Krooninen sairaus

tiivistelmä

metastaattinen potentiaali solujen on tärkeä tekijä suunnittelussa optimaalisen strategioiden henkilökohtainen syövän hoitoon. Käyttäen atomivoimamikroskoopilla (AFM), me osoitamme, yhdenmukaisia ​​aiempien tutkimusten muunlaisia ​​epiteelin syövän, munasarjojen syövän solut ovat yleensä pehmeämpiä ja näyttää alemman luontainen vaihtelu solussa jäykkyys kuin ei-pahanlaatuiset munasarjaepiteelisoluilla. Yksityiskohtainen tarkastelu erittäin invasiivisen munasarjasyövän soluja (HEI A8) suhteessa niiden vähemmän invasiivisia vanhempien soluja (HEI), osoittaa, että muodonmukautumisominaisuuksista myös tarkka biomarkkereiden metastaattisen potentiaalia. Vertaileva geenin ilmentymisen analyysit osoittavat, että vähennetään jäykkyyttä erittäin metastaattinen HEI A8 solujen liittyy aktiinisytoskeletonin remodeling ja mikroskooppinen tutkimus aktiini kuiturakenteen näissä solulinjoissa on sopusoinnussa tämän ennustuksen. Tuloksemme osoittavat, että solu jäykkyys saattaa olla hyödyllinen biomerkkiaine arvioida suhteellinen metastaattisen potentiaalin munasarjojen ja ehkä muiden syöpien soluja.

Citation: Xu W, Mezencev R, Kim B, Wang L, McDonald J, Sulchek T (2012) Cell jäykkyys biomarkkereiden metastaattisen potentiaalin munasarjasyöpäsoluja. PLoS ONE 7 (10): e46609. doi: 10,1371 /journal.pone.0046609

Toimittaja: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21 huhtikuu 2012; Hyväksytty: 04 syyskuu 2012; Julkaistu: 04 lokakuu 2012

Copyright: © Xu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat kiitos NSF (hanke numero CBET-0932510) taloudellisen tuen tämän projektin. Kirjoittajat myös kiittää presidentin Undergraduate Research Award (PURA) ohjelma ja Petit Scholars Program Georgia Tech tarjota rahoitusta BK. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

mekaaninen eheys solujen säätelee dynaaminen verkosto rakenteellisia silloittaminen, ja molekyylejä [1]. Siksi korjauksilla mekaanisia ominaisuuksia yksittäisiä soluja voidaan paljastaa tärkeää tietoa muutoksista näissä verkoissa. Tutkimukset erilaisia ​​sairauksia käyttämällä erilaisia ​​kokeellisia tekniikoita, ovat osoittaneet, että poikkeavuudet elastiset ominaisuudet solujen liittyy taudin patogeneesiin ja etenemiseen [2], [3], [4], [5], [6], [7] [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Esimerkiksi invasiivisia kasvainsolut mekaanisesti pehmentää ja muuttaa niiden kiinnittyminen soluväliaineen, joka parantaa niiden kykyä paeta primaarikasvaimen [5], [17], [18]. Mittaukset syöpäsolun jäykkyys, kvantitoitiin Youngin moduulin, ovat osoittaneet vahvaa korrelaatiota solun muodonmuutoskyky ja solun pahanlaatuisuuden [5]. Vastaavasti, jäykkyys metastaattisen syövän solujen eristetty keuhkopussin nestettä rintasyöpäpotilaiden on raportoitu olevan yli 70% pienempi, ja sen standardipoikkeama yli viisi kertaa kapeampi, kuin hyvänlaatuinen reaktiivinen mesoteelisolujen [3].

jakauma aktiini-verkon tärkeä rooli mekaanisten ominaisuuksien määrittämiseksi yksittäisten solujen [19], [20], [21]. Kuten solut muunnos ei-pahanlaatuisia syöpä- valtiot, niiden solun tukirangan rakennetta muuttuu järjestäytynyt ja epäsäännöllinen verkkoon, ja tämä muutos sen jälkeen vähentää jäykkyyttä yksittäisten solujen [5], [22]. Tutkimuksissa mekaanisten ominaisuuksien syöpäsolujen edellä sitä, että jäykkyyden muutoksen yksittäisiä soluja voidaan ilmaisemaan maligniteetin [15], [16], [23], [24].

tarvitaan tehokasta biomarkkereita sairauksia on erityisen tärkeää silloin, munasarjasyövän, joka on kaikkein vaarallisin gynekologisten syöpien. Munasarjasyöpä sijoittui viidenneksi johtavia syitä syöpään liittyvien kuolemien US naisten vuonna 2007 ja sen 5 vuoden pysyvyys oli 46% kaikista tapauksista diagnosoitu 1999-2005 [25]. Koska ei ole saatavilla luotettavaa seulontaa kliinisessä käytännössä ja oireeton kurssin kautta alkuvaiheessa sairauden, valtaosa munasarjasyöpä tapauksista (68%) on diagnosoitu etäpesäkkeitä huono selviytyminen [26].

