Krooninen sairaus

tiivistelmä

metastaasin koolonkarsinoomasoluissa lisää riskiä paksusuolen syövän kuolleisuus. Olemme äskettäin osoittaneet, että American ginseng estää paksusuolen syöpä, ja heksaaniuutetta American ginseng (HAG) on erityisen voimakas tulehdusta ja syövän ominaisuuksia. Säädeltyyn microRNA (MIR) ilmentyminen on havaittu useissa sairaustiloissa, mukaan lukien paksusuolen syöpä. Käyttämällä globaali miR ilmaisun profilointi, havaitsimme kasvoi miR-29b koolonkarsinoomasoluissa altistuksen jälkeen HAG. Koska miR-29b on rooli säätelemällä syöpäsolujen, me arveltu, että HAG indusoi miR-29b ilmaisun kohdistaa matriksimetalloproteinaasi-2 (MMP-2) samalla poistetaan migraatio koolonkarsinoomasoluissa. Tulokset ovat yhdenmukaisia ​​tämän hypoteesin. Tutkimuksemme tukee käsitys, että kohdentaminen MMP-2 miR-29b on mekanismi, jolla HAG vaimentaa muuttoa koolonkarsinoomasoluissa.

Citation: Poudyal D, Cui X, Le PM, Hofseth AB, Windust , Nagarkatti M, et al. (2013) avainasemassa on mikroRNA-29b torjumista koskeva Colon Cancer Cell Migration American ginseng. PLoS ONE 8 (10): e75034. doi: 10,1371 /journal.pone.0075034

Toimittaja: A. R. M. Ruhul Amin, Winship Cancer Institute of Emory University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 07 elokuu 2013; Julkaistu: 09 lokakuu 2013

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Center for CAM tutkimus autoimmuunisairaudet ja tulehdustautien, NIH avustus 1P01AT003961-01A1 (PN, LJH, MN) ja COBRE rahoitetaan University of South Carolina Center for Colon Cancer Research, NIH avustus P20RR17698-01 (Franklin Berger, Director). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syövän (CRC) on kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä sekä miehillä että naisilla, ja kolmanneksi yleisin syy syövän kuolemaan. Yhdysvalloissa American Cancer Society arvioi 141210 uutta tapausta ja peräsuolen syövän ja 49380 kuolemantapausta vuonna 2011. etäpesäke johtaa 90% syöpään liittyvien kuolleisuutta [1], [2]. Periaatteessa aikana etäpesäkkeiden CRC, jotkut syöpäsoluja primaarikasvaimen massa hyökätä ympäröivään kudokseen, intravasate osaksi verisuonistoon kulkea veren ja imusuonten, pidätys kaukainen kapillaareja, ekstravasoitumaan perussolukko kaukaisten kudosten (pääasiassa maksassa ja keuhkoissa), jossa he seed uusia pesäkkeitä muodostavat makroskooppiset sekundaarikasvaimia [3]. Nämä metastaattinen syöpäsolut menettävät kykynsä tarttua naapurina kasvainsoluihin ja kehittää muuttavien ja invasiivisia ominaisuuksia levittää kaukaisille metastaattisen elimiin. Näin tehdessään metastasoituneessa solut käyvät läpi muutoksia geenien ilmentymistä ja toimintaa, ja saa siten enemmän mesenchymal- kaltaisia ​​piirteitä ja tätä prosessia kutsutaan kuin epiteelikasvaimet että mesenkymaalitransitioon (EMT), ratkaiseva tapahtuma maligniteetti. MikroRNA (Mirs) ovat pienet ei-koodaavat RNA: t on noin 22 nukleotidin (nt) pitkä, että transkription jälkeen säätelee geenin ilmentymistä kasveissa ja eläimissä. Eläimillä Mirs tavoite selostukset kautta epätäydellinen emäspariutuminen 2-7 mukset 5′-päähän miR (niin kutsuttu ”siemenet” sekvenssi) useita sivustoja 3′-alueet (UTR) ja kohde-mRNA, ja tämä epätäydellinen miR-mRNA hybridit Keski pullistuu (nt 9-12) rekrytoi miRNP (microRNA ribonukleoproteiini- kompleksi), jotka mahdollistavat translaation estäminen tai eksonukleolyyttistä mRNA rappeutuminen [katsaus esitetty [4]]. Monet siivous geenit ovat kehittyneet lyhyempi 3′-UTR välttää miR asetuksen [5]. Noin 50% selityksin ihmisen miR geenit sijaitsevat syöpään liittyvä genomialuetta tai hauras sivustoja, jotka ovat alttiita vahvistus, poisto ja translokaatiota in erilaisissa kasvaimissa kuten paksusuolen kasvaimet [6]. Tämän vuoksi jotkut Mirs voisi toimia joko tuumorisuppressoriproteiinia tai onkogeenien [7], [8], [9], [10], [11]. Expression profilointi analyysi on paljastanut ominaisuus miR allekirjoitukset voidaan ennustaa kliinisiä tuloksia CRC [12], [13].

