteen 2008 verrattuna soluihin (40,60 pmol O

2/1 x 10

6 solua /s, p≤0.05) (kuvio 4). Mitään merkittävää tetrasykliiniä hoito vaikutusta perustason hapen kulutuksen todettiin seuraavaa induktion 2008 soluja, vahvistavat, että tetrasykliini ei vaikuttanut hapenkulutus mallissamme (tuloksia ei ole esitetty).

Basal hapenkulutus määritettiin vuonna 2008 ja 2008- Ets1 munasarjasyöpä soluja. Ets-1-ilmentyminen liittyy merkittävä väheneminen pohjapinta hapenkulutuksen viittaa vähentynyt riippuvuus oksidatiivisen fosforylaation 2008-Ets1 soluissa.

Keskustelu

Mitokondrioiden reaktiivisia happiradikaaleja aktivoida useita keskeisiä signalointireitteihin osallistuvien tuumorigeneesiä ja ajan säätelemään tärkeitä onkogeenisten transkriptiotekijöiden kuten Ets-1 [32]. Olemme aiemmin osoittaneet, että lisääntynyt tuotanto solunsisäisen reaktiivisten hapen lajien C13 * soluja, sisplatiini-variantin 2008 munasarjakarsinoomasolut, korreloi kasvu Ets-1-mRNA: n ja proteiinin ekspression [15], [33]. Seuraava käsittely näiden solujen kanssa H

2O

2 kasvoi Ets-1 ilmentymisen annoksesta riippuvaisella tavalla, mikä viittaa siihen, että tämä transkriptiofaktori on erittäin herkkä tuumorista peräisin signaaleja.

edellisessä analyysissä ETS-1 promoottori johti tunnistamiseen antioksidanttina vaste-elementin (ARE), joka osoittautui keskeinen säätelyssä ilmentymisen Ets-1 alle sekä perus- ja H

2O

2 aiheuttamaa olosuhteissa [15] . Perinteisesti toiminnallinen merkitys Ets-1 yli-ilmentyminen syövässä on liittynyt sääntelyä matriisin hajottavien proteaasien ja angiogeenisten tekijöiden [26], [34]. Kuitenkin meidän viimeaikaiset havainnot, että mitokondrioiden reaktiivisia happiradikaaleja voimakkaasti vaikuttaa Ets-1 ilmentymisen transkriptionaalisella tasolla [15] viittaavat siihen, että on tärkeää tämän transkriptiotekijän syövän taudin alkamisen ja etenemisen ulottuu angiogeneesin ja metastaasin yksin.

hypoteesi, että Ets-1 voi olla osallisena säätelyssä mitokondrioiden aineenvaihdunnan syöpäsoluissa koska mitokondriaalisen stressi sekä lisääntynyt reaktiivisten happiradikaalien tuotanto ja elektroninsiirtoketju toimintahäiriö seurauksena lisääntyneeseen Ets-1 mRNA ja proteiini [15]. Jotta voitaisiin määrittää toiminnallisen tärkeää Ets-1 ilmentymisen syövän solujen aineenvaihduntaa, me syntyy tetrasykliini-indusoituva Ets-1 yli-ilmentävät munasarjasyövän solulinja 2008-Ets1. Vanhempien 2008 solut eivät ilmennä havaittavia määriä Ets-1-proteiinia endogeenisesti. Analysoimaan genomisen seuraukset Ets-1 yli-ilmentyminen näissä munasarjasyöpäsoluja teimme ihmisen geeni mikrosirun. Tuloksemme osoittavat, että Ets-1 on joko suoraan tai epäsuorasti osallisena ekspressiota sääteleviä yli 3000 ja yli 28000 ihmisen geenejä tutkitaan. Mielenkiintoista on, että meidän havainnot viittaavat siihen, että Ets-1 voi toimia transkription repressori yli puoli (1665) näiden geenien munasarjakarsinoomasolut.