tässä tutkimuksessa mekaanisten ominaisuuksien solujen useista eri munasarjasyövän solulinjoissa ja ei-pahanlaatuiset kuolemattomaksi munasarjojen pinnan epiteelisolujen (menettää tavallisesti), me osoitamme, että solu jäykkyys ei ainoastaan ​​erottaa munasarjasyöpäsoluja ei-pahanlaatuisia soluja, vaan myös voi erottaa enemmän tuumorigeenistä /kohdunkaulan syöpä soluja vähemmän tuumorigeenisia /invasiivisia tyyppejä. Tuloksemme osoittavat, että mittaus solun jäykkyys munasarjojen ja ehkä muiden syöpien soluja voidaan paitsi edistää parempaa ymmärrystä fyysisen ja molekyylitason mekanismien syövän etenemiseen, mutta voi myös olla hyödyllinen kliininen väline arvioinnissa metastaattisen mahdollisten .

Materiaalit ja menetelmät

munasarjasolulinja kasvu ja näytteiden valmistus

Immortalized munasarjojen pinnan epiteelisolujen (menettää tavallisesti) oli jalomielinen lahjoitus tohtori N. Auersperg (University of British Columbia, Vancouver, Kanada) ja viljeltiin 199/105 väliaineessa (01:01), johon oli lisätty 15% naudan sikiön seerumia (FBS, Atlanta Biologicals, Atalanta, GA) ja 1% antibioottista-antimykoottista liuosta (Mediatech-Cellgro, Manassas, VA ). Munasarjasyöpä HEI ja HEI A8 solulinjat saatiin Dr. G. Mills (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX), ja kasvatettiin RPMI-1640, jota oli täydennetty 10% FBS: ää ja 1% antibiootti-antimykoottiliuoksella (R10 medium). Munasarjasyöpä OVCAR-3 ja OVCAR-4 solulinjat hankitaan Developmental terapeuttinen Program (DTP) National Cancer Institute (NCI) (Bethesda, MD). Ennen AFM kokeissa solut maljataan Fluorodish (World Precision Instruments, Sarasota, FL), jossa alkutiheydellä 10,000-20,000 solua /cm

2.

Atomic Force Microscopy

teimme atomivoimamikroskooppi (AFM) mekaaninen mittaukset [27], [28] yksittäisistä munasarjaepiteelisoluilla. AFM käytetty kokeissa on MFP-3D (alkaen Turvapaikka Research, Santa Barbara, CA), jossa on yhdistetty Nikon Ti käänteinen optisella mikroskoopilla (Nikon, Melville, NY), jota käytetään optisesti kohdista anturi soluihin. Käytetyt koettimet tässä tutkimuksessa olivat MCST-AUHW (Bruker, Camarillo, CA), jonka nimellinen kimmovakiota 0,03

N Twitter /

m

. Yksinkertaistaa yhteyshenkilön geometria ja minimoida sivusuunnassa kanta näytteen aikana sisennys, ulokkeen kärki on modifioitu kiinnittämällä tavallinen piidioksidi microsphere jonka halkaisija on 4,7 um. Mittaukset tehtiin soluviljelyalustoissa huoneenlämpötilassa, ja solut maljattiin lasin pohjalle Fluorodish. Eliminoimiseksi sekoittavien vaikutusten naapurisolujen solun tukirangan järjestely ja morfologia, yksittäiset solut mitattiin.

Ennen solun mittauksiin, ulokkeen kalibroitiin lasille pohjassa Fluorodish lämpöprosessilla tärinän menetelmä [29] kanssa tuloksena lämpö spektrin varustettu Lorentzian toiminnolla määrittää jousivakio. Solut sisennetty noin yli perinuclear alueen yksittäisten solujen. Painuman syvyys valittiin vähintään 1 um, jotta voidaan paremmin jäljitellä muodonmuutoksia, joita esiintyy fysiologisesti. Voima vs. indentation käyrät jokaisen mittauksen analysoitiin käyttämällä Hertzian yhteystietoja malli [30], [31] saada Youngin jokaisen solun. Piirros kokeellisen perustaa on esitetty kuviossa. 1

. Pyyhkäisyelektronimikrovalokuva taivutetun kärjen käytetään tässä kokeessa on esitetty kuvassa. 1

b

. Esimerkkejä optisten kuvien aikana saatujen solujen sisennys on esitetty kuvioissa. 1,

c

–

g

.