Yksi klassisen tunnusmerkkejä syöpä on kyky syöpäsolujen hyökätä ja etäispesäkkeitä [14] . Mirs ovat sekä positiivisia että negatiivisia säätelijöitä syövän etäpesäkkeiden [15], [16], [17]. Yksi negatiivinen säätelijä syövän etäpesäkkeiden on miR-29b [esimerkiksi [18], [19], [20], [21], [22]]. miR-29b kuuluu miR-29 perheen. MIR-29 perheen koostuu kolmesta paralogeihin: miR-29a, -29b ja -29c. miR-29a ja miR-29b1 sijaitsevat kromosomissa 7q32; miR-29b2 ja miR-29c sijaitsevat kromosomissa 1q23 [23]. miR-29b1 ja miR-29b2 sekvenssit ovat identtisiä vaan erottaa B1 ja B2 vuoksi ero lokuksessa. MMP-2, joka on solunulkoisen matriisin (ECM) hajottava entsyymi, joka on tärkeä implisiittisesti etäpesäke ja angiogeneesiä on osoitettu olevan suora kohteena miR-29b [20].

American ginseng (AG;

Panax quinquefolius

) on velvoittanut sävy monivuotinen kotoisin Pohjois-Amerikasta. Alkaen biomääritys ohjattu fraktiointi AG, olemme hiljattain osoittaneet, että heksaania osa AG (HAG) on voimakas antioksidantti ja syövän vastaisen aineen [24], [25]. Tähän mennessä vain rajoitettu syöpälääkkeen tutkimukset lipofiilisten uutteiden AG on tehty, ja nämä tutkimukset ovat enimmäkseen keskittynyt antiproliferatiivisia ja sytotoksisia vaikutuksia [26], [27], [28], [29]. Edelleen ymmärtää syövän mekanismi HAG (lipofiilistä uutetta), tutkimme roolia miR syövän solujen vaeltamiseen.

Materiaalit ja menetelmät

heksaanifraktio AG

P. quinquefolius

uute on kuvattu aiemmin yksityiskohtaisesti laboratoriossamme [30]. Samoin olemme hiljattain kuvanneet sukupolven HAG käytetään tässä tutkimuksessa [24].

Soluviljelmät

HCT 116 villityypin (WT), LOVO ja DLD-1 paksusuolen syöpäsolut hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). HCT 116 soluja viljeltiin McCoyn elatusaineessa (ATCC, Manassas, VA); LOVO solut kulttuurin F-12K keskipitkän (ATCC, Manassas, VA); ja DLD-1-soluja kulttuuri RPMI-1640-väliaine. Kaikki media on täydennetty 10% vastasyntyneen vasikan seerumia (NBCS; GIBCO /Life Technologies, Grand Island, NY), 2 mM glutamiinia (Biofluids, Rockville, MD), penisilliiniä (10 U /ml, Biofluids) ja streptomysiiniä (10 ug /ml, Biofluids).

Global mir Expression

HCT 116 WT-solut ympättiin 1 x 10

6 solua /levy 6 kuoppaisille levyille neljän toiston. Viljelyn jälkeen 24 h, 260 ng /ml HAG lisättiin kuhunkin kuoppaan. Solut kerättiin 0, 12, ja 24 h erikseen RNaasitonta EP putket. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Ambion, Austin, TX). RNA-pitoisuus määritettiin Nanodrop 2000 (NanoDrop, Wilmington, DE). 100 ng RNA: HCT 116 WT soluja käytettiin NCounter miRNA Expression Assay v1.2 (Nanostring Technologies, Seattle, WA), joka sisälsi 800 miRNA: n noudattamalla valmistajan ohjeita.

miR-29b Expression

solut ympättiin, alttiina ajoneuvon (media) tai 260 ug /ml HAG, ja talteen 24 tunnin. Mir-29b tunnistus, 10 ng kokonais-RNA: ta käytettiin reverse puhtaaksi cDNA käyttäen TaqMan miR Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) valmistajan ohjeiden ja miR spesifisiä alukkeita HSA-miR-29b havaitsemiseen ja pieni tumaproteiinin RNU6B (U6) normalisoinnin (Applied Biosystems). qPCR mittaus miR-29b ja U6 ekspressio suoritettiin käyttäen TaqMan miR määritykset (Applied Biosystems) kanssa, 7300 PCR Assay System (Applied Biosystems). Vertaileva kynnys (Ct) menetelmää käytettiin arvioimaan suhteellinen runsaus miR-29b verrattuna U6 ilme (kertamuutoksia suhteessa U6). Kaikki kokeelliset käsittelyt tehtiin kolmessa erässä; joka kerta kolme toistoa.