Vaikka Ets-1 on tutkittu laajasti sekä fysiologisia ja patologisia prosesseja [17], se on harvoin kutsutaan transkription repressori. Yhteydessä mitokondriohäiriöön ja aineenvaihduntaa, Ets-1 havaittiin ainakin osittain alas-säädellä useita komponentteja elektroninsiirtoketju. Complex I, näkyvin sivusto elektronin vuodon johtaa liialliseen reaktiivisen hapen tuotantoa elektroninsiirtoketju, koostuu 39 ydin- koodattuja alayksikkögeenit, joista Ets-1 down-regulation 11. Toinen tärkeä sivusto elektronin vuodon ja reaktiivinen happiradikaaleja tuotanto on Complex III, joka koostuu 10-alayksiköitä, joista Ets-1 down-regulation 3. Ets-1 myös tukahduttaa komponentit Complex IV, Complex V ATP-syntaasi, sekä joitakin elektronien kuljetusta liittyvät tekijät. Yhdessä nämä tukahduttavaa toiminnot viittaavat siihen, että Ets-1 on näkyvästi mukana vähentynyt riippuvuus oksidatiivisen fosforylaation usein liittyvät syöpäsoluja. Näin ollen geenit, jotka koodaavat mitokondrion proteiineja, jotka liittyvät oksidatiivisen fosforylaation olisi alassäädetty, ja solut vaatisi vaihtoehtoisia menetelmiä ATP-tuottamista, mukaan lukien glykolyysin ja rasvahappojen hapettumista. Koska komponentit lähes jokaisen kompleksin elektroninsiirtoketju, useita keskeisiä entsyymejä TCA sykli, ja lopulta vähentää vastineet tarvitaan elektronin liikenteen olivat yhtä alassäädetty, Ets-1 yli-ilmentävät solut näyttävät olevan vähentynyt kyky tuottaa ATP kautta oksidatiivisen fosforylaation geenin ilmentymisen taso.

Syöpäsolut yleensä on vähentynyt riippuvuus oksidatiivisen fosforylaation energiantuotantoon, ja myös ne on suurentunut riippuvuus Glykolyysivaiheen ja rasva aineenvaihduntaa solujen energia [35]. Edelleen tuki Ets-1 on osallisena säätelyssä muuttunut syövän aineenvaihduntaa, Ets-1 liittyy lisääntynyt ekspressio monien geenien glykolyysiin, glykolyyttisiä syöttölaite polkuja, ja pentoosifosfaattireitin. Lisäksi, ekspressio Ets-1 korreloi myös kasvaa ilmentymisen monien geenien mukana rasva-aineenvaihduntaan ja biosynteesiä. Yhdessä nämä suuntausten perusteella Ets-1 on tärkeä transkription säädin paitsi catabolic, mutta myös anabolisia metabolisen siirtymät syöpäsolut lopulta edistää tuumorigeneesiä [35].

Se oli lähes puoli vuosisataa sitten kun ylös-säätely rasvahappojen nopaliinisyntaasin (FASN) kuvattiin ensimmäisen kerran vuonna syöpään [36], joka on nyt tiedetään yli-ilmentyy useimmissa syöpiä. Mielenkiintoista, Ets-1 havaittiin myös olevan osallisena säätelyssä lisääntynyt FASN geeniekspression meidän munasarjasyövän mallissa. Siten meidän geenien ilmentyminen havainnot viittaavat siihen, että Ets-1 on keskeinen transkriptiotekijä metaboliaan osallistuvia syöpäsolujen, ja erityisen tärkeitä aineenvaihdunnan siirtymistä Glykolyysivaiheen ja anaboliset keinot energiantuotannon. Vaikka on tärkeää huomata, että Ets-1-välitteisen metabolisen asetuksen todennäköisesti saavutetaan suuri yhteenliittymä eri transkriptiotekijöiden, monimutkaisempi sääntelyverkon transkriptiotekijöiden vaikuttaa mitokondrioiden ole vielä selvitetty. Olemme osoittaneet, että yli-ilmentyminen Ets-1 meidän munasarjasyövän mallissa ei vaikuttanut proteiinin tasot kaksi läheistä sukua ETS perheenjäseniä; on kuitenkin mahdollista, että muut ETS transkriptiotekijöiden tästä erittäin suuri perhe vaikuttaa myös syöpä aineenvaihduntaan. Ottaen huomioon, että nämä transkriptiotekijät tunnistaa lähes identtiset konsensussekvenssit, toistaminen kokeissa tämän tutkimuksen jälkeen yli-ilmentyminen muiden ETS perheen jäsenet voisivat tuottaa samanlaisia ​​tuloksia. Lisäksi tällaiset kokeet entisestään luonnehtia mahdollisesti suuren transkription verkosto osallistuu erikoistunut aineenvaihduntaan syöpäsoluja.