(A) Piirros mittausten solujen AFM,

δ

on sisennys, (B) SEM kuva ja helmillä kärjen, jäykkyys mittaukset yksittäisten solujen AFM varten (C) menettää tavallisesti, (D) OVCAR-4, (E) HEI, (F) OVCAR-3 ja (G) HEI A8 soluja. Sama konsoli käytettiin; varren ulokkeen leveys on 20 um ja toimii mittakaavajana.

fluoresenssikuvantamisella ja analyysi F-aktiini

kuvattiin leimatun F-aktiini verkosto kustakin solulinjasta käyttäen fluoresenssimikroskopiaa. Soluja kasvatettiin lasipeitinlevyn tiheyteen 5000 solua /cm

2. Kansi slip kanssa päällystetty soluihin pantiin kuoppaan 6-kuoppalevyllä 2 ml soluviljelyalustoissa. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa yön yli ja sitten värjättiin fluorokromilla-konjugoidun phalloidin. Solut värjättiin ensin vahvistamisesta 1 ml: lla 4% formaldehydillä PBS: ssä (pH 7,4) 10 minuutin ajan ja läpäiseviksi 1 ml 0,2% TX-100, estää 1% BSA 20 min ja inkuboimalla yksi tunti 01:20 Alexa Fluor 546 phalloidin (Life Technologies, Grand Island, NY) 1% BSA. Kaikki vaiheet aikana värjäys prosessi suoritettiin huoneenlämpötilassa pimeässä huoneessa. Värjäyksen jälkeen solut välissä lasipeitinlevyn ja lasilevyllä, asennettu pidentää Gold ja sinetöity kynsilakka. Useita kuvia kustakin solulinjasta otettiin käyttäen Nikon Ti mikroskoopilla (Nikon, Melville, NY) kanssa TRITC eksitaatio /emissio suodatin sarja. Analyysi rajattiin yhteen solut, jotka eivät olleet kosketuksissa muihin soluihin.

rakenteelliset ominaisuudet aktiini verkon analysoitiin määrällisesti suuntaa parametri aktiinisäikeiden. Kaksiulotteinen nopea Fourier-muunnos (FFT) on sovellettu alkuperäiseen fluoresenssi kuvia käyttämällä MATLAB rutiinit (MathWorks, Natick, MA). Transformoiduista kuva, mukautetun MATLAB-koodit lasketaan kulma amplitudi FFT yhteen neliön FFT osia, joista orientaatiojakautuman aktiinisäikeiden määritettiin kulman funktiona. Matemaattinen algoritmien laskemiseksi orientaatiojakautuman toiminto perustuivat näiden aikaisemmin raportoitu kirjallisuudessa [32]. Menetelmä on esitetty kuviossa. S1 tukiaineeseen edustajan kanssa fluoresenssi kuvan, menettää tavallisesti solun.

Muuttoliike ja Invasion Analyysit

CytoSelect 24 kuopan solumigraation ja invaasiomääritys Kit (Cell Biolabs, San Diego, CA ) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Migraatiokokeessa, 1,5 x 10

5-solut seerumivapaassa DMEM /F12-alustassa, joka sisälsi 0,5% BSA: ta, 2 mM CaCl

2 ja 2 mM MgCl

2 laitettiin yksittäisiin päällystämättömän inserttien noin 8 um huokoskoon. Insertit pantiin 24-kuoppalevylle, joka sisälsi RPMI-1640-väliaineessa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. 3 tunnin jälkeen oli inkuboitu 37 ° C: ssa kostutetussa ilmassa, jossa oli 5% CO

2, solut, jotka vaelsivat alapuolelle inserttien irrotettiin, hajotettiin ja kvantitoitiin käyttäen CyQuant GR fluoresoiva väriaine levylukijalla 480 nm: ssä /520 nm (Synergy 4, BioTek, Winooski, VT). Invasion määritykset suoritettiin identtisellä tavalla 32 tunnin inkuboinnin käyttämällä tyvikalvon matrix-pinnoitettu insertit. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena aluksi ajankulku tutkimus saavuttaa merkittäviä transmigraatio.