siRNA ja miR transfektio

MMP-2 siRNA, 1,5 x 10

5-soluja kasvatettiin väliaineessa 6 kuoppalevyille 1 vrk ennen transfektiota. Käyttäen INTERFERin siRNA Transfection Reagent (Plyplus, iLllkirch, Ranska), solut transfektoitiin 5 nM MMP-2 Trilencer-27 ihmisen siRNA (Origene, Rockville, MD). 48 tunnin kuluttua transfektion jälkeen solut käsiteltiin western blot analyysi tehon arvioimiseksi kaataa (kuva S3). Sillä Mirvana-miR-29b: n estäjä ja Mirvana-Negatiivinen kontrolli estäjä (Ambion, Austin, TX) transfektion, 1,5 x 10

5-soluja kasvatettiin elatusaineessa, 6-kuoppaisille levyille 1 päivä ennen transfektiota. Käyttäen INTERFERin siRNA Transfection Reagent (Polyplus Transfektiot, Illkirch, Ranska), solut transfektoitiin 10 nmol /l Mirvana-miR-29b estäjän tai Mirvana-Negatiivinen kontrolli estäjä. 48 tunnin kuluttua transfektion jälkeen solut kerättiin RNaasitonta EP putket. Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol valtionhoitaja. RNA-pitoisuus määritettiin Nanodrop 2000. 10 ng kokonais-RNA: ta käänteistranskriboitiin cDNA: ksi käyttäen TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kanssa microRNA spesifisten alukkeiden HSA-miR-29b ja pieni tumaproteiini RNU6B (U6) normalisoinnin. qPCR mittaus miRNA-29b ja U6 ilmaisu suoritettiin käyttäen TaqMan MicroRNA Kokeet kanssa 7300 PCR Assay System. Suhteellinen kertainen muutos miR-29b tason käytettiin edustamaan suhteellinen runsaus miRNA-29b verrattuna U6 ilme. Kuten kohti toimittaja Mirvana-miR-29b Inhibitor (Ambion Life Technologies, Austin, TX), tehoon, jolla nisäkässolut transfektoidaan Mirvana-miR estäjä riippuu solutyypistä ja transfektio, jota käytetään. On suositeltavaa, että optimointi kokeessa (Pitoisuudet 1 100 nM miR estäjä) voidaan suorittaa tuottaa mahdollisimman suurta aktiivisuutta pienellä sytotoksisuutta. Transfektio tehoa ja alkuperä 3 solulinjojen HCT116, LoVo ja DLD-1 ovat erilaisia ​​ja optimoinnin kokeessa (tuloksia ei ole esitetty), Mirvana miR-29b Inhibitor osoittivat suurin aktiivisuus 10 nM jälkeen 48 h transfektion HCT116-solut ja 50 nM LoVo ja DLD-1-soluissa. 48 tunnin kuluttua ja transfektoimalla Mirvana-miR-29b Inhibitor, HAG (260 ug /ml) 24 tuntia ja solut kerättiin kohdegeenin (MMP-2) ilmentymisen ja migraatiokokeessa. Kaikki kokeelliset kontrollinäytteitä käsiteltiin yhtä pitoisuus ei-kohdistuksen estäjä negatiivisena kontrollina sekvenssin, käytettäväksi valvontaa ei-sekvenssi-spesifinen vaikutuksia miR kokeissa. Valetransfektoidun valvonta ei tuota mitään merkittävää vaikutusta johonkin parametreista analysoitu.

mRNA Analysis

Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol reagenssia (Invitrogen, CA). Yksi ug kokonais-RNA toimi templaattina yksittäisen juosteen cDNA-synteesi in reaktio käyttämällä oligo (dT) alukkeita ja AMV-käänteistranskriptaasia (Promega Corp, WI) olosuhteissa valmistajan ilmoittama. PCR cDNA näytteitä suoritettiin näytteistä monistettiin 30 sykliä denaturointi 94 ° C: ssa 30 s, pariutuminen 50 ° C: ssa 30 s, ja pidennys 72 ° C: ssa 30 s ja lopullinen pidentäminen 72 ° C: ssa 10 minuutin ajan . Sekvenssit Real Time PCR-alukkeita käytettiin: MMP-1 Forward 5′-AGG TCT CTG AGG GTC AAG CA-3 ’; MMP-1 Käänteinen 5’-CTG GTT GAA AAG CAT GAG CA-3 ’; MMP-2: Forward 5’-ACA TCA AGG GCA TTC AGG AG-3 ’; MMP-2 Käänteinen 5’-GCC TCG TAT ACC GCA TCA AT-3 ’; MMP-7 Forward 5’-GAG TGC CAG ATG TTG CAG AA-3 ’; MMP-7 Reverse 5’- AAA TGC AGG GGG ATC TCT TT-3 ’; MMP-9 Forward 5’-TTG ACA GCG ACA AGA AGT GG-3 ’; MMP-9 Reverse 5’-GCC ATT CAC GTC GTC CTT AT-3 ’ja GAPDH Forward 5′- GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3′, GAPDH Reverse 5’-TTG ATT TTG GAG GGA TCT CG-3 ’( Integrated DNA Technologies, Inc.). Reaaliaikainen PCR (qPCR) suoritettiin käyttäen 7300 Real-Time PCR Assay System (Applied Biosystems, CA) Power SYBR green PCR master mix (Applied Biosystems, CA) ja alukkeita MMP-1, -2, -7, -9 ja GAPDH mukaan myyjän protokollaa. MMP geeniekspressio normalisoitiin GAPDH-geenin ilmentymistä. Kansi muutos geenien ilmentyminen on suhteessa vektori käsiteltiin [1x fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS)] solut talteen 24 h.