määrittämiseksi toiminnallinen merkitys meidän genomista tuloksia, olemme tutkineet glykolyyttisissä kykyä meidän Ets-1 over -ilmaisu malli. Olemme välillisesti arvioineet oksidatiivisen fosforylaation kapasiteetti näiden solujen käsittelemällä glykolyyttisellä estäjän 2-DG. Munasarjojen C13 * ja indusoi 2008-Ets1 soluja, jotka molemmat ilmentävät Ets-1, osoitti näkyvästi kasvun estämistä vastauksena 2-DG, mikä viittaa siihen, että nämä solut ovat enemmän riippuvaisia ​​Glykolyysivaiheen ATP tuotantoon. Lisäksi Ets-1 yli-ilmentävien munasarjasyöpäsoluja näy merkittävästi vähentynyt kasvu seuraavien glukoosin poisto, jotka korostavat niiden glykolyyttisiä riippuvuus. Kasvuvauhti kaikissa solutyypeissä glukoosi-vapaa media vähennettiin verrattuna normaalisti täydennetty median, erityisesti sen jälkeen kun 48 tuntia, kun selvä eroja solujen kasvua havaittiin yhdenmukaisesti, mikä johtuu todennäköisesti vähentynyt glukoosin saannin. Yli-ilmentyminen Ets-1 voimakkaasti pahentaa poikkeama koska kasvu indusoi 2008-Ets1 solujen jyrkästi vähentynyt jälkeen 48 tuntia. Kuitenkin proteiinitasolla, emme löytäneet mitään merkittäviä eroja ilmaus glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi, pyruvaattidehydrogenaasia, sytokromi

c

, tai heksokinaasi, jotka ovat kaikki entsyymejä, jotka osallistuvat Glykolyysivaiheen tai oksidatiivisen fosforylaation. Mikä tärkeintä, emme katso toistettavia ja merkittäviä eroja glykolyyttisissä riippuvuus liittyy Ets-1 ilmentymisen, ja puute muutosten proteiiniekspressiossa voisi siten johtua translaation jälkeisiä modifikaatioita välittämä Ets-1. Esimerkiksi erot katalyyttinen alue entsyymin johtaisi toiminnallisia eroja, mutta se ei välttämättä ole havaittavissa Western blotilla, koska tämä tekniikka on riippuvainen epitooppia kohteena käytetty vasta-aine. Siten aiomme tutkia entsyymin aktiivisuus näiden metabolisia entsyymejä tulevissa tutkimuksissa onko mitään eroja 2008 ja 2008-Ets1 soluja, jotka voisivat selittää toiminnalliset erot olemme osoittaneet tässä tutkimuksessa.

arviointi O

2 kulutusta solupopulaatio on toiminnallinen arviointi oksidatiivisen kapasiteetin, koska se on hyvä arvio nopeudesta, jolla elektronit kulkevat pitkin elektroninsiirtoketju ja vähennetään H

2O

2. Polarografista käytetty tässä tutkimuksessa mitata O

2 kulutus sisältää anturit, jotka tuottavat nykyinen verrannollinen osapaine O

2 soluun sisältävässä väliaineessa kuluttamalla O

2 katodi puolireaktio, mikä signaali vastaa eksponentiaalisesti muutoksiin O

2 paineen näytteessä. Koska spesifinen kompleksi alustoissa ja ADP, jonka avulla jäljitellään hengitystä, basaalin O

2 kulutusta voidaan mitata. Olemme havainneet merkitsevää pienenemistä O

2 kulutus solujen lisääntynyt Ets-1 ilme. Tuloksemme osoittavat, että Ets-1 osallistuu suoraan säätelyyn solujen oksidatiivisen kapasiteetin, jossa Ets-1 yli-ilmentyminen johti merkittävästi vähentynyt O

2 kulutusta, ja Ets-1 alassäädetty soluilla hyvin merkittävä kasvu O

2 kulutusta. Nämä tulokset viittaavat siihen, että säädelty Ets-1 ilmentymisen edistää vähentynyt riippuvuus oksidatiivinen fosforylaatio energian, ja antaa lisää todisteita kohti toiminnallista merkitystä Ets-1 syöpäsolun aineenvaihduntaan.