Microarray ja Pathway rikastus Analysis

RNA uutettiin kaksi ei-konfluentteja viljelmiä HEI ja HEY A8 soluja kasvatettiin R10 väliaineessa käyttäen Arcturus PicoPure RNA Isolation Kit (Applied Biosciences, Carlsbad, CA) mukaan valmistajan ohjeiden ja RNA eheys varmistettiin käyttämällä Bioanalyzer RNA Pico Chip (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). mRNA leimattiin käyttäen IVT Labeling Kit (Affymetrix, Santa Clara, CA) ja biotiini-leimattu mRNA hybridisoitiin päälle GeneChip- koetinmatriiseja U133 Plus 2.0 (Affymetrix). Affymetrix.CEL tiedostoja käsiteltiin käyttäen Affymetrix Expression Console ohjelmiston versio 5.0 käyttäen RMA 3′-ilme työnkulun. 4746 ominaisuuksia alin 10% arvojen logaritmin signaalin intensiteetin kaikissa 4 sirut poistettiin ja loput 49929 ominaisuuksia analysoitiin merkitys Analysis mikrosirujen (SAM) versio 4.0 [33] kanssa seuraavat parametrit: Response type: kahden luokan parittomia; Testimuuttuja: T-tilasto; Permutaatioiden: 500; Tietojen log2 mittakaavassa; Ei mediaani keskitys. Geenit ilmoitettiin ilmentyvät eri välillä HEI ja HEI A8 luokat jos ne täyttävät seuraavat kriteerit: (i) False Discovery Hinta = 1,1% ja (ii) absoluuttinen kertainen muutos (FC) ≥1.5.

Biologiset tulkinnat ero geenien ilmentyminen tietoja suoritettiin reitin rikastamiseen analyysi käyttäen MetaCore 5,2 (GeneGO, St Joseph, MI). Merkittävästi häirityn reittejä ja verkostoja tunnistettiin kartoittamalla säädelty ja alas geenien (yhdistetty ja erikseen) päälle GeneGO kanoninen reitin kartat (kokoelma käsin kuraattorina signalointi ja metaboliareitteihin) ja GeneGO prosessi verkkojen (käsin kuratoi verkkomallit tärkeimmistä soluprosessien ) [34].

GeneGO kanoninen polku karttoja ja prosessi verkostoja paremmuusjärjestykseen merkitystä syötejoukon geenien käyttäen p-arvot lasketaan hypergeometrisen jakeluun. Useita testaus korjaus tehtiin käyttämällä False Discovery Hinta kanssa adaptiivisen kynnys asetettuna sallimaan enintään 1 koulutusjakson /verkko virheellisesti ennustaa merkittävästi rikastettu.

Voit pidentää biologista tulkinta ero geenien ilmentyminen tietojen topologinen merkitys analyysi (TSA) on geeniekspressioprofiili suoritettiin käyttäen verkkotyökalu, jonka GeneGO Inc (https://topology.genego.com/zcgi/topology_scoring.cgi). Tämä työkalu kartat ilmentyvät eri geenien päälle GeneGO oma tietokanta proteiini-proteiini vuorovaikutusten ja tunnistaa proteiinit, jotka vievät topologisesti merkittäviä asemia suhteessa differentiaalisesti ilmentyvien geenien [35], [36]. Topologisesti merkitsevä geenit (p 0,01) havaittiin kaikkien geenien säädellään ylöspäin HEI A8 soluissa suhteessa HEY soluihin käyttäen ”transkription aktivointi polut kaikki solmut” algoritmi ja sen jälkeen kartoitettiin GeneGO kanoninen polku karttoja edellä kuvatulla tavalla.

qPCR

Selected geenejä (PRKAA2, TWF1 ja MYLK), jonka tunnuksena mikrosiruanalyysillä niin merkittävästi ilmentyvät eri välillä HEI A8 ja HEY soluja, validoitiin käyttäen predesigned TaqMan® Gene Expression Analyysit (Life Technologies, Grand Island , NY). RNA uutettiin 3 ei-konfluentteja viljelmiä HEI ja HEI A8-soluja (Arcturusta PicoPure RNA: n eristäminen Kit) ja käänteiskopioitiin ja monistettiin käyttäen Suosionosoituksia 3′-Amp-järjestelmä (NuGen Technologies, Inc., San Carlos, CA) mukaisesti valmistajan ohjeita. qPCR määritykset suoritettiin kullekin geeniä ja jokainen näyte 4 rinnakkaisten lämpökäsittelyyn olosuhteissa suositellaan TaqMan® Gene Expression Master Mix ja taita muutos arvojen Hey A8 ja Hey solut määritettiin käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmällä käyttämällä GAPDH-geenin sisäisiä ohjaus.

tilastollinen analyysi

Kaiken tilastollista merkitystä eroja keskimääräisissä jäykkyys joukossa solutyyppejä testattiin käyttäen Kruskal-Wallisin testiä. Merkitys eroja kaikkien solupareina testattiin Dunnin kokeen. Merkitys erot maahanmuuton ja invaasio keskuudessa menettää tavallisesti, hei ja HEYA8 solut testattiin ANOVA, jota seurasi Tukey testi pareittain vertailuissa (* p 0,05; ** p 0,01; *** p 0,001. Kruskal-Wallisin testiä, ANOVA ja kaikki post testit suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism versio 5.02 Windowsille (GraphPad Software, San Diego, CA). assosiaatioiden solu jäykkyyden ja solu invasiivisuus, solu jäykkyys ja solujen muuttavien ominaisuuksia, ja solu jäykkyys ja aste co-kohdistus F-aktiini testattiin käyttämällä Pearsonin tuote-hetki korrelaatio ja Spearmanin rho korrelaatio ja ilmaistiin korrelaatiokertoimet (r ja ρ, vastaavasti). korrelaatio analyysi suoritettiin käyttäen vapaan tilasto-ohjelmalla R [37].