Western Blot-analyysi, ja vasta-aineet

Western blotit suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [31]. Vasta-aineita käytetään muun muassa: MMP-2 (Kanin polyklonaaliset, laimennettuna 1 500, kissa # 4022s; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), ja GAPDH (Kanin polyklonaaliset, laimennettu 1: 1000 kissa # 5174; Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Kaikkien blotit, vakio proteiini (BenchMark Esivärjätyt Protein Ladder, Invitrogen, Carlsbad CA) ajettiin varmistaakseen molekyylipaino jokaisen bändejä havaittu. Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-kaniini-vasta-aineet hankittiin yhtiöltä Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). Sekundaariset vasta-aineet laimennettiin 1:2000. Kaikki vasta-aineet laimennettiin 5% maito /PBST (0,1% Tween 20 1 x PBS). Western blot signaali havaittiin Pierce ECL Western blotting alusta (Thermo Scientific, Rockford, IL) ja kehitettiin päälle Hyperfilm.

In vitro

-analyysi Migration

24 hyvin Costar siirtokuoppaan läpäisevä tukijalka, jonka 8-um huokoskoko polykarbonaattimembraanille (Corning Incorporated, NY), ja 6,5 ​​mm: n insertin, käytettiin analysoimaan kasvainsolujen vaeltamista. Tämän migraatiokokeessa, Transvvell- kalvo imeytettiin 15 ug /ml tyypin I kollageeni (BD Biosciences) 30 minuuttia 37 ° C: ssa seerumivapaassa. Kollageeni poistettiin pipetoimalla ja kollageenin päällystetty kalvo oli paikka 24 kuoppalevylle. Soluja ilman seerumia 12 tuntia ja 50000 solut suspendoitiin uudelleen 200 ui: aan seerumitonta Medium (SFM) ja siirrettiin päälle kammion transwell. Alaosaan täytettiin 750 ul: aan SFM ja Complete kasvualustaan ​​(10% NCS täydennetty, kuten kemoattraktantti-solut) tai HAG (260 ug /ml valmiissa elatusaineessa) joita. Transvvell- Levyä inkuboitiin 37 ° C: ssa 12 tuntia. Inkubaation jälkeen, väliaine poistettiin kammiosta, Transvvell- membraani pestiin 1 x PBS: llä ja solut kiinnitettiin formaldehydillä (3,7% PBS: ssä) ja tehtiin läpäiseviksi 100% metanolia ja värjättiin 0,4% kristalliviolettivärjäys. Kalvo pestiin 1 x PBS ja ei-siirretyn päällä Transvvell- kalvon raaputettiin pois steriilillä vanupuikolla. Transvvell- kalvo leikattiin pois siirtokuoppaan kammiosta ja kiinnitetään mikroskooppisesti Permount-peitinlaseilla ja tarkastella mikroskoopilla (100x suurennus). 7 satunnaisen leikkeitä kuvattuna kaikilta levyiltä ja siirrettyjä soluja pohjassa Transvvell- kalvon olivat automaattisesti laskettiin käyttämällä Image J ohjelmisto (https://rsbweb.nih.gov/ij/).

Tilastollinen analyysi

maailmanlaajuinen miR analyysiä, kaikki data tuotiin NSolver Analysis Software v1.0 (Nanostring Technologies) ja normalisoitiin geometrinen keskiarvo 100 Mirs korkein ilme arvoja. Normalisoitu data tuotiin BRB-ArrayTools v4.1.0 analysoitavaksi. Ennen analysointia, tietojen suodatettiin missä tahansa arvo alle 10 jätettiin pois ja kaikki miR puuttuvat 50% näytteistä jätettiin lähdössä 248 miR n analysoitavaksi. Suodatus painoarvo oli sellainen, että normalisoitu datapiste 10 tai log2 muunnetulle datalle arvo 3,321928 kutsuttiin puuttuvat ja jätettiin, koska se on tasolla taustan. Vain ne datapisteet 10 tai log2 muunnetun datan arvo 3,321928 otettiin huomioon ja syötti suodatusasetukset lähtevät 248 Mirs analysoitavaksi. Luokan vertailutesti hyödyntää Student T-testit verrata miR n käsiteltyjen vs. käsittelemättömien solujen. Trend testejä käytetään lineaarista regressio mallinnusta määräsi kategorinen muuttujiin 0 h, 12 h ja 24 h. Benjamini-Hochberg menettelyä käytettiin laskemiseen vääriä löytö hinnat. Kun enemmän kuin kaksi ryhmää verrattiin, päätimme tilastollisia eroja käyttäen yksisuuntaista varianssianalyysiä, jota seurasi Scheffen monivertailutestillä. Jos kaksi ryhmää verrattiin, käytettiin Studentin t-testiä. P-arvon valittu merkitystä tässä tutkimuksessa oli 0.05.