Korkea oksidatiivisen stressin ovat tyypillisesti havaittu kasvaimen mikroympäristössä seurauksena epätasapainosta antioksidanttipuolustuksen tekijät, ja alentunut DNA korjausmekanismit [37] – [39]. Rintasyöpäsoluissa linjat, lisääntynyt pahanlaatuisuuteen liittyy korkea reaktiivisia happiradikaaleja tuottavan superoksididismutaasi aktiivisuutta, yhdistettynä alentuneesta reaktiivisia happiradikaaleja-myrkkyjä glutationiperoksidaasit ja H

2O

2-detoxifying entsyymin katalaasi [40]. Vastaavia antioksidantti-entsyymin epätasapaino on todettu melanooma [41], samoin kuin keuhkojen [42], eturauhassyöpä [43], ja kilpirauhassyövän [44]. Meidän mikrosiruanalyysi todennut Ets-1 on säätelijä antioksidantti geeniekspressiota munasarjasyöpäsoluja, erityisesti glutationiperoksidaasit, joka ensisijaisesti kohdistaa H

2O

2 ja lipidihydroperoksidien vieroitus. Tämä lisääntynyt ekspressio antioksidantteja on vastaus mitokondrioiden oksidatiivisen stressin muodossa liiallisen reaktiivisten happiradikaalien tuotantoa, ja olemme aiemmin osoittaneet, että Ets-1-geenin ilmentymisen nousu vasteena H

2O

2 [15]. On kuitenkin tärkeää huomata, että Ets-1 myös alas geenien koodaavat tietyn H

2O

2-myrkkyjä entsyymejä, mikä viittaa siihen, että nämä syöpäsolut todennäköisesti vaativat ja säilyttää tietty taso H

2O

2 rohkaista korkeat kasvuluvut ominaisia ​​kasvaimen etenemiseen.

A novel toiminto Ets-1 oli selvitetty tässä tutkimuksessa seuraavat genomista ja funktionaalinen analyysi munasarjasyöpäsolu Ets-1 ilmentymisen malli. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus osoittaa rooli tämän transkriptiotekijän aineenvaihduntaan. Lukuisat alas geenien tunnistettiin Ets-1 yli-ilmentävät solut mukaan lukien ne, jotka koodaavat useita mitokondrioiden proteiineja, jotka liittyvät oksidatiivinen fosforylaatio, sekä merkittäviä metabolisia entsyymejä, jotka ovat vastuussa sukupolven vaadittu substraatteja elektroninsiirtoketju. Funktionaaliset analyysit vahvistivat, että Ets-1 yli-ilmentävien syöpäsolujen näkyy vähennetään oksidatiivisen fosforylaation ominaisuudet, sekä tehostettua riippuvuus Glykolyysivaiheen solujen energia. Lisäksi Ets-1 osoitettiin olevan tärkeä sääntelyn solun O

2 kulutusta edelleen viittaa alennettu käyttö oksidatiivisen fosforylaation syöpäsoluissa ilmentävät Ets-1.

Siksi vahingoittaa mitokondriot tuloksiin tuotanto lisääntyy H

2O

2 ja seurauksena säätely ylöspäin Ets-1, joka sitten osallistuu aktiivisesti sääntelyn verkoston, joka mahdollistaa riippuvuus Glykolyysivaiheen ja rasva-aineenvaihduntaan solujen energiantarpeesta. Siten Ets-1 voidaan ryhmitellä muiden transkriptiotekijöiden, jotka on havaittu ajan säätelemään mitokondrioiden proteiineista (NRFs) tai geenien Glykolyysivaiheen (HIF-1) vastauksena tiettyyn korostaa [45], [46] . Yhteenvetona meidän havainnot osoittavat uudenlainen rooli Ets-1 sääntelyssä solujen aineenvaihduntaa vastauksena mitokondrioiden stressiin.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen munasarjasyöpäsolulinjoihin, 2008 ja C13 *, ystävällisesti toimitti tri Paul Andrews (Georgetown University, Rockville MD) [33]. 2008 ja C13 * soluja pidettiin RPMI 1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 2% penisilliini /streptomysiiniä. Stabiili solulinja 2008-Ets1 [27] pidettiin kasvatusväliaineessa, kuten on kuvattu, johon on lisätty 200 ng /ml selektiivisen antibiootin Zeocin. Kaikki soluja pidettiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Media ja täydennykset ostettiin Invitrogen Life Technologies (Burlington, ON, Kanada), ja FBS Fisher Scientific (Ottawa, ON, Kanada). Kaikki reagenssit hankittiin Sigma (Oakville, ON, Kanada).