tulokset ja keskustelu

Solun Jäykkyys on biomarkkereiden metastasoituneen (muuttavien /invasiivisuus) Mahdolliset

edustaja voima-sisennys käyrät saatu mekaaninen tunnustelevat yksittäisten solujen on piirretty kuvassa. 2

. Jokainen käyrä edustaa voiman tarpeen sisentää yksittäisen munasarjojen solu menettää tavallisesti ja HEI solulinjoissa. Koetin koskettaa kennon poukaman 0 um. Koska kaltevuus pisteessä jokaisen voima-sisennys käyrä liittyy soluun jäykkyys, vaihtelevuus rinteitä jokaisen tutkittiin solun tietyssä solulinjassa osoittaa vaihtelevuuden jäykkyys keskuudessa yksittäisten solujen samasta kulttuurista. Yleensä käyrät vastaavat hyvänlaatuisen menettää tavallisesti soluilla on suurempi rinteitä kuin ne, jotka vastaavat munasarjasyövän HEY soluja ja ovat siten jäykempiä.

(A) Box-ja-hiuksenhienosti kuvaajia jäykkyys yksittäisiä soluja eri solujen linjat, persentiili ovat 10%, 25%, 50%, 75% ja 90%, inset esittää edustavat voima käyrät menettää tavallisesti ja hei. Kaiken kaikkiaan ero joukossa välineet on merkitsevä (p-arvo 2,2 x 10

-16, Kruskal-Wallis); pareittain erot ovat merkittäviä välillä menettää tavallisesti ja hei, hei A8 ja OVCAR-3 solujen välillä HEY A8 ja HEI solujen välillä HEI A8 ja OVCAR-4-solut (p 0,05, Dunnin kokeen); (B) Maahanmuutto ja hyökkäys testit menettää tavallisesti, hei ja hei A8 soluja. F (480/520) on fluoresenssin intensiteetti 480 nm: n virityksellä ja 520 nm emissio, joka on verrannollinen määrä vaeltavia tai tunkeutuvat soluihin.

voima käyrät analysoitiin Hertzian kontakti malli määrittää vastaavan kimmomoduuli yksittäisten solujen. Määritimme Youngin moduuli eri munasarjojen epiteelin solulinjoissa, mukaan lukien ei-pahanlaatuinen menettää tavallisesti ja erilaisia ​​syöpäsolulinjoissa (OVCAR-3, OVCAR-4, hei, ja HEI A8). Jakauma Youngin yksittäisten solujen eri solulinjoista on kuvattu laatikossa ja hiuksenhienosti tonttien (Fig. 2

). Menettää tavallisesti osoitettu suurempi keskimääräinen jäykkyys kuin missään munasarjojen syöpien. Yleinen Ero keskuudessa solulinjoissa oli merkitsevä (p 2,2 x 10

-16) seuraavien parien näytetään merkittäviä eroja (p 0,05): menettää tavallisesti vs OVCAR-3, menettää tavallisesti vs HEY, menettää tavallisesti vs HEY A8, OVCAR- 4 vs HEY A8, ja hei vs HEY A8. Keskimääräinen Youngin moduli ja keskihajonnat näiden solujen on esitetty taulukossa 1. Ei-pahanlaatuisten menettää tavallisesti solujen osoitettu suurempi luontainen vaihtelu solussa jäykkyys kuin solut mistä tahansa munasarjasyövän solulinja, joka on sopusoinnussa aiemmin raportoitu suurempi vaihtelu jäykkyys hyvänlaatuinen solujen suhteen rintasyövän eristetyt solut keuhkopussin nestettä [3].

Erityisesti hEI ja hEI A8 soluja, jotka ovat peräisin saman tuumorinäytesylinterin [38] näkyy merkittäviä eroja jäykkyys, ja hEI A8-solujen on enemmän yhteensopiva (Fig. 2

). Tämä havainto on merkittävä, että nämä isogeenisiin solut eroavat toisistaan ​​myös tuumorigeenisyyden nude-hiirillä, jolloin HEI A8 solut ovat tuumorigeenisemmiksi intraperitoneaalisen injektion jälkeen nude-hiirissä [38]. Tutkia suhdetta mekaanisia ominaisuuksia näiden munasarjojen solulinjoissa ja metastasoituneeseen potentiaali, tarkastelimme muuttavien ja invasiivisia ominaisuuksia HEI ja HEI A8 solujen suhteessa menettää tavallisesti käyttämällä

in vitro

määrityksissä. HEI A8 soluilla suurin invasiivisia ja muuttavien aktiivisuus seurasi HEI solujen ja menettää tavallisesti ohjaus solut (Fig. 2

b

) osoittaa, että suhteellinen jäykkyys on korreloi käänteisesti indikaattorit metastaattisen potentiaali (maahanmuutto ja invasiivisuus). Nämä havainnot, koottu kuvioon. 3 ja taulukko 2, ovat yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien yhdistää solujen muodonmuutoksenkestoa kanssa tumorigeeniset ja metastaattista potentiaalia [5], [7], [33].