Tulokset

HAG indusoi miR-29b In Colon Cancer Cells

American ginseng ja HAG ovat molemmat aiheutti ehkäisevä vaikutus kemiallisesti aiheuttama paksusuolensyöpä malli [24], [32]. Aloittaa Tutkimuksessamme koska Mirs on osoitettu olevan sekä pro-kasvain ja kasvaimen ominaisuuksia, tarkastelimme vaikutusta HAG globaaliin miR ilmentymistä koolonkarsinoomasoluissa. Oli merkittävä positiivinen korrelaatio 2 Mirs, ja merkittävä negatiivinen korrelaatio 6 MIRS altistuksen jälkeen HCT 116 solujen HAG (260 ug /ml) 0 h, 12 h, ja 24 h (taulukko 1). Perustuu käsitykseen, että miR-29 perhe on säädeltiin useita pahanlaatuisia kasvaimia [21], [23], [33], [34], että useat tutkimukset ovat osoittaneet, että jopa sääntely miR-29 on antituumorivaikutuksia [22], [35], ja että lisääntynyt ilmentyminen miR-29b osoitettiin kahdella eri tilastollisia menetelmiä (taulukot 1 ja 2), olemme keskittyneet tässä miR. Vahvista miR-29b ylössäätöä by HAG, me toisti kokeen ja tutkittiin miR-29b ylösajon by qRT-PCR. Yhdenmukainen globaali miRNA analyysin tuloksia, Kuvio 1 osoittaa, että on lisättävä miR-29b ilmentymistä (7,3-kertainen) ja altistumisen HCT 116 solujen HAG. Myös kasvua miR-29b lausekkeen altistuminen kahden muun koolonsyöpäsolulinjoissa (DLD-1, 3,1-kertaisesti, ja LOVO, 1,5-kertainen) (kuvio 1).

HCT 116, DLD -1, ja LOVO solut altistettiin 260 ug /ml HAG 24 h (n = 3 aikapistettä kohti). Suhteellinen endogeeninen miR-29b ekspressiotasot havaittiin qRT-PCR: llä käyttäen Taqman-alukkeita ja koettimia havaitsemaan kypsän miR-29b ja pieni ydin- RNA RNU6B (U6), sisäisen valvonnan. Suhteellinen miR-29b ekspressiotasot normalisoitiin keskiarvo ei-käsiteltyjen näytteiden (0 h). * Osoittaa merkitsevää eroa (p-arvo 0,005) päässä 0 h ohjaus.

HAG vaimentaa MMP-2 kaavaan koolonkarsinoomasoluissa

Mahdolliset tavoite geenejä miR-29b ensin käytettäessä ennakoitu verkkotietokantoja, kuten miRTarBase, TargetScan, PicTar, Miranda. MMP-2: ta ennustetaan olevan mahdollinen kohde miR-29b kaikki nämä tietokannat (kuvio 2A). Koska MMP-2 yliekspressoituu tuumorikudoksissa [36], [37], [38], ja on suora vaikutus in etäpesäke ja angiogeneesiä syöpäsolujen [39], [40], ensin tarkasteltiin vaikutuksia HAG on MMP -2 ilme. Hoito HCT-116-solujen HAG 24 tuntia johti vähentäminen MMP-2-geenin ilmentyminen noin puolet kertainen [(1 ± +0,14-0,57 ± 0,05), p-arvo = 0,078] (kuvio 2B). HAG hoito 24 h, vähensi MMP-2-geenin DLD-1-soluissa [(1 ± 0,03-0,03 ± 0,01), p-arvo 0,005] (kuvio 2D). Samoin hoito Lövön solujen HAG 24 h johti vähentäminen MMP-2: n ilmentymisen [(1 ± 0,06-0,74 ± 0,017), p-arvo 0,05] (kuvio 2F). Tarkistaa, onko HAG pienentää MMP-2 aktiivisuutta, HCT-116-soluja käsiteltiin HAG 24 h ja MMP-2-proteiinia analysoitiin. Kuva S4, HAG vähensi pro- ja aktiivi- MMP-2-proteiinin ilmentymisen; vahvistetaan, että HAG vähensi MMP-2: n aktiivisuuden ja geenien ilmentymisen. Lisäksi muita ECM alentava MMP, kuten MMP-1, MMP-7: n ja MMP-9-geenin ilmentyminen ei ollut säännelty HAG hoito (taulukko S2). Mielenkiintoista, nämä MMP (MMP-1, -7 ja -9) eivät ole välittömänä kohteena miR-29b.