Protein eristäminen ja Western blot-analyysi

Koko solulysaatit kerättiin, 30 ug proteiinia erotettiin 10% SDS-PAGE elektroforeesi, siirrettiin nitroselluloosamembraanille (Amersham Biosciences, Baie D’Urfé, QC, Kanada), ja blokattiin 1 tunnin ajan 5% rasvatonta maitoa TBS-T. Membraaneja inkuboitiin yön yli primaarisen vasta-aineen 0,5%: rasvatonta maitoa TBS-T: llä. Seuraavat primaarisen vasta-aineen inkuboinnin jälkeen kalvot pestiin ja inkuboitiin 1 tunnin ajan piparjuuren peroksidaasiin liitetty IgG sekundääristä vasta-ainetta (1:10,000) (Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA). Proteiinit detektoitiin käyttämällä ECL chemiluminescence-reagenssia (Amersham) ja valotettiin filmille. Vasta-aineita Ets-1 (1:100), G6PD (1:1000), ja PDHA (1:500) olivat Abcam; vasta-aineita Ets-2 (1:500), PEA3 (1:100), ja HK (1:250) olivat Santa Cruz Biotechnology; ja vasta-aine CYC (1:250) oli BD Biosciences.

RNA: n eristys ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR

Yhteensä-RNA eristettiin käyttäen Trizol reagenssia kuten valmistajan (Invitrogen) . RNA-näytteet DNaasi käsiteltiin käyttäen Turbo DNA-free ™ kohti valmistajan ohjeita (Ambion), ja 3 ug solun kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin käyttämällä poly-T-alukkeet ja Superscript III First Strand Synthesis System (Invitrogen). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR suoritettiin käyttäen DNA-Engine® lämpösyklilaitetta (Bio-Rad) ja Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invitrogen) ja alukesekvenssit on lueteltu taulukossa 5. Kohdegeenin ilmentyminen oli normalisoitu yhdistettiin geeniekspression arvoja β aktiini (ACTB), B-2 makroglobuliini (B2M), glyseraldehydi-3-phosphdate dehydraa- (GAPDH), ja RNA-polymeraasi II (RPII), kuten siivous valvontaa. Data oli normalisoitu taloudenhoitaja geenien ilmentymistä ja tehokkuutta korjataan käyttäen ΔΔCt menetelmää suhteellisen kvantifioinnin, jossa tilastollista merkittävyyttä ja keskivirhe määritettiin ACt arvoista.

mikrosiruanalyysi

Yhteensä RNA eristetty tetrasykliini-indusoidun 2008 ja 2008-Ets1 soluissa, kuten on kuvattu, puhdistettiin käyttämällä RNeasy-puhdistuskittiä (Qiagen) ja hybridisoitiin GeneChip® Human Gene 1,0 ST Array (28869 ihmisen geenin koettimia). RNA laadun analysointi kautta bioanalysaattorin, microarray valmistelu, hybridisaatio, ja havaitseminen suoritettiin keskus Applied Genomics, The Hospital for Sick Children, Toronto, Kanada. Kaikki matalan tason analyysit, laskeminen differentiaalikaavojen, ja tilastollinen säätöjä laskettiin käyttäen R versio 2.9.2 [47]. Arviointi RNA laadun hybridisaation jälkeinen, ja matalan tason analyysi suoritettiin käyttäen pakkauksen ”affy” [48]. RNA: n hajoamisen tontteja paljasti hieman 5 ’3’ bias ja kaikki paneelit kuului 1,35 keskihajonnan keskimääräinen kaltevuus. Taustakorjaus ja normalisointi suoritettiin käyttäen vankka multi-array keskiarvo (RMA) algoritmia. Vähentää erilaisen ilmentymisen testien myötävirtaan, mikä lisää yleistä valtaa, 50% alimman normalisoitu Log

2 koetin-set intensiteetit poistettiin suositusten mukaisesti Hackstadt ja Hess (2009) [49]. Differentiaalikaavojen arviot laskettiin käyttämällä mukautettua Local Pooled Error testi pakkauksen ”LPEadj” [50]. Benjamini-Hochberg proseduuria väärien löytö määrä (FDR) levitettiin vertailuun-viisasta p-arvoja paketin ”multtest”. Raportoitu q-arvot edustavat vähintään FDR, jolla tietty testi voidaan katsoa merkittäväksi. Kertainen muutos ilmaus arvoja 10 satunnaista kohdegeenien vaihtelevia kertaluokkamuutos suuruusluokkaa validoitiin käyttäen reaaliaikaista PCR. Vastaavat suhteelliset kertainen muutokset määritettiin käyttämällä ΔΔCT menetelmää suhteellisen kvantifioinnin, ja korrelaatiokertoimet laskettiin määritellä suhde reaaliaikainen PCR ja mikrosirujen havainnoista.

glykolyyttisissä riippuvuus määrityksissä

Cellular kasvu ja