Datapisteet sähkökäyttöisiä lainsäädännön selkeyden vuoksi. Virhepylväät: keskivirheprosentit keinoin.

geeniekspressioprofilointi hei ja hei A8 Cells Linkit Lisääntynyt Metastaattinen Mahdolliset kanssa Muutokset Actin välittämää solun tukirangan Remodeling Pathways

Todettuaan että hankinta väheni jäykkyys HEI A8 soluissa suhteessa HEY soluihin korreloi kasvun kanssa metastaattisessa potentiaali (eli solujen vaeltamiseen ja invasiivisuus), teimme vertaileva geeniekspressioanalyysissä (DNA-siru) näiden kahden solulinjan, jotta saavat tietoa mahdollisista molekyyliperustan hankitun fenotyypin.

käyttäen merkitys Analyysi mikrosirujen (SAM) tunnistimme 3641 ilmentyvät eri ominaisuuksia näiden solulinjojen (File F1) ja todennut, että 1258 geenit olivat sääteli ja 1272 säädellä vähentävästi HEI A8 suhteessa HEY soluihin (15 geenit näkyy ristiriitaisia ​​muutoksia ilmaisun välillä HEI ja HEI A8 solujen tarpeeton koetinsarjojen). Merkittävästi rikastettu GeneGO väyliä (taulukko 3) ja prosessi verkot (taulukko 4), joka vastaa meidän joukko erilaisesti ilmaisi geenien mukaan erot HEI ja HEI A8 soluihin sisältyvät muutokset mitoosi vaiheessa solusyklin (kehräkokoonpanon /kromosomi erottelu, kara mikrotubulushaarojen) sääntely epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon (EMT), solun tukirangan remodeling, soluadheesiota, ja sääntelyn CFTR (cftr).

Red lämpömittari: geenien kopiointia ylös- säännelty HEI A8 soluissa; sininen lämpömittari: geenit transkriptionaalisesti säädellä vähentävästi HEI A8 soluissa; keltainen lämpömittari: proteiineja topologisesti merkitystä joukko up geenien.

(A) menettää tavallisesti, (B) OVCAR-4, (C) HEI, (D) OVCAR-3 ja (E ) HEI A8.

(A) edustaja suunta kertymäfunktio kunkin solulinjan, (B) jäykkyys verrattuna aste coalignment F-aktiini, virhepalkin edustaa keskivirhettä (SEM).

edelleen tutkia mahdollisuuksia biologista merkitystä eroja geenien ilmentymisessä välillä HEI ja HEY A8 soluja, käytimme topologinen merkitys analyysi (TSA). Tätä lähestymistapaa käyttäen tunnistimme 1108 ainutlaatuinen Entrez Gene tunnukset vastaavat topologisesti asiaan liittyvien proteiinien up-geenien in HEI A8 soluissa (Entrez geeni tunnukset muunnetaan 1199 viralliset geeni symboleja esitetään File S2). Merkittävästi rikastettu GeneGO väyliä näiden topologisesti asiaan proteiineja (360 reittejä at FDR = 0,26%) ehdottaa huomattavia biologisia eroja HEI ja HEI A8 solut mukaan lukien ne, joita ei voitu tunnistaa transkription tasolla (File S3). Käsitellään perusteellisesti näitä tuloksia ei kuulu tämän paperin ja esitetään muualla. Täällä me rajoitamme keskustelun näihin muutoksiin eniten merkitystä havaitut erot solussa jäykkyys edellä.