(A) miR-29 perheen (miR-29a /b /c) ja sen otaksuttu sitovan sekvenssin 3′-UTR: MMP-2-geenin. Siementen sekvenssi miR-29 perheen näkyy ruudussa. (B) HCT116 WT solut altistettiin 260 ug /ml HAG 24 tuntia. (C) HCT116-solut transfektoitiin 10 nM Mirvana miR-29b, 48 h ja altistettiin 260 ug /ml HAG 24 tuntia. (D) DLD-1-solut altistettiin 260 ug /ml HAG 24 tuntia. (E) DLD-1-solut transfektoitiin 50 nM Mirvana miR-29b, 48 h ja altistettiin 260 ug /ml HAG 24 tuntia. (F) LOVO-solut altistettiin 260 ug /ml HAG 24 tuntia. (G) LOVO-solut, jotka on transfektoitu 50 nM Mirvana miR-29b, 48 h ja altistettiin 260 ug /ml HAG 24 tuntia. Suhteellinen MMP-2: n ilmentymisen tason havaittiin qRT-PCR. MMP-2: n mRNA kullekin näytteelle normalisoitiin GAPDH ilme. Kertainen muutos MMP-2: n mRNA taso oli suhteellisen ei-käsiteltyjä soluja kerättiin 0 h (n = 3 aikapistettä kohti). Tulokset osoittavat heksaanifraktio AG vaimentaa MMP-2: n mRNA tasolla verrattuna ei-käsiteltyihin soluihin. *, Osoittaa merkittävä ero, P-arvo 0,05 0 h ohjaus.

Lisäksi, tarkistaakseen, onko HAG välittämää tukahduttaminen MMP-2-geenin riippuu miR-29b, me vaiennetaan asennuspalveli- 29b (kuva S1) käyttäen miR-29b estäjä (katso menetelmät 4.2.5). HAG ei tukahduttaa MMP-2-geenin ilmentyminen, kun miR-29b vaimentuu (kuviot 2C, 2E ja 2G). Itse asiassa, on 2,4-kertainen ekspression lisääntyminen MMP-2: miR-29b vaiennetaan HCT116-solut, kun se altistetaan HAG, 24 h (kuvio 2C). Ei ollut MMP-2-geenin ilmentymisen miR-29b vaiennetaan DLD-1 ja LOVO koolonkarsinoomasoluissa altistuessaan HAG, 24 h (kuviot 2E ja 2G). Yhdessä nämä tulokset ovat sopusoinnussa hypoteesin, että tukahduttaminen MMP-2 HAG riippuu miR-29b.

HAG vaimentaa muutto koolonkarsinoomasoluissa

MiR-29b tavoitteet avain pelaajat tukahduttaa ja metastaasit [19], [20], [21], [22]. MMP-2 on mukana kulkeutumista paksusuolen syövän soluja (taulukko S1, kuvio S2). Noin 3,5-kertainen väheneminen solujen määrä siirtyneet /mikroskooppisten kentän HCT116-soluissa MMP-2 kolhi /alas solujen verrattuna HCT116 WT solujen läsnä ollessa 10% seerumia kemoatrak- raportoidaan (taulukko S1, kuva S2). Tämä on selvä osoitus siitä, että MMP-2 on keskeinen tekijä säätelyssä solujen vaeltamiseen, mutta sitä ei voida sulkea pois, että muut ECM halventava MMP kuten MMP-1, MMP-7, MMP-9 ja MMP-13 on osoitettu liittyvän peräsuolen syövän etenemisessä [37], [41], [42], [43], [44]. Koska HAG up-regulation miR-29b ilmaisun ja alas-säätelee ECM hajottava entsyymi MMP-2-geenin ilmentyminen, me tutki tarkemmin toiminnallinen vaikutus HAG syöpään solujen vaeltamiseen. Vuonna HCT116-soluissa, HAG tukahdutti migraatio syöpäsolujen lähes 7-kertaiseksi (kuviot 3A ja 3C). Vuonna miR-29b vaiennetaan HCT-116-solut, HAG ei tukahduttaa muuttoliikettä. Yhdenmukainen MMP-2 tulosta (kuvio 2C), ilman miR-29b aktiivisuus, HAG kohonnut solujen määrä siirryttäessä alempaan kammioon siirtokuoppaan kalvon lähes 2,5-kertaiseksi verrattuna positiiviseen kontrolliin (kuviot 3B ja 3D). Samoin HAG tukahdutti muuttoa DLD-1-soluissa vain läsnäollessa miR-29b, jossa se vähensi vaeltavien solujen lähes 5-kertaisesti verrattuna positiiviseen kontrolliin (kuviot 4A ja 4C). HAG ei aiheuttanut vastaista muuttavien aktiivisuutta miR-29b hiljennettiin DLD-1-solut (kuviot 4B ja 4D). Kaiken kaikkiaan tulokset tästä osoittavat miR-29b on risteyksessä on kyky HAG aikaansaamaan anti-muuttavien toimintaa.

Kollageeni tyyppi-I (15 ug /ml) päällystettyjä siirtokuoppaan kammio levitettiin 5 x 10

4 HCT116-soluja (A /B) 12 tuntia. Alempi kammio sisältää SFM /Serum (10%) tai HAG (260 ug /ml täydellisessä väliaineessa). (A) 5 x 10

4 HCT116 WT-solut levitettiin ylempään kammioon Transvvell- kalvo. (B) 5 x 10

4 HCT116 (transfektoitu Mirvana miR-29b, 10 nM, 48 h) solut levitettiin ylempään kammioon transwell kalvo. 12 h inkubaation jälkeen 37 ° C: ssa, solut siirtynyt sisälle (alempi kalvo) on transwell kalvo laskettiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa (7 satunnaisen mikroskooppikentäs- (100X) arvioitiin solujen laskenta). (C) kuvaa edustavan kuvan HCT116 WT solun siirtymisen kunkin hoidon. (D) kuvaa edustavan kuvan HCT116 (transfektoitu Mirvana miR-29b, 10 nM, 48 h) solujen siirtymisen kunkin hoidon. Taustalla kuvassa näkyy 8 um huokosten sisään Transvvell- kalvo. * Tarkoittaa merkitsevää eroa (p-arvo 0,005) verrattuna SFM. # Osoittaa merkittävää eroa (p-arvo 0,005), verrattuna 10% seerumia.

Kollageeni tyyppi-I (15 ug /ml) päällystettiin transwell kammion levitettiin 5 x 10

4 DLD-1-soluissa (A /B) 12 tuntia. Alempi kammio sisältää SFM /Serum (10%) tai HAG (260 ug /ml täydellisessä väliaineessa). (A) 5 x 10

4 DLD-1 WT-solut levitettiin ylempään kammioon Transvvell- kalvo. (B) 5 x 10

4 DLD-1 (transfektoitu Mirvana miR-29b, 10 nM, 48 h) solut levitettiin ylempään kammioon transwell kalvo. 12 h inkubaation jälkeen 37 ° C: ssa, solut siirtynyt sisälle (alempi kalvo) on transwell kalvo laskettiin käyttäen ImageJ ohjelmistoa (7 satunnaisen mikroskooppikentäs- (100X) arvioitiin solujen laskenta). (C) kuvaa edustavan kuvan DLD-1 WT solujen siirtymisen kunkin hoidon. (D) kuvaa edustavan kuvan DLD-1 (transfektoitu Mirvana miR-29b, 10 nM, 48 h) solujen siirtymisen kunkin hoidon. Taustalla kuvassa näkyy 8 um huokosten sisään Transvvell- kalvo. * Osoittaa merkitsevää eroa (p-arvo 0,005) verrattuna SFM.

Keskustelu

Tässä olemme osoittaneet, että HAG tukahduttaa migraatio paksusuolisyöpäsolulinjassa. Tämä antimetastaattisia omaisuutta HAG välittyy säätely ylöspäin mikroRNA-29b, joka suoraan suunnattu ja alas-säätelee keskeinen molekyyli osallistuu etäpesäkkeitä, MMP-2.

Global miR analyysi HAG – käsiteltyjen HCT116-solut johti kohonnut ilmentyminen miR-29b, joka vastaisi sekä suuntaus ja kertamuutosta tilastollinen analyysi (taulukot 1 ja 2). Oli 8 miRNA (HSA-miR-938, HSA-miR-203, HSA-miR-1975, HSA-miR-29b, HSA-miR-600, HSA-miR-1244, HSA-miR-548o: n ja HSA-miR -590-5p), jotka olivat tilastollisesti (p 0,05) ylös tai alas-säädellä. Positiivinen korrelaatiokerroin osoitetuista kohonneeseen miR lisääntynyt altistuminen HAG (0 h 12 h 24 h), jossa on vain 2 MIRS (HSA-miR-29b ja HSA-miR-590-5p) kuuluvat tähän luokkaan. Näistä 2 Mirs, miR-29b oli korkein korrelaatiokertoimen arvo 0,621. Kuten hyvin, koska miR-29b oli myös tilastollisesti merkitsevästi ajan sääntelee HAG taitteen muutoksen analyysi (taulukko 2), ja että tämä miR on osoitettu muiden pelata tuumorisuppressorina rooli [23], [33], [ ,,,0],45], [46], [47], keskityimme miR-29b varten tässä tutkimuksessa. Rooli miR-29b tuumorisuppressorina on hyvin selvitetty useissa maligniteetteja, mukaan lukien, AML [23], [45], keuhkosyöpä [33], CLL [46], [47] ja kolangiokarsinooma [48]. Down-sääntely miR-29 perhe on raportoitu useissa ihmisen syövissä kuten keuhko- [49], eturauhas- [50], invasiivisen rintasyövän [51]. Viime aikoina Kuo et’al ovat raportoineet alhaisempi ilmentymistaso miR-29a /c on peräsuolen syövän varhainen uusiutuminen ryhmässä verrattuna ei-varhainen uusiutuminen ryhmä, joka osoittaa alhaisen tason ilmentymistä miR-29a /c mahdollisena biomarkkeri varhainen uusiutuminen CRC [52]. Tuloksemme ovat paremmin selvitetty mahdollisia mekanismeja tämän havainnon.