Top Tilanne GeneGO koulutusjakson topologisesti asiaan proteiineja (File S3) on ”TGF, WNT ja solun tukirangan remodeling polku ”(Fig. 4). Tämä polku tunnistettiin myös merkittävästi rikastettu geenien säädellä vähentävästi HEI A8 soluissa (taulukko 3). Nämä havainnot osoittavat, että erot jäykkyys välillä HEI ja HEI A8 solut liittyvät tukirangan remodeling. Meidän havainnot tukevat aikaisemmin ennusteita, että perusteella vähennetään jäykkyyttä syöpään liittyvän [39] ja erittäin invasiivinen soluihin [40] voi liittyä solun tukirangan remodeling. Lisätukea tämä johtopäätös tulee TSA josta löytyy eri isophorms aktiini superperheen topologisesti merkittäviä geenejä säädellään ylöspäin HEI A8 soluissa (File S2), samoin kuin ero ilmentymisanalyysiä, jossa todettiin, että aktiini-monomeeri sitovien proteiinien CFL2 , TWF1 ja PFN1 jotka säätelevät sisällyttäminen aktiini monomeerien säikeiksi [41] ovat yli-ilmennetään HEI A8 soluissa. Yli-ilmentymisen cofilin-2 (CFL2) parantaa nopeutta aktiinifilamentin liikevaihdon depolymeroimiseksi säikeitä niiden terävä kärki [42], kun twinfilin (TWF1) toimii aktiini-monomeeri-pidättävää proteiini, joka myös katkaisee aktiinisäikeiden edistää hehkulamppuja purkamista

in vitro

ja sen nopeaan kiertoon

in vivo

[43]. Se, että myosiinikevytketjua kinaasi (MYLK), joka edistää aktiini aktivoituvan myosiinin motoristen toimintojen ja jännitys sukupolvi [44], on merkittävästi säädellä vähentävästi HEI A8 soluissa edelleen tukee roolia stressin kuitujen havaitun eron solussa jäykkyys. Mielenkiintoista on, BDM ja ML-7, inhibiittorit MYLK, on ​​aiemmin raportoitu aiheuttavan pehmeneminen fibroblastisolulinjat [45]. Fosforylaation myosiinin kevyen ketjun, stressi kuidun muodostumista, ja sen seurauksena lisääntynyt solun jäykkyyttä voidaan myös indusoi kautta RhoA /Rho-kinaasi-reitin [46], joka on inaktivoitu cAMP-riippuvaisen proteiinikinaasin (PKA) [47]. Olemme havainneet, että sääntelyn (PRKAR2A, PRKAR2B) ja katalyyttinen (PRKACB) alayksikön geenit PKA yliekspressoituvat merkittävästi HEI A8 suhteessa HEI soluihin viittaa siihen, PKA-riippuvainen inaktivaatio RhoA /Rho-kinaasi-polun HEI A8-soluissa. qPCR validointi ero geenien ilmentyminen tietoja microarray kokeilu vahvisti yliekspressio PRKAA2 ja TWF1 geenejä vastaavien kertamuutoksia 3,89 ja 2,63 ja laski ilmentyminen MYLK geenin kertainen muutos -2,0 in HEI A8 soluissa suhteessa HEY soluihin (kuvio. S2).

mikroskooppinen analysointi munasarjasyövän ja ohjaus Cells Varmista, että Actin välittämä solun tukirangan remodeling liittyy muutos Metastaattinen Mahdolliset

Koska meidän molekyyli analyysit osoittivat, että aktiini-välitteinen solun tukirangan remodeling voi olla merkittävä tekijä havaitut erot solussa jäykkyyden välillä hEI ja invasiivisia /tuumorigeenisiä hEI A8 soluja, testasimme hypoteesia tutkimalla solun tukirangan rakennetta hEI ja hEI A8 solujen suhteessa muihin munasarjasyöpäsoluja (OVCAR-3, OVCAR-4) ja ei -malignant kuolemattomaksi munasarjojen pinnan epiteelisolujen (menettää tavallisesti). Tulokset esitetty kuvassa. 5 näyttö tiheämpi, hyvin linjassa F-aktiini pidemmän stressiä kuitujen menettää tavallisesti suhteessa kaikkiin munasarjasyöpäsoluja. Tämä on sopusoinnussa aiemmin raportoitu vertailuja normaalit ja syöpäsolut [5], [20].

Lisäksi aste yhteistyössä kohdistus F-aktiini kuitujen keskuudessa eri tutki solulinjat korreloivat havaittua ero soluissa jäykkyys. Esimerkiksi jäykempi menettää tavallisesti solujen aktiinisäikeiden jaellaan soluun elin, jossa useimmat F-aktiini nippuja linjassa pitkin pitkää akselia solun hyvin määritellyt stressi kuituja ja paikallisissa kontakteissa. Sen sijaan aktiinisäikeiden että pehmeämpi munasarjasyöpäsoluja ovat vähemmän järjestäytynyt ja F-aktiini niput ovat suuntautuneet sattumanvaraisesti kanssa häiritsi, lyhyet segmentit. In OVCAR-4-solut, aktiinisäikeiden ovat linjassa vain paikallisesti ja muodostavat sotkuinen verkko. Vuonna HEY soluissa aktiinisäikeiden murtautua lyhyempiä segmenttejä ja näyttää vähensi yhteistyön linjaus. F-aktiini in OVCAR-3 solujen ylläpitää kuorirakenteelle useimpien filamentteja makaa reuna alueella solun, vaikkakin suhteellisen alhainen tiheys. HEI A8 soluilla samanlaisia ​​ominaisuuksia F-aktiini jakelu HEY soluihin, mutta jolla on pienempi tiheys. Koska aktiinisytoskeletonin myötävaikuttaa mekaanisia ominaisuuksia solujen, havaitut vaihtelut ovat johdonmukaisia ​​eroja solujen jäykkyys ja aikaisempien raporttien kanssa [8], [19].