miR-29 perheeseen kuuluu kolme jäsentä: miR-29a, miR-29b, ja miR-29c (miR29a /b /c), jotka osoittavat korkeaa sekvenssin samankaltaisuus ja yhteinen siemen sekvenssin kohde tunnustamista (kuvio 2A). Toiset ovat ilmoittaneet käänteinen suhde koskien ilmaus miR-29b ja MMP-2 [20], [22], [53], [54]. Kuten hyvin, koska miR tietokannat (miRTarBase, TargetScan, PicTar, ja Miranda) osoittavat MMP-2 mahdollisena kohteena miR-29b, tutkimme toiminnallinen merkitys tämän. MMP-2, joka tunnetaan myös gelatinaasi A tai tyypin IV kollagenaasi, on ECM hajottavaa entsyymiä, ja ilmentyy laajalti useimmissa kudosten ja solujen [55]. Samoin, MMP-2: n yli-ilmentynyt kasvainkudoksissa [36], [37], [38] ja aktivointi MMP-2 tulokset ECM hajoamista, mikä helpottaa ja metastaasit kasvainsolujen [56]. Reaaliaikainen RT-PCR-tulokset osoittivat, että HAG vähentää MMP-2: n ilmentymisen 2-kertaisesti HCT116-soluissa ja noin 30-kertainen väheneminen DLD-1-soluissa (kuviot 2C ja 2E). HAG vähensi myös MMP-2-proteiinin ekspressio (Kuva S4). Kun miR-29b aktiivisuus vaimentuu transfektoimalla koolonkarsinoomasoluissa kanssa Mirvana miR-29b estäjä (kuvio S1), HAG ei vaikuta vähentäminen MMP-2: n ilmentymisen (kuviot 2C, 2E ja 2G) ja jossain määrin indusoi MMP -2 ilme. Syynä voi olla, koska ei ole endogeenisen miR-29b, HAG voinut säädellä miR-29b, joka edelleen tehostaa MMP-2 eritystä. Osa komponenteista läsnä HAG, olisi mahdollista parantaa MMP-2: n ilmentymisen suoraan ilman endogeenistä miR-29b, mutta tämä on vielä tutkittava vahvistamatta. Siksi voimakas eristäminen prosessi aktiivisten komponenttien HAG on käynnissä ja tulevien tutkimusten tästä ovat linjaa. Kaikki yhdessä, meidän tiedot viittaavat siihen miR-29b on kriittinen HAG tukahduttaa MMP-2: n ilmentymisen syöpäsoluissa.

Matrix metalloproteinases on pidetty avainmolekyylejä avustaminen kasvainsolujen aikana etäpesäkkeiden [57], [58 ], [59], [60]. MMP: t ovat perheen sinkkiä sisältävien endopeptidaasit tunnetaan parhaiten niiden roolista fysiologisissa ja patologisissa remodeling ECM angiogeneesin aikana, haavan paranemisen, alkionkehityksen, kasvaimen etäpesäke, ja erilaisten sydän- ja tulehdussairauksien [61], [62]. On osoitettu, että miR-29b on mukana negatiiviseen säätelyyn etäpesäkkeiden useissa syöpätyypeissä [18], [20], [63]. Yhdistämällä nämä havainnot, joissa miR-29b on negatiivinen säätelijä etäpesäkkeiden ja tavoitteet avainasemassa etäpesäkkeiden MMP-2, ja HAG indusoi miR-29b ja estää MMP-2: n ilmentymisen (taulukot 1 ja 2, kuviot 1, 2 ja S4), kysyimme kysymyksen jos HAG toiminnallisesti tukahduttaa etäpesäke koolonkarsinoomasoluissa. Olemme osoittaneet, että HAG toiminnallisesti vaimentaa

in vitro

etäpesäke koolonkarsinoomasoluissa suorittamalla migraatiokokeessa paksusuolen syövän solujen (kuviot 3A, 3C, 4A, ja 4C). Koska miR-29b aktiivisuus, HAG ei ollut tehokas tukahduttamaan muuttoa koolonkarsinoomasoluissa (kuviot 3B, 3D, 4B, ja 4D). Vaikka vielä esitetty

in vivo

, kaikki yhdessä, meidän

in vitro

tulokset osoittavat, että HAG suoriutuu antimetastaattisia aktiivisuutta säätelemällä miR-29b.

Major läsnä olevien komponenttien heksaania uute (lipofiilinen uute) AG ovat polyacetylene (Panaxydiol, panaxydol ja panaxynol), joka käsittää noin 50% koko uutetta, sekä rasvahappoja, joissa lähes GS [24]. Olemme äskettäin osoittaneet, että HAG hallussaan tulehdusta ja syövän ominaisuuksia [24]. Useat muut tutkimukset anti-inflammatorisia ja anti-cancer ominaisuudet American ginseng on keskitytty ginsenoside tai saponiinia sisältöä ginseng [64], [65], [66], [67], joka on saatu vesipitoisesta etanolista uutetta (polaarinen liuotin) ginseng.