analysoitiin kvantitatiivisesti asteen co-kohdistus F-aktiini kaikissa viidessä solulinjoissa käyttämällä suunta kertymäfunktio. Tulokset näkyvät kuvassa. 6

. Parametri

D

, määritellään käytettiin määrällisesti asteen yhteistyössä kohdistus F-aktiini päässä orientaatiojakautuman tehtäviä, joissa

P (θ) B edustaa suunnan kertymäfunktio, joka on todennäköisyys kuidun suunnattu kulmassa

θ

fluoresenssissa kuvan.

P

0 (θ) B on suunta kertymäfunktio äärirajat tapauksessa, jossa F-aktiini ovat täysin satunnaisesti jakautuneet ja siksi sen arvo on

P

0 (θ) =

1/180. Ääritapauksessa, jossa kaikki aktiini kuidut ovat suuntautuneet sattumanvaraisesti ilman etusijalle, orientaatiojakautuman toiminto pitäisi olla vakio ja riippumaton kulmasta. Määritelmän

D

, suurempi arvo

D

osoittaa yhä poikkeamaa satunnainen suuntaus ja korkeampi yhteistyön kohdistus F-aktiini. Suunta jakaumia F-aktiini eroavat näistä viidestä munasarjojen solulinjoissa (Fig. 6

). Ei-pahanlaatuisten menettää tavallisesti soluja, joista useimmat F-aktiini niput ovat linjassa pitkin pitkää akselia solu, joka on ~135 °. Sen sijaan OVCAR-4-soluissa näyttää useita painotuksista F-aktiini, mikä osoittaa, että aktiinisäikeiden eivät ole tasaisesti kohdistettu, eivätkä tasaisesti jakautunut. Tämä tulos on helposti ilmi fluoresenssi kuvaa kuvion. 5. suhde asteen co-kohdistus F-aktiini ja jäykkyys yhden solun on piirretty kuviossa. 6

b

, mikä osoittaa vahvaa ja merkittävä positiivinen korrelaatio (r = 0,99834 p-val = 8,064 x 10

-5 ja ρ = 1 p-val = 0,01667). Tämä tulos viittaa siihen, että muutokset yhteistyössä kohdistus F-aktiini kimppuja voitaisiin myös edistää eroja solussa jäykkyys sisällä tutki munasarjojen solulinjoissa.

Johtopäätökset

analyysi ei-pahanlaatuisten menettää tavallisesti ja neljä munasarjasyövän solulinjoissa osoittaa, että syöpäsolut näytteille alempi keskimääräinen jäykkyys suhteessa hyvänlaatuisen edeltäjä soluja. Kiinnostavaa kyllä, me myös huomata, että kasvu invasiivisia ja muuttavien kapasiteetti liittyy HEI A8 solujen suhteessa HEY soluihin myös korreloi vähentää merkittävästi solun jäykkyys. Vertaileva geeniekspressioanalyysiä HEI A8 ja HEI solujen osoittaa, että molekyyli vähennys perustuu jäykkyys näiden solujen on heijastava laaja molekyyli- muutoksia, kuten muutokset aktiinisytoskeletonin remodeling reittejä. Mikroskooppisia analyysejä aktiinisytoskeletonin munasarjasyövän ja ohjaus solut ovat yhdenmukaisia ​​tämän hypoteesin.

Koska meidän mittaukset tehdään syövän solulinjoissa, lisätutkimuksia tarvitaan, onko samanlaisia ​​tuloksia löytyy tapauksessa potilaan -johdannainen soluja. Perustamisesta suhteellinen metastaattista potentiaalia syöpäsolujen on tärkeä tekijä suunnittelussa optimaalisen strategioiden henkilökohtainen syövän hoidossa [48]. Tällä hetkellä, laaja molekyyli- profilointi on tarpeen arvioida metastaattisen potentiaalin syöpäsolujen [49]. Yhdessä meidän tulokset osoittavat, että mekaaninen jäykkyys saattaa olla hyödyllinen biomarkkerin kehittämisessä tarkka, ei-invasiivisia kliinisiä menetelmiä arvioida suhteellisen metastaattisen potentiaalin munasarjojen ja ehkä muiden syöpien soluja.